JP2012083621A - 走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】広範囲かつ高解像な画像を、高速に且つ撮りもらしなく取得することができる走査型レーザ顕微鏡を提供する。
【解決手段】標本４上においてレーザ光を２次元走査するガルバノミラー２と、走査されたレーザ光を標本４に集光する対物レンズ３と、標本４からの光を検出するＰＭＴ８と、ＰＭＴ８により検出された光の強度とガルバノミラー２の走査位置情報に基づいて、相互に重複せずに隣接する標本４の部分画像を含み、且つ、部分画像よりも大きな拡大部分画像を、部分画像と同じ画素分解能で生成する拡大部分画像生成部（ＣＰＵ９）と、生成された複数の拡大部分画像を蓄積するハードディスク１１と、蓄積された複数の拡大部分画像を互いに一部重複するように合成して、標本４の全体画像を生成する画像合成部（ＣＰＵ９）とを備える走査型レーザ顕微鏡１００，１０１を採用する。
【選択図】図１

Description

本発明は、走査型レーザ顕微鏡に関するものである。

広範囲で高解像な顕微鏡画像を取得したい場合、高倍率の部分画像を複数取得して後で貼り合わせる方法が一般的である。しかし、顕微鏡のステージの移動には誤差があるため、隣接する部分画像どうしを単純につないだだけでは、観察領域の重複や欠損が生じる可能性がある。そこで、重複領域を設けながら部分画像を複数枚取得し、部分画像間の重複を利用してパターンマッチングを行って画像を合成する方法が用いられている。

部分画像観察領域の設定方法には２つの方法がある。第１の方法は、特許文献１に示されるように、ユーザーが注目領域の範囲および対物レンズの倍率を指定すると、注目領域を不足なく覆うように、且つ所定の大きさの重複領域だけ重なり合うように複数の部分画像観察領域が設定される方法である。１つの部分画像観察領域の大きさは、指定された対物レンズの倍率における観察領域の大きさである。

第２の方法は、ユーザーが部分画像数と対物レンズの倍率を指定すると、指定された数の部分画像観察領域が重複領域を設けながら設定され、各部分画像が取得される方法である。１つの部分画像観察領域の大きさは、指定された対物レンズの倍率における観察領域の大きさである。

特許第３８２４１１６号公報

第１の方法で生じる問題点として、重複領域を設ける分だけ部分画像の枚数が増えることが挙げられる。例えば、隣接する部分画像観察領域の重複領域が１つの部分画像観察領域の大きさに対して２０％とすると、重複させないときと比較しておよそ１．６倍の画像枚数が必要となる。その結果、全ての部分画像を撮影するのにかかる時間が増える。複数の領域の画像を取得する際に必要な時間は、画像取得自体よりもステージの移動のほうが支配的なことが多い。つまり、たとえ注目領域の大きさが同じでも、画像の枚数が多いとステージの移動回数が多くなり、全ての部分画像を撮影する時間が増えてしまう。また、画像の枚数が多いとパターンマッチングを行う回数が増えるので、画像合成処理にかかる時間も増える。

また、第２の方法においては、重複領域の分だけ全体の撮影範囲が減少し、ユーザーが要求する領域を撮りもらす可能性があるという問題が生じる。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、広範囲かつ高解像な画像を、高速に且つ撮りもらしなく取得することができる走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本上においてレーザ光を２次元走査する走査部と、該走査部により走査されたレーザ光を前記標本に集光する対物レンズと、前記標本からの光を検出する光検出部と、該光検出部により検出された光の強度と前記走査部の走査位置情報に基づいて、相互に重複せずに隣接する前記標本の部分画像を含み、且つ、該部分画像よりも大きな拡大部分画像を、前記部分画像と同じ画素分解能で生成する拡大部分画像生成部と、該拡大部分画像生成部により生成された複数の前記拡大部分画像を蓄積する拡大部分画像蓄積部と、該拡大部分画像蓄積部に蓄積された複数の前記拡大部分画像を互いに一部重複するように合成して、前記標本の全体画像を生成する画像合成部とを備える走査型レーザ顕微鏡を採用する。

