JP2006031008A

JP2006031008A - 光走査型顕微鏡による対象物の画像捕捉のための方法

Info

Publication number: JP2006031008A
Application number: JP2005205005A
Authority: JP
Inventors: Ralf Wolleschensky; ヴォレシェンスキーラルフ; Frank Hecht; へクトフランク; Ralf Engelmann; エンゲルマンラルフ
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 2004-07-16
Filing date: 2005-07-13
Publication date: 2006-02-02
Also published as: DE102004034963A1; EP1617375A1; US20080048105A1; US20060011861A1

Abstract

【課題】光走査型顕微鏡による対象物の画像捕捉のための方法
【解決手段】試料画像の生成のため走査ステップで試料２３の走査が行われる、少なくとも２つの走査ステップ間の距離が変更でき調整可能である、および少なくとも１つの第２試料走査が行われ、その場合走査方向に対する走査ステップの位置がシフトされる、好ましくも、試料に対してライン走査が行われる方法。
【選択図】図１

Description

以下では図面を参照しながら本発明をさらに詳しく説明する。

図１は主要部が５つのコンポーネント、すなわち、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール２、励起光をコリメートして試料上の走査のため然るべき偏向を行なう走査モジュール３、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュール４および試料からの光線を受け止め検出する検出モジュール５から成るレーザ走査型顕微鏡１の模式図である。その場合検出モジュール５は、図１に描かれているように、スペクトル別のマルチチャネル型に構成することができる。

点状走査式のレーザ走査型顕微鏡に関する一般事項についてはＤＥ１９７０２７５３Ａ１が参考になり、したがってその内容は本明細書の構成部分でもある。
光源モジュール２は、レーザ走査型顕微鏡検査に適した照明光、したがって特に蛍光を誘起し得るビームを生成する。適用法に対応させるため、光源モジュールは当目的用に複数の光源を有している。図示された実施態様では光源モジュール２に２つのレーザ６および７が配備されている。それらの後にはそれぞれ光バルブ８および減衰器９が接続されており、それらはビームを結合ポイント１０を通じて光ファイバ１１に連結させている。光バルブ８は、レーザユニット６または７のレーザ自体の作動を遮断しなくてもビームを遮断させることのできるビーム偏向器として機能する。光バルブ８は、例えば、ビーム遮断のためレーザビームを光ファイバ１１へ連結する手前で、図示されていない光の落下方向に偏向させるＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）として形成されている。

図１のモデル例では、レーザユニット６は、３つのレーザＢ、Ｃ、Ｄを有しているが、それに対しレーザユニット７はレーザＡを１つ持つのみである。したがって、図の６と７は単一波長用レーザと多種波長用レーザの組み合せモデルであり、個別に、または共同で１つまたは複数のファイバに連結されている。複数ファイバを通じてビームを同時連結することも可能であるが、その場合ではビームは後に、すなわち適合光学系の通過後にカラー結合器によって混合される。このようにして、励起光用に種々様々な波長または波長領域を使用することができる。

光ファイバ１１に通されたビームは、移動式のコリメーション光学系１２および１３によりビーム結合ミラー１４，１５を通じて合一化され、ビーム形成ユニット内でビームの特性が変更される。

コリメータ１２、１３は、光源モジュール２から走査モジュール３へ送られるビームが無限大光路にコリメートされるように作用する。これはそれぞれ、（図には描かれていない）中央制御ユニットの制御下のもと光軸に沿って移動することでフォーカシング機能を発揮する個別レンズで行うのが有利である。コリメータ１２、１３とそれぞれの光ファイバ末端との距離は変更可能なようになっている。

ビーム形成ユニットについては後にさらに詳しく説明するが、これは、ビーム結合ミラー１４、１５の後方に位置する回転対称なガウス型プロフィールのレーザビームから、もはや回転対称でない、長方形型照明フィールドの形成に適した横断面を持つ線形ビームを生成する。

線形ビームとも言われるこの照明光は励起光として用いられ、メインカラースプリッタ１７を通じてスキャナ１８に誘導される。メインカラースプリッタについては後ほど詳しく述べるので、ここでは顕微鏡モジュール４から戻ってきた試料光を励起光から分離させる機能を持つことだけを指摘しておく。

スキャナ１８は線形ビームを１軸または２軸方向に偏向させるので、ビームは走査対物レンズ１９および顕微鏡モジュール４の鏡筒レンズ、対物レンズを通って、プレパラートまたは試料内にある焦点２２に集束する。その場合光学結像は、試料が励起光により焦点で照明されるように行なわれる。

線形フォーカスで励起されたこのような蛍光ビームは顕微鏡モジュール４の対物レンズ、鏡筒レンズおよび走査対物レンズ１９を通ってスキャナ１８に戻るので、スキャナ１８に向かっての戻り過程の方向では再び定常ビームになっている。したがって、スキャナ１８は蛍光ビームをデスキャンするとも言われる。

