JPH10333056A - 顕微鏡装置及び画像作成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 広視野の画像を分解能を犠牲にすることなく
得ることができ、しかも安価な顕微鏡装置及び画像作成
方法を提供する。 【解決手段】 ２次元的に移動可能な走査ステージ１３
上の試料の画像を作成する画像作成方法において、走査
ステージ１３の移動位置情報をメモリ１４に記憶し、メ
モリ１４に記憶された移動位置情報に基づいて走査ステ
ージ１３を移動させて複数の部分画像を取得し、複数の
部分画像を１つの画像につなぎ合わせる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は顕微鏡装置及び画
像作成方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】レーザ走査顕微鏡は、レーザ光を射出す
るレーザ光源と、このレーザ光を対物レンズの瞳面を満
たす大きさに拡大するビームエクスパンダと、試料で励
起された蛍光を透過させるビームスプリッタと、レーザ
光を２次元走査するＸＹスキャナと、ＸＹスキャナと試
料との間に配置された対物レンズと、対物レンズの焦点
面と共役な位置に蛍光を集光させる集光レンズと、対物
レンズの焦点面と共役な位置に設けられたピンホール
と、ピンホールを通過した蛍光を検出し、電気信号に変
換する蛍光検出器と、蛍光検出器からの電気信号をＡ／
Ｄ変換によってデジタル化するＡ／Ｄ変換器と、デジタ
ル化した信号を１画面分記憶するフレームメモリと、演
算等の処理を行うＣＰＵと、ＣＰＵで処理された結果を
画像化して表示するモニタとを備える。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記構成のレーザ走査
顕微鏡では、フレームメモリの容量によって画像の分解
能や視野の大きさが制限される。

【０００４】対物レンズによって決定される光学分解能
を損なわないように配慮すれば、定められた画素数の下
では自動的に得られる視野の大きさが決定され、それは
非常に狭いものとなる。

【０００５】一方、観察したい視野が予め広く決まって
いる場合には、試料上でサンプリングする画素の間隔が
大きくなって、対物レンズで得られるはずの光学分解能
に追い付かない画像となる。

【０００６】一般に、フレームメモリを大きくするだけ
でなく、ＸＹスキャナの振れ角を大きくし、且つ対応す
る走査光学系に変更する必要がある。また、視野を大き
くすれば、視野周辺での視野照明ムラ（シェーディン
グ）等の問題が発生する。

【０００７】図９（ａ）は対物レンズのもつ光学分解能
を損なわない視野の場合の説明図、図９（ｂ）は観察し
たい視野が予め決まっている場合の説明図、図９（ｃ）
は容量の大きなフレームメモリを用いた場合の説明図で
ある。

【０００８】例えば、１００倍の対物レンズを用いたと
き、接眼視野の径は２５０μｍとなる。したがって、接
眼視野に内接する正方形を視野とした場合、縦横約１８
０μｍの試料が表示される。

【０００９】この視野を５１２×５１２のフレームメモ
リを用いて画像を取得すると、画素ｐ間の間隔（ΔＸ，
ΔＹ）は約０．３５μｍとなる。

【００１０】ところで、光学顕微鏡の分解能は対物レン
ズの開口数と使用する波長によって決まる。例えば０．
２μｍの分解能を有する光学顕微鏡であれば、０．２μ
ｍ程度の細かいものが肉眼で見える。

【００１１】したがって、上記視野を画像化した場合に
は、対物レンズによる分解能が追い付かず、もし画像領
域内に光学分解能に匹敵する微細な構造が存在したとし
ても、モニタ１１１の画面上でその構造を画像化するこ
とはできない（図９（ｂ）参照）。

【００１２】対物レンズのもつ光学分解能を損なわない
ように画像を取得するには、対物レンズの分解能を０．
２μｍとしたとき、レーザ走査顕微鏡では画素間隔がこ
の分解能と同程度の間隔で走査する必要がある。具体的
には、ナイキストのサンプリング定理から、対物レンズ
の分解能の半分（０．１μｍ）で走査すれば元の画像を
忠実に再現できることがわかっている。

