JP4576112B2 - 共焦点レーザ顕微鏡 - Google Patents

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Description

本発明は、観察対象となる試料の共焦点(コンフォーカル:CF)画像と非共焦点(ノンコンフォーカル:NCF)画像を得ることのできる共焦点レーザ顕微鏡に関する。
今日、同一の試料から得られた複数種類の画像を観察することのできる光学顕微鏡が開発されている。例えば、共焦点レーザ顕微鏡では、レーザ走査型顕微鏡(レーザスキャニングマイクロスコープ:LSM)画像として、共焦点画像と非共焦点画像の2種類の画像を取得することができる。微小なスポット光をXY走査して試料上の焦点の合った位置からの光のみをピンホールを介して結像させることで、コントラストの高い共焦点画像を得ることができ、また、ピンホールを介さないで得られた画像は、通常の光学顕微鏡と同じような結像特性を有する非共焦点画像となる。
このような共焦点レーザ顕微鏡では、得られた共焦点画像と非共焦点画像を重ね合わせて表示したり(例えば、特許文献1参照)、切り替えて表示したりする(例えば、特許文献2参照)表示方法が用いられている。
また、試料の蛍光像と透過像を同時にディスプレイに表示する走査型光学顕微鏡も提案されている(例えば、特許文献3参照)。
特開平2000−098241号公報 特開平09−133869号公報 特許第3326881号公報
しかしながら、上述した従来の共焦点レーザ顕微鏡における共焦点画像と非共焦点画像の表示方法には、次のような問題がある。
共焦点画像と非共焦点画像を画面上で重ね合わせて表示したのでは、それぞれの画像の情報を別々に認識することが難しく、これらの画像を切り替えて表示したのでは、2つの画像を同時に観察することが不可能である。したがって、共焦点画像と非共焦点画像を別々に認識可能な情報として同時に観察することは困難である。
また、共焦点レーザ顕微鏡においては、これらの2つの画像以外に、CCD(Charge Coupled Device )カメラ等を用いて撮像した非共焦点画像であるテレビ(TV)画像も利用される場合がある。
本発明の課題は、共焦点画像と非共焦点画像を別々に認識可能な情報として同時に利用しながら効率的に観察を行うことのできる共焦点レーザ顕微鏡を提供することである。
本発明のもう1つの課題は、LSM画像とテレビ画像を別々に認識可能な情報として同時に利用しながら効率的に観察を行うことのできる共焦点レーザ顕微鏡を提供することである。
本発明の第1の局面における共焦点レーザ顕微鏡は、観察対象の上に集光したレーザ光を2次元走査しながら顕微鏡画像を取得する共焦点レーザ顕微鏡であって、前記観察対象に前記レーザ光を照射して前記観察対象のLSM画像を取得するためのLSM画像取得用検出手段と、前記観察対象に前記レーザ光とは別の照明光を照射して前記観察対象のTV画像を取得するためのTV画像取得用検出手段と、前記LSM画像取得用検出手段または前記TV画像取得用検出手段からの検出信号による前記観察対象の画像を生成する画像生成手段と、前記画像生成手段で生成された画像を同一画面上に複数並べて表示する表示手段と、前記画面上に並べて表示された画像の明るさを変更する操作が可能な操作手段と、前記操作手段により前記表示手段に並べて表示されている前記複数の画像のうち1つの画像を選択し、選択された前記画像の明るさを変更操作した場合、選択された前記画像が、変更操作された明るさとなるように、選択された前記画像を取得する検出手段の設定値を変更するとともに、連動して、同一画面上に表示されている他の画像の明るさを変更するように、他の画像を取得する検出手段の設定値を変更するよう制御する制御手段と、を備えることを特徴とする。
本発明の第2の局面において、第1の局面における共焦点レーザ顕微鏡は、前記操作手段により前記複数の画像のうち1つの画像を選択し、選択された前記画像の明るさを変更操作した場合、同一画面上に表示されている他の画像の明るさを非連動にする非連動操作モードを有することを特徴とする。