メインカラースプリッタ１７は、励起光とは別な波長領域にある蛍光ビームを通すことができるので、蛍光ビームは、検出モジュール５の転向ミラー２４で転向させた後分析することができる。検出モジュール５は、図１の実施態様では複数のスペクトルチャネルを有している。すなわち、転向ミラー２４のほうから来た蛍光ビームはサブカラースプリッタ２５により２つのスペクトルチャネルに分割される。

各スペクトルチャネルは、試料２３に対して共焦点結合あるいは部分共焦点結合を実現するスリット絞り２６を有しており、その大きさがビームの検出を可能にする焦点深度を決定する。したがって、スリット絞り２６の幾何学構造は、蛍光ビームの検出がなされる（厚みのある）プレパラート内の切断面を決定づける。

スリット絞り２６の後方には、さらに検出モジュール５に到達した歓迎されざる励起光をブロックするためのブロックフィルタ２７が配置されている。特定深度の切断面に由来する、このように分離され扇形に広がった線形ビームは、次に然るべき検出器２８によって分析される。上記のカラーチャネルと同様に、スリット絞り２６ａ、ブロックフィルタ２７ａおよび検出器２８ａを持つ第２スペクトル検出チャネルも構成されている。

検出モジュール５における共焦点スリット開口の使用はモデル例に過ぎない。もちろん、単点型スキャナの実現も可能である。その場合ではスリット絞り２６、２６ａはホール型絞りに代えられ、ビーム形成ユニットは省くことができる。因みに、そのような構造様式にはすべての光学系が回転対称に構成される。もちろん、単点式の走査および検出に代えて、後に図３および４を手掛かりに改めて説明する点雲形式またはニポーディスク形式のコンセプトなど、原則として任意の多点型装置を使用することもできる。ただし、スキャナの通過時には複数の試料点が平行して捕捉されるので、検出器２８はスポット分解能を有していることが重要である。

図１から分かるように、可動式、すなわち移動可能なコリメータ１２および１３の後方にあるガウス光線束はビーム結合ミラー１４、１５形式のステップ型ミラーを通じて合一化され、続いて、図示された共焦点スリット絞り付き構造様式の場合では、長方形の横断面を持つ光線束に変換される。図１の実施例では、ビーム形成ユニット内には円筒型テレスコープ３７が使用されていて、その後ろには非球面ユニット３８、さらに円筒型光学系３９が配置されている。

ビーム変形後では、ビームはプロフィール平面にはほぼ長方形のフィールドを照らし出す。その場合フィールドの長軸に沿った強度分布はガウス形ではなくボックス形である。
非球面ユニット３８を持つ照明装置は、鏡筒レンズと対物レンズ間にあるひとみを均一充填させるのに用いられる。それによって、対物レンズの光学分解能を完全に発揮させることができる。したがって、このバリエーション法は単点走査式または多点走査式の顕微鏡システム、例えばライン走査システムにも有用である（後者の場合、当該軸に加えそれ以外にも、試料上または試料中にフォーカシングされる）。

例えば、線形に整えられた励起光がメインカラースプリッタ１７の方向に偏向される。当カラースプリッタは、好ましい実施態様では分割ミラーとして、つまり本発明でもその内容を包括的に取り入れているＤＥ１０２５７２３７Ａ１記載のスペクトル中性な分割ミラーとして形成されている。したがって、「カラースプリッタ」の概念には非スペクトル的に作用する分割システムの意が含まれている。記述のスペクトル非依存型カラースプリッタの代わりに、均一型中性スプリッタ（例えば５０／５０、７０／３０、８０／２０タイプなど）またはダイクロイックスプリッタを使用することができる。それにより、適用別に選択することが可能になるので、メインカラースプリッタとしては、交換可能な個別スプリッタを含む、例えば然るべきスプリッタ切換ダイヤルにより簡易交換のできる機構の備わっているのが好ましい。

例えば、反射、ストークス／反ストークスラマン分光法、高次数のコヒーレントラマンプロセスや、第２高調波発生、第３高調波発生、和周波混合発生などの一般的パラメトリック非線光学プロセス、２光子、多光子吸収および蛍光におけるコヒーレントビーム、すなわち特に方向づけられたビームを検出すべき場合はダイクロイックメインカラースプリッタが有利である。これらの方法のうち、非線光学分光法のいくつかは、コリニヤ重畳をなす２つまたはそれ以上のレーザビームの使用を必要とする。この場合、図示されているような複数レーザビームの結合が特に有利であると実証されている。原則的には、蛍光顕微鏡検査で広く普及しているダイクロイックビームスプリッタであれば使用可能である。また、ラマン顕微鏡検査には、レイリー散乱成分の抑制のため検出器の前にホログラフィックノッチ・スプリッタまたはフィルタを設置するのが有利である。

図１の実施態様では、励起光または照明光はモータ制御式ズーム光学系４１を通じてスキャナ１８に送り込まれる。ズーム倍率は当方式で適合化させることができ、走査される視野は特定の調整領域内で連続的に変更することができる。ズーム光学系としては、連続的同調過程における焦点位置および結像倍率の適合化のあいだ、ひとみ位置が維持されたままであるようなタイプが特に有利である。

