CN110638424B

CN110638424B - 一种扫描光片谐波显微成像方法及装置

Info

Publication number: CN110638424B
Application number: CN201910886847.7A
Authority: CN
Inventors: 王伟波; 吴必伟; 谭久彬
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN110638424A

Abstract

本发明涉及一种用于活体生物样品三维成像的扫描光片谐波显微成像方法及装置，属于光学显微成像技术领域；本发明采用柱面镜形成激光光片并通过扫描光片进行生物样品二次、三次谐波的面状激发，接着在垂直于激发光路方向上直接进行谐波信号的宽场成像。本发明装置包括激光光片生成系统、样品扫描旋转系统、谐波信号宽场成像系统、以及图像重建与数据处理系统。本发明利用扫描光片代替了传统谐波显微成像模式中的点扫描激发探测方式，能极大提升谐波显微成像的成像速度，实现高帧率、大视场、高探测深度的三维谐波显微成像。

Description

一种扫描光片谐波显微成像方法及装置

技术领域

本发明属于光学显微测量领域，主要涉及一种用于活体生物样品的三维成像的扫描光片谐波显微成像方法及装置。

背景技术

随着科学技术的不断发展，对活体生物样品进行高分辨率、高帧率、长时间、三维成像已成为系统生物学研究不可或缺的条件。近几年，研究人员开始采用非线性光学效应进行生物成像，以期获得传统显微无法探测到的样品结构信息。其中，谐波生成为非线性光学效应中的代表。二次、三次谐波生成过程只有虚拟的能量转换，且响应时间在飞秒量级。因此利用谐波生成过程进行成像可实现高灵敏度，高速响应成像。谐波信号是样品自身产生的非线性效应，不需要外在荧光标记，从而不影响生物样品的活性。因此，谐波显微成像允许对样品进行长时间探测而不影响活体生物样品正常的生命活动。但是由于传统谐波显微成像系统采用衍射极限光斑逐点扫描的方式进行谐波激发和探测，成像速度受到限制，无法实现高帧率高信噪比的动态成像。若要提升速度，则会牺牲成像的视场，因此扫描成像方式也使得成像视场也受到限制。

Huisken等人在2004年提出选择平面照明显微(SPIM)，该方法也为扫描光片显微中的一种。选择平面照明显微在对生物发展过程的三维成像中具有极大优越性。传统显微不能够提供足够的穿透深度以及获取速度来捕捉活体胚胎中的全部细节信息。由于整个生物体的尺寸和不透明性，使得在生物组织深度处获得单细胞分辨率变得十分困难。选择平面照明显微则可以很好的解决该问题。

因此，目前需要本领域技术人员迫切解决的一个技术问题就是：如何能够对活体样品进行高帧率、高穿透深度、大视场下的三维谐波显微成像。

发明内容

本发明的目的是为了克服已有技术的不足之处，提出一种扫描光片谐波显微成像方法及装置。本发明采用扫描光片进行生物样品谐波的激发，并在垂直方向上进行谐波信号的宽场成像。本发明克服了传统谐波显微成像方法在逐点扫描探测模式下成像速度慢、视场小的挑战。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提出的一种扫描光片谐波显微成像装置，其特征在于所述装置包括：激光光片生成系统、样品扫描旋转系统、谐波信号宽场成像系统、以及图像重建与数据处理系统；

其中：所述激光光片生成系统包括超短脉冲激光光源、光开关、光束变换单元，以及柱面镜；超短脉冲激光光源用于提供产生谐波信号的激发脉冲光，光开关用于激发光的开关控制，光束变换单元用于调整所述激发脉冲光光束尺寸，柱面镜用于扫描光片的生成，也可在激光光片生成系统中加入动态光学元件用于系统像差的校正。

所述样品扫描旋转系统置于激光光片生成系统之后，包括样品固定腔、微位移扫描平台、和旋转平台，旋转平台固定于微位移扫描平台之上，样品固定腔固定于旋转平台之上，样品固定腔用于保存和固定样品，微位移扫描平台用于样品的层析扫描，其运动方向垂直于激光光片生成系统的光轴方向，旋转平台用于样品固定腔及样品的旋转。

