JP4934772B2 - ライン走査式のレーザ走査型顕微鏡 - Google Patents
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Description
以下では図面を参照しながら本発明をさらに詳しく説明する。
図１は主要部が４つのコンポーネント、すなわち、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール２、励起光をコリメートして試料上の走査のため然るべき偏向を行なう走査モジュール３、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュール４および試料からの光線を受け止め検出する検出モジュール５から成るレーザ走査型顕微鏡１の模式図である。その場合検出モジュール５は、図１に描かれているように、スペクトル別のマルチチャネル型に構成することができる。
図１は主要部が４つのコンポーネント、すなわち、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール２、励起光をコリメートして試料上の走査のため然るべき偏向を行なう走査モジュール３、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュール４および試料からの光線を受け止め検出する検出モジュール５から成るレーザ走査型顕微鏡１の模式図である。その場合検出モジュール５は、図１に描かれているように、スペクトル別のマルチチャネル型に構成することができる。
点状走査式のレーザ走査型顕微鏡に関する一般事項についてはＤＥ １９７０２７５３Ａ１が参考になり、したがってその内容は本明細書の構成部分でもある。
光源モジュール２は、レーザ走査型顕微鏡検査に適した照明光、したがって特に蛍光を誘起し得るビームを生成する。適用法に対応させるため、光源モジュールは当目的用に複数の光源を有している。図示された実施態様では光源モジュール２に２つのレーザ６および７が配備されている。それらの後にはそれぞれ光バルブ８および減衰器９が接続されており、それらはビームを結合ポイント１０を通じて光ファイバ１１に連結させている。光バルブ８は、レーザユニット６または７のレーザ自体の作動を遮断しなくてもビームを遮断させることのできるビーム偏向器として機能する。光バルブ８は、例えば、ビーム遮断のためレーザビームを光ファイバ１１へ連結する手前で、図示されていない光の落下方向に偏向させるＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）として形成されている。
光源モジュール２は、レーザ走査型顕微鏡検査に適した照明光、したがって特に蛍光を誘起し得るビームを生成する。適用法に対応させるため、光源モジュールは当目的用に複数の光源を有している。図示された実施態様では光源モジュール２に２つのレーザ６および７が配備されている。それらの後にはそれぞれ光バルブ８および減衰器９が接続されており、それらはビームを結合ポイント１０を通じて光ファイバ１１に連結させている。光バルブ８は、レーザユニット６または７のレーザ自体の作動を遮断しなくてもビームを遮断させることのできるビーム偏向器として機能する。光バルブ８は、例えば、ビーム遮断のためレーザビームを光ファイバ１１へ連結する手前で、図示されていない光の落下方向に偏向させるＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）として形成されている。
図１のモデル例ではレーザユニット６は３つのレーザＢ、Ｃ、Ｄを有しているが、それに対しレーザユニット７はレーザＡを１つもつのみである。したがって、図示の６と７は単一波長レーザと多種波長レーザの組み合わせモデルであり、個別に、または共同で1つまたは複数のファイバに連結されている。複数ファイバを通じてビームを同時連結することも可能であるが、その場合ではビームは後に、すなわち適合光学系の通過後にカラー結合器によって混合される。このようにして、励起光用に種々様々な波長または波長領域を使用することができる。
光ファイバ１１に通されたビームは、移動式のコリメーション光学系１２および１３によりビーム結合ミラー１４、１５を通じて合一化され、ビーム形成ユニット内でビームの特性が変更される。
光ファイバ１１に通されたビームは、移動式のコリメーション光学系１２および１３によりビーム結合ミラー１４、１５を通じて合一化され、ビーム形成ユニット内でビームの特性が変更される。
コリメータ１２、１３は、光源モジュール２から走査モジュール３へ送られるビームが無限大光路にコリメートされるように作用する。これはそれぞれ、（図には描かれていない）中央制御ユニットの制御下のもと光軸に沿って移動することでフォーカシング機能を発揮する個別レンズで行うのが有利である。コリメータ１２、１３とそれぞれの光ファイバ末端との距離は変更可能なようになっている。
ビーム形成ユニットについては、後にさらに詳しく説明するが、これはビーム結合ミラー１４、１５の後方に位置する回転対称なガウス型プロフィールのレーザビームから、もはや回転対称でない、長方形型照明フィールドの形成に適した横断面を持つ線形ビームを生成する。
線形ビームとも言われるこの照明光は励起光として用いられ、メインカラースプリッタ１７を通じてスキャナ１８に誘導される。メインカラースプリッタについては後ほど詳しく述べるので、ここでは顕微鏡モジュール4から戻ってきた試料光を励起光から分離させる機能を持つことだけを指摘しておく。
スキャナ１８は線形ビームを１軸または２軸方向に偏向させるので、ビームは走査対物レンズ１９および顕微鏡モジュール４の鏡筒レンズ、対物レンズを通って、プレパラートまたは試料内にある焦点２２に集束する。その場合光学結像は、試料が励起光により焦点で照明されるように行なわれる。
線形フォーカスで励起されたこのような蛍光ビームは、顕微鏡モジュール４の対物レンズ、鏡筒レンズおよび走査対物レンズ１９を通ってスキャナ１８に戻るので、スキャナ１８に向かっての戻り過程の方向では再び定常ビームになっている。したがって、スキャナ18は蛍光ビームをデスキャンするとも言われる。
メインカラースプリッタ１７は、励起光とは別な波長領域にある蛍光ビームを通すことができるので、蛍光ビームは、検出モジュール５の転向ミラー２４で転向させた後分析することができる。検出モジュール５は、図１の実施態様では複数のスペクトルチャネルを有している。すなわち、転向ミラー２４の方から来た蛍光ビームは、サブカラースプリッタ２５により２つのスペクトルチャネルに分割される。
各スペクトルチャネルは、試料２３に対して共焦点結合あるいは部分共焦点結合を実現するスリット絞り２６を有しており、その大きさがビームの検出を可能にする焦点深度を決定する。したがって、スリット絞り２６の幾何学構造は、蛍光ビームの検出がなされる（厚みのある）プレパラート内の切断面を決定づける。