図１に矢印で示されたモータによるズーム光学系４１の自由移動度は、結像倍率、焦点位置、ひとみ位置の３つのパラメータの適合化に想定されている自由度の数値に精確に一致している。その出力側のひとみに固定式絞り４２の配置されたズーム光学系４１が特に好ましい。絞り４２を実地で簡単に実現するには、スキャナ１８鏡面幅の制限によって構成することもできる。ズーム光学系４１を持つ出力側絞り４２により、ズーム倍率の設定如何に拘わらず常に一定したひとみ直径を走査対物レンズ１９上に結像させることが可能になる。このように、ズーム光学系４１を任意に設定した場合でも対物レンズのひとみは依然として完全に照らし出されたままである。スキャナ１８領域での願わしくない散乱光発生事態の阻止には独自型絞り４２の使用が好ましい。

ズーム光学系４１と共同作用をする円筒型テレスコープ３７は、同じくモータ作動式であり、非球面ユニット３８の前に配置されている。図２の実施態様ではコンパクト構造の理由からこれが選ばれているが、そのようにする必要はない。
ズーム倍率１．０未満が望まれる場合、円筒型テレスコープ３７は自動的に光学光路内に旋回挿入される。これは、ズーム対物レンズ４１が縮小された場合に開口絞り４２への照明が不完全になるのを防止する。したがって、旋回挿入の可能なこの円筒型テレスコープ３７により、ズーム倍率１未満の場合でも、すなわちズーム対物レンズ４１の設定の如何に拘わらず、対物レンズひとみの位置では常に一定長の照明光線の到達が保証される。それにより、単式視野ズームに比較して、照明光におけるレーザ出力損失が避けられる。

円筒型テレスコープ３７の旋回挿入時には照明光線による画像明度の急変が避けられないので、画像明度を一定に保つため、（図には描かれていない）制御ユニットでは、円筒型テレスコープ３７が作動している場合、スキャナ１８の送出し速度または検出モジュール５における検出器の増幅係数がそれ相応に適合するような設計がなされている。

図１のレーザ走査型顕微鏡では、モータ作動式ズーム光学系４１およびモータにより操作切換可能な円筒型テレスコープ３７のほか、検出モジュール５でも遠隔制御可能な調整素子が設置されている。例えば、色波長誤差の補正のため、スリット絞りの前に丸型光学系４４と円筒型光学系３９が、検出器２８の直前に円筒型光学系３９が設置されており、それらはモータによりそれぞれ軸方向に移動できるようになっている。

加えて、補償のため補正ユニット４０が配備されているが、それについては以下に簡単に説明する。
スリット絞り２６は、前方配置の丸型光学系４４、同様に前方配置の第１円筒型光学系３９および後方配置の第２円筒型光学系と共に検出システム５のピンホール対物レンズを形成するが、この場合のピンホールはスリット絞り２６によって実現される。システム内で反射した励起光の意図しない検出を避けるため、第２円筒型レンズ３９の前にはブロックフィルタ２７も設置されており、これは求める蛍光ビームだけを検出器２８、２８ａに到達させるべく、それに適したスペクトル特性を有している。

カラースプリッタ２５またはブロックフィルタ２７を取り換えて旋回挿入した場合、幾分かの傾斜誤差または楔角誤差が発生するのは避けられない。カラースプリッタは試料領域とスリット絞り２６間の誤差を、ブロックフィルタ２７はスリット絞り２６と検出器２８間の誤差を持ち込む可能性がある。その場合に、スリット絞り２６または検出器２８の新たな位置調整が必要になることがないように、丸型光学系４４とスリット絞り２６の間に、すなわち試料と検出器２８間の結像光路内に、コントローラの制御下で様々な傾斜位置に設定することのできるオプチカルフラットのプレート４０が配置されている。オプチカルフラットのプレート４０は、その目的のために然るべきホルダ内に位置調整可能なように設置されている。

図２は、ズーム光学系４１を利用すれば提供された最大限の視野ＳＦ内で如何にしてＲＯＩ（観察対象領域）が選択できるかを示している。例えば、共振型スキャナの場合では必ず必要なことであるが、振幅に変化が起きないようにスキャナ１８を持続的に制御すれば、ズーム光学系においてセットされた１．０以上の倍率により走査フィールドＳＦの光軸を中心として選択されるＲＯＩ領域が狭められる。

共振型スキャナに関しては、例えばＰａｗｌｅｙ著“ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｆｏｃａｌＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ社１９９４年刊、４６１ページ以降に記述されている。
スキャナがフィールドを、光軸に対し、すなわち走査ミラーの定常位置に対し非対称に走査するように、スキャナの制御を行えば、ズーム作用との関連性から選定ＲＯＩ領域の補正移動ＯＦが得られる。既に触れたスキャナ１８のデスキャン作用およびズーム光学系４１の再通過により、検出器方向への検出光路における観察対象領域ＲＯＩの選択が改めて中断される。それにより、走査画像ＳＦ内のＲＯＩ領域に対し任意の選択が可能になる。様々なＲＯＩ領域の選択毎に画像を追加獲得することができ、それらを高分解性画像に合成することができる。