所述谐波信号宽场成像系统，其排布方向垂直于激光光片生成系统，包括谐波信号收集物镜，滤光片、成像透镜、以及信号探测相机，谐波信号收集物镜用于光片所激发出的宽场谐波信号的收集，滤光片用于除谐波信号外的杂散光的滤除，成像透镜用于谐波信号宽场成像聚焦，信号探测相机用于谐波宽场成像的信号探测与成像。

所述图像重建与数据处理系统，与所述样品扫描旋转系统中的微位移扫描平台、旋转平台和所述谐波信号宽场成像系统中的信号探测相机相连，用于对信号探测相机采集到的光片图像进行全局图像处理和三维重构。

所述的所有光学元件的光学面中心与入射激光和谐波信号的中心光束形成的光轴重合，所有透镜均垂直于光轴。

进一步地，所述的激光光片生成系统的光轴与谐波信号宽场成像系统的光轴垂直，即谐波信号收集物镜从侧面方向对谐波信号进行收集。

进一步地，所述的信号探测相机可以是CCD相机，sCMOS相机，EMCCD相机。

进一步地，所述的激光光片生成系统中，可包含可变形反射镜、空间光调制器等动态光学元件用于系统像差的校正。

进一步地，所述的谐波信号宽场成像系统，可采用二次三次谐波同步探测；用二向色镜分离二次、三次谐波信号；滤光片透过波长分别对应二次、三次谐波信号波长；独立的两个信号探测相机分别探测二次谐波和三次谐波信号，探测器灵敏波长分别对应相应的二次、三次谐波波长。

进一步地，所述的谐波信号宽场成像系统，可在激光光片生成系统的光轴的垂直方向两侧设置对称的探测臂，从两个相反方向进行谐波信号探测。

一种扫描光片谐波显微成像方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)激光光片生成系统产生激光光片，激发宽场谐波信号；

(2)样品扫描旋转系统中的微位移扫描平台在垂直于激光光片生成系统光轴方向上步进移动，使激光光片对样品进行层析扫描；

(3)谐波信号宽场成像系统对各个扫描位置的宽场谐波信号进行探测成像；

(4)图像重建与数据处理系统对信号探测相机采集到的宽场图像进行图像重建和数据处理，重构出该扫描方向最终的谐波图像；

(5)样品扫描旋转系统中旋转平台旋转一定角度，重复(1)-(4)的步骤，完成另一角度的光片扫描与谐波成像；

(6)重复以上步骤，完成对样品的全方位光片扫描谐波显微成像。

本发明所述的扫描光片谐波显微成像方法其特征在于所述的旋转平台每次旋转的角度是360°/n，旋转n次，其中n为正整数。

本发明所述的扫描光片谐波显微成像方法其特征在于若采用对称双臂探测装置，则将旋转次数减少为单臂探测时的一半。

本发明的有益效果在于，通过采用扫描光片的方式进行谐波信号的激发，在垂直于照明路径的方向上进行谐波信号的宽场成像，从而代替了传统谐波显微成像模式中的点扫描探测方式，能极大提升谐波显微成像的成像速度，实现高帧率、大视场、高探测深度的三维谐波显微成像。

附图说明

图1是本发明所述的扫描光片谐波显微成像装置的结构示意图。

图2是本发明实施例1的扫描光片谐波显微成像装置结构示意图。

图3是本发明实施例2的扫描光片谐波显微成像装置结构示意图。

图4是本发明实施例3的扫描光片谐波显微成像装置结构示意图。

图5是本发明实施例4的扫描光片谐波显微成像装置结构示意图。

其中：1-超短脉冲激光光源、2-光开关、3-第一光束变换单元、4-柱面镜、5-微位移扫描平台、6-旋转平台、7-第一谐波信号收集物镜、8-第一滤光片、9-第一成像透镜、10-第一信号探测相机、11-二向色镜、12-第二滤光片、13-第二成像透镜、14-第二信号探测相机、15、动态光学元件、16-第二光束变换单元、17-第二谐波信号收集物镜、18-第三滤光片、19-第三成像透镜、20-第三信号探测相机、21-图像重建与数据处理系统。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施实例对本发明做进一步详细的描述。

