JP2006031011A - 光走査型顕微鏡およびそれの使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】第1作業ステップで、試料23の照明、試料光の検出および検出データの記録、つまり少なくとも1つの第1方向での試料ボード移動過程におけるラスタフィールドサイズを越えての検出データの記録が行われ、それぞれのボードポジションの記録がデータ記録に割り振られる光走査型顕微鏡。
【選択図】図1
Description
図1は主要部が5つのコンポーネント、すなわち、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール2、励起光をコリメートして試料上の走査のため然るべき偏向を行なう走査モジュール3、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュール4および試料からの光線を受け止め検出する検出モジュール5から成るレーザ走査型顕微鏡1の模式図である。その場合検出モジュール5は、図1に描かれているように、スペクトル別のマルチチャネル型に構成することができる。
点状走査式のレーザ走査型顕微鏡に関する一般事項についてはDE 19702753A1が参考になり、したがってその内容は本明細書の構成部分でもある。
光ファイバ11に通されたビームは、移動式のコリメーション光学系12および13によりビーム結合ミラー14,15を通じて合一化され、ビーム形成ユニット内でビームの特性が変更される。
ビーム変形後では、ビームはプロフィール平面にはほぼ長方形のフィールドを照らし出す。その場合フィールドの長軸に沿った強度分布はガウス形ではなくボックス形である。
10257237 A1記載のスペクトル中性な分割ミラーとして形成されている。したがって、「カラースプリッタ」の概念には非スペクトル的に作用する分割システムの意が含まれている。記述のスペクトル非依存型カラースプリッタの代わりに、均一型中性スプリッタ(例えば50/50、70/30、80/20タイプなど)またはダイクロイックスプリッタを使用することができる。それにより、適用別に選択することが可能になるので、メインカラースプリッタとしては、交換可能な個別スプリッタを含む、例えば然るべきスプリッタ切換ダイヤルにより簡易交換のできる機構の備わっているのが好ましい。
ズーム倍率1.0未満が望まれる場合、円筒型テレスコープ37は自動的に光学光路内に旋回挿入される。これは、ズーム対物レンズ41が縮小された場合に開口絞り42への照明が不完全になるのを防止する。
円筒型テレスコープ37の旋回挿入時には照明光線による画像明度の急変が避けられないので、画像明度を一定に保つため、(図には描かれていない)制御ユニットでは、円筒型テレスコープ37が作動している場合、スキャナ18の送出し速度または検出モジュール5における検出器の増幅係数がそれ相応に適合するような設計がなされている。
スリット絞り26は、前方配置の丸型光学系44、同様に前方配置の第1円筒型光学系39および後方配置の第2円筒型光学系と共に検出システム5のピンホール対物レンズを形成するが、この場合のピンホールはスリット絞り26によって実現される。システム内で反射した励起光の意図しない検出を避けるため、第2円筒型レンズ39の前にはブロックフィルタ27も設置されており、これは求める蛍光ビームだけを検出器28、28Aに到達させるべく、それに適したスペクトル特性を有している。
共振型スキャナに関しては、例えばPawley著“Handbook of Biological Confocal Microscopy”Plenum
Press社1994年刊、461ページ以降に記述されている。
“Three-dimentional and maltidimantional microscopy ; Image aquisition processing VII” Proceeding
of SPIE 第3919巻(2000年)、141〜150ページのGustafsson, M.著“Doubling
the lateral resolution of wide−field fluorescence microscopy using structured illumination”に記載されているようなアルゴリズムに従って高分解性のある画像に修正することができる。