選択ＲＯＩ領域を光軸に対する補正分ＯＦだけ移動させるのでなく、それに加えて回転もさせたい場合は、メインカラースプリッタ１７と試料２３間の光路のひとみに、周知のとおり画像フィールドに対して回転作用のあるアッベ・ケーニッヒプリズムを配置した実施態様が目的に適っている。この場合も検出器方向で作業の中断を行う。それにより、様々な補正シフトＯＦおよび様々な回転角を持つ画像が測定でき、続いて、例えば文献“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌａｎｄｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；Ｉｍａｇｅａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ VII”ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＳＰＩＥ第３９１９巻（２０００年）、１４１〜１５０ページのＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｍ．著“Ｄｏｕｂｌｉｎｇｔｈｅｌａｔｅｒａｌｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｕｓｉｎｇｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ”に記載されているようなアルゴリズムに従って高分解性のある画像に修正することができる。

図３は、ニポーディスク方式を実現するレーザ走査型顕微鏡１として考えられる別な構造様式を示している。図３では極端に簡略描画されている光源モジュールが、ミニレンズアレー６５からメインカラースプリッタ１７を通過して、例えばＵＳ６，０２８，３０６、ＷＯ８８０７６９５またはＤＥ２３６０１９７Ａ１に記載されているようなニポーディスク６４を照明する。ミニレンズアレー６５を通じて照明されたニポーディスクのピンホールは顕微鏡モジュール４内の試料に結像する。ここでも試料側の画像サイズを変更できるように、ズーム光学系４１が設置されている。

ニポースキャナの場合、図１の構造様式からは変更部分があり、照明はメインカラースプリッタ１７を通過させて行われ、検出光は反射分離される。さらに、ニポーディスク６４による多点照明の場合では、それに対応した平行な走査が行われるように、図２に変更を加えて検出器２８はスポット分解能を持つように作られている。そのほか、ニポーディスク６４とズーム光学系４１の間には、ニポーディスク６４のピンホールを通り抜ける発散光を適当な束直径に変換させる、正の屈折力を持った然るべき固定型光学系６３が配置されている。メインカラースプリッタ１７は、図３のニポー式構造の場合では旧来型のダイクロイックビームスプリッタであり、したがってスリット状または点状の反射領域を持つ上記ビームスプリッタではない。

ズーム光学系４１は上段で説明した構造様式に対応しているが、この場合はニポーディスク６４があるため、もちろんスキャナ１８は不要になる。しかし、図２を基に説明したＲＯＩ領域の選択を行いたい場合は、これを設置することができる。同じことがアッベ・ケーニッヒプリズムについても言える。

多点走査による別法が模式図として図４に示されているが、その方法では複数の光源がスキャナのひとみに対して斜めに照射される。この場合でもメインカラースプリッタ１７とスキャナ１８間での結像にズーム光学系４１を使用することにより、図２に描かれたようなズーム機能を実現することができる。ひとみに共役な平面に様々な角度から光線束を同時入射することにより、光点が対象物平面に共役な平面に形成され、それがスキャナ１８により同時に対象物フィールド全体のうちの一部領域上に誘導される。スポット分解性のあるマトリックス検出器２８では部分画像全体の評価を通して画像情報が生成される。

その他の実施態様としては、ＵＳ６，０２８，３０６に記載されているような多点走査があるが、その開示内容の中で関連事項は本発明に包括的に取り入れられている。ここでもスポット分解性のある検出器２８を設置することができる。その場合では試料は多点光源によって照明されるが、それは、多点光源が実現されるようにマルチ開口プレートを照明する、マイクロレンズアレーの後続配置されたビームエキスパンダによってなされる。

図５ａは、シフト幅ａの走査ラインＳＬを持つラインスキャナの走査フィールドを示している。
この走査ラインは、点像スキャナによる点状走査からライン状に繋げて同じように生成することもできる。
この場合のシフト幅ａは、顕微鏡装置で可能な最大の光学分解能をもたらす走査レートにおける走査ライン間の距離よりも大きい。しかしそれにより、対象物フィールドはそれだけ迅速に走査することができる。それは、撮像のための走査ライン当りの滞留時間が撮影全体の速度を決めるからである。

図５ｂでは走査ラインがａ／２分またはａ／Ｎ分（Ｎ＝２、３…）垂直方向にシフトしている。個別ラインの撮像は、依然距離ａで行われるが、走査過程走査ラインの中間領域では図５ａにしたがって行われる。

図６は、被験対象物の入力可能速度における顕微鏡の空間的および時間的分解能の比率調整のためのシフト制御器を表わした簡略図である。
走査ラインは同じ走査速度でいくらかの距離分シフトされるが（スキャナのシフト（オフセット）が変更される）、ここではブリーチングの理由によるのではなく、それは、高い時間分解能による迅速な過程または移動の撮影と試料内で準静止した、または緩慢な動き（殆ど動きなし）である、したがって結像にあまり時間的分解能の必要でない領域または形成物が同時に重なった場合の妥協量である。例えば、１２ｍｍ幅で、可能なライン数が１０２４本という走査フィールドは最大限の光学分解能によると４×２５６ラインに分割され、それぞれ１ラインずつシフトされ４回走査される。
それにより、２５６ラインの走査は非常に迅速に行われる。１ラインの積分時間が約２０マイクロセカンドであれば、撮像は２５６×２０マイクロセカンド内、すなわち約５ミリセカンドで行われる。