本发明提出的扫描光片谐波显微成像方法，该方法包括以下步骤：

(1)激光光片生成系统产生激光光片，激发宽场谐波信号；

本发明还根据上述方法提出一种扫描光片谐波显微成像装置，其结构如图1所示，包括：激光光片生成系统、样品扫描旋转系统、谐波信号宽场成像系统、以及图像重建与数据处理系统；

其中：激光光片生成系统包括超短脉冲激光光源、光开关、光束变换单元，以及柱面镜；超短脉冲激光光源用于提供产生谐波信号的激发脉冲光，光开关用于激发光的开关控制，光束变换单元用于调整所述激发脉冲光光束尺寸，柱面镜用于扫描光片的生成，也可在激光光片生成系统中加入动态光学元件用于系统像差的校正；

样品扫描旋转系统置于激光光片生成系统之后，包括样品固定腔、微位移扫描平台、和旋转平台，旋转平台固定于微位移扫描平台之上，样品固定腔固定于旋转平台之上，样品固定腔用于保存和固定样品，微位移扫描平台用于样品的层析扫描，其运动方向垂直于激光光片生成系统的光轴方向，旋转平台用于样品固定腔及样品的旋转；

谐波信号宽场成像系统，其排布方向垂直于激光光片生成系统，包括谐波信号收集物镜，滤光片、成像透镜、以及信号探测相机，谐波信号收集物镜用于光片所激发出的宽场谐波信号的收集，滤光片用于除谐波信号外的杂散光的滤除。成像透镜用于谐波信号宽场成像聚焦，信号探测相机用于谐波宽场成像的信号探测与成像；

图像重建与数据处理系统，与所述样品扫描旋转系统中的微位移扫描平台、旋转平台和所述谐波信号宽场成像系统中的信号探测相机相连，用于对信号探测相机采集到的光片图像进行全局图像处理和三维重构；

所有光学元件的光学面中心与入射激光和谐波信号的中心光束形成的光轴重合，所有透镜均垂直于光轴。

本发明装置中各组成部分的具体实现方式如下：

激光光片生成系统的光轴与谐波信号宽场成像系统的光轴垂直，即谐波信号收集物镜从侧面方向对谐波信号进行收集。

激光光片生成系统中，可包含可变形反射镜、空间光调制器等动态光学元件用于系统像差的校正。

谐波信号宽场成像系统中，信号探测相机可以是CCD相机，sCMOS相机，EMCCD相机等。

谐波信号宽场成像系统中，可采用二次三次谐波同步探测；用二向色镜分离二次、三次谐波信号；滤光片透过波长分别对应二次、三次谐波信号波长；独立的两个信号探测相机分别探测二次谐波和三次谐波信号，探测器灵敏波长分别对应相应的二次、三次谐波波长。

谐波信号宽场成像系统中，可在激光光片生成系统的光轴的垂直方向两侧设置对称的探测臂，从两个相反方向进行谐波信号探测。

实施例1：

本实施例1的一种扫描光片谐波显微成像装置示意图如图2所示。该装置包括超短脉冲激光光源1、光开关2、第一光束变换单元3、柱面镜4、微位移扫描平台5、旋转平台6、第一谐波信号收集物镜7、第一滤光片8、第一成像透镜9、第一信号探测相机10、图像重建与数据处理系统21。上述各元器件的连接关系为：所有光学元件的光学面中心与入射激光和谐波信号的中心光束形成的光轴重合，所有透镜均垂直于光轴；其中，超短脉冲激光光源1、光开关2、第一光束变换单元3、柱面镜4组成激光光片生成系统用于产生激光光片；微位移扫描平台5、旋转平台6组成样品扫描旋转系统，置于激光光片生成系统之后，用于实现样品的三维扫描以及全方位探测；第一谐波信号收集物镜7、第一滤光片8、第一成像透镜9、第一信号探测相机10组成谐波信号宽场成像系统，其光轴方向与激光光片生成系统光轴方向垂直，用于谐波信号的收集和宽场成像；图像重建与数据处理系统21与微位移扫描平台5、旋转平台6，以及第一信号探测相机10相连，用于信号的时序控制和同步探测，以及图像的三维重构。

