CN110146473A - 一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置及方法，属于激光点扫描显微领域，实现了对样品的双光子轴向超分辨成像。通过飞秒激光器发出超短脉冲激光，以实现荧光样品的双光子激发；通过空间光调制器对激发光进行相位调制，依次用轴向实心光斑和轴向空心光斑扫描样品，对得到的两幅扫描双光子图像进行权重差分最终得到轴向超分辨图像。相对于其他双光子轴向超分辨成像显微镜，该装置其结构简单，成像深度大，为生命科学和纳米技术提供了良好的研究手段。

Description

一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置及方法

技术领域

本发明涉及激光点扫描显微领域，具体地说，涉及一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置及方法。

背景技术

双光子显微技术在生命科学领域的应用越来越广泛。相较于传统的单光子荧光显微技术，双光子可以实现更深的穿透深度，并且由于双光子激发需要较高的光子密度，因此双光子的吸收仅仅局限在焦点附近很小的范围内，一定程度上提高了轴向分辨率。

此外，双光子成像通常采用红外波段的激发光源，对活体细胞和组织的光损伤比较小，能够进行长时间的成像。虽然根据阿贝衍射理论计算，波长越长，衍射极限越大，但双光子由于其穿透深度深、光损伤较小、光学切片功能更好等优势被广泛运用在生物领域的研究。

当一个点光源经过成像系统后，由于衍射效应，会在像面上形成一个艾里斑，并用点扩散函数(Point Spread Function，PSF)来描述。在横向(x-y)，它的分布为贝塞尔函数，而在轴向(z)则可以用辛格函数(sinc)来描述。一般认为，轴向的分辨率会2～3倍差于横向分辨率。

但对轴向延展的生物组织，如对神经元成像，轴向分辨率的限制会极大程度地降低成像质量。目前双光子组织成像中也存在一些技术与方法，例如，双光子显微技术与自适应光学(Adaptive Optics)、光切片显微技术(Light Sheet Microscopy)、受激辐射损耗超分辨显微技术(Stimulation Emission Depletion Microscopy)等结合使用。

然而，系统的轴向分辨率仍未得到改善，这对于分析组织样本的轴向信息是不利的。可见，提高双光子成像的轴向分辨率对于生物研究的成像有着重要的研究意义与实用价值。

发明内容

本发明的目的为提供一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置，可实现对样品的轴向超分辨成像。

本发明的另一目的为提供一种轴向超分辨的双光子荧光显微方法，该方法基于上述轴向超分辨的双光子荧光显微装置实现。

为了实现上述目的，本发明提供的轴向超分辨的双光子荧光显微装置包括激发光路和探测光路，激发光路上沿光路依次布置有：

飞秒激光器，用于发出超短脉冲激光对荧光样品进行双光子激发；

第一半波片，用于调节设于飞秒激光器之后的光参量振荡器出射光的s光和p光的比例；

偏振分束器，与第一半波片配合，调节光路中的光强；

起偏器，使p偏振光入射到空间光调制器；

空间光调制器，用于将光斑调制成轴向空心光斑；

第二半波片，用于将线偏振光转换为圆偏振光，其后设有扫描系统和二色镜，激发光透过二色镜进入显微物镜，照明荧光样品，荧光样品产生的荧光经二色镜后反射进入探测光路；

探测光路上设有用于聚焦荧光的场镜和将探测到的光信号转换成为电信号并传至计算机的探测器；

计算机用于处理探测器传送过来的电信号，并控制振镜系统对样品进行x和y方向上的扫描以及控制显微物镜轴向移动进行z方向上的扫描。

上述技术方案中，通过空间光调制器对激发光进行相位调制，依次用轴向实心光斑和轴向空心光斑扫描样品，对得到的两幅扫描图像进行权重差分最终得到轴向超分辨图像。相对于其他轴向超分辨成像显微镜，该装置其结构简单，成像深度大，为生命科学和纳米技术提供了良好的研究手段。