本発明の第3の局面において、第1の局面における共焦点レーザ顕微鏡は、前記操作手段は、前記画面上に並べて表示された複数の画像のズーム倍率、表示サイズ、表示位置、およびコントラストのうち少なくとも1つの属性を変更する操作が可能であり、前記操作手段により前記複数の画像のうち1つの画像を選択してズーム倍率、表示サイズ、表示位置、およびコントラストのうち少なくとも1つの属性を変更操作した場合、選択されていない画像の属性を連動または独立して変更させる連動/非連動選択手段を備えることを特徴とする。
本発明の第の局面において、本発明の第1の局面における共焦点レーザ顕微鏡は、前記表示手段は、前記画面上に並べて表示された複数の画像の輝度プロファイルを該画面上に併せて表示することを特徴とする。
本発明の第5の局面において、第1の局面における共焦点レーザ顕微鏡は、前記LSM画像は、前記レーザ光を前記観察対象に照射し、該観察対象により反射された反射光をピンホールを介して検出して生成した画像、または、前記反射光をピンホールを介さずに検出して生成した画像であることを特徴とする。
本発明の第の局面において、第の局面における共焦点レーザ顕微鏡は、前記LSM画像取得用検出手段は、フォトマルチプライヤであり、前記TV画像取得用検出手段は、CCDカメラであることを特徴とする。
表示手段により表示される画像には以下の画像が含まれる。
・レーザ光で2次元走査された観察対象からの反射光をピンホールを介して検出することで取得された共焦点LSM画像
・上記ピンホールを介した方法で取得され、画像格納手段に格納された画像データ(保存画像)
・レーザ光で2次元走査された観察対象からの反射光をピンホールを介さずに検出することで取得された非共焦点LSM画像
・上記ピンホールを介さない方法で取得され、画像格納手段に格納された画像データ(保存画像)
・カメラ(デジタルまたはアナログ)により撮像したテレビ画像
・上記カメラにより撮像され、画像格納手段に格納された画像データ(保存画像)
本発明によれば、共焦点画像と非共焦点画像、あるいは、LSM画像(共焦点LSM画像および/または非共焦点LSM画像)とテレビ画像が同一画面上に並べて表示されるので、それらの画像を別々に認識可能な情報として同時に利用しながら効率的に観察することができる。このように、異なる検鏡法による複数の画像を同時に観察することで、より多くの情報を効率良く得ることが可能となる。また、並べて表示された複数の画像の属性を連動または独立して変更するようにすれば、さらに効率的な観察を行うことができる。
以下、図面を参照しながら、本発明を実施するための最良の形態を詳細に説明する。
図1は、本実施形態の共焦点レーザ顕微鏡の構成図である。図1の共焦点レーザ顕微鏡は、顕微鏡本体101、コントローラ102、入力装置103、表示装置104、および試料台105を備える。
顕微鏡本体101は、対物レンズ111、レボルバ112、ビームスプリッタ113、118、128、照明レンズ114、コレクタレンズ115、白色光源116、結像レンズ117、1/4波長板119、瞳投影レンズ120、光スキャナ121、偏光ビームスプリッタ122、集光レンズ123、127、レーザ光源124、TVレンズ125、TV画像取得用CCDカメラ126、ピンホール129、共焦点LSM画像取得用検出器130、および非共焦点LSM画像取得用検出器131を備える。
光スキャナ121としては、例えば、ガルバノミラーが用いられ、検出器130および131としては、例えば、フォトマルチプライヤが用いられる。また、白色光源116としては、例えば、白色照明用ファイバ光源が用いられる。
LSM画像(共焦点LSM画像および/または非共焦点LSM画像)を取得する場合、レーザ光源124から出力されたレーザ光(照明光)は、集光レンズ123および偏光ビームスプリッタ122、光スキャナ121、瞳投影レンズ120、1/4波長板119、ビームスプリッタ118、結像レンズ117、ビームスプリッタ113、および対物レンズ111を経由して、試料台105上に置かれた試料106上に集光され、スポット光となる。照明光が光スキャナ121により2次元走査されると、試料106上のスポット光はXY方向に走査される。
試料106からの反射光は、上記光路を対物レンズ111から偏光ビームスプリッタ122まで逆向きに経由して、偏光ビームスプリッタ122により集光レンズ127の方へ導かれる。集光レンズ127を通過した反射光は、ビームスプリッタ128により2つに分岐し、一方はピンホール129を経由して検出器130に入射し、もう一方は検出器131に入射する。