次の走査（位相シフトされた次の２５６ライン）では、不動対象物については分解能が２倍になるが、一方迅速移動対象物についてはその移動の感知は不明確になる。走査サブステップは光学分解能の限界に達するまで繰返し行われる。この限界は、ナイキスト基準によれば、サンプリングステップ幅が顕微鏡光学分解能の半分に相当した場合に達成される。例えばナイキスト基準の達成に２０４８ラインの走査が必要な場合、空間的に高い分解構造の検査が可能な時間分解能は２０４８×２０マイクロセカンド、すなわち４０ミリセカンドとなる。

迅速に移動する対象物は、その過程で１箇所に留まっていれば、先ずは（空間サンプリング分解能が低いので）不鮮明に現われるが、走査の繰返しおよびシフトによって鮮明さを増す。低分解能および高速度での撮影（一種の概要走査）による記録では、有利にも、最高の分解能による撮影でしか見えなかったような迅速な動きが見えるようになる（撮像時間の関係による）。

時間分解能Ａｔ（フレームレート）、走査フィールドを動く対象物の捕捉速度Ｖ（操作者の期待値）および空間分解能Ａｒ間の比率は、操作者が適当な入力手段、例えばシフト制御器（図６）を用いて調整する。これは、常に操作者の期待に基づく最適化のための妥協点である。
例えば、迅速移動対象物として１００マイクロメータ大のものが考え得る。
ここでは１マイクロメータの分解能は必要でない。操作者は、例えば１０マイクロメータの分解能に設定し、対象物の移動捕捉精度を上げるために撮影速度を高めることができよう。

顕微鏡画像レートに比べて静止状態にある対象物は、回折限界における光学分解能によって再現される。
画像レートよりも迅速移動する動的対象物は、一般には光学分解能よりも低いサンプリングレートの空間分解能によって再現される。

時間シリーズ撮影の場合、動的対象物は当初不鮮明に現われ、直ぐに静的対象物になり、回折限界における分解能で再現される。
迅速動的対象物は、個別画像相互間の相関関係によって見ることが可能になる。これは、（順次撮影された画像の）相関点が、ある種の画像カラーを有し、残りの画像点が別な画像カラーを有していることで実現される。
迅速移動対象物と緩慢移動対象物のカラーコード化された重畳が可能であり、その場合静的画像情報は画像相関関係を基に分離させることができる。それには、様々な時点で相関する画像点が用いられる。

図７ａには高度な光学分解性を示すモニタ像が描かれている。
右側は左側画像の拡大面で、そこには例として、高度な光学分解能のため１箇所でしか見ることのできない迅速移動対象物が描かれている。図７ｂでは本発明に基づき光学分解能が引き下げられている（低画像レート）。
それにより、迅速移動対象物（過剰描写）は不鮮明に現われるが、しかし静止対象物は引き続き鮮明である。不鮮明対象物の移動が観察または記録できる。

図８を基に、画像レートを引き下げた場合の画像調整について説明する。
ライン検出器はＸ軸に、シフト装置はＹ軸にあり、信号式は（Ｃｋ、Ｉ）ｊであって、シフトステップは垂直方向（Ｙ方向）である。個別チャネルの測定信号は（ｃ_ｋｉｊ）Ｉで表わされる。ただし、ｉ＝１…Ｎはライン検出器のチャネル数、ｋはライン数およびｊ＝０…ｎ−１はシフトａ／ｎの回数である。スリット毎にＮ×ｎの計算をするため、下記アルゴリズムに基づき個別値総和の差Ｓ_ｍを求める：

算出値Ｓ（スリットごとの中間値）は、続いて示された画像上に、例えば走査中にグラフィック表示することができる。図９には、上記配置に基づいた検出器分解能のシフト数ｎ依存性が示されている。ｎ＝１の場合検出ユニットの空間分解能はステップ幅（ａ）の空間分解能と同じである。幅ａ／５の５回のシフトの場合、検出ユニットの分解能はａ／５である。達成可能な最大空間分解能は顕微鏡の光学限界分解能で決定される。この最大空間分解能が、検出分解能が顕微鏡の潜在分解能の半分に等しければ、ナイキストの走査理論に基づき精確に達成される。これは次式で表わされる：
ｎ_ｍａｘ＝２・Ｌ／△ρ

ストライプの投射（７５０５）の場合、部分画像が撮影され計算される。計算により高い分解能が達成される。この部分画像を情報取得に使用する場合では、スポット分解能が悪くても時間分解能の高いものであれば利用できよう（例えば、３倍速）。
このように、画像情報は撮影された部分画像から取得できよう。その場合、画像走査は補間法により補償されよう。画像にはそれぞれ迅速移動に関する情報も追加的に含まれよう。格子現象は、この場合格子周期を通じての然るべき平均化により、または最高位置の評価により抑制することができる。図２は本発明の別な実施例を示したものである。