为了使激发光束为理想的圆偏振光，作为优选，第二半波片之后的光路上设有四分之一波片，用于补偿后续元件造成的圆偏振光的偏振变化。

作为优选，空间光调制器对激发光斑进行0～π相位调制。

为了稳固地放置样品，作为优选，荧光样品放置在固定的载物台上。

作为优选，探测器为光电倍增管。

作为优选，振镜系统包括分别用于x方向与y方向上扫描的两片扫描振镜。

为了实现上述另一目的，本发明提供的轴向超分辨的双光子荧光显微方法包括以下步骤：

1)飞秒激光器发出激发光束，经过光参量振荡器出射，并经过第一半波片和偏振分束镜后得到的线偏振光；

2)线偏振光束进入起偏器，保证入射到空间光调制器的光束为p偏振光；

3)空间光调制器对入射光进行0～π相位调制，得到双光子轴向空心激发光斑；

4)依次用实心光斑和轴向空心光斑扫描同一样品同一区域分别得到实心光斑扫描图像和轴向空心光斑扫描图像，利用荧光差分方法，选择差分系数，得到轴向超分辨显微图像。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明实现了对样品的轴向超分辨成像。通过空间光调制器对激发光进行相位调制，依次用轴向实心光斑和轴向空心光斑扫描样品，对得到的两幅扫描图像进行权重差分最终得到轴向超分辨图像。相对于其他轴向超分辨成像显微镜，该装置其结构简单，成像深度大，为生命科学和纳米技术提供了良好的研究手段。

附图说明

图1为本发明实施例的轴向超分辨的双光子荧光显微装置的示意图；

图2为本发明实施例的空间光调制器的相位模式；

图3为本发明实施例的轴向实心光斑减去空心光斑差分超分辨示意图，(a)为轴向实心光斑示意图，(b)为轴向空心光斑示意图，(c)为差分结果示意图；

图4为本发明实施例的轴向点扩散函数一维曲线图，实线为实心轴向点扩散函数，虚线为空心轴向点扩散函数，强度都进行了归一化处理；

图5为本发明实施例的差分点扩散函数与原点扩散函数的对比图，虚线为实心轴向点扩散函数一维曲线图，实线为差分结果的轴向点扩散函数一维曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合实施例及其附图对本发明作进一步说明。

实施例

参见图1，本实施例的轴向超分辨的双光子荧光显微装置，包括飞秒激光器1，光参量振荡器2，第一半波片3，偏振分束器4，反射镜5，反射镜6，起偏器7，空间光调制器8，反射镜9，反射镜10，第二半波片11，四分之一波片12，反射镜13，反射镜14，扫描镜15，扫描镜16，扫描透镜17，场镜18，反射镜19，二色镜20，显微物镜21，样品22，滤光片23，收集透镜24，光电倍增管25和计算机26。

采用图1所示的装置所实现的轴向超分辨双光子显微方法，其过程如下：

(1)飞秒激光器1发出照明光，经过光参量振荡器2出射，通过第一半波片3成为s光、p光比例经过调制的偏振光，通过第一半波片3和偏振分束器4实现对于光路中光强的调节；

(2)线偏振光束经过反射镜5和反射镜6进入起偏器7，起偏器7保证入射到空间光调制器8的光束为p偏振光；

(3)空间光调制器8对入射的p偏振光进行相位调制，在不进行相位调制的情况下得到实心激发光斑，在进行0～π相位调制的情况下得到轴向空心激发光斑，依次用实心光斑和轴向空心光斑扫描同一样品分别得到实心光斑扫描图像和轴向空心光斑扫描图像，通过利用两幅图像特殊权重差分最终得到轴向超分辨显微图像；

(4)经过空间光调制器8后的线偏振光经过反射镜9和反射镜10入射到第二半波片11和四分之一波片12，第二半波片11和四分之一波片12组合用于将线偏光调节成圆偏振光，并且补偿后续光路的光学元器件造成的偏振改变，使得入射到物镜21后焦面的光为理想的圆偏振光；

(5)从第二半波片11和四分之一波片12出射的光经反射镜13和反射镜14反射至扫描振镜15和扫描振镜16，扫描振镜15和扫描振镜16组成的振镜系统由计算机26控制，通过计算机26对振镜系统控制来完成二维扫描，得到样品对应的二维图像；

(6)激发光经过扫描透镜17和场镜18，经反射镜19反射，透过二色镜20进入显微物镜21，照明荧光样品；

(7)激光照明荧光样品后激发样品产生荧光，再经过物镜21收集后入射到二色镜20上，二色镜19反射荧光，使其入射到滤波片23上；荧光经滤光后，滤除了样品反射的激光和其他杂散光，经过收集透镜23聚焦到光电倍增管25上；