スリット絞り２６の後方には、更に、検出モジュール５に到達した歓迎されざる励起光をブロックするためのブロックフィルタ２７が配置されている。特定深度の切断面に由来する、このように分離され扇形に広がった線形ビームは、次に然るべき検出器２８によって分析される。上記のカラーチャネルと同様に、スリット絞り２６ａ、ブロックフィルタ２７ａおよび検出器２８ａを持つ第２スペクトル検出チャネルも構成されている。
検出モジュール５における共焦点スリット開口の使用はモデル例に過ぎない。もちろん、単点型スキャナの実現も可能である。その場合は、スリット絞り２６、２６ａはホール型絞りに代えられ、ビーム形成ユニットは省くことができる。因みに、そのような構造様式にはすべての光学系が回転対称に構成される。もちろん、単点式の走査および検出に代えて、後に図３および４を手掛かりに改めて説明する点雲形式またはニポーディスク形式のコンセプトなど、原則として任意の多点型装置を使用することもできる。ただし、スキャナの通過時には複数の試料点が平行して捕捉されるので、検出器２８はスポット分解能を有していることが重要である。
図１から分かるように、可動式、すなわち移動可能なコリメータ１２および１３の後方にあるガウス光線束は、ビーム結合ミラー１４、１５形式のステップ型ミラーを通じて合一化され、続いて、図示された共焦点スリット絞り付き構造様式の場合は、長方形の横断面を持つ光線束に変換される。図1の実施例では、ビーム形成ユニット内には円筒型テレスコープ３７が使用されていて、その後ろには非球面ユニット３８、さらに円筒型光学系３９が配置されている。
ビーム変形後は、ビームはプロフィール平面に、ほぼ長方形のフィールドを照らし出す。その場合、フィールドの長軸に沿った強度分布はガウス形ではなくボックス形である。
非球面ユニット３８を持つ照明装置は、鏡筒レンズと対物レンズ間にあるひとみを均一充填させるのに用いられる。それによって、対物レンズの光学分解能を完全に発揮させることができる。したがって、このバリエーション法は、単点走査式または多点走査式の顕微鏡システム、例えば、ライン走査システムにも有用である（後者の場合、当該軸に加えそれ以外にも、試料上または試料中にフォーカシングされる）。
例えば、線形に整えられた励起光がメインカラースプリッタ１７の方向に偏向される。当カラースプリッタは、好ましい実施態様では、分割ミラーとして、つまり本発明でもその内容を包括的に取り入れているＤＥ １０２５７２３７ Ａ１記載のスペクトル中性な分割ミラーとして形成されている。したがって、「カラースプリッタ」の概念には非スペクトル的に作用する分割システムの意が含まれている。記述のスペクトル非依存型カラースプリッタの代わりに、均一型中性スプリッタ（例えば、５０／５０、７０／３０、８０／２０タイプなど）またはダイクロイックスプリッタを使用することができる。それにより、適用別に選択することが可能になるので、メインカラースプリッタとしては、交換可能な個別スプリッタを含む、例えば、然るべきスプリッタ切換ダイヤルにより簡易交換のできる機構の備わっているのが好ましい。
例えば、反射、ストークス/反ストークスラマン分光法、高次数のコヒーレントラマンプロセスや、第２高調波発生、第３高調波発生、和周波混合発生などの一般的パラメトリック非線光学プロセス、２光子、多光子吸収および蛍光におけるコヒーレントビーム、すなわち特に方向づけられたビームを検出すべき場合はダイクロイックメインカラースプリッタが有利である。これらの方法のうち、非線光学分光法のいくつかは、コリニヤ重畳をなす２つまたはそれ以上のレーザビームの使用を必要とする。この場合、図示されているような複数レーザビームの結合が特に有利であると実証されている。原則的には、蛍光顕微鏡検査で広く普及しているダイクロイックビームスプリッタであれば使用可能である。また、ラマン顕微鏡検査には、レイリー散乱成分の抑制のため、検出器の前にホログラフィックノッチ・スプリッタまたはフィルタを設置するのが有利である。
図１の実施態様では、励起光または照明光はモータ制御式ズーム光学系４１を通じてスキャナ１８に送り込まれる。ズーム倍率は当方式で適合化させることができ、走査される視野は特定の調整領域内で連続的に変更することができる。ズーム光学系としては、連続的同調過程における焦点位置および結像倍率の適合化の間、ひとみ位置が維持されたままであるようなタイプが特に有利である。
図１に矢印で示されたモータによるズーム光学系４１の自由移動度は、結像倍率、焦点位置、ひとみ位置の３つのパラメータの適合化に想定されている自由度の数値に精確に一致している。その出力側のひとみに固定式絞り４２の配置されたズーム光学系４１が特に好ましい。絞り４２を実地で簡単に実現するには、スキャナ１８の鏡面幅の制限によって構成することもできる。ズーム光学系４１を持つ出力側絞り４２により、ズーム倍率の設定如何に拘わらず常に一定したひとみ直径を走査対物レンズ１９上に結像させることが可能になる。このように、ズーム光学系４１を任意に設定した場合でも対物レンズのひとみは依然として完全に照らし出されたままである。スキャナ１８の領域での願わしくない散乱光発生事態の阻止には独自型絞り４２の使用が好ましい。
図１に矢印で示されたモータによるズーム光学系４１の自由移動度は、結像倍率、焦点位置、ひとみ位置の３つのパラメータの適合化に想定されている自由度の数値に精確に一致している。その出力側のひとみに固定式絞り４２の配置されたズーム光学系４１が特に好ましい。絞り４２を実地で簡単に実現するには、スキャナ１８の鏡面幅の制限によって構成することもできる。ズーム光学系４１を持つ出力側絞り４２により、ズーム倍率の設定如何に拘わらず常に一定したひとみ直径を走査対物レンズ１９上に結像させることが可能になる。このように、ズーム光学系４１を任意に設定した場合でも対物レンズのひとみは依然として完全に照らし出されたままである。スキャナ１８の領域での願わしくない散乱光発生事態の阻止には独自型絞り４２の使用が好ましい。
ズーム光学系４１と共同作用をする円筒型テレスコープ３７は、同じくモータ作動式であり、非球面ユニット３８の前に配置されている。図２の実施態様ではコンパクト構造の理由からこれが選ばれているが、そのようにする必要はない。
ズーム倍率１．０未満が望まれる場合、円筒型テレスコープ３７は自動的に光学光路内に旋回挿入される。これは、ズーム対物レンズ４１が縮小された場合に開口絞り４２への照明が不完全になるのを防止する。したがって、旋回挿入の可能なこの円筒型テレスコープ３７により、ズーム倍率１未満の場合でも、すなわちズーム対物レンズ４１の設定の如何に拘わらず、対物レンズひとみの位置では常に一定長の照明光線の到達が保証される。それにより、単式視野ズームに比較して、照明光におけるレーザ出力損失が避けられる。
