JP5032754B2 - 光走査型顕微鏡およびそれの使用 - Google Patents

Description

本発明は、大きな試料の迅速走査を可能にする方法および装置について記述する。当方法は、特に、撮影領域が顕微鏡の最大画像フィールドより大きい場合に適している。
ＤＥ １９７０２７５３Ａ１

大きな試料を撮影する場合、現在では複数の画像およびスタックが撮影されている。その場合、試料は画像またはスタックの撮影間に動力化試料ボードと共に移動させられる。撮影された画像またはスタックは、続いて、全体像の構成のためボードポジションに応じてコピーされる。共焦点顕微鏡による画像およびスタックの撮像速度引き上げのための開発に伴って、ボードの位置設定が総撮像時間に大きく関わる状況となった。

以下では図面を参照しながら本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する。
図１は主要部が５つのコンポーネント、すなわち、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール２、励起光をコリメートして試料上の走査のため然るべき偏向を行なう走査モジュール３、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュール４および試料からの光線を受け止め検出する検出モジュール５から成るレーザ走査型顕微鏡１の模式図である。その場合検出モジュール５は、図１に描かれているように、スペクトル別のマルチチャネル型に構成することができる。
点状走査式のレーザ走査型顕微鏡に関する一般事項についてはＤＥ １９７０２７５３Ａ１が参考になり、したがってその内容は本明細書の構成部分でもある。

光源モジュール２は、レーザ走査型顕微鏡検査に適した照明光、したがって特に蛍光を誘起し得るビームを生成する。適用法に対応させるため、光源モジュールは当目的用に複数の光源を有している。図示された実施態様では光源モジュール２に２つのレーザ６および７が配備されている。それらの後にはそれぞれ光バルブ８および減衰器９が接続されており、それらはビームを結合ポイント１０を通じて光ファイバ１１に連結させている。光バルブ８は、レーザユニット６または７のレーザ自体の作動を遮断しなくてもビームを遮断させることのできるビーム偏向器として機能する。光バルブ８は、例えば、ビーム遮断のためレーザビームを光ファイバ１１へ連結する手前で、図示されていない光の落下方向に偏向させるＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）として形成されている。

図１のモデル例ではレーザユニット６は３つのレーザＢ、Ｃ、Ｄを有しているが、それに対しレーザユニット７はレーザＡを１つ持つのみである。したがって、図の６と７は、単一波長用レーザと多種波長用レーザの組み合せモデルであり、個別に、または共同で１つまたは複数のファイバに連結されている。複数ファイバを通じてビームを同時連結することも可能であるが、その場合では、ビームは、後に、すなわち適合光学系の通過後にカラー結合器によって混合される。このようにして、励起光用に種々様々な波長または波長領域を使用することができる。
光ファイバ１１に通されたビームは、移動式のコリメーション光学系１２および１３によりビーム結合ミラー１４,１５を通じて合一化され、ビーム形成ユニット内でビームの特性が変更される。

コリメータ１２、１３は、光源モジュール２から走査モジュール３へ送られるビームが無限大光路にコリメートされるように作用する。これはそれぞれ、（図には描かれていない）中央制御ユニットの制御下のもと光軸に沿って移動することでフォーカシング機能を発揮する個別レンズで行うのが有利である。コリメータ１２、１３とそれぞれの光ファイバ末端との距離は変更可能なようになっている。

ビーム形成ユニットについては後にさらに詳しく説明するが、これは、ビーム結合ミラー１４、１５の後方に位置する回転対称なガウス型プロフィールのレーザビームから、もはや回転対称でない、長方形型照明フィールドの形成に適した横断面を持つ線形ビームを生成する。線形ビームとも言われるこの照明光は励起光として用いられ、メインカラースプリッタ１７を通じてスキャナ１８に誘導される。メインカラースプリッタについては後ほど詳しく述べるので、ここでは顕微鏡モジュール４から戻ってきた試料光を励起光から分離させる機能を持つことだけを指摘しておく。

スキャナ１８は線形ビームを１軸または２軸方向に偏向させるので、ビームは走査対物レンズ１９および顕微鏡モジュール４の鏡筒レンズ、対物レンズを通って、プレパラートまたは試料内にある焦点２２に集束する。その場合、光学結像は、試料が励起光により焦点で照明されるように行なわれる。