本発明によれば、走査部により標本上において２次元走査されたレーザ光が、対物レンズにより標本に集光され、標本からの光が光検出部により検出される。そして、拡大部分画像生成部により、光検出部により検出された光の強度と走査部の走査位置情報に基づいて、拡大部分画像が、標本の部分画像と同じ画素分解能で生成される。ここで、拡大部分画像とは、相互に重複せずに隣接する標本の部分画像を含み、且つ、該部分画像よりも大きな画像のことである。このように生成された複数の拡大部分画像は、拡大部分画像蓄積部に蓄積され、画像合成部により、互いに一部重複するように合成されて、標本の全体画像が生成される。

ここで、従来のように、部分画像を互いに一部重複するように合成した場合には、全体画像において重複領域の分だけ撮影範囲が小さくなってしまう。これに対して、本発明によれば、部分画像よりも大きな拡大部分画像を、互いに一部重複するように合成して標本の全体画像が生成されるので、全体画像における撮影範囲の減少を防ぐことができ、所望の撮影範囲を撮りもらすことがなくなる。また、この場合において、拡大部分画像は部分画像と同じ画素分解能で生成されているため、解像度を落とすことなく全体画像を取得することができる。

上記発明において、前記拡大部分画像生成部が、前記走査部による走査範囲を広げることで、前記拡大部分画像を生成することとしてもよい。
このようにすることで、拡大部分画像を部分画像と同じ画素分解能で生成することができ、解像度を落とすことなく全体画像を取得することができる。

上記発明において、前記拡大部分画像生成部が、前記部分画像を重複領域の半分の大きさだけ拡大させて拡大部分画像を生成することとしてもよい。
重複領域の半分の大きさだけ部分画像を拡大させることにより、後で複数の拡大部分画像を配置したときに、拡大前の部分画像を互いに接するように配置したときと同じ配置になり、ユーザーにとってどのように拡大部分画像が配置されるかがわかりやすくなる。

上記発明において、前記対物レンズの光軸に直交する方向に、前記標本を前記対物レンズに対して相対的に移動させるステージを備え、前記拡大部分画像生成部が、前記ステージの移動誤差に基づいて、前記部分画像の拡大および前記拡大部分画像の重複領域の設定を行うこととしてもよい。
ステージの移動誤差を重複領域の計算のパラメータとして使用することによって、隣接する部分画像を確実に重複させながら撮影することができ、全体画像における観察領域の欠損を防止することができる。

上記発明において、前記拡大部分画像生成部が、画像合成の結果得られた合成位置から前記ステージの移動誤差を算出することとしてもよい。
このようにすることで、画像合成の結果得られた合成位置からステージの移動誤差を算出し、このステージの移動誤差に基づいて重複領域の大きさを計算することができ、最低限の大きさの重複領域で拡大部分画像を取得することができる。

上記発明において、前記対物レンズの光軸に直交する方向に、前記標本を前記対物レンズに対して相対的に移動させるステージを備え、前記画像合成部が、前記ステージの移動誤差に基づいて画像の合成位置を探索する範囲を設定することとしてもよい。
ステージの移動誤差に基づいて画像合成時の探索範囲を設定することで、合成位置を探索する範囲の中に正しい合成位置を確実に含ませることができ、全体画像における観察領域の欠損を防止することができる。

上記発明において、前記画像合成部が、前記光検出部まで前記標本からの光が届かなかった前記拡大部分画像の外周部分を除いてから画像合成を行うこととしてもよい。
このようにすることで、標本からの光が光検出部まで届かなかった領域を除いて、画像合成に有効な領域だけを合成して全体画像を生成することができ、全体画像における観察領域の欠損を防止することができる。

上記発明において、前記画像合成部が、前記全体画像の大きさを調整することとしてもよい。
このようにすることで、画像合成によって得られた全体画像の大きさを、ユーザーが１枚の画像として所望する大きさに調整することができ、ユーザーは所望のサイズの全体画像を得ることができる。