円筒型テレスコープ３７の旋回挿入時には照明光線による画像明度の急変が避けられないので、画像明度を一定に保つため、（図には描かれていない）制御ユニットでは、円筒型テレスコープ３７が作動している場合、スキャナ１８の送出し速度または検出モジュール５における検出器の増幅係数がそれ相応に適合するような設計がなされている。
図１のレーザ走査型顕微鏡では、モータ作動式ズーム光学系４１およびモータにより操作切換可能な円筒型テレスコープ３７のほか、検出モジュール５でも遠隔制御可能な調整素子が設置されている。例えば、色波長誤差の補正のため、スリット絞りの前に丸型光学系４４と円筒型光学系３９が、検出器２８の直前に円筒型光学系３９が設置されており、それらはモータによりそれぞれ軸方向に移動できるようになっている。
加えて、補償のため補正ユニット４０が配備されているが、それについては以下に簡単に説明する。
スリット絞り２６は、前方配置の丸型光学系４４、同様に前方配置の第１円筒型光学系３９および後方配置の第２円筒型光学系と共に検出システム５のピンホール対物レンズを形成するが、この場合のピンホールはスリット絞り２６によって実現される。システム内で反射した励起光の意図しない検出を避けるため、第２円筒型レンズ３９の前にはブロックフィルタ２７も設置されており、これは求める蛍光ビームだけを検出器２８、２８ａに到達させるべく、それに適したスペクトル特性を有している。
カラースプリッタ２５またはブロックフィルタ２７を取り換えて旋回挿入した場合、幾分かの傾斜誤差または楔角誤差が発生するのは避けられない。カラースプリッタは試料領域とスリット絞り２６間の誤差を、ブロックフィルタ２７はスリット絞り２６と検出器２８間の誤差を持ち込む可能性がある。その場合に、スリット絞り２６または検出器２８の新たな位置調整が必要になることがないように、丸型光学系４４とスリット絞り２６の間に、すなわち試料と検出器２８間の結像光路内に、コントローラの制御下で様々な傾斜位置に設定することのできるオプチカルフラットのプレート４０が配置されている。オプチカルフラットのプレート４０は、その目的のために然るべきホルダ内に位置調整可能なように設置されている。
図２は、ズーム光学系４１を利用すれば提供された最大限の視野ＳＦ内で如何にしてＲＯＩ（観察対象領域）が選択できるかを示している。例えば、共鳴スキャナの場合では必ず必要なことであるが、振幅に変化が起きないようにスキャナ１８を持続的に制御すれば、ズーム光学系においてセットされた１．０以上の倍率により走査フィールドＳＦの光軸を中心として選択されるＲＯＩ領域が狭められる。
共鳴スキャナに関しては、例えばPawley著“Handbook of Biological Confocal Microscopy”Plenum Press社1994年刊、461ページ以降に記述されている。スキャナがフィールドを、光軸に対し、すなわち走査ミラーの定常位置に対し非対称に走査するように、スキャナの制御を行えば、ズーム作用との関連性から選定ROI領域の補正移動ＯＦが得られる。既に触れたスキャナ１８のでスキャン作用およびズーム光学系４１の再通過により、検出器方向への検出光路における観察対象領域ＲＯＩの選択が改めて中断される。それにより、走査画像ＳＦ内のＲＯＩ領域に対し任意の選択が可能になる。様々なＲＯＩ領域の選択毎に画像を追加獲得することができ、それらを高分解性画像に合成することができる。
共鳴スキャナに関しては、例えばPawley著“Handbook of Biological Confocal Microscopy”Plenum Press社1994年刊、461ページ以降に記述されている。スキャナがフィールドを、光軸に対し、すなわち走査ミラーの定常位置に対し非対称に走査するように、スキャナの制御を行えば、ズーム作用との関連性から選定ROI領域の補正移動ＯＦが得られる。既に触れたスキャナ１８のでスキャン作用およびズーム光学系４１の再通過により、検出器方向への検出光路における観察対象領域ＲＯＩの選択が改めて中断される。それにより、走査画像ＳＦ内のＲＯＩ領域に対し任意の選択が可能になる。様々なＲＯＩ領域の選択毎に画像を追加獲得することができ、それらを高分解性画像に合成することができる。
選択ＲＯＩ領域を光軸に対する補正分ＯＦだけ移動させるのでなく、それに加えて回転もさせたい場合は、メインカラースプリッタ１７と試料２３間の光路のひとみに、周知のとおり画像フィールドに対して回転作用のあるアッベ・ケーニッヒプリズムを配置した実施態様が目的に適っている。この場合も検出器方向で作業の中断を行う。それにより、様々な補正シフトＯＦおよび様々な回転角を持つ画像が測定でき、続いて、例えば文献 “Three-dimensional and multidimensional microscopy ; Image acquisition processing ＶII” Proceedings of SPIE第3919巻（2000年）、141〜150ページのGustafsson, M.著“Doubling the lateral resolution of wide-field fluorescence microscopy using structured illumination”に記載されているようなアルゴリズムに従って高分解性のある画像に修正することができる。
図３は、ニポーディスク方式を実現するレーザ走査型顕微鏡１として考えられる別な構造様式を示している。図３では極端に簡略描画されている光源モジュールが、ミニレンズアレー６５からメインカラースプリッタ１７を通過して、例えば、ＵＳ ６，０２８，３０６、ＷＯ ８８ ０７６９５またはＤＥ ２３６０１９７ Ａ１に記載されているようなニポーディスク６４を照明する。ミニレンズアレー６５を通じて照明されたニポーディスクのピンホールは顕微鏡モジュール４内の試料に結像する。ここでも試料側の画像サイズを変更できるように、ズーム光学系４１が設置されている。
ニポースキャナの場合、図１の構造様式からは変更部分があり、照明はメインカラースプリッタ１７を通過させて行われ、検出光は反射分離される。さらに、ニポーディスク64による多点照明の場合では、それに対応した平行な走査が行われるように、図２に変更を加えて検出器２８はスポット分解能を持つように作られている。そのほか、ニポーディスク６４とズーム光学系４１の間には、ニポーディスク６４のピンホールを通り抜ける発散光を適当な束直径に変換させる、正の屈折力を持った然るべき固定型光学系６３が配置されている。メインカラースプリッタ１７は、図３のニポー式構造の場合では旧来型のダイクロイックビームスプリッタであり、したがってスリット状または点状の反射領域を持つ上記ビームスプリッタではない。