線形フォーカスで励起されたこのような蛍光ビームは顕微鏡モジュール４の対物レンズ、鏡筒レンズおよび走査対物レンズ１９を通ってスキャナ１８に戻るので、スキャナ１８に向かっての戻り過程の方向では再び定常ビームになっている。したがって、スキャナ１８は蛍光ビームをデスキャンするとも言われる。

メインカラースプリッタ１７は励起光とは別な波長領域にある蛍光ビームを通すことができるので、蛍光ビームは検出モジュール５の転向ミラー２４で転向させた後分析することができる。検出モジュール５は、図１の実施態様では複数のスペクトルチャネルを有している。すなわち、転向ミラー２４のほうから来た蛍光ビームはサブカラースプリッタ２５により２つのスペクトルチャネルに分割される。

各スペクトルチャネルは、試料２３に対して共焦点結合あるいは部分共焦点結合を実現するスリット絞り２６を有しており、その大きさがビームの検出を可能にする焦点深度を決定する。したがって、スリット絞り２６の幾何学構造は、蛍光ビームの検出がなされる（厚みのある）プレパラート内の切断面を決定づける。

スリット絞り２６の後方には、さらに検出モジュール５に到達した歓迎されざる励起光をブロックするためのブロックフィルタ２７が配置されている。特定深度の切断面に由来する、このように分離され扇形に広がった線形ビームは、次に然るべき検出器２８によって分析される。上記のカラーチャネルと同様に、スリット絞り２６Ａ、ブロックフィルタ２７Ａおよび検出器２８Ａを持つ第２スペクトル検出チャネルも構成されている。

検出モジュール５における共焦点スリット開口の使用はモデル例に過ぎない。もちろん、単点型スキャナの実現も可能である。その場合はスリット絞り２６、２６Ａはホール型絞りに代えられ、ビーム形成ユニットは省くことができる。因みに、そのような構造様式にはすべての光学系が回転対称に構成される。もちろん、単点式の走査および検出に代えて、後に図３および４を手掛かりに改めて説明する点雲形式またはニポーディスク形式のコンセプトなど、原則として任意の多点型装置を使用することもできる。ただし、スキャナの通過時には複数の試料点が平行して捕捉されるので、検出器２８はスポット分解能を有していることが重要である。

図１から分かるように、可動式、すなわち移動可能なコリメータ１２および１３の後方にあるガウス光線束はビーム結合ミラー１４、１５形式のステップ型ミラーを通じて合一化され、続いて、図示された共焦点スリット絞り付き構造様式の場合では、長方形の横断面を持つ光線束に変換される。図１の実施例では、ビーム形成ユニット内には円筒型テレスコープ３７が使用されていて、その後ろには非球面ユニット３８、さらに円筒型光学系３９が配置されている。
ビーム変形後では、ビームはプロフィール平面にはほぼ長方形のフィールドを照らし出す。その場合フィールドの長軸に沿った強度分布はガウス形ではなくボックス形である。

非球面ユニット３８を持つ照明装置は、鏡筒レンズと対物レンズ間にあるひとみを均一充填させるのに用いられる。それによって、対物レンズの光学分解能を完全に発揮させることができる。したがって、このバリエーション法は単点走査式または多点走査式の顕微鏡システム、例えばライン走査システムにも有用である（後者の場合、当該軸に加えそれ以外にも、試料上または試料中にフォーカシングされる）。例えば線形に整えられた励起光がメインカラースプリッタ１７の方向に偏向される。

当カラースプリッタは、好ましい実施態様では分割ミラーとして、つまり本発明でもその内容を包括的に取り入れているＤＥ
１０２５７２３７ Ａ１記載のスペクトル中性な分割ミラーとして形成されている。したがって、「カラースプリッタ」の概念には非スペクトル的に作用する分割システムの意が含まれている。記述のスペクトル非依存型カラースプリッタの代わりに、均一型中性スプリッタ（例えば５０/５０、７０/３０、８０/２０タイプなど）またはダイクロイックスプリッタを使用することができる。それにより、適用別に選択することが可能になるので、メインカラースプリッタとしては、交換可能な個別スプリッタを含む、例えば然るべきスプリッタ切換ダイヤルにより簡易交換のできる機構の備わっているのが好ましい。