上記発明において、前記走査部の走査範囲を維持したまま、前記標本上でレーザ光を照射する範囲および画像化する範囲を変えるように前記走査部および前記光検出部を制御する制御部を備えることとしてもよい。
このようにすることで、走査範囲を容易に変更できない走査部を用いている場合や、高速にタイムラプス観察を行っているときなど、途中で走査範囲を変更することが困難な場合でも、レーザ光を照射する範囲および画像化する範囲を変更することができる。

本発明によれば、広範囲かつ高解像な画像を、高速に且つ撮りもらしなく取得することができるという効果を奏する。

本発明の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。 本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。 登録時の部分画像観察領域、拡大後の部分画像観察領域、重複領域の関係を説明する図である。 部分画像観察領域を配置したときの状態を示す図である。 部分画像観察領域と視野円との関係を説明する図である。 画像合成の方法を説明する図である。 本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。

［第１の実施形態］
本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００について、図面を参照して以下に説明する。
図１に示すように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００は、レーザ光源１と、ガルバノミラー２（走査部）と、対物レンズ３と、標本４と、ＸＹステージ５と、ダイクロイックミラー６と、ピンホール７と、ＰＭＴ８（光検出部）と、ＰＣ１５とを備えている。

ガルバノミラー２は、ＸＹステージ５に置かれた標本４の上で、レーザ光源１からのレーザ光を２次元走査する。
対物レンズ３は、標本４に対向して配置されており、レーザ光を標本４に集光させ、標本４を照明する。
ＸＹステージ５は、対物レンズ３の光軸に直交する方向（ＸＹ方向）に、標本４と対物レンズ３とを相対的に移動させる。

ダイクロイックミラー６は、レーザ光源１からのレーザ光は反射する一方、標本４からの観察光を透過させる。これにより、ダイクロイックミラー６は、レーザ光と標本４からの観察光を分離する。
ピンホール７は、ダイクロイックミラー６を透過してきた観察光のうち、対物レンズ３の焦点以外からの光を遮断する。
ＰＭＴ（Photomultiplier Tube）８は、ピンホール７を通過した観察光を検出し、電気信号に変換してＰＣ１５に出力する。

ＰＣ１５は、ＣＰＵ９（拡大部分画像生成部、画像合成部、制御部）と、メモリ１０と、ハードディスク１１（拡大部分画像蓄積部）と、モニタ１２と、マウス１３と、キーボード１４とを備えている。

ＣＰＵ９は、ＰＭＴ８からの情報に基づいて部分画像を生成したり、ガルバノミラー２やＰＭＴ８、ＸＹステージ５に制御指令を与えたり、部分画像から画像合成を行って全体画像を生成する。

具体的には、ＣＰＵ９は、ＰＭＴ８により検出された標本４からの観察光の強度とガルバノミラー２の走査位置情報に基づいて、拡大部分画像を標本４の部分画像と同じ画素分解能で生成する。ここで、拡大部分画像とは、図３に示すように、相互に重複せずに隣接する標本４の部分画像を含み、且つ、該部分画像よりも大きな画像のことである。
また、ＣＰＵ９は、このように生成された複数の拡大部分画像を、図４に示すように、互いに一部重複するように合成して、標本４の全体画像を生成する。

メモリ１０は、部分画像の取得条件や部分画像の情報を一時的に保持する。
ハードディスク１１は、ＣＰＵ９により生成された拡大部分画像を蓄積する。
モニタ１２は、画像取得条件の設定画面およびＣＰＵ９により生成された全体画像を表示する。

マウス１３およびキーボード１４は、部分画像取得条件や部分画像観察領域、１枚の画像として取得する注目領域をユーザーに指定させる。
ユーザーは、モニタ１２を参照しながらマウス１３およびキーボード１４を操作することによって、各種の設定を行うことができる。

