CN101915752B - 激光扫描成像装置 - Google Patents
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本发明涉及一种激光扫描成像装置，包括激光器、激光扫描镜、显微物镜、近红外散射光检测通道、双光子激发荧光检测通道、二次谐波检测通道和数据采集成像系统。该激光扫描成像装置可同时实现双光子激发荧光显微成像、二次谐波成像以及近红外散射成像，可广泛适用于活体生物样品的快速高分辨结构和功能成像等领域，具有较大的实用价值。
Description
【技术领域】
本发明涉及光学检测和成像技术领域，尤其涉及一种激光扫描成像装置。
【背景技术】
活体生物样品的快速高分辨结构和功能成像是现代生命科学研究中的重要课题。对活体生物样品进行观测需要同时满足以下条件：1.具有很高的空间和时间分辨能力，如亚细胞空间分辨能力(分子水平)和亚毫秒级时间分辨能力；2.对样品损伤小，可实现长时间观测；3.灵敏度高，特异性好。
双光子激发荧光显微成像是上世纪九十年代发展起来的一种新型高分辨光学显微成像技术。与单光子荧光显微成像技术(如宽场荧光成像、共聚焦荧光显微成像等)相比，双光子技术使用高峰值功率的近红外脉冲激光对生物样品进行高度局域化的荧光激发，具有成像深度深、分辨率高、低光漂白和光损伤等众多优点。因此，双光子激发荧光显微成像技术可以对生物样品，尤其是厚组织样品实现非侵入式的三维高分辨荧光成像，并可用于长时间动态观察活体生物样品，因而成为生命科学研究的重要工具。
二次谐波成像是近年来迅速发展起来的一种新型高分辨光学显微成像技术。与双光子激发荧光显微成像技术相同，二次谐波成像也具有非线性光学成像技术所特有的高分辨率和大成像深度，但与双光子激发过程相比，二次谐波产生过程不产生伴随的光化学过程，从而可避免双光子激发过程中产生的光漂白效应，减小对生物样品的损伤。此外，二次谐波成像还具有对微观结构对称性高度敏感的特点，这对于双光子激发荧光显微成像技术是一个强有力的补充。
但不论是双光子激发荧光显微成像还是二次谐波成像，其均不能获得全方位的检测信息，不能对生物样本进行多方位的成像。
【发明内容】
基于此，有必要提供一种检测信息丰富、可以对生物样本进行多方位成像的激光扫描成像技术。
一种激光扫描成像装置，包括激光器、激光扫描镜、显微物镜、近红外散射光检测通道、双光子激发荧光检测通道、二次谐波检测通道和数据采集成像系统；激光扫描镜接收激光器发出的激光并对激光进行二维平面上的扫描后将激光传到显微物镜并照射到待测样品上以激发出激发光，激发光包括近红外散射光信号、双光子激发荧光信号以及二次谐波信号，近红外散射光检测通道、双光子激发荧光检测通道和二次谐波检测通道分别接收待测样品发出的激发光并分别进行近红外散射光信号、双光子激发荧光信号和二次谐波信号的光电信号转换，数据采集成像系统收集光电转换后的信号并进行近红外散射成像、双光子激发荧光显微成像和二次谐波成像。
优选的，还包括设置在激光扫描镜与显微物镜之间共焦设置的透镜对，透镜对包括第一透镜和第二透镜，第一透镜的前焦点与激光扫描镜重合，第一透镜的后焦点与第二透镜的前焦点重合，第二透镜的后焦点与显微物镜的后焦点重合。
优选的，第一透镜和第二透镜的焦距与显微物镜的数值孔径和激光光束的直径匹配，激光经透镜对后光束的直径与显微物镜的数值孔径相同。
优选的，还包括设置在第二透镜的后焦点或显微物镜的后焦点处的第一滤光片，第一滤光片为长反短透型滤光片，波长大于700nm的光被反射，波长在700nm以下的光将透过；第一滤光片将经透镜对传过来的激光反射后传入显微物镜；双光子激发荧光检测通道和二次谐波检测通道分别接收透过第一滤光片的待测样品激发光。