ズーム光学系４１は上段で説明した構造様式に対応しているが、この場合はニポーディスク６４があるため、もちろんスキャナ１８は不要になる。しかし、図２を基に説明したＲＯＩ領域の選択を行いたい場合は、これを設置することができる。同じことがアッベ・ケーニッヒプリズムについても言える。
多点走査による別法が模式図として図４に示されているが、その方法では複数の光源がスキャナのひとみに対して斜めに照射される。この場合でもメインカラースプリッタ１７とスキャナ１８巻での結像にズーム光学系４１を使用することにより、図２に描かれたようなズーム機能を実現することができる。ひとみに共役な平面に様々な角度から光線束を同時入射することにより、光点が対象物平面に共役な平面に形成され、それがスキャナ１８により同時に対象物フィールド全体のうちの一部領域上に誘導される。スポット分解性のあるマトリックス検出器２８では部分画像全体の評価を通して画像情報が生成される。
その他の実施態様としては、ＵＳ ６ ０２８ ３０６に記載されているような多点走査があるが、その開示内容の中で関連事項は本発明に包括的に取り入れられている。ここでもスポット分解性のある検出器２８を設置することができる。その場合では試料は多点光源によって照明されるが、それは、多点光源が実現されるようにマルチ開口プレートを照明する、マイクロレンズアレーの後続配置されたビームエキスパンダによってなされる。
図５では後方に格子Ｇの配置された光源ＬＱ２が示されている。
これは、スプリッタＴにより蛍光励起のための光源ＬＱ１と合一化させることができる。両光源は円筒型光学系ＺＬを通じラインとして試料上に結像する。その場合、ＬＱ１は試料上/中に均一ラインを、ＬＱ２は格子Ｇの作用により周期的に変調されたラインを生成する。
これは、スプリッタＴにより蛍光励起のための光源ＬＱ１と合一化させることができる。両光源は円筒型光学系ＺＬを通じラインとして試料上に結像する。その場合、ＬＱ１は試料上/中に均一ラインを、ＬＱ２は格子Ｇの作用により周期的に変調されたラインを生成する。
MDBは照明光を検出光から切り離す。ＭＤＢはダイクロイックカラースプリッタとして、またはＤＥ １０２５７２３７に基づくストライプミラーとして形成することができる。後者の場合、ＭＤＢは顕微鏡装置のひとみ平面の近くに配置しなければならない。これは、ＬＱ１成分およびＬＱ２の零次数成分の反射取り込み用として中央に配置されたストライプミラー（y軸に沿う方向）、および格子周波数に対応してＬＱ２用に中央から離れた位置にy軸に沿って配置された２つのストライプミラーを有している。
スキャナＰ２は試料ＰＲに沿って照明光線を移動させるのに用いられる。そのほか、走査光学系ＳＯ、鏡筒レンズＴＬ、対物レンズＬが共通の光路に、ピンホール光学系ＰＯ、フィルタおよび検出器またはスリット絞りが検出光路に配置されている。
ＬＱ１およびＬＱ２は、試料照射するＬＱ１、ＬＱ２の同期化のための制御ユニットと結合している。
スキャナＰ２は試料ＰＲに沿って照明光線を移動させるのに用いられる。そのほか、走査光学系ＳＯ、鏡筒レンズＴＬ、対物レンズＬが共通の光路に、ピンホール光学系ＰＯ、フィルタおよび検出器またはスリット絞りが検出光路に配置されている。
ＬＱ１およびＬＱ２は、試料照射するＬＱ１、ＬＱ２の同期化のための制御ユニットと結合している。
図６には、振幅格子Ｇにレーザ光が透過した場合に次数‐１、０および１からの干渉フィールドが如何にして形成されるかが示されている。
この干渉性フィールドを試料へ例えば線形で結像させれば、Ｚ方向にタルボット構造（文献ではタルボット効果）が発生する。このタルボット効果はコヒーレント光が周期ｄの周期性平坦構造で回折した場合に出現する。元の構造を持つ画像が
Ｚｎ＝２ｎｄ２／λ
の間隔で現われる。この場合、構造は奇数倍ごとにオリジナル構造の周期dの丁度半分ずつシフトする（文献 : Lexikon der Optik/Spektrum Akademie刊、1999年、ベルリン）。なお、λは波長およびnはタルボット平面の整数倍を表わしている。図6の部分図a）にはいわゆるタルボット平面（xに沿う方向）が図解されている。+/-1および０の回折次数の重畳により、タルボット長atの間隔にしてちょうどｐｉ／２の構造シフトが生じる。
この干渉性フィールドを試料へ例えば線形で結像させれば、Ｚ方向にタルボット構造（文献ではタルボット効果）が発生する。このタルボット効果はコヒーレント光が周期ｄの周期性平坦構造で回折した場合に出現する。元の構造を持つ画像が
Ｚｎ＝２ｎｄ２／λ
の間隔で現われる。この場合、構造は奇数倍ごとにオリジナル構造の周期dの丁度半分ずつシフトする（文献 : Lexikon der Optik/Spektrum Akademie刊、1999年、ベルリン）。なお、λは波長およびnはタルボット平面の整数倍を表わしている。図6の部分図a）にはいわゆるタルボット平面（xに沿う方向）が図解されている。+/-1および０の回折次数の重畳により、タルボット長atの間隔にしてちょうどｐｉ／２の構造シフトが生じる。
対物レンズの深度分解能は
△ｚ＝πａ２／２λから得られる。ただし、ａは対物レンズの横方向の分解能である。格子Gの格子定数は、好ましくは、試料においてｄ＝√πa／２の周期的構造が得られるように選択する。この場合タルボット平面の間隔は顕微鏡対物レンズの深度分解能に等しい。
光源ＬＱ２は格子と組み合わせれば、蛍光過程の抑制に有用である
（文献 : S. W. HellおよびJ. Wichmann“Opt. Lett.”第19巻、780号、1994年）。
過疎分布のメカニズムとしては、例えば刺激による放出（文献 : A. Klar、M. DybaおよびS. W. Hell“Appl. Phys. Let.”第78巻第4号、393ページ、2001年）、基底準位における過疎分布化または色素の様々な放出状態/吸収状態への照準的切換が考えられる。ＬＱ１のビームは蛍光励起に用いられる。
△ｚ＝πａ２／２λから得られる。ただし、ａは対物レンズの横方向の分解能である。格子Gの格子定数は、好ましくは、試料においてｄ＝√πa／２の周期的構造が得られるように選択する。この場合タルボット平面の間隔は顕微鏡対物レンズの深度分解能に等しい。
光源ＬＱ２は格子と組み合わせれば、蛍光過程の抑制に有用である
（文献 : S. W. HellおよびJ. Wichmann“Opt. Lett.”第19巻、780号、1994年）。
過疎分布のメカニズムとしては、例えば刺激による放出（文献 : A. Klar、M. DybaおよびS. W. Hell“Appl. Phys. Let.”第78巻第4号、393ページ、2001年）、基底準位における過疎分布化または色素の様々な放出状態/吸収状態への照準的切換が考えられる。ＬＱ１のビームは蛍光励起に用いられる。