例えば、反射、ストークス/反ストークスラマン分光法、高次数のコヒーレントラマンプロセスや、第２高調波発生、第３高調波発生、和周波混合発生などの一般的パラメトリック非線光学プロセス、２光子、多光子吸収および蛍光におけるコヒーレントビーム、すなわち特に方向づけられたビームを検出すべき場合は、ダイクロイックメインカラースプリッタが有利である。これらの方法のうち、非線光学分光法のいくつかは、コリニヤ重畳をなす２つまたはそれ以上のレーザビームの使用を必要とする。この場合、図示されているような複数レーザビームの結合が特に有利であると実証されている。原則的には、蛍光顕微鏡検査で広く普及しているダイクロイックビームスプリッタであれば使用可能である。また、ラマン顕微鏡検査には、レイリー散乱成分の抑制のため検出器の前にホログラフィックノッチ・スプリッタまたはフィルタを設置するのが有利である。

図１の実施態様では、励起光または照明光はモータ制御式ズーム光学系４１を通じてスキャナ１８に送り込まれる。ズーム倍率は当方式で適合化させることができ、走査される視野は特定の調整領域内で連続的に変更することができる。ズーム光学系としては、連続的同調過程における焦点位置および結像倍率の適合化のあいだ、ひとみ位置が維持されたままであるようなタイプが特に有利である。

図１に矢印で示されたモータによるズーム光学系４１の自由移動度は、結像倍率、焦点位置、ひとみ位置の３つのパラメータの適合化に想定されている自由度の数値に精確に一致している。その出力側のひとみに固定式絞り４２の配置されたズーム光学系４１が特に好ましい。絞り４２を実地で簡単に実現するには、スキャナ１８鏡面幅の制限によって構成することもできる。ズーム光学系４１を持つ出力側絞り４２により、ズーム倍率の設定如何に拘わらず常に一定したひとみ直径を走査対物レンズ１９上に結像させることが可能になる。このように、ズーム光学系４１を任意に設定した場合でも対物レンズのひとみは依然として完全に照らし出されたままである。スキャナ１８領域での願わしくない散乱光発生事態の阻止には独自型絞り４２の使用が好ましい。

ズーム光学系４１と共同作用をする円筒型テレスコープ３７は、同じくモータ作動式であり、非球面ユニット３８の前に配置されている。図２の実施態様ではコンパクト構造の理由からこれが選ばれているが、そのようにする必要はない。
ズーム倍率１．０未満が望まれる場合、円筒型テレスコープ３７は自動的に光学光路内に旋回挿入される。これは、ズーム対物レンズ４１が縮小された場合に開口絞り４２への照明が不完全になるのを防止する。

したがって、旋回挿入の可能なこの円筒型テレスコープ３７により、ズーム倍率１未満の場合でも、すなわちズーム対物レンズ４１の設定の如何に拘わらず、対物レンズひとみの位置では常に一定長の照明光線の到達が保証される。それにより、単式視野ズームに比較して、照明光におけるレーザ出力損失が避けられる。
円筒型テレスコープ３７の旋回挿入時には照明光線による画像明度の急変が避けられないので、画像明度を一定に保つため、（図には描かれていない）制御ユニットでは、円筒型テレスコープ３７が作動している場合、スキャナ１８の送出し速度または検出モジュール５における検出器の増幅係数がそれ相応に適合するような設計がなされている。

図１のレーザ走査型顕微鏡では、モータ作動式ズーム光学系４１およびモータにより操作切換可能な円筒型テレスコープ３７のほか、検出モジュール５でも遠隔制御可能な調整素子が設置されている。例えば、色波長誤差の補正のため、スリット絞りの前に丸型光学系４４と円筒型光学系３９が、検出器２８の直前に円筒型光学系３９が設置されており、それらはモータによりそれぞれ軸方向に移動できるようになっている。

