JP5250749B2 - 点状光源分布式の光走査型顕微鏡およびそれの使用 - Google Patents
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Description
本発明は、US 6028306のような多点照明にもUS 6028306、WO 8807695、EP 539691A1のようなニポー型装置にも有利に適用することができる。
図1は主要部が5つのコンポーネント、すなわち、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール2、励起光をコリメートして試料上の走査のため然るべき偏向を行なう走査モジュール3、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュール4および試料からの光線を受け止め検出する検出モジュール5から成るレーザ走査型顕微鏡1の模式図である。その場合検出モジュール5は、図1に描かれているように、スペクトル別のマルチチャネル型に構成することができる。
点状走査式のレーザ走査型顕微鏡に関する一般事項についてはDE 19702753A1が参考になり、したがってその内容は本明細書の構成部分でもある。
光ファイバ11に通されたビームは、移動式のコリメーション光学系12および13によりビーム結合ミラー14,15を通じて合一化され、ビーム形成ユニット内でビームの特性が変更される。
線形ビームとも言われるこの照明光は励起光として用いられ、メインカラースプリッタ17を通じてスキャナ18に誘導される。メインカラースプリッタについては後ほど詳しく述べるので、ここでは顕微鏡モジュール4から戻ってきた試料光を励起光から分離させる機能を持つことだけを指摘しておく。
スリット絞り26の後方にはさらに、検出モジュール5に到達した歓迎されざる励起光をブロックするためのブロックフィルタ27が配置されている。特定深度の切断面に由来する、このように分離され扇形に広がった線形ビームは、次に然るべき検出器28によって分析される。上記のカラーチャネルと同様に、スリット絞り26a、ブロックフィルタ27aおよび検出器28aを持つ第2スペクトル検出チャネルも構成されている。
ビーム変形後では、ビームはプロフィール平面にはほぼ長方形のフィールドを照らし出す。その場合フィールドの長軸に沿った強度分布はガウス形ではなくボックス形である。
図1に矢印で示されたモータによるズーム光学系41の自由移動度は、結像倍率、焦点位置、ひとみ位置の3つのパラメータの適合化に想定されている自由度の数値に精確に一致している。その出力側のひとみに固定式絞り42の配置されたズーム光学系41が特に好ましい。絞り42を実地で簡単に実現するには、スキャナ18鏡面幅の制限によって構成することもできる。
ズーム光学系41と共同作用をする円筒型テレスコープ37は、同じくモータ作動式であり、非球面ユニット38の前に配置されている。図2の実施態様ではコンパクト構造の理由からこれが選ばれているが、そのようにする必要はない。
スリット絞り26は、前方配置の丸型光学系44、同様に前方配置の第1円筒型光学系39および後方配置の第2円筒型光学系と共に検出システム5のピンホール対物レンズを形成するが、この場合のピンホールはスリット絞り26によって実現される。システム内で反射した励起光の意図しない検出を避けるため、第2円筒型レンズ39の前にはブロックフィルタ27も設置されており、これは求める蛍光ビームだけを検出器28、28aに到達させるべく、それに適したスペクトル特性を有している。
共振型スキャナに関しては、例えばPawley著“Handbook of Biological Confocal Microscopy”Plenum Press社1994年刊、461ページ以降に記述されている。
ズーム光学系41は上段で説明した構造様式に対応しているが、この場合はニポーディスク64があるため、もちろんスキャナ18は不要になる。しかし、図2を基に説明したROI領域の選択を行いたい場合は、これを設置することができる。同じことがアッベ・ケーニッヒプリズムについても言える。
ラインスキャナ(詳細は図1参照)の模式図にあるように、交換可能なダイクロイックビームスプリッタの使用下、たとえば分離ハンドルTにより異なったスペクトルの検出波長間の迅速交換が、および複数のライン検出器、ここでは1および2の番号が付けられた検出器により平行して検出が行われる。
ここでは、スペクトル検出モジュールの変更に代えて、またはそれに加えてZ方向でのスライス厚の変更を実現するための調整可能なスリット絞りが図示されている。
軸方向または横方向の分割を伴うビーム多重化の場合は、ダイクロイックビームスプリッタの代わりに中性スプリッタを使用することもできる。光線経路の軸方向または横方向の相互移動は、例えばスリット絞りの軸方向、横方向の然るべきポジション設定により検出器に選択的に反映させることができる。
本発明は、迅速作業性のある共焦点レーザ走査型顕微鏡の適用可能性を大幅に拡大するものである。このような改良開発の重要性は、細胞生物学的に関する標準文献およびそこに記述されている細胞、副細胞の迅速な変化過程1、さらには多数の色素を用いた検査方法2を手掛かりに読み取ることができる。
1 B.Alberts他著(2002年):Molecular Biology of the Cell;Garland Science刊
1,2 G.Karp著(2002年):Cell and Molecular Biology ; Concepts and Experiments;Wiley Text Books刊
1,2 R.Yuste他著(2000年):Imaging neurons–a laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press刊、 ニューヨーク