优选的，还包括第二滤光片，第二滤光片为长反短透型滤光片，波长大于500nm的光被反射，波长在500nm以下的光将透过；双光子激发荧光检测通道接收被第二滤光片反射的待测样品激发光，二次谐波检测通道接收经第二滤光片透过的待测样品激发光。
优选的，近红外散射光检测通道包括第三滤光片和第一光电倍增管，第三滤光片为短波截止型滤光片，波长大于700nm的光将透过；第一光电倍增管接收透过第三滤光片的待测样品激发光并转换成近红外散射电信号传入数据采集成像系统。
优选的，双光子激发荧光检测通道包括第四滤光片和第二光电倍增管，第四滤光片为长波截止型滤光片，700nm以下波长的光将透过；第二光电倍增管接收透过第四滤光片的待测样品激发光，并转换成双光子激发电信号传入数据采集成像系统。
优选的，二次谐波检测通道包括第五滤光片和第三光电倍增管，第五滤光片为带通滤光片，中心波长为400nm，带宽10nm的光将透过；第三光电倍增管接收透过第五滤光片的激发光，并转换成二次谐波电信号传入数据采集成像系统。
优选的，还包括设置在激光器和激光扫描镜之间的用于实现激光功率衰减的电光调制器。
优选的，激光器为钛宝石锁模或光纤锁模的皮秒或飞秒脉冲激光器。
上述激光扫描成像装置可同时实现双光子激发荧光显微成像、二次谐波成像以及近红外散射成像，可广泛适用于活体生物样品的快速高分辨结构和功能成像等领域，具有较大的实用价值。
采用透镜对组成的中继系统，可以充分利用显微物镜的数值孔径，提高成像空间分辨率；在双光子激发荧光检测通道和二次谐波检测通道之前设置两道滤光片，将相应波长的激发光滤除，从而图像显示效果更好，图像更准确可靠。
【附图说明】
图1为激光扫描成像装置一实施例结构图。
图2为激光扫描成像装置中扫描镜与透镜对以及物镜之间位置关系示意图。
【具体实施方式】
通过加入近红外散射成像探测通道，重建出活体生物组织内部的光学特性参数(如吸收和散射系数等)分布图像，可以提供更多的检测信息，从而对双光子激发荧光显微成像和二次谐波成像技术进行补充。
下面主要结合附图说明激光扫描成像装置的结构。
如图1所示为一优选实施例中激光扫描成像装置的结构图。该激光扫描成像装置包括激光器10、电光调制器11、激光扫描镜12、透镜对13、第一滤光片14、显微物镜15、第二滤光片16、近红外散射光检测通道17、双光子激发荧光检测通道18、二次谐波检测通道19和数据采集成像系统20。
激光器10优选皮秒或者飞秒脉冲激光器，功率高，可调波长范围大约为700nm～1000nm，脉冲宽度大约为100飞秒(10-15秒)，脉冲重复频率大约为80MHz，脉冲峰值功率大约为数十千瓦，平均功率约为1瓦，满足双光子激发时所需要的在极短时间内聚集大量光子的需求，可作为理想的双光子激发光源。
电光调制器11主要用于调节激光器10发出的激光的功率，激光器10发出的高能激光需要进行适当衰减后才能照射到后续的光学器件和待测样品上，以避免烧损此类器件和待测样品。电光调制器11可以将激光器10发出的高能激光衰减至初始值的百分之一以下。
激光扫描镜12用于对激光进行XY二维方向上的逐行扫描，其速度可以达到每个像素点小于10微秒，从而实现二维平面上的快速成像。
