CN114355621B - 一种多点非标记差分超分辨成像方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于面阵探测器和艾里斑细分的多焦点非标记差分超分辨成像方法与装置，激光器发出的光被偏振分光镜分为偏振方向互相垂直的两束光，两束光分别被SLM的左右两个半屏加载的相位掩膜调制，两束光分别为实心光束和空心光束；之后实心光束和空心光进行合束，合束后的光束再被分为第一子光束和第二子光束，分别包含实心光束和空心光束，以一定角度入射到扫描振镜模块，并被物镜聚焦，形成第一焦斑组合和第二焦斑组合，从而在焦面上形成四个焦斑。基于时域转化为空域的方法，使用面阵探测器代替单点探测器，在相对较低成本下，可以实现对艾里斑4进行40个以上探测器的细分。同时，采用多焦点激发，进一步提升了系统的成像效率。

Description

一种多点非标记差分超分辨成像方法与装置

技术领域

本发明属于光学工程领域，特别涉及一种基于面阵探测器和艾里斑细分的多点非标记差分超分辨成像方法与装置。

背景技术

光学超分辨成像具有无损、直观、高分辨率的巨大优势，在过去的二十年里，人们提出并研制了多种超分辨显微镜。这些技术可分为两类：①荧光标记超分辨显微镜，包括发射损耗显微镜、定位显微镜、结构照明显微镜等；②非标记超分辨显微镜。非标记显微技术可以直观地观测样品结构，不受染料限制，但相较于荧光成像技术，非标记显微技术在超分辨能力上发展相对较慢。目前，较为流行的非标记超分辨率显微镜为近场扫描光学显微镜（SNOM）技术，但其成像速度较低，探针需要精密控制且极易损坏。对于非标记样品，由于缺少了荧光的非线性效应，成像系统无法有效的收集样品高频信息，使得荧光超分辨成像技术无法直接应用于非标记样品，导致非标记超分辨成像技术的空间分辨率总体上落后于荧光超分辨技术。随后，研究人员提出了多种基于纳米结构的非标记超分辨成像技术，如双曲色散超透镜、微球、基于超材料的固体浸没透镜（MSIL）和纳米线环形照明显微镜（NWRIM）等。虽然这些技术可以获得亚百纳米分辨率，但是往往仅限于表面探测，成像深度有限。另一方面，这些技术实现手段相对复杂，对器件制造提出更高的要求，增加了成本。总体来说，非标记超分辨显微成像技术大多局限于样品表面，无法在远场高分辨率显微成像上解析深度信息，这极大地限制了非标记显微成像技术在生命科学研究等领域的应用。

艾里斑细分技术是采用并行探测器将探测艾里斑进行细分再进行图像重组的一种成像探测技术，传统的基于艾里斑细分的差分成像系统往往基于单点探测器，因此要实现艾里斑的细分，需要多个单点探测器，通常情况下会使用多个单光子计数器来实现。理论上，细分数量越多，成像质量越好，所需要的单光子计数器的数量越多。目前报道的差分成像技术中，最多采用了19个单光子计数器，这是由于系统成本所限制的。蔡司公司的相关共聚焦设备可以实现37个探测器的细分，但该探测器不能单独出售，且目前只用于普通共聚焦成像。采用面阵探测器可以实现更多的细分，但由于面阵探测器单帧曝光速度无法与单光子探测器相比，极大的降低了成像速度。

此外，传统的差分成像需要采用空心焦斑和实心焦斑对样品扫描两次，相同条件下成像速度比共聚焦慢一倍。有研究人员采用双焦点（空心焦斑和实心焦斑）并行扫描，同时探测的方法实现差分成像，但系统结构较为复杂，且需要采用两个单光子计数器。

发明内容

针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明提出了一种基于面阵探测器和艾里斑细分的非标记差分超分辨成像方法与装置，用于实现对非标记细胞样品的深度超分辨成像。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种基于面阵探测器和艾里斑细分的多点非标记差分超分辨成像装置，包括激光器、偏振分光镜、SLM、扫描振镜模块和物镜，所述激光器发出的光被偏振分光镜分为偏振方向互相垂直的两束光，两束光分别被SLM的两个半屏加载的相位掩膜调制，其中一束光加载涡旋相位和倾斜相位，两束光分别为实心光束和空心光束；之后实心光束和空心光进行合束，合束后的光束再被分为能量相同的两束光，称为第一子光束和第二子光束，第一子光束和第二子光束分别包含实心光束和空心光束；第一子光束和第二子光束以一定角度入射到扫描振镜模块，并被物镜聚焦，形成第一焦斑组合和第二焦斑组合，从而在焦面上形成四个焦斑。