また、TV画像を取得する場合、白色光源116から出力された照明光は、コレクタレンズ115、照明レンズ114、ビームスプリッタ113、および対物レンズ111を経由して試料106上を照明する。試料106からの反射光は、対物レンズ111、ビームスプリッタ113、結像レンズ117、ビームスプリッタ118、およびTVレンズ125を経由してCCDカメラ126に入射する。
検出器130および131を含むLSM検出系では、ピンホール129が挿入されたCF系とピンホール129のないNCF系が、ビームスプリッタ128を通して同時に反射光を検出できるように配置されている。この場合、検出器130および131から2チャンネル(CH)のLSM信号が出力される。
一方、CCDカメラ126を含むCCD光学系では、レーザ光源124からのレーザ光を消灯することにより、白色光源116からの照明光により照明されたTV画像が得られる。この場合、CCDカメラ126からは1CHのCCD信号が出力される。
2CHのLSM信号と1CHのCCD信号は、顕微鏡本体101に接続されたコントローラ102に入力され、コントローラ102により同時に取得可能となっている。つまり、顕微鏡本体101は、2CH以上の画像信号を同時に出力することが可能である。こうして取得された画像は、表示装置104のモニタ画面141上に並べて表示される。
各CHで取得される画像の特徴は以下の通りである。
共焦点LSM画像
コントラストが高く、焦点深度の浅い白黒画像が得られ、計測および観察に用いられる。ただし、共焦点LSM画像のみではピント合わせおよび試料106上の観察場所の特定(位置決め)が困難なため、非共焦点LSM画像やTV画像のような非共焦点画像のCHが必要となる。また、2CHの画像を組み合わせることで、全体像(焦点深度の深い画像)と部分的な像(焦点深度の深い画像)の観察、もしくは色情報を含めた観察が同時に可能となる。
非共焦点LSM画像
コントラストは比較的高く、焦点深度は通常の顕微鏡と同じ程度の白黒画像が得られ、ピント合わせ、位置決め、および観察に用いられる。
TV画像
色情報を含む、通常の顕微鏡の画像が得られ、ピント合わせ、位置決め、および観察に用いられる。また、暗視野、DIC(微分干渉)等の検鏡法を利用することが可能である。
図2は、図1のコントローラ102の構成図である。コントローラ102は、例えば、パーソナルコンピュータ等の情報処理装置(コンピュータ)に相当し、処理部201、制御回路202、画像入力回路203、および画像格納部204から構成される。処理部201は、CPU(中央処理装置)およびメモリを有し、メモリにはROM(read only memory)およびRAM(random access memory)が含まれる。
処理部201のCPUは、メモリを利用して制御プログラム211を実行することにより、制御回路202および画像入力回路203を制御し、画像表示のために必要な処理を行う。制御プログラム211には、CCD明るさ設定値演算プログラム212、電圧設定値演算プログラム213、およびズーム制御プログラム214が含まれる。
処理部201で用いられるプログラムおよびデータは、メモリカード、フレキシブルディスク、CD−ROM(compact disk-read only memory )、光ディスク、光磁気ディスク等の任意のコンピュータ読み取り可能な記録媒体を介して処理部201のメモリにロードすることができる。また、これらのプログラムおよびデータを、外部の装置から通信ネットワークを介してメモリにロードすることも可能である。この場合、その外部装置は、プログラムおよびデータを搬送する搬送信号を生成し、通信ネットワークを介してコントローラ102に送信する。
入力装置103は、例えば、キーボード、マウス等のポインティングデバイス、タッチパネル等であり、グラフィカルユーザインタフェース(GUI)を介して、ユーザからの指示や情報を処理部201に入力する。また、CCDカメラ126、検出器205、光スキャナ121、レーザ光源124は、制御回路202を通して処理部201により制御される。この場合、検出器205は、図1の検出器130および131に対応する。