図7には、Ｘ軸に沿って試料を矢印方向に均一に照明するＬＱ１光線がＸ−Ｚ方向で描かれている。対物レンズの深度分解能は、好ましくは、タルボット平面の間隔に等しく設定される。格子によって生成されたビーム１（ＬＱ２光源）の照明模様により、黒塗り部（格子分布）の領域では色素分子の蛍光活性が抑制される。
刺激放出の場合、これは黒塗りストライプ領域における刺激的放出を手段とする色素分子の照準的鎮静化によって行われる。そのようにして、比較的高い蛍光強度を持つ領域（非鎮静化領域）と低い蛍光強度を持つ領域（鎮静化領域）が生じる。強度の高い領域を検出することにより撮像分解能を高めることができる。そのためには、光源ＬＱ１およびＬＱ２はパルス化するのが有利である。ＬＱ１からのパルスによって先ず色素が励起される。蛍光の寿命（ナノ秒領域）が続いている間は、ＬＱ２の光分配により蛍光分子の鎮静化が行われる。その後、励起された残留蛍光分子の自然放出により蛍光光子の検出が行われる。それに続き、改めてＬＱ１のパルスにより新たなサイクルで均一に励起することができる。
刺激放出の場合、これは黒塗りストライプ領域における刺激的放出を手段とする色素分子の照準的鎮静化によって行われる。そのようにして、比較的高い蛍光強度を持つ領域（非鎮静化領域）と低い蛍光強度を持つ領域（鎮静化領域）が生じる。強度の高い領域を検出することにより撮像分解能を高めることができる。そのためには、光源ＬＱ１およびＬＱ２はパルス化するのが有利である。ＬＱ１からのパルスによって先ず色素が励起される。蛍光の寿命（ナノ秒領域）が続いている間は、ＬＱ２の光分配により蛍光分子の鎮静化が行われる。その後、励起された残留蛍光分子の自然放出により蛍光光子の検出が行われる。それに続き、改めてＬＱ１のパルスにより新たなサイクルで均一に励起することができる。
基底準位における過疎分布化または色素の切換の場合、色素分子における蛍光活性の抑制は、基底準位での照準的過疎分布化または黒のストライプ領域での色素の放出特性および/または吸収特性の局部的変更によって行なわれる。それにより、ＬＱ１のビームによっては全く蛍光励起し得ない領域が発生する。ＬＱ１による励起が可能な残りの領域で生成された蛍光を検出することによって撮像分解能を高めることができる。この目的には、光源ＬＱ１およびＬＱ２にパルスを与える必要はない。色素は、基底準位の過疎分布状態においてＬＱ２の照明構造により照明されるが、それは基底状態における三重項集合（系内クロス）によってはもはや色素分子が供給されなくなるまで行われる。三重項準位の寿命期間（１／１０秒領域）内に、予め照射されていない領域の蛍光分子に対してＬＱ１の光分布により励起が行われる。蛍光光子の検出は、予め照射されていない領域の自然放出により行われる。
ＬＱ２の照明構造による色素特性の切換では、色素はすべての色素分子がＬＱ２の照明構造の領域内で「ダーク」に切り換るまで照明される。続いて、この変更特性を持つ色素が存在する期間内に、予め照射されていない領域の蛍光分子がＬＱ１の光分配により励起され、自然放出によって生成された蛍光光子が検出される。
共焦点絞りとしてのスリット絞りの作用により、その上、対物レンズの深度分解単位をｄ（タルボット平面の間隔）以下の範囲に縮小させることができる。そのほか、現状技術レベルのＳＰＥＭ法を使用することもできる（文献 : “Saturated patterned excitation microscopy”J. Opt. Soc. Am. A.第19巻第8号、2002年）。
ここに提案した配置では、有利なことに、格子を通してのコヒーレントな照明によって軸方向と横方向とで同時に構造化されるのが認められた。このようにして、分解能強化のための方法が非常に簡単に、耐久性よく、効率的に実施することが可能である。横方向と軸方向の同時構造化は、少なくとも１軸で平坦な３つの波の干渉重畳（次数‐１、０および＋１）によって行われる。３次数の生成は様々な方法で、例えば平面波を持つ振幅格子の照射によって行うことができる。そのほか、特殊なビームスプリッタを使用することもできる（文献 : “High efficiency beam splitter for multifocal multiphoton microscopy”、J. of Microscopy、第201号第3部、2001年、1ページ）。その場合では３次数だけが生成されて使用される。
本発明は、迅速作業性のある共焦点レーザ走査型顕微鏡の適用可能性を大幅に拡大するものである。このような改良開発の重要性は、細胞生物学的に関する標準文献およびそこに記述されている細胞、副細胞の迅速な変化過程1、さらには多数の色素を用いた検査方法2を手掛かりに読み取ることができる。
例えば下記の文献が参考になる :
1 B. Alberts他著（2002年）: Molecular Biology of the Cell ; Garland Science刊
1,2 G. Karp著（2002年）: Cell and Molecular Biology ; Concepts and Experiments ; Wiley Text Books刊
1,2 R. Yuste他著（2000年）: Imaging neurons _ a laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press刊、 ニューヨーク
2 R.P. Haugland著（2003年）: Handbook of fluorescent Probes and research Products第10版 ; Molecular Probes Inc. and Molecular Probes Europe BV刊
例えば下記の文献が参考になる :
1 B. Alberts他著（2002年）: Molecular Biology of the Cell ; Garland Science刊
1,2 G. Karp著（2002年）: Cell and Molecular Biology ; Concepts and Experiments ; Wiley Text Books刊
1,2 R. Yuste他著（2000年）: Imaging neurons _ a laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press刊、 ニューヨーク
2 R.P. Haugland著（2003年）: Handbook of fluorescent Probes and research Products第10版 ; Molecular Probes Inc. and Molecular Probes Europe BV刊
本発明は次のプロセスおよび変遷にとって非常に重要な意味を持っている :
有機体の生育