(8)由计算机26控制显微镜物镜21的轴向移动完成对样品的轴向扫描，最终得到样品对应的轴向截面图像。

本实施例的原理如下：

通过如图2的0～π相位调制得到轴向空心激发光斑如图3(b)，不加相位调制得到轴向实心激发光斑如图3(a)，用实心激发光斑和轴向空心激发光斑两种双光子激发模式的光斑扫描，分别得到两幅图像。第一幅是由实心光斑扫描得到的普通双光子成像图像，强度分布记为I_s(x，z)；另外一幅是由轴向空心光斑扫描得到的轴向空心双光子成像图像，强度分布记为I_h(x，z)。双光子轴向超分辨图像I_f(x，z)是光子成像图像与轴向空心双光子成像图像的特殊权重差分的结果，如图3(c)所示，表达式为：

I_f(x,z)＝I_s(x,z)-αI_h(x,z)

式中，I_f(x，z)，I_s(x，z)和I_h(x，z)在计算时均取归一化强度分布，α为权重因子，可根据实际成像效果确定。在计算过程中，有可能因为差分出现负强度问题，一般采取直接归零的方式。

从系统点扩散函数出发，对应的成像结果可表示为：

I_f(x,z)＝I_s(x,z)-αI_h(x,z)＝[PSF_s(x,z)-αPSF_h(x,z)]*O(x,z)

其中PSF_s(x,z)表示实心激发点扩散函数，PSF_h(x,z)表示轴向空心点扩散函数，O(x,z)表示物函数。则本系统实际的点扩散函数PSF_f(x,z)可表示为：

PSF_f(x,z)＝PSF_s(x,z)-αPSF_h(x,z)

三个点扩散函数对比图由图4、图5所示，在图5中可以看到在此实施例中双光子轴向点扩散函数的半高全宽得到压缩，这表明本实施例在轴向分辨率提升方面的能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置，包括激发光路和探测光路，其特征在于，所述激发光路上沿光路依次布置有：

飞秒激光器，用于发出超短脉冲激光对荧光样品进行双光子激发；

第一半波片，用于调节设于所述飞秒激光器之后的光参量振荡器出射光的s光和p光的比例；

偏振分束器，与所述第一半波片配合，调节光路中的光强；

起偏器，使p偏振光入射到空间光调制器；

空间光调制器，用于将光斑调制成轴向空心光斑；

第二半波片，用于将线偏振光转换为圆偏振光，其后设有扫描系统和二色镜，激发光透过所述二色镜进入显微物镜，照明荧光样品，所述荧光样品产生的荧光经二色镜后反射进入所述探测光路；

所述探测光路上设有用于聚焦荧光的场镜和将探测到的光信号转换成为电信号并传至计算机的探测器；

所述计算机用于处理探测器传送过来的电信号，并控制振镜系统对样品进行x和y方向上的扫描以及控制显微物镜轴向移动进行z方向上的扫描。

2.根据权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的第二半波片之后的光路上设有四分之一波片，用于补偿后续元件造成的圆偏振光的偏振变化。

3.根据权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的空间光调制器对激发光斑进行0～π相位调制。

4.根据权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的荧光样品放置在固定的载物台上。

5.根据权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的探测器为光电倍增管。

6.根据权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的振镜系统包括分别用于x方向与y方向上扫描的两片扫描振镜。

7.一种轴向超分辨的双光子荧光显微方法，基于权利要求1～4中任一权利要求所述的双光子荧光显微装置实现，其特征在于，包括以下步骤：

1)飞秒激光器发出激发光束，经过光参量振荡器出射，并经过第一半波片和偏振分束镜后得到的线偏振光；

2)线偏振光束进入起偏器，保证入射到空间光调制器的光束为p偏振光；

3)空间光调制器对入射光进行0～π相位调制，得到双光子轴向空心激发光斑；

4)依次用实心光斑和轴向空心光斑扫描同一样品同一区域分别得到实心光斑扫描图像和轴向空心光斑扫描图像，利用荧光差分方法，选择差分系数，得到轴向超分辨显微图像。