进一步的，所述第一焦斑组合和第二焦斑组合同时扫描。

进一步的，所述四个焦斑激发的光束被物镜收集后，被反射进入面阵探测器，从而在面阵探测器上形成四个探测焦斑。

进一步的，在面阵探测器前设置透镜。

进一步的，在面阵探测器前设置一维振镜。

进一步的，通过扫描振镜模块扫描组成图像，再经过图像反卷积和平移，得到最终的图像。

一种基于面阵探测器和艾里斑细分的多点非标记差分超分辨成像方法，包括如下步骤：

步骤1、将激光器发出的平行光束一次通过起偏器和半波片，再经过偏振分光镜分为两束偏振态相互垂直的偏振光；

步骤2、将其中一束光入射到SLM一半屏幕上；将另一束光入射到SLM的另一半屏幕上，在SLM其中一个半屏幕上加载倾斜相位，并叠加涡旋相位；

步骤3、从SLM反射出来的两束光，各自经过一个1/4波片后，经另一偏振分光镜进行合束；

步骤4、合束后的光束再通过普通分光镜进行分束；

步骤5、将分束后的两束光各自以一定角度穿过半反半透镜，并入射到扫描振镜模块；

步骤6、从扫描振镜模块出射的两束光依次经过扫描镜、场镜、物镜后，在焦面聚焦为四个焦斑，为两个空心焦斑和两个实心焦斑；

步骤7、调整SLM上倾斜相位，使空心焦斑靠近实心焦斑，两者相邻；

调整两束光入射到半反半透镜上的角度，使两对焦斑各自扫描一定的区域；通过扫描振镜模块对样品上一定的区域进行扫描，再用物镜收集返回的信号光；

步骤8、在半反半透镜后设置透镜和一维振镜，不同焦斑激发的信号光反射进入到面阵探测器中。

进一步的，所述扫描振镜模块扫描的同时，一维振镜同时进行一维扫描，使信号光在面阵探测器单帧曝光时间内划出一条覆盖若干像素的直线，四个焦斑在面阵探测器单帧曝光时间内画出四条直线。

进一步的，对应扫描振镜模块的单点曝光时间，将面阵探测器的图像进行细分，不同区域的像素对应不同曝光时间的信号；对像素进行重组，获得若干幅图像；对图像进行反卷积、平移和拼接处理，得到最终的图像。

本发明的有益效果：本发明的基于面阵探测器和艾里斑细分的多焦点非标记差分超分辨成像装置，基于时域转化为空域的方法，使用面阵探测器代替单点探测器，在相对较低成本下，可以实现对艾里斑进行40个以上探测器的细分。同时，与传统单点扫描成像系统相比，帧率保持不变。采用多焦点激发，进一步提升了系统的成像效率。

附图说明

图1a为艾里斑细分理想情况下并行探测原理示意图；

图1b为艾里斑细分实际情况下并行探测示意图；

图2为本发明的基于面阵探测器的艾里斑细分的实例原理示意图；图中依次为探测器像面、50μs光斑移动的图像、一个像素组，20×20像素、binning为10×10像素；

图3为本发明的基于面阵探测器和艾里斑细分的多焦点非标记差分超分辨成像装置示意图；

图4为本发明的基于面阵探测器和艾里斑细分的多焦点非标记差分超分辨成像装置成像原理图；图中依次为子光束形成的焦斑，两个子光束扫描区域，面阵探测器像面使用情况，初步焦斑实验结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