本实施例中，谐波信号的探测方式为单侧收集；

所述的旋转平台在完成一个角度的光片扫描探测之后，每次旋转的角度为90°，旋转4次，完成全方位的光片扫描谐波成像。

实施例2：

本实施例2的一种扫描光片谐波显微成像装置示意图如图3所示。该装置包括超短脉冲激光光源1、光开关2、第一光束变换单元3、柱面镜4、微位移扫描平台5、旋转平台6、第一谐波信号收集物镜7、第一滤光片8、第一成像透镜9、第一信号探测相机10、二向色镜11、第二滤光片12、第二成像透镜13、第二信号探测相机14、图像重建与数据处理系统21。上述各元器件的连接关系为：所有光学元件的光学面中心与入射激光和谐波信号的中心光束形成的光轴重合，所有透镜均垂直于光轴；其中，超短脉冲激光光源1、光开关2、第一光束变换单元3、柱面镜4组成激光光片生成系统用于产生激光光片；微位移扫描平台5、旋转平台6组成样品扫描旋转系统，置于激光光片生成系统之后，用于实现样品的三维扫描以及全方位探测；第一谐波信号收集物镜7、第一滤光片8、第一成像透镜9、第一信号探测相机10、二向色镜11、第二滤光片12、第二成像透镜13、第二信号探测相机14组成谐波信号宽场成像系统，其中第一谐波信号收集物镜的光轴方向与激光光片生成系统光轴方向垂直，用于谐波信号的收集和宽场成像，二向色镜11用于分离二次、三次谐波的分离，从而实现样品二次、三次谐波信号的联合探测；图像重建与数据处理系统21与微位移扫描平台5、旋转平台6、第一信号探测相机10以及第二信号探测相机14相连，用于信号的时序控制和同步探测，以及图像的三维重构。

本实施例中，谐波信号的探测方式为单侧收集且为二次谐波、三次谐波联合探测，可同时获得二次谐波和三次谐波的宽场图像；

实施例3：

本实施例3的一种扫描光片谐波显微成像装置示意图如图4所示。该装置包括超短脉冲激光光源1、光开关2、第一光束变换单元3、柱面镜4、微位移扫描平台5、旋转平台6、第一谐波信号收集物镜7、第一滤光片8、第一成像透镜9、第一信号探测相机10、动态光学元件15、第二光束变换单元16、图像重建与数据处理系统21。上述各元器件的连接关系为：所有光学元件的光学面中心与入射激光和谐波信号的中心光束形成的光轴重合，所有透镜均垂直于光轴；其中，超短脉冲激光光源1、光开关2、第一光束变换单元3、动态光学元件15、第二光束变换单元16、柱面镜4组成可自适应校正像差的激光光片生成系统用于产生激光光片，其中动态光学元件15用于像差的自适应校正；微位移扫描平台5、旋转平台6组成样品扫描旋转系统，置于激光光片生成系统之后，用于实现样品的三维扫描以及全方位探测；第一谐波信号收集物镜7、第一滤光片8、第一成像透镜9、第一信号探测相机10组成谐波信号宽场成像系统，其中第一谐波信号收集物镜的光轴方向与激光光片生成系统光轴方向垂直，用于谐波信号的收集和宽场成像；图像重建与数据处理系统21与微位移扫描平台5、旋转平台6、动态光学元件15、第一信号探测相机10相连，用于信号时序和动态元件的控制和同步探测，以及图像的三维重构。