上記構成を有する走査型レーザ顕微鏡１００の動作について、図２のフローチャートを参照して説明する。
まず、部分画像観察領域の設定を行う（ステップＳ１）。ユーザーは、モニタ１２を参照しながらマウス１３やキーボード１４を操作して、部分画像取得条件を設定する。具体的には、対物レンズ３の倍率、ズーム倍率、画素分解能、画像サイズ、レーザ強度、ＰＭＴ８の感度を指定する。また、ユーザーは、１つの画像として取得したい範囲の中心にＸＹステージ５を移動させ、マウス１３やキーボード１４を使用して、その際の観察領域を部分画像観察領域として登録する。登録した際の部分画像取得条件はメモリ１０に保存される。本実施形態では、部分画像取得条件として、画素分解能を１μｍ／ｐｉｘｅｌ、画像サイズを５１２ｐｉｘｅｌ×５１２ｐｉｘｅｌに設定する。

次に、注目領域の設定を行う（ステップＳ２）。ユーザーは、マウスやキーボードを使用して、１つの画像として取得したい範囲全体を撮影できるように、登録した部分画像観察領域を中心として縦、横に広げたい部分画像数を指定する。本実施形態では、図４に示すように、縦３、横３、合計９個の部分画像を取得するように設定する。

次に、ＣＰＵ９により重複領域の大きさを計算する（ステップＳ３）。重複領域の大きさとは、隣接する画像間で重複させる長方形の領域の短辺の長さを意味する。まず、パターンマッチングに最低限必要な重複領域の一辺の画素数を適当に決めておく。数値が大きければパターンマッチングの精度は高くなるが、処理に時間がかかることを考慮して、適当な数値を設定する。本実施形態では、３０ｐｉｘｅｌとする。

また、ステージ制御の最大誤差を１０μｍとする。重複領域の大きさ[μｍ]は、ステージ制御の最大誤差[μｍ]＋パターンマッチングに必要な画素数×画素分解能で求める。本実施形態では、１０＋３０×１＝４０[μｍ]となる。このように重複領域を計算することによって、取得した部分画像においてパターンマッチングに必要な画素数分の領域を確実に重複させることができる。

次に、部分画像観察領域の拡大と配置が行われる（ステップＳ４、ステップＳ５）。
ここで、図３と図４を用いて部分画像観察領域の拡大と配置を説明する。図３は、ステップＳ１で登録した時の部分画像観察領域２１（部分画像）、拡大後の部分画像観察領域２２（拡大部分画像）、そして重複領域２３の関係を示したものである。斜線部分が重複領域２３で、矢印の長さが重複領域の大きさを示す。図３のように、部分画像観察領域は重複領域の１／２の大きさだけ拡大させ、周辺部に重複領域を設定する。

図４は、９個の部分画像観察領域を配置したときの状態を示している。ＣＰＵ９は、縦横の部分画像数をもとに、重複領域３１が重なり合うように拡大後の部分画像観察領域３２を配置し、全ての部分画像観察領域のステージ座標を計算する。このように重複領域の１／２の大きさだけ拡大し、重複領域で重なり合うように部分画像観察領域を配置すると、登録時の部分画像観察領域３３を互いに接するように配置したときと同じ配置になり、ユーザーにとってどのように部分画像観察領域が配置されるかが予想しやすくなる。

次に、ＣＰＵ９は、最初の部分画像観察領域のステージ座標にＸＹステージ５を移動させる（ステップＳ６）。部分画像の取得する順番は、例えば左上から右下に向かって順に取得する方法や、中心から外に向かって取得する方法が考えられる。

次に、ＣＰＵ９は、ガルバノミラー２やＰＭＴ８等に制御指令を送り、部分画像観察領域を撮影する（ステップＳ７）。画像取得条件はメモリ１０に保存された部分画像観察領域登録時の条件を用いる。このようにして得た部分画像はハードディスク１１に保存される。

次に、全ての部分画像を取得したか否かが判断され（ステップＪ１）、全ての部分画像を取得するまでステップＳ６〜Ｓ７の処理を繰り返す。
全ての部分画像を取得し終わったら、ＣＰＵ９は、ハードディスク１１から部分画像をメモリ１０に読み込む（ステップＳ８）。