艾里斑细分是采用并行探测器将探测艾里斑进行细分再进行图像重组的过程。如图1a所示，理想的并行探测器数量越多成像质量越好。以61个探测器覆盖一个艾里斑为例，那么最终将同时得到61幅图像，再将图像平移重组后得到一帧图像。该方法虽然没有打破衍射极限，但极大地提升了高频信息比重，进而获得超越常规共聚焦成像的分辨率和信噪比。虽然细分越多，成像质量越好，但所需的探测器数量越多。而在实际中，如果采用单光子计数器作为探测器，一方面由于目前没有商用产品，制造这样的并行探测器难度较高，质量难以保证。另一方面，采用单光子计数器实现61细分，将导致系统成本极高。采用面阵探测器可以实现更多的细分，但由于面阵探测器单帧曝光速度无法与单光子探测器相比，极大的降低了成像速度。如图1b所示，为此，本发明基于面阵探测器，提出了一种新型并行探测技术，在实现高度细分艾里斑的基础上，获得媲美点扫描成像的帧率。

如图2所示，为本发明的基于面阵探测器和艾里斑细分的实例原理示意图。这里对比点扫描成像进行说明，假如点扫描成像获得一幅512×512像素的图像，单点曝光时间6μs，则单帧时间为1.6s。若采用一款高速相机（pco.dimax cs1）作为探测器，该相机在全像素（1296×1024 pixels）下帧达到3086fps，528×528像素下可达10782fps，单帧最短曝光时间92μs。将探测艾里斑直径调控为20个像素，再将20×20个像素作为一个像素组，假如探测艾里斑在该时间内在探测器像面移动覆盖了500个像素，也就是25个像素组，就可以得到25个艾里斑的信息，每个艾里斑曝光6μs，那么等同于在150μs里曝光了25次，即得到了25个扫描点的信息，针对521×512像素的图像，每帧时间依然为1.6s。针对艾里斑，覆盖了400个像素，为了提升信噪比，做一次2×2的像素合并（binning），整合为100个像素，等同于100个探测器，除去无效像素后也超过了61个探测器。因此，该技术不仅实现了高达61个探测器的艾里斑细分，同时获得了媲美点扫描成像的帧率，更极大的节省了系统成本。

如图3所示，为本发明的一种基于面阵探测器和艾里斑细分的多焦点非标记差分超分辨成像装置。由于传统差分成像需要采用实心光与空心光各扫描样品一次，对于512×512像素、单点曝光为6μs的图像，实际成像时间约为3.2s。为此本发明采用多焦点并行激发的策略，进一步提升效率。激光器1发出的光经过起偏器2和半波片3调控后，被偏振分光镜分4为两束。一束经半波片6和反射镜7后，入射到SLM8右半屏。另一束经反射镜9入射到左半屏。在左半屏加载涡旋相位并叠加倾斜相位，是经过左半屏反射的光束变为空心光束。右边屏加载普通像差矫正相位，依然为实心光束。左半屏出射的空心光束经反射镜10反射进入合束棱镜11。右半屏出射的实心光束进入合束棱镜11后与空心光束进行合束，合束后的光束被1/4波片12转化为圆偏光，再被分束棱镜13分为能量相同的两束光，即第一子光束31和第二子光束32。第一子光束31经过反射镜14和15反射，经过半反半透镜16进入扫描振镜模块20。第二子光束32经过反射镜17、18和19反射，经过半反半透镜16进入扫描振镜模块20。第一子光束31和第二子光束32形成一定角度。两束光再经过扫描镜21、场镜22和物镜23聚焦后，便会形成四个焦斑，即第一子光束31形成一个实心斑、一个空心斑，即第一焦斑组合41。第二子光束32形成一个实心斑、一个空心斑，即第二焦斑组合42，最后是产生四个焦斑。四个焦斑激发的信号，经过物镜收集，再被半反半透镜16和反射镜24反射，经过一个透镜25和一维振镜26后进入面阵探测器27。

如图4所示，为本发明的基于面阵探测器和艾里斑细分的多焦点非标记差分超分辨成像装置成像原理图。第一焦斑组合41和第二焦斑组合42分别扫描一半的目标区域，由于焦斑错位，所以有一部分扫描区域只有被空心焦斑或实心焦斑扫描，这部分区域被舍弃。另一个区域是重叠区域，这部分区域被第一焦斑组合41的实心斑扫描，被第二焦斑组合42的空心斑扫描，这部分区域依然可用。

在单帧曝光时间内，通过一维振镜扫描，使四个信号光在SCMOS像面上画出四条线。SCMOS使用区域内，没有接收信号的像元被弃用，以减少数据量。

Claims (8)