2 R.P.Haugland著(2003年):Handbook of fluorescent Probes and research Products第10版; Molecular Probes Inc.and Molecular Probes Europe BV刊
有機体の生育
記述の本発明は、なかでも1/10秒から時間レベルまでのダイナミックな変遷を特徴とする生育過程の研究に適している。ここでは細胞結合面および有機体全体への適用例について記述する:
・ Abdul−Karin、M.A.他は2003年“Microvasc.Res.”第66巻、113〜125ページに動物生体における血管の変化に関する長期分析結果を記録した。その場合、蛍光画像は数日間隔で撮影された。運動の定角軌道を模式的に描くために、3次元のデータ記録が適合アルゴリズムで評価されている。
・ Soll、D.R.他は2003年“Scientic World Journ.”第3巻827〜841ページに3次元空間全体における生体細胞の核および偽足に関する顕微鏡データのソフトウェアベースによる運動分析について記述している。
・ Grossmann,R他は2002年“Glia”第37巻229〜240ページにラットの微小神経膠細胞における運動の3次元分析について記述している。そのデータは10時間以上に亘って記録されたものである。神経膠細胞にはトラウマ性傷害の後に同時に迅速反応が発現するので、高いデータ収得率およびそれ相応のデータ量が得られる。
・ その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので3次元ROI照明から保護されねばならない3次元領域での生細胞の分析
・ 例えばFRET実験などにおいて、3次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の3次元領域での分析
・ 例えば3次元FRAP、FLIP実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にROI外の観察も必要なマーカーによる生細胞の3次元領域での分析
・ 例えば3次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の3次元領域での照準分析
・ 例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の3次元領域での照準分析
・ 例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の3次元領域での照準分析
・ 例えばCFP、GFP、YFP、DsRed、HcRedなど可変性多重マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・ 機能に依存して変色する、例えばCa+マーカーなどでマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・ 生育に起因して変色するマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、例えばGFPによる形質転換動物
・ 例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・ 検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・ 最終項目とそれ以前の項目との組み合せ
記述の本発明は細胞内運搬過程の研究にはこの上なく適している。この場合では正しく非常に微小な運動構造体、例えばタンパク質を高速度で(殆どが1/100秒の領域)描写しなければならないからである。複雑な運搬過程のダイナミックスを捕捉するためには、ROIブリーチングを伴うFRAPもしばしば適用される。そのような研究例として、ここでは以下のものを挙げておく:
・ Umenishi,F.他が2000年“Biophys J.”第78巻1024〜1035ページに、GFP変換された培養細胞におけるアクアポリンの空間運動性についての分析結果を記述している。その場合、細胞膜の照準点を局部ブリーチングして、周辺における蛍光拡散の分析を行っている。
・ Gimpl,G.他が2002年“Prog.Brain Res.”第139巻43〜55ページに、ROIブリーチングによる実験、運動性分析のための蛍光撮像およびGFPマーキングされたオキシトシン受容体の線維芽細胞内での分布について記述している。その場合、空間位置設定、分解能およびブリーチングと撮像との直接的な時間的連続性に関して高い要求が課されている。
・ Zhang他が2001年“Neuron”第31巻261〜275ページに、GFP変換された神経細胞における生細胞の撮像について記述している。その場合、顆粒の運動がブリーチングと蛍光撮像との組み合せにより分析された。神経細胞のダイナミックスに起因して、撮像速度には高い要求が課される。
記述の本発明は、特に分子間およびその他副細胞間の相互作用の描写に適している。これらの場合では非常に微小な構造が高速度(1/100秒レベル)で描出されねばならない。相互作用に必要な分子の空間ポジションの解明には、例えばROIブリーチングを伴うFRETなどの間接的な技術を使用することもできる。適用される例として、ここでは以下のものを挙げておく:
・ Petersen,M.A.およびDalley,M.E.が2004年“Glia”第46巻195〜206ページに、ラット海馬角の培養における2チャネル撮影について記述している。この場合は、マーカーとしてのレクチンとシトックスについて3次元空間において長時間に亘り2チャネルで記録される。
・ Yamamoto,N.他が2003年“Clin.Exp.Metastasis”第20巻633〜638ページに、ヒトの線維肉腫細胞の2色撮影について記述している。この場合では緑色と赤色の蛍光タンパク質(GFPおよびRFP)が同時にリアルタイムで観察された。