記述の本発明は、なかでも１／１０秒から時間レベルまでのダイナミックな変遷を特徴とする生育過程の研究に適している。ここでは細胞結合面および有機体全体への適用例について記述する :
・ Abdul-Karin、M. A.他は2003年“Microvasc. Res.”第66巻、113〜125ページに動物生体における血管の変化に関する長期分析結果を記録した。その場合、蛍光画像は数日間隔で撮影された。運動の定角軌道を模式的に描くために、3次元のデータ記録が適合アルゴリズムで評価されている。
・ Soll、D. R.他は2003年“Scientic World Journ.”第3巻827〜841ページに3次元空間全体における生体細胞の核および偽足に関する顕微鏡データのソフトウェアベースによる運動分析について記述している。
・ Grossmann, R他は2002年“Glia”第37巻229〜240ページにラットの微小神経膠細胞における運動の3次元分析について記述している。そのデータは10時間以上に亘って記録されたものである。神経膠細胞にはトラウマ性傷害の後に同時に迅速反応が発現するので、高いデータ収得率およびそれ相応のデータ量が得られる。
これに関しては特に次のことが重要なポイントである :
・ その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので３次元ROI照明から保護されねばならない３次元領域での生細胞の分析
・ 例えば、FRET実験などにおいて、３次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば、３次元FRAP、FLIP実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にROI外の観察も必要なマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば３次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えば、paGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えば、コンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばCFP、GFP、YFP、DsRed、HcRedなど可変性多重マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 機能に依存して変色する、例えば、Ca+マーカーなどでマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 生育に起因して変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、例えばＧＦＰによる形質転換動物
・ 例えば、paGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・ 最終項目とそれ以前の項目との組み合せ
有機体の生育
記述の本発明は、なかでも１／１０秒から時間レベルまでのダイナミックな変遷を特徴とする生育過程の研究に適している。ここでは細胞結合面および有機体全体への適用例について記述する :
・ Abdul-Karin、M. A.他は2003年“Microvasc. Res.”第66巻、113〜125ページに動物生体における血管の変化に関する長期分析結果を記録した。その場合、蛍光画像は数日間隔で撮影された。運動の定角軌道を模式的に描くために、3次元のデータ記録が適合アルゴリズムで評価されている。
・ Soll、D. R.他は2003年“Scientic World Journ.”第3巻827〜841ページに3次元空間全体における生体細胞の核および偽足に関する顕微鏡データのソフトウェアベースによる運動分析について記述している。
・ Grossmann, R他は2002年“Glia”第37巻229〜240ページにラットの微小神経膠細胞における運動の3次元分析について記述している。そのデータは10時間以上に亘って記録されたものである。神経膠細胞にはトラウマ性傷害の後に同時に迅速反応が発現するので、高いデータ収得率およびそれ相応のデータ量が得られる。
これに関しては特に次のことが重要なポイントである :
・ その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので３次元ROI照明から保護されねばならない３次元領域での生細胞の分析
・ 例えば、FRET実験などにおいて、３次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば、３次元FRAP、FLIP実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にROI外の観察も必要なマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば３次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えば、paGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えば、コンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばCFP、GFP、YFP、DsRed、HcRedなど可変性多重マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 機能に依存して変色する、例えば、Ca+マーカーなどでマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 生育に起因して変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、例えばＧＦＰによる形質転換動物
・ 例えば、paGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・ 最終項目とそれ以前の項目との組み合せ
細胞内の運搬過程
記述の本発明は細胞内運搬過程の研究にはこの上なく適している。この場合では正しく非常に微小な運動構造体、例えば、タンパク質を高速度で（殆どが１／１００秒の領域）描写しなければならないからである。複雑な運搬過程のダイナミックスを捕捉するためには、ＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＡＰもしばしば適用される。そのような研究例として、ここでは以下のものを挙げておく :