1.一种基于面阵探测器和艾里斑细分的多点非标记差分超分辨成像装置，包括激光器（1）、偏振分光镜（4）、SLM（8）、扫描振镜模块（20）和物镜（23），其特征在于：所述激光器（1）发出的光被偏振分光镜（4）分为偏振方向互相垂直的两束光，两束光分别被SLM（8）的两个半屏加载的相位掩膜调制，其中一束光加载涡旋相位和倾斜相位，两束光分别为实心光束和空心光束；之后实心光束和空心光进行合束，合束后的光束再被分为能量相同的两束光，称为第一子光束（31）和第二子光束（32），第一子光束（31）和第二子光束（32）分别包含实心光束和空心光束；第一子光束（31）和第二子光束（32）以一定角度入射到扫描振镜模块（20），并被物镜（23）聚焦，形成第一焦斑组合（41）和第二焦斑组合（42），从而在焦面上形成四个焦斑；所述四个焦斑激发的光束被物镜收集后，被反射进入面阵探测器（27），从而在面阵探测器（27）上形成四个探测焦斑。

2.如权利要求1所述的基于面阵探测器和艾里斑细分的多点非标记差分超分辨成像装置，其特征在于：所述第一焦斑组合（41）和第二焦斑组合（42）同时扫描。

3.如权利要求1所述的基于面阵探测器和艾里斑细分的多点非标记差分超分辨成像装置，其特征在于：在面阵探测器（27）前设置透镜（25）。

4.如权利要求1所述的基于面阵探测器和艾里斑细分的多点非标记差分超分辨成像装置，其特征在于：在面阵探测器（27）前设置一维振镜（26）。

5.如权利要求1所述的基于面阵探测器和艾里斑细分的多点非标记差分超分辨成像装置，其特征在于：通过扫描振镜模块（20）扫描组成图像，再经过图像反卷积和平移，得到最终的图像。

6.一种基于面阵探测器和艾里斑细分的多点非标记差分超分辨成像方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1、将激光器（1）发出的平行光束一次通过起偏器（2）和半波片（3），再经过偏振分光镜（4）分为两束偏振态相互垂直的偏振光；

步骤2、将其中一束光入射到SLM（8）一半屏幕上；将另一束光入射到SLM（8）的另一半屏幕上，在SLM（8）其中一个半屏幕上加载倾斜相位，并叠加涡旋相位；

步骤3、从SLM（8）反射出来的两束光，先经过合束棱镜（11）进行合束，再经过一个1/4波片；

步骤4、合束后的光束再通过普通分光镜进行分束；

步骤5、将分束后的两束光各自以一定角度穿过半反半透镜（16），并入射到扫描振镜模块（20）；

步骤6、从扫描振镜模块（20）出射的两束光依次经过扫描镜（21）、场镜（22）、物镜（23）后，在焦面聚焦为四个焦斑，为两个空心焦斑和两个实心焦斑；

步骤7、调整SLM（8）上倾斜相位，使空心焦斑靠近实心焦斑，两者相邻；

调整两束光入射到半反半透镜（16）上的角度，使两对焦斑各自扫描一定的区域；通过扫描振镜模块（20）对样品上一定的区域进行扫描，再用物镜（23）收集返回的信号光；

步骤8、在半反半透镜（16）后设置透镜（25）和一维振镜（26），不同焦斑激发的信号光反射进入到面阵探测器（27）中。

7.如权利要求6所述的基于面阵探测器和艾里斑细分的多点非标记差分超分辨成像方法，其特征在于：

所述扫描振镜模块（20）扫描的同时，一维振镜（26）同时进行一维扫描，使信号光在面阵探测器（27）单帧曝光时间内划出一条覆盖若干像素的直线，四个焦斑在面阵探测器单帧曝光时间内画出四条直线。

8.如权利要求7所述的基于面阵探测器和艾里斑细分的多点非标记差分超分辨成像方法，其特征在于：

对应扫描振镜模块（20）的单点曝光时间，将面阵探测器的图像进行细分，不同区域的像素对应不同曝光时间的信号；对像素进行重组，获得若干幅图像；对图像进行反卷积、平移和拼接处理，得到最终的图像。

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