共焦点顕微鏡での試料の撮影速度を高めるためにラインまたは画像の飛び越しを行えば、蛍光試料の場合では幾つかの領域で不均一または強いブリーチングを招来する。ここで説明している方法によれば試料において均一なブリーチングが達成される。
共焦点顕微鏡による撮像で撮影速度を上げるには、ｎ番目毎のラインだけを照明し撮影する（図１０）。非撮影ラインの強度は隣接ピクセルの強度から補間法で求める。その場合時間シリーズおよび連続的データ記録においては、蛍光試料の個別ラインはブリーチングされるが、隣接領域はブリーチングされない。

この場合の参照撮影とは、試料内撮影ピクセルの距離が両画像方向で等しい画像撮影のことである。画像方向はｘ方向およびｙ方向で表わされ、試料の点状照明の場合ではｘ方向は試料走査時に点が迅速に動く方向である。試料のライン照明の場合では、ｘ方向がラインの方向である。ｙ方向はｘ方向に対して垂直に配置すべきであり、それは画像平面内にある。

加速データ記録の場合にｙ方向にどれだけのラインが飛び越しされるかを表わす重畳値ｎが整数で決定される。画像の繰返し撮影の場合、試料は同一箇所でなくｙ方向に幾らかシフトさせて走査する。シフト量はそれぞれの撮影ライン毎に異なる可能性がある。しかし同じ量を適用すれば作業は簡易である。最も簡単な例では、参照撮影からラインまでのｙ方向の距離がシフト量として使用され、ｉを整数としてｎ＊ｉ番目の撮像時に再び最初の画像と同じ箇所で照明される。

この方法により試料の均一ブリーチングが達成される。各ライン毎の最大ブリーチング作用は約１／ｎに下げることができる。この方法は、照明方向からは任意の方向に向いた画像平面を持つ画像の撮影に適用することができる。シフトの実現のため、スキャナおよび圧電駆動部のほかに別な駆動装置を使用することもできる。

画像スタックの撮影には、基本は同じ考えながら、ただ次元の広い一般化された方法を適用することができる。
その場合では、スタックの個別画像は次のスタック撮影時には画像平面に垂直方向にシフトされる。画像およびスタックの重畳撮影法も同時に適用することもできる。

本発明はライン走査に限定されるものではない。ニポースキャナの場合では、第１ステップにおける螺旋状ホールまたは有孔装置の部分評価は省略でき、以降のステップでは別な有孔装置を組入れることができよう。
試料上を移動させる多点型装置の場合、当初は特定の点領域または点走査は評価の対象にはできないだろう。

本発明は、迅速作業性のある共焦点レーザ走査型顕微鏡の適用可能性を大幅に拡大するものである。このような改良開発の重要性は、細胞生物学的に関する標準文献およびそこに記述されている細胞、副細胞の迅速な変化過程^１、さらには多数の色素を用いた検査方法^２を手掛かりに読み取ることができる。
例えば下記の文献が参考になる：
^１Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ他著（２００２年）：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＣｅｌｌ；ＧａｒｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ刊
^１，２Ｇ．Ｋａｒｐ著（２００２年）：ＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ；ＣｏｎｃｅｐｔｓａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ；ＷｉｌｅｙＴｅｘｔＢｏｏｋｓ刊
^１，２Ｒ．Ｙｕｓｔｅ他著（２０００年）：Ｉｍａｇｉｎｇｎｅｕｒｏｎｓ–ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ刊、ニューヨーク
^２Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ著（２００３年）：ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ第１０版；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＥｕｒｏｐｅＢＶ刊

本発明は次のプロセスおよび変遷にとって非常に重要な意味を持っている：
有機体の生育
記述の本発明は、なかでも１／１０秒から時間レベルまでのダイナミックな変遷を特徴とする生育過程の研究に適している。ここでは細胞結合面および有機体全体への適用例について記述する：
・Ａｂｄｕｌ−Ｋａｒｉｎ、Ｍ．Ａ．他は２００３年“Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．”第６６巻、１１３〜１２５ページに動物生体における血管の変化に関する長期分析結果を記録した。その場合、蛍光画像は数日間隔で撮影された。運動の定角軌道を模式的に描くために、３次元のデータ記録が適合アルゴリズムで評価されている。
・Ｓｏｌｌ、Ｄ．Ｒ．他は２００３年“ＳｃｉｅｎｔｉｃＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎ．”第３巻８２７〜８４１ページに３次元空間全体における生体細胞の核および偽足に関する顕微鏡データのソフトウェアベースによる運動分析について記述している。
・Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｒ他は２００２年“Ｇｌｉａ”第３７巻２２９〜２４０ページにラットの微小神経膠細胞における運動の３次元分析について記述している。そのデータは１０時間以上に亘って記録されたものである。神経膠細胞にはトラウマ性傷害の後に同時に迅速反応が発現するので、高いデータ収得率およびそれ相応のデータ量が得られる。