【００１３】すなわち、上記した接眼視野の場合には、
元の画像を忠実に再現できる視野は縦横５０μｍの範囲
となって元のモニタ１１１画面に対して非常に狭いもの
となる（図９（ａ）参照）。

【００１４】これに対し、図９（ｃ）に示すように、例
えば容量が４０９６×４０９６のフレームメモリを用
い、ＸＹスキャナの走査範囲を広くすることも考えられ
るが、上記フレームメモリは高価であるという問題があ
る。

【００１５】この発明はこのような事情に鑑みてなされ
たもので、その課題は広視野の画像を分解能を犠牲にす
ることなく得ることができ、しかも安価な顕微鏡装置及
び画像作成方法を提供することである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】前述の課題を解決するた
め請求項１記載の発明の顕微鏡装置は、２次元的に移動
可能なステージ上の試料の画像を取得・観察する顕微鏡
装置において、前記ステージの移動位置情報を記憶する
記憶手段と、前記記憶手段に記憶された移動位置情報に
基づいて前記ステージを移動させて複数の部分画像を取
得する画像取得手段と、前記複数の部分画像を１つの画
像につなぎ合わせる画像合成手段とを備えていることを
特徴とする。

【００１７】記憶手段にステージの移動位置情報を記憶
させ、画像取得手段でこの移動位置情報に基づいてステ
ージを移動させて複数枚の部分画像を取得し、画像合成
手段で複数枚の部分画像をつなぎ合わせて１回の走査で
得られた全体画像に匹敵する１枚の画像を得る。

【００１８】請求項２記載の発明の顕微鏡装置は、請求
項１に記載の顕微鏡装置において、キャリブレーション
チャートを用いて複数の部分画像を取得し、それらの部
分画像を１つの画像につなぎ合わせたときに得られた前
記ステージの移動距離が、前記移動位置情報であること
を特徴とする。

【００１９】キャリブレーションチャートを用いて複数
の部分画像を取得し、それらの部分画像を１つの画像に
つなぎ合わせたとき、１枚目の部分画像の座標から見
た、他の部分画像の始点となる仮想の座標を、キャリブ
レーションチャートを用いてティーチングし、移動位置
情報を取得する。

【００２０】請求項３記載の発明の顕微鏡装置は、請求
項１又は２に記載の顕微鏡装置において、前記記憶手段
に記憶される情報は、前記画像合成手段による前記複数
の部分画像のつなぎ合わせに適したＸ方向移動位置情報
とＹ方向移動位置情報とであることを特徴とする。

【００２１】１枚目の部分画像の座標から見た、他の部
分画像の始点となる仮想の座標を、キャリブレーション
チャートを用いてティーチングし、複数の部分画像のつ
なぎ合わせに適したステージのＸ方向移動位置情報とＹ
方向移動位置情報を取得する。

【００２２】請求項４記載の発明の画像作成方法は、２
次元的に移動可能なステージ上の試料の画像を作成する
画像作成方法において、前記ステージの移動位置情報を
記憶手段に記憶させる第１工程と、前記記憶手段に記憶
された移動位置情報に基づいて前記ステージを移動させ
て複数の部分画像を取得する第２工程と、前記複数の部
分画像を１つの画像につなぎ合わせる第３工程とを含む
ことを特徴とする。

【００２３】記憶手段に予め記憶されたステージの移動
位置情報に基づいて走査ステージを移動させて複数枚の
部分画像を取得し、この複数枚の部分画像をつなぎ合わ
せて１回の走査で得られた全体画像に匹敵する１枚の画
像を得る。

【００２４】請求項５記載の発明の画像作成方法は、請
求項４に記載の画像作成方法において、キャリブレーシ
ョンチャートを用いて複数の部分画像を取得し、それら
の部分画像を１つの画像につなぎ合わせたときに得られ
た前記ステージの移動距離が、前記移動位置情報である
ことを特徴とする。

【００２５】キャリブレーションチャートを用いて複数
の部分画像を取得し、それらの部分画像を１つの画像に
つなぎ合わせたとき、１枚目の部分画像の座標から見
た、他の部分画像の始点となる仮想の座標を、キャリブ
レーションチャートを用いてティーチングし、移動位置
情報を取得する。