加えて、補償のため補正ユニット４０が配備されているが、それについては以下に簡単に説明する。
スリット絞り２６は、前方配置の丸型光学系４４、同様に前方配置の第１円筒型光学系３９および後方配置の第２円筒型光学系と共に検出システム５のピンホール対物レンズを形成するが、この場合のピンホールはスリット絞り２６によって実現される。システム内で反射した励起光の意図しない検出を避けるため、第２円筒型レンズ３９の前にはブロックフィルタ２７も設置されており、これは求める蛍光ビームだけを検出器２８、２８Ａに到達させるべく、それに適したスペクトル特性を有している。

カラースプリッタ２５またはブロックフィルタ２７を取り換えて旋回挿入した場合、幾分かの傾斜誤差または楔角誤差が発生するのは避けられない。カラースプリッタは試料領域とスリット絞り２６間の誤差を、ブロックフィルタ２７はスリット絞り２６と検出器２８間の誤差を持ち込む可能性がある。その場合に、スリット絞り２６または検出器２８の新たな位置調整が必要になることがないように、丸型光学系４４とスリット絞り２６の間に、すなわち試料と検出器２８間の結像光路内に、コントローラの制御下で様々な傾斜位置に設定することのできるオプチカルフラットのプレート４０が配置されている。オプチカルフラットのプレート４０は、その目的のために然るべきホルダ内に位置調整可能なように設置されている。

図２は、ズーム光学系４１を利用すれば提供された最大限の視野ＳＦ内で如何にしてＲＯＩ（観察対象領域）が選択できるかを示している。例えば、共振型スキャナの場合では必ず必要なことであるが、振幅に変化が起きないようにスキャナ１８を持続的に制御すれば、ズーム光学系においてセットされた１．０以上の倍率により走査フィールドSＦの光軸を中心として選択されるＲＯＩ領域が狭められる。
共振型スキャナに関しては、例えばＰａｗｌｅｙ著“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ社１９９４年刊、４６１ページ以降に記述されている。

スキャナがフィールドを、光軸に対し、すなわち走査ミラーの定常位置に対し非対称に走査するように、スキャナの制御を行えば、ズーム作用との関連性から選定ＲＯＩ領域の補正移動ＯＦが得られる。既に触れたスキャナ１８のデスキャン作用およびズーム光学系４１の再通過により、検出器方向への検出光路における観察対象領域ＲＯＩの選択が改めて中断される。それにより、走査画像ＳＦ内のＲＯＩ領域に対し任意の選択が可能になる。様々なＲＯＩ領域の選択毎に画像を追加獲得することができ、それらを高分解性画像に合成することができる。

選択ＲＯＩ領域を光軸に対する補正分ＯＦだけ移動させるのでなく、それに加えて回転もさせたい場合は、メインカラースプリッタ１７と試料２３間の光路のひとみに、周知のとおり画像フィールドに対して回転作用のあるアッベ・ケーニッヒプリズムを配置した実施態様が目的に適っている。この場合も検出器方向で作業の中断を行う。それにより、様々な補正シフトＯＦおよび様々な回転角を持つ画像が測定でき、続いて、例えば文献
“Ｔｈｒｅｅ-ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｍａｌｔｉｄｉｍａｎｔｉｏｎａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ; Ｉｍａｇｅ ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ VII” Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｏｆ ＳＰＩＥ 第３９１９巻（２０００年）、１４１〜１５０ページのＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ, Ｍ．著“Ｄｏｕｂｌｉｎｇ
ｔｈｅ ｌａｔｅｒａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ”に記載されているようなアルゴリズムに従って高分解性のある画像に修正することができる。

図３は、ニポーディスク方式を実現するレーザ走査型顕微鏡１として考えられる別な構造様式を示している。図３では極端に簡略描画されている光源モジュールが、ミニレンズアレー６５からメインカラースプリッタ１７を通過して、例えばＵＳ
６ ０２８ ３０６、ＷＯ ８８ ０７６９５またはＤＥ ２３６０１９７ Ａ１に記載されているようなニポーディスク６４を照明する。ミニレンズアレー６５を通じて照明されたニポーディスクのピンホールは顕微鏡モジュール４内の試料に結像する。ここでも試料側の画像サイズを変更できるように、ズーム光学系４１が設置されている。