6 028 306、WO 88 07695またはDE 2360197 A1に記載されているようなニポーディスク64を照明する。ミニレンズアレー65を通じて照明されたニポーディスクのピンホールは顕微鏡モジュール4内の試料に結像する。ここでも試料側の画像サイズを変更できるように、ズーム光学系41が設置されている。
ズーム光学系41は上段で説明した構造様式に対応しているが、この場合はニポーディスク64があるため、もちろんスキャナ18は不要になる。しかし、図2を基に説明したROI領域の選択を行いたい場合は、これを設置することができる。同じことがアッベ・ケーニッヒプリズムについても言える。
3次元座標系は、z軸が顕微鏡光軸の方向になるように決定する。x軸およびy軸z軸に直交する。それらの精確な方向は方法を説明する上では重要でない。
本発明に基づく方法では、全領域の記録のため、データはx方向のラインに沿って記録される。顕微鏡ボードは一定速度でy軸方向に移動する。記録された個別ラインデータは、記録された順序で順次画像メモリの中の隣接ラインにコピーされる。
試料内の異なったyポジションでこの工程を繰り返せば、x方向もy方向も顕微鏡の最大画像フィールドよりも大きな画像を生成することができる。
大きなスタックの撮影では、上記に加え撮影ラインが周期的にx方向に追加シフトされる。
ラインスキャナの場合もこれに準じたことが行われる。
以下では、ボードの同じxポジションで撮影された画像データセグメントを画像ストライプと言うことにする。左側にあるストライプのxポジションは、例えばそれぞれスタート点のポジションということになろう。図はx(スタート)ポジションの異なる3つの画像ストライプを示している。
保存は、最終画像メモリに直接行うか、または個別画像ストライプ用の中間メモリに行うこともできる。後者の場合、画像ストライプは後に最終画像メモリの撮像ポジションに当る箇所に保存される。
1. 第1画像ストライプの撮影および中間メモリへの保存
2. 中間メモリからの画像ストライプの最終画像メモリへのコピー
3. x方向でのボードの移動
4. 次の画像ストライプの撮影
5. 中間メモリおよび最終画像メモリからのオーバラップ領域の取り出しおよびその画像データからボードの相対的リアルポジションの決定
6. 中間メモリからの画像ストライプの取り出しおよび最終画像メモリの特定ボードポジションに対応するポジションへのコピー
7.すべての画像ストライプを撮影すれば、撮影を終了する。そうでない場合は、ステップ3の撮影を続行する。
2 光源モジュール
3 走査モジュール
4 顕微鏡モジュール
5 検出モジュール
6,7 レーザユニット
8 光バルブ
10 結合ポイント
11 光ファイバ
12,13 コリメータ
14,15 ビーム結合ミラー
17 カラースプリッタ
18 スキャナ
19 走査対物レンズ
20 鏡筒レンズ
21 対物レンズ
22 焦点
23 試料
24 転向ミラー
26 スリット絞り
27 ブロックフィルタ
28 検出器
29 ハロゲンランプ
34 水銀蒸気ランプ
36 ビームスプリッタ
37 円筒形テレスコープ
38 非球面ユニット
40 補正ユニット
41 ズーム対物レンズ
42 固定式絞り
64 ニポーディスク
SF 視野(走査フィールド)
Claims (5)
- 大きさの制限されたラスタフィールド内で試料をラスタ状に照明するための少なくとも1次元の光分布装置、試料光捕捉のための検出装置および少なくとも1方向に移動できる試料ボードを有する光走査型顕微鏡であって、第1作業ステップで、試料の照明、試料光の検出および検出データの記録、つまり少なくとも1つの第1方向での試料ボード移動過程におけるラスタフィールドサイズを越えての検出データの記録が行われ、それぞれのボードポジションの記録がデータ記録に割り振られる光走査型顕微鏡。
- 光分布装置の少なくとも1方向での移動によりラスタフィールドが生成される、請求項1に記載の光走査型顕微鏡。
- 第2作業ステップで、第1の方向に垂直に試料ボードがシフトされてシフトポジションが保存される、および複数の走査領域の形成のために第1作業ステップが繰返し行われる、先行請求項の1つに記載の光走査型顕微鏡。
- 複数の走査領域が互に隣接していて、保存された走査領域のデータから画像が合成される、先行請求項の1つに記載の光走査型顕微鏡。
- 走査領域がオーバラップしていて、保存されたボードポジションが画像比較を基に少なくとも1つの試料領域に対して修正される、先行請求項の1つに記載の光走査型顕微鏡。
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