【００２６】請求項６記載の発明の画像作成方法は、請
求項４又は５に記載の画像作成方法において、前記記憶
手段に記憶される情報は、前記画像合成手段による前記
複数の部分画像のつなぎ合わせに適したＸ方向移動位置
情報とＹ方向移動位置情報とであることを特徴とする。

【００２７】１枚目の部分画像の座標から見た、他の部
分画像の始点となる仮想の座標を、キャリブレーション
チャートを用いてティーチングし、複数の部分画像のつ
なぎ合わせに適したステージのＸ方向移動位置情報とＹ
方向移動位置情報を取得する。

【００２８】

【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態を図
面に基づいて説明する。

【００２９】図１はこの発明の一実施形態に係るレーザ
走査顕微鏡装置の概念図である。

【００３０】このレーザ走査顕微鏡装置は、レーザ光源
１と、ビームエクスパンダ２と、ビームスプリッタ３
と、スキャナユニット４と、対物レンズ５と、集光レン
ズ６と、ピンホール７と、検出器８と、Ａ／Ｄ変換器９
と、フレームメモリ（画像取得手段）１０と、モニタ１
１と、ＣＰＵ（画像合成手段）１２と、走査ステージ
（ステージ）１３と、メモリ（記憶手段）１４を備え
る。

【００３１】ビームエクスパンダ２はレーザ光源１から
出射されたレーザ光１ａを対物レンズ５の瞳面を満たす
大きさに拡大し、対物レンズ５の瞳面を洩れなく照明す
る。

【００３２】ビームスプリッタ３はレーザ光１ａを反射
し、走査ステージ１３上の試料（図示せず）で励起され
た蛍光１ｂを透過させる。このビームスプリッタ３はダ
イクロイックミラーを用いることもできる。

【００３３】スキャナユニット４は走査ミラーを備え、
レーザ光１ａを２次元的（ＸＹ方向）に走査する。

【００３４】対物レンズ５はレーザ光１ａを試料に集光
させ、レーザ光１ａによって試料を照明する。

【００３５】ピンホール７は対物レンズ５の焦点面と共
役な位置に配置された集光レンズ６で集光された蛍光１
ｂだけを通過させる。集光レンズ６は集めた蛍光１ｂを
損失なくピンホール７へ進ませる。

【００３６】検出器８はピンホール７を通過した蛍光１
ｂを検出し、電気信号（アナログ信号）に変換する。

【００３７】Ａ／Ｄ変換器９は検出器８からの電気信号
をＡ／Ｄ変換によって「１」と「０」の数値で表すこと
ができるデジタル信号に変換し、１フレーム分づつ出力
する。

【００３８】フレームメモリ１０は１フレーム分の部分
画像をいったん記憶する。このフレームメモリ１０に
は、例えばＤＲＡＭを４個使用する。

【００３９】モニタ１１はＣＰＵ１２で複数の部分画像
を１つの画像につなぎ合わせる処理が行われた画像を表
示する。

【００４０】メモリ１４は走査ステージ１３の移動位置
情報を記憶する。移動位置情報は後述するキャリブレー
ションチャート１５Ａを用いて複数の部分画像を取得
し、それらの部分画像を１つの画像につなぎ合わせたと
きに得られた走査ステージ１３の移動距離であり、Ｘ方
向移動位置情報とＹ方向移動位置情報とからなる。な
お、走査ステージ１３は圧電素子（図示せず）によって
駆動され、ＣＰＵ１２の指示に基づいて微小距離ずつ移
動できる。

【００４１】図２は画像作成方法を説明する図である。

【００４２】図は部分画像の画素数を５１２×５１２と
し、４枚の部分画像をつなぎ合わせて画素数が１０２４
×１０２４の画像を作成する場合を示している。

【００４３】ＣＰＵ１２は後述する第１工程で得た走査
ステージ１３の移動位置情報に基づいて走査ステージ１
３を移動させて４枚の部分画像Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄを取得し
（第２工程）、この４枚の部分画像Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄを所
定の順序でつなぎ合わせて１回の走査で得られた全体画
像に匹敵する１枚の画像を得る（第３工程）。