LSM画像とTV画像を同時に観察する場合は、LSM画像が1フレーム撮像されると、次に制御回路202がレーザ光源124を消灯(OFF)することにより、TV画像が1フレーム撮像される。その後、制御回路202がレーザ光源124を点灯(ON)することで、LSM画像が1フレーム撮像され、以降同様の制御が繰り返される。このように、LSM画像とTV画像を1フレーム毎に切り換えて撮像することで、LSM画像とTV画像の同時観察が可能となる。切換のタイミングは、処理部201により、それぞれ制御回路202を通して制御される。
レーザ光源124の消灯は、レーザダイオード(LD)を消灯する、もしくはLDからのレーザ光をシャッタ等で遮断することにより行われ、制御回路202は、レーザ光の強度を制御することもできる。
検出器205からの画像信号は画像入力回路203に入力され、LSM画像として表示装置104に出力される。また、CCDカメラ126からの画像信号は画像入力回路203に入力され、TV画像として表示装置104に出力される。さらに、画像入力回路203は、あらかじめ画像格納部204に格納されている画像を取り出して表示装置104に出力することもできる。
表示画像の明るさは、ユーザからの指示に従って、制御プログラム211により調整することができる。この場合、CCD明るさ設定値演算プログラム212および電圧設定値演算プログラム213は、それぞれCCD用および検出器用のパラメータを演算し、指定された明るさをパラメータに置き換えてCCDカメラ126および検出器205に出力する。CCD用パラメータとしては、例えば、ゲイン設定値および/またはシャッタスピード設定値が用いられ、検出器用パラメータとしては、例えば、フォトマルチプライヤ高圧電源電圧の設定値が用いられる。
通常、CCD明るさ設定値演算プログラム212および電圧設定値演算プログラム213は、CCDカメラ126および検出器205からの出力が同じ割合で変化するようにパラメータを変更するため、ユーザはLSM画像とTV画像を特に意識して区別する必要はない。ただし、必要であればLSM画像とTV画像を区別して明るさを指定することができ、例えば、TV画像のみをもう少し明るくしたいといった指定も可能である。
表示画像のズーム倍率も、ユーザからの指示に従って、制御プログラム211により調整することができる。この場合、ズーム制御プログラム214は、例えば、以下の方法でズーム倍率を調整する。
LSM画像の場合、制御回路202の走査角制御により光スキャナ121の走査角を小さくすることで、生成される画像のズームを実現することができる。光スキャナ121の走査角が小さくなれば、実際にレーザ光が走査する範囲が狭くなり、その狭くなった範囲からの反射光を用いてそれまでに検出した画素単位で画像生成を行えば、生成された画像は拡大されたものと同じになる。
TV画像の場合、CCDカメラ126で撮像する画像を画像入力回路203のデジタル処理により画素拡大することで、ズーム倍率を変更することができる。また、少なくとも2つのレンズを相対的に移動させることで実現可能なズーム光学系を、CCDカメラ126へと導かれる光路中に設けて、制御回路202によりそのズーム光学系を駆動制御することで、ズーム倍率の変更を実現することもできる。
図3は、表示装置104のモニタ画面141の表示例を示している。この例では、画像表示ウィンドウ301および302内に、現在観察中のLSM画像、現在観察中のTV画像、または画像格納部204に保存されている保存画像が表示される。表示される画像は画像チャンネル選択ボタン307〜310により選択され、マウス等によりボタン307、308、309、および310がクリックされると、共焦点LSM画像、非共焦点LSM画像、TV画像、および保存画像がそれぞれ選択される。
まず、最初にいずれかのチャンネルの画像が選択されると、選択された画像が所定のウィンドウサイズで表示される。次に、2番目の画像が選択されると、画像表示ウィンドウが2つに分割され、左側のウィンドウ301に最初に選択された画像、右側のウィンドウ302に2番目に選択された画像が表示される。
さらに、別の画像が選択されると、最初に選択された画像の表示が解除され、その画像の代わりに最後に選択された画像が表示される。あるいは、最初の画像の表示が解除されると同時に、2番目の画像がウィンドウ302からウィンドウ301に移り、最後の画像がウィンドウ302に表示されるようにしてもよい。それ以降は同様の表示処理が繰り返される。また、画像の選択は、同じボタンを再度クリックすることにより解除することができる。