为了使激光扫描镜12扫描后的光束能够顺利进入显微物镜15并实现对待测样品区域的扫描成像，本实施例中采用一共焦设置的透镜对13组成的中继系统，可以充分利用显微物镜15的数值孔径，提高成像空间分辨率。透镜对13包括第一透镜132和第二透镜134，所述共焦设置即第一透镜132的前焦点与激光扫描镜12重合，第一透镜132的后焦点与第二透镜134的前焦点重合，第二透镜134的后焦点与显微物镜15的后焦点重合，如图2所示，f为第一透镜132的焦距，f1为第二透镜134的焦距，F为显微物镜15的后焦距；第一透镜132和第二透镜134的焦距与显微物镜15的数值孔径和激光光束的直径匹配，从而激光经透镜对13后光束的直径变得与显微物镜15的数值孔径相同。如进入第一透镜132前的激光光束直径为2mm，显微物镜15的数值孔径为5mm，则可选择第一透镜132的焦距为50mm，选择第二透镜134的焦距为125mm，可以将2mm直径的光束扩束2.5倍至5mm，从而充分利用显微物镜15的数值孔径，提高成像空间分辨率。
激光器10发出的高能激光先经电光调制器11进行功率衰减调节后传到激光扫描镜12进行二维平面上的逐行扫描，扫描后的激光经透镜对13组成的中继系统进入显微物镜15并照射到待测样品上并激发出激发光，该激发光包括近红外散射光信号、近红外散射光信号以及二次谐波信号。激发光分别进入所述近红外散射光检测通道17、双光子激发荧光检测通道18和二次谐波检测通道19进行近红外散射光信号(波长为800nm)、双光子激发荧光信号(波长600～650nm)和二次谐波信号(波长为400nm)的光电信号转换，所述数据采集成像系统20收集检测转换信号并进行近红外散射成像、双光子激发荧光显微成像和二次谐波成像。
本实施例中在透镜对13与显微物镜15之间设置有第一滤光片14，该滤光片为长反短透型滤光片，波长大于700nm的光将被反射，波长在700nm以下的光将透过，由于激光器10发出的激光波长范围在700nm～1000nm，因此，可以利用第一滤光片14将透镜对13传来的激光反射传入所述显微物镜15，此外，第一滤光片14还可以对待测样品的激发光进行第一步筛选，以将长波长的近红外散射光信号与短波长的双光子激发荧光信号及二次谐波信号分离。
为了实现双光子激发荧光信号与二次谐波信号的分离，本实施例中还设置有第二滤光片16，用于实现对第一步筛选的激发光进行第二步的筛选，该滤光片同样为长反短透型滤光片，波长大于500nm的光将被反射，波长在500nm以下的光将透过。
近红外散射光检测通道17包括第三滤光片172和第一光电倍增管174，其中第三滤光片172为短波截止滤光片，只允许700nm以上波长的光通过，用于过滤二次谐波信号和双光子激发荧光信号，近红外散射光信号通过第三滤光片172后进入第一光电倍增管174，第一光电倍增管174将检测到的近红外散射光信号转换成近红外散射电信号，并传给所述数据采集成像系统20进行近红外散射成像。
双光子激发荧光检测通道18包括第四滤光片182和第二光电倍增管184，其中，第四滤光片182为长波截止型滤光片，700nm以下波长的光将透过，用于进一步过滤激发光；经第二滤光片16进行波长第二步筛选后的激发光经第四滤光片182再次进行波长选择后传入第二光电倍增管184，第二光电倍增管184将双光子激发荧光信号转换成双光子激发荧光电信号并传入数据采集成像系统20进行双光子激发荧光显微成像。
二次谐波检测通道19包括第五滤光片192和第三光电倍增管194，第五滤光片192为带通滤光片，只允许中心波长为400nm，带宽10nm的光透过；经第二滤光片16进行波长第二步筛选后的激发光经第五滤光片192再次进行波长选择后传入第三光电倍增管194，第三光电倍增管194将二次谐波信号转换成二次谐波电信号并传入数据采集成像系统20进行二次谐波成像。