これに関しては特に次のことが重要なポイントである：
・その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので３次元ＲＯＩ照明から保護されねばならない３次元領域での生細胞の分析
・例えばＦＲＥＴ実験などにおいて、３次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・例えば３次元ＦＲＡＰ、ＦＬＩＰ実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にＲＯＩ外の観察も必要なマーカーによる生細胞の３次元領域での分析、
・例えば３次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の３次元領域での照準分析
・例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・例えばＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなど可変性多重マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・機能に依存して変色する、例えばＣａ＋マーカーなどでマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・生育に起因して変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、例えばＧＦＰによる形質転換動物
・例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・最終項目とそれ以前の項目との組み合せ

細胞内の運搬過程
記述の本発明は細胞内運搬過程の研究にはこの上なく適している。この場合では正しく非常に微小な運動構造体、例えばタンパク質を高速度で（殆どが１／１００秒の領域）描写しなければならないからである。複雑な運搬過程のダイナミックスを捕捉するためには、ＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＡＰもしばしば適用される。そのような研究例として、ここでは以下のものを挙げておく：
・Ｕｍｅｎｉｓｈｉ，Ｆ．他が２０００年“ＢｉｏｐｈｙｓＪ．”第７８巻１０２４〜１０３５ページに、ＧＦＰ変換された培養細胞におけるアクアポリンの空間運動性についての分析結果を記述している。その場合、細胞膜の照準点を局部ブリーチングして、周辺における蛍光拡散の分析を行っている。
・Ｇｉｍｐｌ，Ｇ．他が２００２年“Ｐｒｏｇ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．”第１３９巻４３〜５５ページに、ＲＯＩブリーチングによる実験、運動性分析のための蛍光撮像およびＧＦＰマーキングされたオキシトシン受容体の線維芽細胞内での分布について記述している。その場合、空間位置設定、分解能およびブリーチングと撮像との直接的な時間的連続性に関して高い要求が課されている。
・Ｚｈａｎｇ他が２００１年“Ｎｅｕｒｏｎ”第３１巻２６１〜２７５ページに、ＧＦＰ変換された神経細胞における生細胞の撮像について記述している。その場合、顆粒の運動がブリーチングと蛍光撮像との組み合せにより分析された。神経細胞のダイナミックスに起因して、撮像速度には高い要求が課される。

分子間の相互作用
記述の本発明は、特に分子間およびその他副細胞間の相互作用の描写に適している。これらの場合では非常に微小な構造が高速度（１／１００秒レベル）で描出されねばならない。相互作用に必要な分子の空間ポジションの解明には、例えばＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＥＴなどの間接的な技術を使用することもできる。適用される例として、ここでは以下のものを挙げておく：
・Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ａ．およびＤａｌｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．が２００４年“Ｇｌｉａ”第４６巻１９５〜２０６ページに、ラット海馬角の培養における２チャネル撮影について記述している。この場合は、マーカーとしてのレクチンとシトックスについて３次元空間において長時間に亘り２チャネルで記録される。
・Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．他が２００３年“Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ”第２０巻６３３〜６３８ページに、ヒトの線維肉腫細胞の２色撮影について記述している。この場合では緑色と赤色の蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびＲＦＰ）が同時にリアルタイムで観察された。
・Ｂｅｒｔｅｒａ，Ｓ．他が２００３年“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”第３５巻７１８〜７２２ページに、合成後色が緑から赤に変化するタイムレポータプロテインによってマーキングされた転換マウスのマルチカラー撮影について記述している。撮像は生体動物の組織内３次元空間で迅速シリーズとして行われる。

細胞間の信号伝達
記述の本発明は、殆どが極端に迅速になる信号伝達過程の研究には他に抜きん出て適している。殆どが神経生理学に関するこの過程では経時的分解能に最大限の要求が課される。それは、イオンによって媒介される活動が１／１００秒から１／１０００秒以下の範囲で起こるからである。筋肉系または神経系の検査への適用例として、ここでは次のものを挙げておく：
・ＢｒｕｍＧ他が２０００年“ＪＰｈｙｓｉｏｌ”第５２８巻４１９〜４３３ページに、伝達物質としてのカフェインによる刺激後のカエルの筋肉細胞における迅速なＣａ＋活動の位置確認について記述している。この位置確認およびマイクロメータ単位の精度を持つ分解能は、迅速型の共焦点顕微鏡の使用下でないと達成されない。
・ＳｃｈｍｉｄｔＨ他が２００３年“ＪＰｈｙｓｉｏｌ”第５５１巻１３〜３２ページに、転換マウスの神経細胞突起におけるＣａ＋イオンの分析について記述している。変化するＣａ＋に結合するタンパク質による、マウス内での迅速なＣａ＋変化状況についての研究は、高分解能を持つ共焦点顕微鏡により初めて行うことができた。それは、神経細胞内におけるＣａ＋活動の位置確認およびその精確な経時的動力学が重要な役割を果たしているからである。