【００４４】部分画像Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄのつなぎ合わせは
次のように行われる。

【００４５】１枚目の部分画像Ａの画素の座標（以下、
単に座標と称する）（１，５１２）の右方へ１画素離れ
た仮想の座標（１，５１３）に、２枚目の部分画像Ｂの
座標（１，１）を一致させる。

【００４６】１枚目の部分画像Ａの座標（５１２，１）
の下方へ１画素離れた仮想の座標（５１３，１）に、３
枚目の部分画像Ｃの座標（１，１）を一致させる。

【００４７】１枚目の部分画像Ａの座標（５１２，５１
２）の右及び下方へ１画素づつ離れた仮想の座標（５１
３，５１３）に、４枚目の部分画像Ｄの座標（１，１）
を一致させる。

【００４８】上記作成方法によれば、得られた画像は広
視野であるとともに、各部分画像Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄと同等
の光学分解能を維持する。

【００４９】図３（ａ）はキャリブレーションチャート
が形成されたスライドグラスの平面図であり、図３
（ｂ）はチャートパターンが連続でない場合を説明する
モニタ画面を示す図、図３（ｃ）はチャートパターンが
連続である場合を説明するモニタ画面を示す図である。

【００５０】キャリブレーションチャート１５Ａはスラ
イドグラス１５の表面に升目状（例えば、１０×１０μ
ｍ）のチャートパターンとして形成されている。

【００５１】１枚目の部分画像Ａの座標（１，１）から
見た、他の部分画像Ｂ，Ｃ，Ｄの仮想の座標（１，５１
３）、（５１３，１）及び（５１３，５１３）は、キャ
リブレーションチャート１５Ａを用いてティーチングさ
れる。

【００５２】スライドグラス１５を走査ステージ１３上
に配置し、レーザ光１ａをＸＹ方向に走査して部分画像
Ａを取得した後、走査ステージ１３を部分画像の大きさ
に対応した距離づつＸ方向及びＹ方向へ移動して部分画
像Ｂ、部分画像Ｃ及び部分画像Ｄを取得する。その結
果、図３（ｂ）に示す画像が得られる。

【００５３】図３（ｂ）からわかるように、上記走査ス
テージ１３の移動だけでは各部分画像のチャートパター
ンは連続しないので、走査ステージ１３を更にＸ方向及
びＹ方向に移動させて微調整し、図３（ｃ）に示すよう
に各部分画像Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤのチャートパターンがＸ方
向及びＹ方向で連続するようにする。

【００５４】この微調整後の部分画像Ａから部分画像
Ｂ、部分画像Ｃ及び部分画像Ｄへのそれぞれの移動距離
が、２枚目、３枚目、４枚目の部分画像Ｂ，Ｃ，Ｄを取
り込むための移動位置情報としてメモリ１４に記憶され
る（第１工程）。

【００５５】このティーチングは観察を行う度に行う必
要はなく、例えば故障等によりスキャナ４自体を交換し
たり走査ステージ１３を交換したりしたときに行えばよ
い。

【００５６】なお、レボルバを用いる場合、予め対物レ
ンズ５毎に移動位置情報を取得してメモリ１４に記憶
し、対物レンズ５を切換える毎に対応する移動位置情報
を読み出すようにしてもよい。

【００５７】また、４枚以上の部分画像をつなぎ合わせ
る場合でも、上記と同様な操作を行うことで１回の走査
で得られた全体画像に匹敵する１枚の画像を得ることが
できる。

【００５８】同様にして、走査ステージ１３の移動可能
な視野範囲全体の１枚の画像を得ることもできる。この
とき、画像を一度にモニタ１１に表示させるには部分画
像に対応して多くのフレームメモリ１０（又はハードデ
ィスク）を必要とするが、スクロール機能を用いれば大
きな視野範囲を１枚の画像として観察することができ
る。