ボタン310により選択される保存画像としては、過去に観察したLSM画像またはTV画像や、あらかじめ用意された基準画像等が用いられる。これらの画像は、同じ試料の別の部分を比較のために表示したり、製品の製造管理のための判定基準として表示するために用いられる。
ユーザは画像の表示サイズを変更することができ、表示サイズがウィンドウより大きい場合は、スクロールバー303〜306により表示位置を移動させることができる。また、ズーム倍率、明るさ、コントラスト等の調整も可能である。これらの操作は、操作連動/非連動選択ボタン311(またはメニュー等の設定画面)により、連動操作モードおよび非連動操作モードの選択が可能である。
ボタン311をONにすることで連動操作モードが選択された場合は、2つのウィンドウ301および302内の画像を同時に操作することができる。この場合、一方のウィンドウ内の画像のズーム倍率、表示サイズ、表示位置、明るさ、コントラスト等の属性を変更する操作を行うと、もう一方の画像の属性も連動して変更される。
例えば、ウィンドウ301および302内にLSM画像およびTV画像がそれぞれ表示されている状態でユーザがLSM画像の明るさを変更すると、図2のCCD明るさ設定値演算プログラム212および電圧設定値演算プログラム213が制御回路202を介してCCDカメラ126および検出器205を同時に制御する。これにより、2つの画像の明るさが連動して変更される。また、ユーザが一方の画像のズーム倍率を変更すると、もう一方の画像も連動して同じ倍率になるように変更される。
このような連動操作モードによれば、ユーザは2つのウィンドウの画像に対する操作を同時に行うことができるので、効率的に観察を行うことができる。
これに対して、ボタン311をOFFにすることで非連動操作モードが選択された場合は、2つのウィンドウ301および302内の画像を別々に操作することができる。例えば、ウィンドウ301および302内にLSM画像およびTV画像がそれぞれ表示されている状態で、TV画像の明るさのみを選択的に変更することが可能となる。また、TV画像で広い視野を観察しながら、LSM画像でズーム倍率を上げたい(拡大したい)場合にも、この非連動操作モードが非常に有用となる。
また、図4に示すように、2つのウィンドウ301および302内に輝度プロファイル位置指定ライン401および402をそれぞれ表示し、このライン上の輝度プロファイルを別のウィンドウ403および404内に表示することもできる。あるいは、図5に示すように、2つのライン上の輝度プロファイルを1つのウィンドウ内に重ね合わせて表示するようにしてもよい。
図4のモニタ画面141においても、操作連動/非連動選択ボタン311(またはメニュー等の設定画面)により、2つのウィンドウ403および404内の輝度プロファイルの表示/非表示の選択、スケール変更、表示位置変更等の連動操作が可能である。このような輝度プロファイルを表示することで、各画像の明るさの分布を定量的に把握することが可能となる。
図3および図4では、モニタ画面141内で2つの画像を左右に並べて表示しているが、図6に示すように上下に並べて表示してもよい。また、同一画面内に3つ以上の画像を並べて表示して、それらの画像の操作を連動させることも可能である。
例えば、4つの画像を並べて表示する場合は、図7に示すような表示方法が用いられる。この表示方法によれば、観察中の共焦点LSM画像、観察中の非共焦点LSM画像、観察中のTV画像、および保存画像の組み合わせや、観察中の共焦点LSM画像、観察中のTV画像、第1の保存画像、および第2の保存画像の組み合わせのような4CH表示が可能となる。
第1および第2の保存画像として過去に観察した共焦点LSM画像およびTV画像をそれぞれ表示すれば、観察中の2つの画像を対応する過去の2つの画像とそれぞれ比較することができる。したがって、類似サンプルを用いた良否判定等を行う際に、効率的に画像を比較することが可能となる。
共焦点レーザ顕微鏡の構成図である。 コントローラの構成図である。 モニタ画面を示す第1の例の図である。 モニタ画面を示す第2の例の図である。 輝度プロファイルの重ね合わせ表示を示す図である。 モニタ画面を示す第3の例の図である。 モニタ画面を示す第4の例の図である。