次に、１つの部分画像観察領域の大きさと光学系の視野円の大きさから、部分画像観察領域が視野円の中に収まっているか確認する（ステップＪ２）。図５のように、もし部分画像観察領域４１が視野円４２よりも大きい場合、観察光がＰＭＴ８に届かないと予想される部分画像観察領域の外周部分４３は切り取られ、次のテンプレートマッチングには使用されないようにする（ステップＳ９）。

次に、ＣＰＵ９は重複領域を利用してパターンマッチングを行い、全ての部分画像を合成して全体画像を生成する（ステップＳ１０）。
ここで、図６のように、部分画像Ａ５１と、部分画像Ａ５１の右隣の領域を撮影した部分画像Ｂ５２のパターンマッチングを例に画像合成の方法を説明する。まず、部分画像Ａ５１または部分画像Ｂ５２の重複領域だけを切り取る。この場合の重複領域は、画像取得時の重複領域の大きさと同じである。今回は部分画像Ａ５１の重複領域を切り取り、これをテンプレート画像５３と呼ぶ（図６の斜線部）。

そして、テンプレート画像５３を部分画像Ｂ５２上で移動させて、差の二乗和や相互相関係数等を用いて類似度を計算する。テンプレートマッチングのアルゴリズムに関しては公知の技術を用いる。テンプレート画像５３を移動させる探索範囲５４は、部分画像Ｂ５２の重複領域５５から左右上下に（ステージ制御の最大誤差[μｍ]／画素分解能）の分だけ広げた範囲であり、この探索範囲５４の中をテンプレート画像５３がはみ出さないように移動させ、それぞれの場所で類似度を計算する。類似度が最も高かった位置を合成位置とする。このようにＸＹステージ５の移動誤差に基づいてパターンマッチング時の探索範囲を設定すると、探索範囲５４の中に正しい合成位置が確実に含まれることになり、画像合成で失敗する可能性が下がる。

次に、ＣＰＵ９は、全体画像の大きさをユーザーが指定した注目領域の大きさと等しくなるようにする（ステップＳ１１）。本実施形態では部分画像取得条件が５１２ｐｉｘｅｌ×５１２ｐｉｘｅｌで縦３個横３個の部分画像数を指定したので、全体画像が１５３６ｐｉｘｅｌ×１５３６ｐｉｘｅｌの画像サイズになるように、余分であれば周囲を切り取る。この処理によって、ユーザーは注目領域登録時に要求したサイズの全体画像を得ることができる。

以上のように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００によれば、広範囲かつ高解像な画像を取得できるとともに、部分画像観察領域を拡大するので重複領域の分だけ撮影する範囲が小さくなることがなく、ユーザーが要求した範囲を撮りもらすことがなくなる。具体的には、本実施形態では、部分画像の一辺が５１２μｍで、縦３個横３個の部分画像数を指定したので、全体画像の一辺が１５３６μｍになることが保証される。一方、従来技術で画像取得を行った場合は、重複領域（４０μｍ）の分だけ減るため、全体画像の一辺は１５３６−４０×２＝１４５６[μｍ]となってしまう。その結果、観察対象物の末端部などが切れてしまった場合、再度画像を取得しなくてはならない。
高倍率で画像を取得したり、ステージの移動誤差が大きくて部分画像に対する重複領域の割合が増える場合には、さらに顕著な効果を得ることができる。

また、重複領域の１／２の大きさだけ部分画像観察領域を拡大させることにより、後で複数の部分画像観察領域を配置したときに、拡大前の部分画像観察領域を互いに接するように配置したときと同じ配置になり、ユーザーにとってどのように部分画像観察領域が配置されるかがわかりやすくなる。

また、画素分解能を維持したまま部分画像観察領域を拡大するので、解像度を落とすことなく全体画像を取得することができる。
また、ステージの移動誤差を重複領域の計算のパラメータとして使用することによってパターンマッチングに必要な重複領域を確実に確保することができ、画像合成で失敗する可能性が下がる。