【００５９】図４は画像取得範囲の変形例を示す図であ
る。

【００６０】例えば、試料２０が図の一点鎖線で示す形
状の場合、画像取得範囲を図４（ａ）又は図４（ｂ）と
することができる。

【００６１】このようにすることで、画像取得しない範
囲Ａ１，Ａ２に対応する部分のフレームメモリ１０を節
約することができる。

【００６２】図５（ａ）は他のキャリブレーションチャ
ートを形成したスライドグラスの平面図であり、図５
（ｂ）はチャートパターンが連続でない場合を説明する
モニタ画面を示す図、図５（ｃ）はチャートパターンが
連続である場合を説明するモニタ画面を示す図である。

【００６３】この同心円状のチャートパターンが形成さ
れたキャリブレーションチャート１１５Ａを用いた場合
も、図３（ａ）のキャリブレーションチャート１５Ａを
用いた場合と同様に、４枚の部分画像をつなぎ合わせて
１回の走査で得られた画像に匹敵する１枚の画像を得る
ことができる。

【００６４】図６は１つの対物レンズによる接眼視野内
に収まる部分画像をつなぎ合わせて画像を作成する場合
のパラメータの例を示す図、図７（ａ）は精細モードに
おける画像取得を説明する図、図７（ｂ）は節約モード
における画像取得を説明する図である。

【００６５】１つの対物レンズ５による接眼視野内に収
まる部分画像をつなぎ合わせて画像を作成する場合に
は、まず図１に示すレーザ走査顕微鏡の有するズーム機
能によりモニタ１１画面上に観察したい試料２０の全領
域の画像を取得する。

【００６６】対物レンズ５の倍率と、対物レンズ５の開
口数と、照明光（レーザ光）の波長とをパラメータとし
たとき（図６参照）、ナイキストのサンプリング定理か
ら画素の間隔ΔＸ，ΔＹが決まるとともに、求める画像
領域に必要な画素数も決まる。

【００６７】画像領域の画素数Ｘ，Ｙがフレームメモリ
１０（例えば、画素数５１２×５１２）の整数倍となっ
ていれば、（Ｘ／５１２）×（Ｙ／５１２）枚の部分画
像を取得し、つなぎ合わせることで画像を得ることがで
きる。

【００６８】なお、観察者の好みにより、図７（ａ）に
示すように部分画像をより細かくして試料２０の画像を
取得しても、図７（ｂ）に示すように部分画像を大きく
して試料２０の画像を取得してもよい。

【００６９】後者によれば、フレームメモリ１０を節約
したい場合や画像取得時間を短くできる。

【００７０】図８は高倍率・高開口数の対物レンズでは
接眼視野に収まらない大きい領域の画像を高分解能で取
得する場合の説明図である。

【００７１】実際に画像取得に用いたい高倍率・高開口
数の対物レンズ５（例えば、倍率：４０×）では接眼視
野に収まらない大きい領域の画像を高分解能で取得した
い場合には、まず観察したい領域が１つの領域に収まる
ような低倍の対物レンズ５（例えば、倍率：１０×）を
用いてモニタ１１の画面上に観察したい全領域の画像１
１Ａを取得する。

【００７２】その後、図８に矢印ａで示すように高倍率
・高開口数の対物レンズ５で取得した領域１１Ｂの始点
ｐ１を倍率差分に応じて始点ｐ０へ移動した後、上記方
法と同様にして部分画像の取得及び画像のつなぎ合わせ
を行う。

【００７３】上記始点は手入力で、又は数種の対物レン
ズ５を装着したレボルバであって対物レンズ５の自動認
識機能あるいは自動指定機能を備えている場合には自動
的に移動される。

【００７４】なお、上記実施形態はレーザ走査顕微鏡装
置を用いた場合で説明したが、一般の走査顕微鏡を用い
ることもできる。また、反射型の顕微鏡に限るものでは
なく、透過型の顕微鏡にも適用できる。更に、光学顕微
鏡にも適用できる。

【００７５】

【発明の効果】以上に説明したように請求項１〜６に記
載の発明の顕微鏡装置及び画像作成方法によれば、広視
野の画像を、各部分画像と同等の光学分解能を維持した
まま取得することができるので、例えば離れた細胞間の
反応を１つの画面内で見ることができ、離れた細胞間の
相互作用等を容易に観察することができる。また、容量
が大きいが高価である容量の大きなフレームメモリを用
いなくてよいので、顕微鏡装置のコストダウンを図るこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はこの発明の一実施形態に係る顕微鏡装置
の概念図である。