記述の本発明は細胞内運搬過程の研究にはこの上なく適している。この場合では正しく非常に微小な運動構造体、例えば、タンパク質を高速度で（殆どが１／１００秒の領域）描写しなければならないからである。複雑な運搬過程のダイナミックスを捕捉するためには、ＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＡＰもしばしば適用される。そのような研究例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・ Umenishi, F.他が2000年“Biophys J.”第78巻1024〜1035ページに、GFP変換された培養細胞におけるアクアポリンの空間運動性についての分析結果を記述している。その場合、細胞膜の照準点を局部ブリーチングして、周辺における蛍光拡散の分析を行っている。
・ Gimpl, G.他が2002年“Prog. Brain Res.”第139巻43〜55ページに、ROIブリーチングによる実験、運動性分析のための蛍光撮像およびGFPマーキングされたオキシトシン受容体の線維芽細胞内での分布について記述している。その場合、空間位置設定、分解能およびブリーチングと撮像との直接的な時間的連続性に関して高い要求が課されている。
・ Zhang他が2001年“Neuron”第31巻261〜275ページに、GFP変換された神経細胞における生細胞の撮像について記述している。その場合、顆粒の運動がブリーチングと蛍光撮像との組み合せにより分析された。神経細胞のダイナミックスに起因して、撮像速度には高い要求が課される。
・ Gimpl, G.他が2002年“Prog. Brain Res.”第139巻43〜55ページに、ROIブリーチングによる実験、運動性分析のための蛍光撮像およびGFPマーキングされたオキシトシン受容体の線維芽細胞内での分布について記述している。その場合、空間位置設定、分解能およびブリーチングと撮像との直接的な時間的連続性に関して高い要求が課されている。
・ Zhang他が2001年“Neuron”第31巻261〜275ページに、GFP変換された神経細胞における生細胞の撮像について記述している。その場合、顆粒の運動がブリーチングと蛍光撮像との組み合せにより分析された。神経細胞のダイナミックスに起因して、撮像速度には高い要求が課される。
分子間の相互作用
記述の本発明は、特に分子間およびその他副細胞間の相互作用の描写に適している。これらの場合では非常に微小な構造が高速度（１／１００秒レベル）で描出されねばならない。相互作用に必要な分子の空間ポジションの解明には、例えばＲＯＩブリーチングを伴うFRETなどの間接的な技術を使用することもできる。適用される例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・ Petersen, M. A.およびDalley, M. E.が2004年“Glia”第46巻195〜206ページに、ラット海馬角の培養における2チャネル撮影について記述している。この場合は、マーカーとしてのレクチンとシトックスについて3次元空間において長時間に亘り2チャネルで記録される。
・ Yamamoto, N.他が2003年“Clin. Exp. Metastasis”第20巻633〜638ページに、ヒトの線維肉腫細胞の2色撮影について記述している。この場合では緑色と赤色の蛍光タンパク質（GFPおよびRFP）が同時にリアルタイムで観察された。
・ Bertera, S.他が2003年“Biotechniques”第35巻718〜722ページに、合成後色が緑から赤に変化するタイムレポータプロテインによってマーキングされた転換マウスのマルチカラー撮影について記述している。撮像は生体動物の組織内3次元空間で迅速シリーズとして行われる。
記述の本発明は、特に分子間およびその他副細胞間の相互作用の描写に適している。これらの場合では非常に微小な構造が高速度（１／１００秒レベル）で描出されねばならない。相互作用に必要な分子の空間ポジションの解明には、例えばＲＯＩブリーチングを伴うFRETなどの間接的な技術を使用することもできる。適用される例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・ Petersen, M. A.およびDalley, M. E.が2004年“Glia”第46巻195〜206ページに、ラット海馬角の培養における2チャネル撮影について記述している。この場合は、マーカーとしてのレクチンとシトックスについて3次元空間において長時間に亘り2チャネルで記録される。
・ Yamamoto, N.他が2003年“Clin. Exp. Metastasis”第20巻633〜638ページに、ヒトの線維肉腫細胞の2色撮影について記述している。この場合では緑色と赤色の蛍光タンパク質（GFPおよびRFP）が同時にリアルタイムで観察された。
・ Bertera, S.他が2003年“Biotechniques”第35巻718〜722ページに、合成後色が緑から赤に変化するタイムレポータプロテインによってマーキングされた転換マウスのマルチカラー撮影について記述している。撮像は生体動物の組織内3次元空間で迅速シリーズとして行われる。
細胞間の信号伝達
記述の本発明は、殆どが極端に迅速になる信号伝達過程の研究には他に抜きん出て適している。殆どが神経生理学に関するこの過程では経時的分解能に最大限の要求が課される。それは、イオンによって媒介される活動が１／１００秒から１／１０００秒以下の範囲で起こるからである。筋肉系または神経系の検査への適用例として、ここでは次のものを挙げておく :
・ Brum G他が2000年“J Physiol”第528巻419〜433ページに、伝達物質としてのカフェインによる刺激後のカエルの筋肉細胞における迅速なCa+活動の位置確認について記述している。この位置確認およびマイクロメータ単位の精度を持つ分解能は、迅速型の共焦点顕微鏡の使用下でないと達成されない。
・ Schmidt H他が2003年“J Physiol”第551巻13〜32ページに、転換マウスの神経細胞突起におけるCa+イオンの分析について記述している。変化するCa+に結合するタンパク質による、マウス内での迅速なCa+変化状況についての研究は、高分解能を持つ共焦点顕微鏡により初めて行うことができた。それは、神経細胞内におけるCa+活動の位置確認およびその精確な経時的動力学が重要な役割を果たしているからである。
記述の本発明は、殆どが極端に迅速になる信号伝達過程の研究には他に抜きん出て適している。殆どが神経生理学に関するこの過程では経時的分解能に最大限の要求が課される。それは、イオンによって媒介される活動が１／１００秒から１／１０００秒以下の範囲で起こるからである。筋肉系または神経系の検査への適用例として、ここでは次のものを挙げておく :