本实施例中，谐波信号的探测方式为单侧收集；

所述的光学动态元件可以是空间光调制器，可变形反射镜或空间光调制器，可变形反射镜组成的联用系统等；

实施例4：

本实施例4的一种扫描光片谐波显微成像装置示意图如图5所示。该装置包括超短脉冲激光光源1、光开关2、第一光束变换单元3、柱面镜4、微位移扫描平台5、旋转平台6、第一谐波信号收集物镜7、第一滤光片8、第一成像透镜9、第一信号探测相机10、第二谐波信号收集物镜17、第三滤光片18、第三成像透镜19、第三信号探测相机20、图像重建与数据处理系统21。上述各元器件的连接关系为：所有光学元件的光学面中心与入射激光和谐波信号的中心光束形成的光轴重合，所有透镜均垂直于光轴；其中，超短脉冲激光光源1、光开关2、第一光束变换单元3、柱面镜4组成激光光片生成系统用于产生激光光片；微位移扫描平台5、旋转平台6组成样品扫描旋转系统，置于激光光片生成系统之后，用于实现样品的三维扫描以及全方位探测；第一谐波信号收集物镜7、第一滤光片8、第一成像透镜9、第一信号探测相机10、第二谐波信号收集物镜17、第三滤光片18、第三成像透镜19、第三信号探测相机20组成谐波信号宽场成像系统，其中第一谐波信号收集物镜7、第一滤光片8、第一成像透镜9、第一信号探测相机10组成的探测臂光路位于与激光光片生成系统光轴方向的垂直方向的一侧，第二谐波信号收集物镜17、第三滤光片18、第三成像透镜19、第三信号探测相机20组成的另一侧探测臂光路位于与激光光片生成系统光轴方向的垂直方向的另一侧，实现了谐波信号的两侧收集和宽场成像；图像重建与数据处理系统21与微位移扫描平台5、旋转平台6、第一信号探测相机10、第三信号探测相机20相连，用于信号时序的控制和同步探测，以及图像的三维重构。

本实施例中，谐波信号的探测方式为两侧收集，从垂直于照明路径光轴方向的两侧同时进行谐波信号的宽场探测；

所述的旋转平台在完成一个角度的光片扫描探测之后，每次旋转的角度为90°，旋转2次，完成全方位的光片扫描谐波成像。

以上对本发明所提出的扫描光片谐波显微成像方法及装置进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，这些改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种扫描光片谐波显微成像装置，其特征在于所述装置包括：激光光片生成系统、样品扫描旋转系统、谐波信号宽场探测系统、以及图像重建与数据处理系统；

其中：所述激光光片生成系统包括超短脉冲激光光源、光开关、光束变换单元，以及柱面镜；超短脉冲激光光源用于提供产生谐波信号的激发脉冲光，光开关用于激发光的开关控制，光束变换单元用于调整所述激发脉冲光光束尺寸，柱面镜用于扫描光片的生成，也可在激光光片生成系统中加入动态光学元件用于系统像差的校正；

所述样品扫描旋转系统置于激光光片生成系统之后，包括样品固定腔、微位移扫描平台、和旋转平台，旋转平台固定于微位移扫描平台之上，样品固定腔固定于旋转平台之上，样品固定腔用于保存和固定样品，微位移扫描平台用于样品的层析扫描，其运动方向垂直于激光光片生成系统的光轴方向，旋转平台用于样品固定腔及样品的旋转；

所述谐波信号宽场探测系统，其排布方向垂直于激光光片生成系统，包括谐波信号收集物镜，滤光片、成像透镜、以及信号探测相机，谐波信号收集物镜用于光片所激发出的宽场谐波信号的收集，滤光片用于除谐波信号外的杂散光的滤除，成像透镜用于谐波信号宽场成像聚焦，信号探测相机用于谐波宽场成像的信号探测与成像，可在激光光片生成系统的光轴的垂直方向两侧设置对称的探测臂，从两个相反方向进行谐波信号探测，若采用对称双臂探测装置，则将旋转次数减少为单臂探测时的一半；

所述图像重建与数据处理系统，与所述样品扫描旋转系统中的微位移扫描平台、旋转平台和所述谐波信号宽场探测系统中的信号探测相机相连，用于对信号探测相机采集到的光片图像进行全局图像处理和三维重构；

2.根据权利要求1所述的一种扫描光片谐波显微成像装置，其特征在于所述的激光光片生成系统的光轴与谐波信号宽场探测系统的光轴垂直，即谐波信号收集物镜从侧面方向对谐波信号进行收集。

3.根据权利要求1所述的一种扫描光片谐波显微成像装置，其特征在于所述的信号探测相机可以是CCD相机，sCMOS相机，EMCCD相机。

4.根据权利要求1所述的一种扫描光片谐波显微成像装置，其特征在于所述的激光光片生成系统中，可包含可变形反射镜、空间光调制器用于系统像差的校正。

5.根据权利要求1所述的一种扫描光片谐波显微成像装置，其特征在于所述的谐波信号宽场探测系统，可采用二次三次谐波同步探测；用二向色镜分离二次、三次谐波信号；滤光片透过波长分别对应二次、三次谐波信号波长；独立的两个信号探测相机分别探测二次谐波和三次谐波信号，探测器灵敏波长分别对应相应的二次、三次谐波波长。