・ Bertera,S.他が2003年“Biotechniques”第35巻718〜722ページに、合成後色が緑から赤に変化するタイムレポータプロテインによってマーキングされた転換マウスのマルチカラー撮影について記述している。撮像は生体動物の組織内3次元空間で迅速シリーズとして行われる。
記述の本発明は、殆どが極端に迅速になる信号伝達過程の研究には他に抜きん出て適している。殆どが神経生理学に関するこの過程では経時的分解能に最大限の要求が課される。それは、イオンによって媒介される活動が1/100秒から1/1000秒以下の範囲で起こるからである。筋肉系または神経系の検査への適用例として、ここでは次のものを挙げておく:
・ Brum G他が2000年“J Physiol”第528巻419〜433ページに、伝達物質としてのカフェインによる刺激後のカエルの筋肉細胞における迅速なCa+活動の位置確認について記述している。この位置確認およびマイクロメータ単位の精度を持つ分解能は、迅速型の共焦点顕微鏡の使用下でないと達成されない。
・ Schmidt H他が2003年“J Physiol”第551巻13〜32ページに、転換マウスの神経細胞突起におけるCa+イオンの分析について記述している。変化するCa+に結合するタンパク質による、マウス内での迅速なCa+変化状況についての研究は、高分解能を持つ共焦点顕微鏡により初めて行うことができた。それは、神経細胞内におけるCa+活動の位置確認およびその精確な経時的動力学が重要な役割を果たしているからである。
2 光源モジュール
3 走査モジュール
4 顕微鏡モジュール
5 検出モジュール
6,7 レーザユニット
8 光バルブ
9 減衰器
10 結合ポイント
11 光ファイバ
12.13 コリメーション光学系
14,15 ビーム結合ミラー
17 メインカラースプリッタ
18 スキャナ
19 走査対物レンズ
22 焦点
23 試料
24 転向ミラー
25 サブカラースプリッタ
26 スリット絞り
27 ブロックフィルタ
28 検出器
37 テレスコープ
38 非球面ユニット
40 補正ユニット
41 ズーム系光学系
42 絞り
64 二ポーディスク
Claims (8)
- 照明光と試料間の相対的移動により試料領域の少なくとも1箇所を捕捉するための光走査型顕微鏡であって、照明光が試料を複数の点または領域で平行に照明し、複数の点または領域が検出装置によって同時に検出される光走査型顕微鏡において、
照明光が点状光源の分散から成っていて、照明された試料点には検出サイドで検出器が割り当てられ、
検出光路には他のビームスプリッタおよび/またはフィルタと交換可能なビームスプリッタおよび/またはフィルタが配備され、
調整可能な共焦点絞りが光学スライス厚の変更のために配備され、
補正ユニットが、前記ビームスプリッタおよび/またはフィルタが交換されたときに発生する誤差を補正するために設けられている、光走査型顕微鏡。 - 交換可能なビームスプリッタが、複数の内部検出器に対して波長の割り振りを行うために、検出器に装備されている、請求項1に記載の光走査型顕微鏡。
- 複数の照明領域が、複数の点または線によって照明され、該複数の点または線に対して検出器が割り振られている、請求項1又は2に記載の光走査型顕微鏡であって、スペクトル検出の迅速変換により蛍光スペクトルが記録され、異なった波長がスペクトル分離される、光走査型顕微鏡。
- 共振型スキャナ、ニポースキャナまたは多点スキャナを有する請求項1乃至3のいずれか1項に記載の光走査型顕微鏡。
- 生育過程を研究のために請求項1乃至4のいずれか1項に記載の光走査型顕微鏡を用いる方法であって、生育過程を研究は、下記諸点、
・ その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので3次元ROI照明から保護されねばならない3次元領域での生細胞の分析、
・ 3次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の3次元領域での分析、
・ レーザ照準照明下で退色する、同時にROI外の観察も必要なマーカーによる生細胞の3次元領域での分析、
・ レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の3次元領域での照準分析、
・ レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の3次元領域での照準分析、
・ 微弱マーカーによる生細胞の3次元領域での照準分析、
・ 可変性多重マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、
・ 機能に依存して変色する3次元組織結合における生細胞、
・ 生育に起因して変色するマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、
・ レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、
・ 検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、
・ 最終項目とそれ以前の項目との組み合せ
のうちの少なくとも1つに基づく、方法。 - 微小な運動構造体の高速度描写に適用される、細胞内運搬過程の研究のために請求項1乃至4のいずれか1項に記載の光走査型顕微鏡を用いる方法。
- 間接的技術の使用下における、分子およびその他副細胞の描写のために請求項1乃至4のいずれか1項に記載の光走査型顕微鏡を用いる方法。
- 1/100秒から1/1000秒以下に到るまでの領域で展開されるイオン介在活動に関係する迅速な信号伝達過程のための、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の光走査型顕微鏡を用いる方法。
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