・ Brum G他が2000年“J Physiol”第528巻419〜433ページに、伝達物質としてのカフェインによる刺激後のカエルの筋肉細胞における迅速なCa+活動の位置確認について記述している。この位置確認およびマイクロメータ単位の精度を持つ分解能は、迅速型の共焦点顕微鏡の使用下でないと達成されない。
・ Schmidt H他が2003年“J Physiol”第551巻13〜32ページに、転換マウスの神経細胞突起におけるCa+イオンの分析について記述している。変化するCa+に結合するタンパク質による、マウス内での迅速なCa+変化状況についての研究は、高分解能を持つ共焦点顕微鏡により初めて行うことができた。それは、神経細胞内におけるCa+活動の位置確認およびその精確な経時的動力学が重要な役割を果たしているからである。
１ レーザ走査型顕微鏡
２ 光源モジュール
３ 走査モジュール
４ 顕微鏡モジュール
５ 検出モジュール
６，７ レーザ
８ 光バルブ
９ 減衰器
１０ 結合ポイント
１１ 光ファイバ
１２、１３ コリメーション光学系
１４，１５ ビーム結合ミラー
１７ メインカラースプリッタ
１８ スキャナ
１９ 走査対物レンズ
２２ 焦点
２３ 試料
２４ 転向ミラー
２５ サブカラースプリッタ
２６ スリット絞り
２７ ブロックフィルタ
２８ 検出器
３７ 円筒形テレスコープ
３８ 非球面ユニット
３９ 円筒形光学系
４０ 補正ユニット
４１ ズーム光学系
４２ 固定式絞り
４４ 丸型光学系
ＳＦ 視野
ＬＱ 光源
ＺＬ 円筒型光学系
Ｇ 振幅格子
Ｐ２ スキャナ
ＳＯ 走査光学系
ＴＬ 鏡筒レンズ
Ｌ レンズ
ＰＯ ピンホール光学系
２ 光源モジュール
３ 走査モジュール
４ 顕微鏡モジュール
５ 検出モジュール
６，７ レーザ
８ 光バルブ
９ 減衰器
１０ 結合ポイント
１１ 光ファイバ
１２、１３ コリメーション光学系
１４，１５ ビーム結合ミラー
１７ メインカラースプリッタ
１８ スキャナ
１９ 走査対物レンズ
２２ 焦点
２３ 試料
２４ 転向ミラー
２５ サブカラースプリッタ
２６ スリット絞り
２７ ブロックフィルタ
２８ 検出器
３７ 円筒形テレスコープ
３８ 非球面ユニット
３９ 円筒形光学系
４０ 補正ユニット
４１ ズーム光学系
４２ 固定式絞り
４４ 丸型光学系
ＳＦ 視野
ＬＱ 光源
ＺＬ 円筒型光学系
Ｇ 振幅格子
Ｐ２ スキャナ
ＳＯ 走査光学系
ＴＬ 鏡筒レンズ
Ｌ レンズ
ＰＯ ピンホール光学系
Claims (21)
- 試料が、第１および第２の照明光によって照明され、その場合、第１照明光が試料の励起を誘起し、第２照明光が試料内で照射横方向および照射軸方向に空間的な周期性構造を有し、該第２照明光が試料内で少なくとも３つのコヒーレント・ビームの干渉によって生成される、ライン走査式のレーザ走査型顕微鏡。
- 第１および第２のレーザ光パターンが、試料で立体的に重なり合い、試料内第２照明光の領域内で励起状態の切換がなされる、請求項１に記載の顕微鏡。
- 第１および第２の照明光がレーザビームである、請求項１又は２に記載の顕微鏡。
- 第１および第２の照明光が共同で試料に沿って動かされる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
- 照明が、試料に対してライン状になされる、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
- 第２照明光の構造が、複数の回折次数のコヒーレント重畳により干渉模様として生成される、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
- 回折次数が、格子にて生成される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
- タルボット格子効果が生成される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の顕微鏡。
- 顕微鏡対物レンズの深度分解能が、タルボットラインの間隔領域内にある、請求項１乃至８のいずれか１項の１つに記載の顕微鏡。
- 少なくとも１つの照明光がパルスレーザである、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の顕微鏡。
- 請求項１乃至１０のいずれか１項に記載された顕微鏡の動作方法であって、試料内で過疎分布化及び励起が交互に行われるように該顕微鏡が動作される、方法。
- 過疎分布化の後に励起が行われる、請求項１１に記載の方法。
- 励起後に過疎分布化が行われる、請求項１１に記載の方法。
- 第１、第２照明光の生成のために２つのパルスレーザが同期化されて、試料内で励起と過疎分布化が交互に行われる、請求項１１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
- 光学分解能が周期的構造の周波数の変更によって調整できる、請求項１１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
- 顕微鏡対物レンズの交換時に、第２照明光の構造形成装置が交換される、請求項１１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
- 第２照明光内の格子が交換される、請求項１１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
- 生育過程の研究のための方法であって、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載された顕微鏡を用いて細胞群および有機体全体のレベルにおいて１／１０秒から時間単位までのダイナミックなプロセスを研究することを含む方法。
- 細胞内運搬過程の研究のための方法であって、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載された顕微鏡を用いて微小な運動構造体を高速度で描写することを含む方法。
- 分子および細胞内の相互作用の描写のための方法であって、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載された顕微鏡を用いて非常に微小な構造を高速度で描写することを含む方法。
- 迅速な信号伝達過程の表現のための方法であって、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載された顕微鏡を用いて筋肉系または神経系における高い経時的分解能による神経生理学過程を表現することを含む方法。
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