レーザ走査型顕微鏡の模式図最大限の視野ＳＦ内で如何にしてＲＯＩ（観察対象領域）が選択されるかを示すニポーディスク方式を実現するレーザ走査型顕微鏡１として考えられる別な構造様式多点走査による別法の模式図（ａ）シフト幅ａの走査ラインＳＬを持つラインスキャナの走査フィールド、（ｂ）走査ラインがａ／２またはａ／Ｎ垂直方向にシフト単一波長用レーザと多種波長用レーザの組み合せモデル（ａ）高度な光学分解性を示すモニタ像、（ｂ）光学分解能が引き下げられている低画像レートのモニタ像画像レートを引き下げた場合の画像調整検出器分解能のシフト数ｎ依存性を示すのグラフ共焦点顕微鏡による撮像で撮影速度を上げるための方法

符号の説明

１レーザ走査型顕微鏡
２光源モジュール
３走査モジュール
４顕微鏡モジュール
５検出モジュール
６，７レーザユニット
８光バルブ
１１光ファイバ
１２，１３コリメータ
１４，１５ビーム結合ミラー
１７カラースプリッタ
１８スキャナ
１９走査対物レンズ
２０鏡筒レンズ
２１対物レンズ
２２焦点
２３試料
２４転向ミラー
２６スリット絞り
２７ブロックフィルタ
２８検出器
２９ハロゲンランプ
３４水銀蒸気ランプ
３６ビームスプリッタ
３７円筒形テレスコープ
３８非球面ユニット
４１ズーム対物レンズ
４２開口絞り
ＳＦ視野（走査フィールド）

Claims

光走査型顕微鏡による対象物の画像捕捉のための方法であって、
試料画像の生成のため走査ステップで試料の走査が行われ、
少なくとも２つの走査ステップ間の距離が変更でき調整可能である、
および少なくとも１つの第２試料走査が行われ、その場合走査方向に対する走査ステップの位置がシフトされる方法。
光走査型顕微鏡による対象物の画像捕捉のための方法であって、
試料画像の生成のため走査ステップで試料のライン走査が行われ、
少なくとも２つの走査ステップ間の距離が変更でき調整可能である、
および少なくとも１つの第２試料走査が行われ、その場合走査方向に対する走査ステップの位置がシフトされる方法。
距離の拡大によって光学分解能の引き下げが行われる、請求項１または２に記載の方法。
捕捉がラインスキャナ、ニポースキャナまたは多点スキャナによって行われる、先行請求項の１つに記載の方法。
試料画像の複数回撮影により、時間シリーズ撮影が行われる、先行請求項の１つに記載の方法。
時間シリーズの複数画像が、移動状態の表示のため相互に関連付けられる、先行請求項の１つに記載の方法。
距離の拡大および／または走査ステップの位置移動が調整できる、先行請求項の１つに記載の方法。
空間分解能と時間分解能の比率が、操作者により調整され、その結果を基に入力手段を通じて変更される、先行請求項の１つに記載の方法。
試料または試料領域のカラーコード化による表示が、それらの移動速度に基づき行われる、先行請求項の１つに記載の方法。
少なくとも１つのラスタ式第１試料照明による均一な照明のための、なかでも光走査型顕微鏡による試料の均一なブリーチングのための、それも特に先行請求項の１つに記載された方法であって、データ記録のスピード化のため、照明された試料点間の距離拡大の際に少なくとも１つのラスタ式第２試料照明が行なわれ、第１試料照明における照明試料点の間にある試料点の照明が行なわれる方法。
特に細胞結合面および有機体全体における、なかでも１／１０秒から時間単位までのダイナミックなプロセス等の生育過程、それも特に下記諸点、すなわち
・その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので３次元ＲＯＩ照明から保護されねばならない３次元領域での生細胞の分析、
・例えばＦＲＥＴ実験などにおいて、３次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の３次元領域での分析、
・例えば３次元ＦＲＡＰ、ＦＬＩＰ実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にＲＯＩ外の観察も必要なマーカーによる生細胞の３次元領域での分析、
・例えば３次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の３次元領域での照準分析、
・例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析、
・例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析、
・例えばＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなど可変性多重マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
・機能に依存して変色する、例えばＣａ＋マーカーなどでマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
・生育に起因して変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、例えばＧＦＰによる形質転換動物、
・例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
・検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
・最終項目とそれ以前の項目との組み合せ
のうちの少なくとも１つの研究のための、先行請求項の少なくとも１つに記載の方法の使用。
特に、微小な運動構造体、例えばタンパク質の高速度描写に（殆どが１／１００秒の領域）、それも特にＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＡＰなどに適用される、細胞内運搬過程の研究のための先行請求項の少なくとも１つに記載の方法の使用。
例えば、副分子構造解明のためのＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＥＴなど、好ましくは間接的技術の使用下における、特に、非常に微小な構造の高速度描写など、分子およびその他副細胞の描写のための先行請求項の少なくとも１つに記載の方法の使用。
特に筋肉系または神経系に関する研究における迅速な信号伝達過程のための、特に、１／１００秒から１／１０００秒以下に到るまでの領域で展開されるイオン介在活動に関係する、高い経時的分解能による神経生理学過程のための、先行請求項の少なくとも１つに記載の方法の使用。