ニポースキャナの場合、図１の構造様式からは変更部分があり、照明はメインカラースプリッタ１７を通過させて行われ、検出光は反射分離される。さらに、ニポーディスク６４による多点照明の場合では、それに対応した平行な走査が行われるように、図２に変更を加えて検出器２８はスポット分解能を持つように作られている。そのほか、ニポーディスク６４とズーム光学系４１の間には、ニポーディスク６４のピンホールを通り抜ける発散光を適当な束直径に変換させる、正の屈折力を持った然るべき固定型光学系６３が配置されている。

メインカラースプリッタ１７は、図３のニポー式構造の場合では，旧来型のダイクロイックビームスプリッタであり、したがってスリット状または点状の反射領域を持つ上記ビームスプリッタではない。
ズーム光学系４１は上段で説明した構造様式に対応しているが、この場合はニポーディスク６４があるため、もちろんスキャナ１８は不要になる。しかし、図２を基に説明したＲＯＩ領域の選択を行いたい場合は、これを設置することができる。同じことがアッベ・ケーニッヒプリズムについても言える。

多点走査による別法が模式図として図４に示されているが、その方法では複数の光源がスキャナのひとみに対して斜めに照射される。この場合でもメインカラースプリッタ１７とスキャナ１８間での結像にズーム光学系４１を使用することにより、図２に描かれたようなズーム機能を実現することができる。ひとみに共役な平面に様々な角度から光線束を同時入射することにより、光点が対象物平面に共役な平面に形成され、それがスキャナ１８により同時に対象物フィールド全体のうちの一部領域上に誘導される。スポット分解性のあるマトリックス検出器２８では部分画像全体の評価を通して画像情報が生成される。

その他の実施態様としては、ＵＳ ６ ０２８ ３０６に記載されているような多点走査があるが、その開示内容の中で関連事項は本発明に包括的に取り入れられている。ここでもスポット分解性のある検出器２８を設置することができる。その場合は試料は多点光源によって照明されるが、それは、多点光源が実現されるようにマルチ開口プレートを照明する、マイクロレンズアレーの後続配置されたビームエキスパンダによってなされる。

図５は、（Ｘ／Ｙ）点像スキャナ、点光源および点検出器の使用下におけるフォーカシング装置を通じての大きな試料の走査を示している。ライン状に行われるＸ方向点走査における撮像／照明領域ＢＭは、スキャナのパラメータおよび使用光学系によって決定される。Ｙ方向における走査は、ここではスキャナに代わりボードの連続的Ｙ駆動で決定されるが、当該Ｙスキャナによって限定される、点像スキャナ通常の走査フィールドを越えている。

図６では図１に基づくライン状光源が試料に結像し、ボードがここでも同じようにＹ方向へシフトする。
３次元座標系は、z軸が顕微鏡光軸の方向になるように決定する。ｘ軸およびｙ軸ｚ軸に直交する。それらの精確な方向は方法を説明する上では重要でない。
本発明に基づく方法では、全領域の記録のため、データはｘ方向のラインに沿って記録される。顕微鏡ボードは一定速度でｙ軸方向に移動する。記録された個別ラインデータは、記録された順序で順次画像メモリの中の隣接ラインにコピーされる。
試料内の異なったｙポジションでこの工程を繰り返せば、ｘ方向もｙ方向も顕微鏡の最大画像フィールドよりも大きな画像を生成することができる。
大きなスタックの撮影では、上記に加え撮影ラインが周期的にｘ方向に追加シフトされる。

図７は、点像スキャナの場合に試料内レーザスポットが移動して描いた曲線を示している。
ラインスキャナの場合もこれに準じたことが行われる。
以下では、ボードの同じｘポジションで撮影された画像データセグメントを画像ストライプと言うことにする。左側にあるストライプのｘポジションは、例えばそれぞれスタート点のポジションということになろう。図はｘ（スタート）ポジションの異なる３つの画像ストライプを示している。
保存は、最終画像メモリに直接行うか、または個別画像ストライプ用の中間メモリに行うこともできる。後者の場合、画像ストライプは後に最終画像メモリの撮像ポジションに当る箇所に保存される。