数据采集成像系统20采集第一光电倍增管174、第二光电倍增管184和第三光电倍增管194传入的电信号进行图像重建，同时显示出近红外散射图像、双光子激发荧光显微图像和二次谐波图像。
上述激光扫描装置可同时实现双光子激发荧光显微成像、二次谐波成像以及近红外散射成像，可广泛适用于活体生物样品的快速高分辨结构和功能成像等领域，具有较大的实用价值。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (3)
1.一种激光扫描成像装置，其特征在于，包括激光器、激光扫描镜、显微物镜、近红外散射光检测通道、双光子激发荧光检测通道、二次谐波检测通道和数据采集成像系统；
所述激光扫描镜接收所述激光器发出的激光并对激光进行二维平面上的扫描后将所述激光传到所述显微物镜并照射到待测样品上以激发出激发光，所述激发光包括近红外散射光信号、双光子激发荧光信号以及二次谐波信号，所述近红外散射光检测通道、双光子激发荧光检测通道和二次谐波检测通道分别接收所述待测样品发出的激发光并分别进行近红外散射光信号、双光子激发荧光信号和二次谐波信号的光电信号转换，所述数据采集成像系统收集光电转换后的信号并进行近红外散射成像、双光子激发荧光显微成像和二次谐波成像；还包括设置在所述激光扫描镜与所述显微物镜之间共焦设置的透镜对，所述透镜对包括第一透镜和第二透镜，所述第一透镜的前焦点与所述激光扫描镜重合，所述第一透镜的后焦点与第二透镜的前焦点重合，所述第二透镜的后焦点与所述显微物镜的后焦点重合，所述第一透镜和第二透镜的焦距与所述显微物镜的数值孔径和激光光束的直径匹配，激光经透镜对后光束的直径与所述显微物镜的数值孔径相同；还包括设置在所述第二透镜的后焦点或显微物镜的后焦点处的第一滤光片，所述第一滤光片为长反短透型滤光片，波长大于700nm的光被反射，波长在700nm以下的光将透过；所述第一滤光片将经透镜对传过来的激光反射后传入所述显微物镜；所述双光子激发荧光检测通道和所述二次谐波检测通道分别接收透过所述第一滤光片的待测样品激发光；还包括第二滤光片，所述第二滤光片为长反短透型滤光片，波长大于500nm的光被反射，波长在500nm以下的光将透过；所述双光子激发荧光检测通道接收被所述第二滤光片反射的待测样品激发光，所述二次谐波检测通道接收经所述第二滤光片透过的待测样品激发光；所述近红外散射光检测通道包括第三滤光片和第一光电倍增管，所述第三滤光片为短波截止型滤光片，波长大于700nm的光将透过；所述第一光电倍增管接收透过所述第三滤光片的待测样品激发光并转换成近红外散射电信号传入所述数据采集成像系统；所述双光子激发荧光检测通道包括第四滤光片和第二光电倍增管，所述第四滤光片为长波截止型滤光片，700nm以下波长的光将透过；所述第二光电倍增管接收透过所述第四滤光片的待测样品激发光，并转换成双光子激发电信号传入所述数据采集成像系统；所述二次谐波检测通道包括第五滤光片和第三光电倍增管，所述第五滤光片为带通滤光片，中心波长为400nm，带宽10nm的光将透过；所述第三光电倍增管接收透过所述第五滤光片的激发光，并转换成二次谐波电信号传入所述数据采集成像系统。
2.如权利要求1所述的激光扫描成像装置，其特征在于，还包括设置在所述激光器和激光扫描镜之间的用于实现激光功率衰减的电光调制器。
3.如权利要求1所述的激光扫描成像装置，其特征在于，所述激光器为钛宝石锁模或光纤锁模的皮秒或飞秒脉冲激光器。
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