符号の説明
101 顕微鏡本体
102 コントローラ
103 入力装置
104 表示装置
105 試料台
111 対物レンズ
112 レボルバ
113、118、128 ビームスプリッタ
114 照明レンズ
115 コレクタレンズ
116 白色光源
117 結像レンズ
119 1/4波長板
120 瞳投影レンズ
121 光スキャナ
122 偏光ビームスプリッタ
123、127 集光レンズ
124 レーザ光源
125 TVレンズ
126 TV画像取得用CCDカメラ
129 ピンホール
130 共焦点LSM画像取得用検出器
131 非共焦点LSM画像取得用検出器
141 モニタ画面
201 処理部
202 制御回路
203 画像入力回路
204 画像格納部
205 検出器
211 制御プログラム
212 CCD明るさ設定値演算プログラム
213 電圧設定値演算プログラム
301、302 画像表示ウィンドウ
303、304、305、306 スクロールバー
307、308、309、310 画像チャンネル選択ボタン
311 操作連動/非連動選択ボタン
401、402 輝度プロファイル位置指定ライン
403、404 ウィンドウ

Claims (6)

  1. 観察対象の上に集光したレーザ光を2次元走査しながら顕微鏡画像を取得する共焦点レーザ顕微鏡であって、
    前記観察対象に前記レーザ光を照射して前記観察対象のLSM画像を取得するためのLSM画像取得用検出手段と、
    前記観察対象に前記レーザ光とは別の照明光を照射して前記観察対象のTV画像を取得するためのTV画像取得用検出手段と、
    前記LSM画像取得用検出手段または前記TV画像取得用検出手段からの検出信号による前記観察対象の画像を生成する画像生成手段と、
    前記画像生成手段で生成された画像を同一画面上に複数並べて表示する表示手段と、
    前記画面上に並べて表示された画像の明るさを変更する操作が可能な操作手段と、
    前記操作手段により前記表示手段に並べて表示されている前記複数の画像のうち1つの画像を選択し、選択された前記画像の明るさを変更操作した場合、選択された前記画像が、変更操作された明るさとなるように、選択された前記画像を取得する検出手段の設定値を変更するとともに、連動して、同一画面上に表示されている他の画像の明るさを変更するように、他の画像を取得する検出手段の設定値を変更するよう制御する制御手段と、
    を備えることを特徴とする共焦点レーザ顕微鏡。
  2. 前記操作手段により前記複数の画像のうち1つの画像を選択し、選択された前記画像の明るさを変更操作した場合、同一画面上に表示されている他の画像の明るさを非連動にする非連動操作モードを有すること
    を特徴とする請求項1記載の共焦点レーザ顕微鏡。
  3. 前記操作手段は、前記画面上に並べて表示された複数の画像のズーム倍率、表示サイズ、表示位置、およびコントラストのうち少なくとも1つの属性を変更する操作が可能であり、
    前記操作手段により前記複数の画像のうち1つの画像を選択してズーム倍率、表示サイズ、表示位置、およびコントラストのうち少なくとも1つの属性を変更操作した場合、選択されていない画像の属性を連動または独立して変更させる連動/非連動選択手段
    を備えることを特徴とする請求項1記載の共焦点レーザ顕微鏡。
  4. 前記表示手段は、前記画面上に並べて表示された複数の画像の輝度プロファイルを該画面上に併せて表示すること
    を特徴とする請求項1記載の共焦点レーザ顕微鏡。
  5. 前記LSM画像は、前記レーザ光を前記観察対象に照射し、該観察対象により反射された反射光をピンホールを介して検出し生成した画像、または、前記反射光をピンホールを介さずに検出し生成した画像であること、
    を特徴とする請求項記載の共焦点レーザ顕微鏡。
  6. 前記LSM画像取得用検出手段は、フォトマルチプライヤであり、
    前記TV画像取得用検出手段は、CCDカメラであること
    を特徴とする請求項1記載の共焦点レーザ顕微鏡。
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