ｘ、ｙ方向でのボード移動が不正確であれば、画像ストライプの接合箇所に目に見えるズレを来たす場合がある。これを避けるには、画像ストライプをオーバラップさせて撮影することができる。続いて、オーバラップ領域の画像情報から画像の特徴を引き出し、画像比較または相互に関連付けることで、各画像ストライプに対応するボードのリアルポジションを決定し、それに呼応して画像ストライプを移動させ最終メモリにコピーする。この場合画像ストライプ用に中間メモリが必要である。最低限のレベルでは１画像ストライプに１つの中間メモリで十分である。ボードのリアルポジションの決定は相互関連付けから行える。

撮影のためのボードのリアルポジション修正には次の過程が想定できる :
１． 第１画像ストライプの撮影および中間メモリへの保存
２． 中間メモリからの画像ストライプの最終画像メモリへのコピー
３． ｘ方向でのボードの移動
４． 次の画像ストライプの撮影
５． 中間メモリおよび最終画像メモリからのオーバラップ領域の取り出しおよびその画像データからボードの相対的リアルポジションの決定
６． 中間メモリからの画像ストライプの取り出しおよび最終画像メモリの特定ボードポジションに対応するポジションへのコピー
７．すべての画像ストライプを撮影すれば、撮影を終了する。そうでない場合は、ステップ３の撮影を続行する。

光源モジュール、走査モジュールおよび検出モジュールを有するレーザ走査顕微鏡の模式図 ズーム作用の効果を表わすための走査フィールドの模式図 ニポーディスク付きレーザ走査型顕微鏡の模式図 平行な多点照明および多点走査機能を持つレーザ走査型顕微鏡の模式図 （Ｘ／Ｙ）点像スキャナ、点光源および点検出器の使用下におけるフォーカシング装置を通じての大きな試料の走査 図１に基づくライン状光源が試料に結像し、ボードがここでも同じようにＹ方向へシフトする試料の走査 点像スキャナの場合に試料内レーザスポットが移動して描いた曲線

符号の説明

１ レーザ走査型顕微鏡
２ 光源モジュール
３ 走査モジュール
４ 顕微鏡モジュール
５ 検出モジュール
６，７ レーザユニット
８ 光バルブ
１０ 結合ポイント
１１ 光ファイバ
１２，１３ コリメータ
１４，１５ ビーム結合ミラー
１７ カラースプリッタ
１８ スキャナ
１９ 走査対物レンズ
２０ 鏡筒レンズ
２１ 対物レンズ
２２ 焦点
２３ 試料
２４ 転向ミラー
２６ スリット絞り
２７ ブロックフィルタ
２８ 検出器
２９ ハロゲンランプ
３４ 水銀蒸気ランプ
３６ ビームスプリッタ
３７ 円筒形テレスコープ
３８ 非球面ユニット
４０ 補正ユニット
４１ ズーム対物レンズ
４２ 固定式絞り
６４ ニポーディスク
ＳＦ 視野（走査フィールド）

Claims (3)

1. 光走査型顕微鏡であって、
   局所的に限定された領域を超えて第１の方向に向かって移動できる試料ボードであって、前記第１の方向は、前記顕微鏡の光軸と垂直である、前記試料ボードと、
   前記第１の方向への前記試料ボードの移動中に、前記局所的に限定された領域における試料の格子状の照明のためにライン状の光分布を生成する照明手段と、
   ライン状の試料光を検出するためのスポット分解能を有する検出手段であって、２次元の画像ストライプ内の検出された試料光のデータ、および前記試料ボードの位置を記録する前記検出手段と、
   前記試料ボードの位置に従って、前記記録されたデータから全体画像を生成する手段と、を備え、
   前記光分布の少なくとも１方向での移動により前記局所的に限定された領域が生成され、
   前記試料ボードが第１の方向に垂直に順次シフトして複数の走査領域が形成され、且つ前記試料ボードが順次シフトする際に前記試料ボードのシフト位置が保存される、光走査型顕微鏡。
2. 複数の走査領域が互に隣接していて、保存された走査領域のデータから画像が合成される、請求項１に記載の光走査型顕微鏡。
3. 走査領域がオーバラップしていて、保存されたボードポジションが画像比較を基に少なくとも１つの試料領域に対して修正される、請求項１または２に記載の光走査型顕微鏡。