【図２】図２は画像作成方法を説明する図である。

【図３】図３（ａ）はキャリブレーションチャートが形
成されたスライドグラスの平面図であり、図３（ｂ）は
チャートパターンが連続でない場合を説明するモニタ画
面を示す図、図３（ｃ）はチャートパターンが連続であ
る場合を説明するモニタ画面を示す図である。

【図４】図４は画像取得範囲の変形例を示す図である。

【図５】図５（ａ）は他のキャリブレーションチャート
を形成したスライドグラスの平面図であり、図５（ｂ）
はチャートパターンが連続でない場合を説明するモニタ
画面を示す図、図５（ｃ）はチャートパターンが連続で
ある場合を説明するモニタ画面を示す図である。

【図６】図６は１つの対物レンズによる接眼視野内に収
まる部分画像をつなぎ合わせて合成画像を作成する場合
のパラメータの例を示す図である。

【図７】図７（ａ）は精細モードにおける画像取得を説
明する図、図７（ｂ）は節約モードにおける画像取得を
説明する図である。

【図８】図８は高倍率・高開口数の対物レンズでは接眼
視野に収まらない大きい領域の画像を高分解能で取得す
る場合の説明図である。

【図９】図９（ａ）は対物レンズによって可能な光学分
解能を損なわない視野の場合の説明図、図９（ｂ）は観
察したい視野が予め決まっている場合の説明図、図９
（ｃ）は画素数の大きなフレームメモリを用いた場合の
説明図である。

【符号の説明】

１０ フレームメモリ（画像取得手段） １２ ＣＰＵ（画像合成手段） １３ 走査ステージ（ステージ） １４ メモリ（記憶手段） １５Ａ，１１５Ａ キャリブレーションチャート Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ 部分画像

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２次元的に移動可能なステージ上の試料
   の画像を取得・観察する顕微鏡装置において、 前記ステージの移動位置情報を記憶する記憶手段と、 前記記憶手段に記憶された移動位置情報に基づいて前記
   ステージを移動させて複数の部分画像を取得する画像取
   得手段と、 前記複数の部分画像を１つの画像につなぎ合わせる画像
   合成手段とを備えていることを特徴とする顕微鏡装置。
2. 【請求項２】 キャリブレーションチャートを用いて複
   数の部分画像を取得し、それらの部分画像を１つの画像
   につなぎ合わせたときに得られた前記ステージの移動距
   離が、前記移動位置情報であることを特徴とする請求項
   １に記載の顕微鏡装置。
3. 【請求項３】 前記記憶手段に記憶される前記移動位置
   情報は、前記画像合成手段による前記複数の部分画像の
   つなぎ合わせに適したＸ方向移動位置情報とＹ方向移動
   位置情報とであることを特徴とする請求項１又は２に記
   載の顕微鏡装置。
4. 【請求項４】 ２次元的に移動可能なステージ上の試料
   の画像を作成する画像作成方法において、 前記ステージの移動位置情報を記憶手段に記憶させる第
   １工程と、 前記記憶手段に記憶された移動位置情報に基づいて前記
   ステージを移動させて複数の部分画像を取得する第２工
   程と、 前記複数の部分画像を１つの画像につなぎ合わせる第３
   工程とを含むことを特徴とする画像作成方法。
5. 【請求項５】 キャリブレーションチャートを用いて複
   数の部分画像を取得し、それらの部分画像を１つの画像
   につなぎ合わせたときに得られた前記ステージの移動距
   離が、前記移動位置情報であることを特徴とする請求項
   ４に記載の画像作成方法。
6. 【請求項６】 前記記憶手段に記憶される情報は、前記
   画像合成手段による前記複数の部分画像のつなぎ合わせ
   に適したＸ方向移動位置情報とＹ方向移動位置情報とで
   あることを特徴とする請求項４又は５に記載の画像作成
   方法。