また、ステージの移動誤差に基づいてパターンマッチング時の探索範囲を設定するため、探索範囲の中に正しい合成位置が確実に含まれ、画像合成で失敗する可能性が下がる。
また、部分画像観察領域の拡大時に生じうる検出手段まで観察光が届かない領域を除くため、画像合成で失敗する可能性が下がる。
また、全体画像の大きさをユーザーが指定した注目領域の大きさと等しくなるように調整するため、ユーザーは要求したサイズの全体画像を得ることができる。

［第１の変形例］
以下に、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００の第１の変形例について説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００の第１の変形例として、ユーザーが注目領域を設定する際に、部分画像数を指定するのではなく、注目領域の範囲を指定してもよい。その場合は、注目領域の大きさと部分画像の取得条件（対物レンズ３の倍率とズーム倍率）から最低限必要な部分画像数を計算する。例えば、部分画像取得条件の画素分解能を１μｍ／ｐｉｘｅｌ、画像サイズを５１２ｐｉｘｅｌ×５１２ｐｉｘｅｌ、重複領域の大きさを４０μｍ、注目領域の大きさを縦３０００μｍ、横４０００μｍとすると、縦は３０００／（５１２×１＋４０）でおよそ５．４、横は４０００／（５１２×１＋４０）でおよそ７．２となる。したがって、縦は６個、横は８個、合計４８個の部分画像を配置すれば注目領域を不足なく撮影できることになる。

このように注目領域の範囲を指定する方法において、部分画像観察領域の拡大を適用すると、部分画像の枚数が減ってＸＹステージ５の移動回数が減ることにより、画像取得にかかる時間や画像を合成する時間を減少させることができる。さらに、標本４が蛍光染色されている場合においては、重複領域の総数が減るために２度レーザ光で走査される領域、つまり蛍光の退色が進みやすい領域を減少させることができる。

［第２の変形例］
以下に、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００の第２の変形例について説明する。
前述の実施形態では、部分画像の生成やガルバノミラー２、ＰＭＴ８、ＸＹステージ５の制御と画像合成処理を、同じＰＣ１５のＣＰＵ９で行ったが、本変形例では、それぞれ異なるＰＣ（ＰＣ−１、ＰＣ−２）で行ってもよい。例えば、部分画像の生成やガルバノミラー２、ＰＭＴ８、ＸＹステージ５の制御を担当するＰＣ−１と、画像合成処理を担当するＰＣ−２がネットワークでつながれており、ＰＣ−２はＰＣ−１のハードディスクに保存された部分画像を参照して全体画像を生成することとしてもよい。

［第２の実施形態］
本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１０１について、図面を参照して以下に説明する。
標本４が蛍光染色されている場合においては、重複領域は退色が進みやすいので、ユーザーにとって重複領域はできるだけ小さいほうが良い。第１の実施形態では、ステージ制御の最大誤差を用いて重複領域を計算しているが、ステージの移動誤差は様々な条件に依存して変動するため、実際にはもっと少ない誤差で重複領域を計算しても貼り合わせに成功することも大いにありうる。特に、同じ条件で同じ領域の画像を取得する場合の誤差はいずれも近い値になることが予想される。

そこで、第２の実施形態では、同じ条件で同じ領域の画像を複数回取得するタイムラプス観察を行う場合において、部分画像を取得し画像合成を行った結果求まるステージの移動誤差を、次回の部分画像取得時の重複領域の計算に反映させる。生細胞の観察時には細胞が変形することがあるため、このような広範囲の領域のタイムラプス観察がよく行われている。
以下、本実施形態の走査型レーザ顕微鏡１０１について、第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１００と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１０１は、第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００と同様の構成を有しており、図１に示すように、レーザ光源１と、ガルバノミラー２（走査部）と、対物レンズ３と、標本４と、ＸＹステージ５と、ダイクロイックミラー６と、ピンホール７と、ＰＭＴ８（光検出部）と、ＰＣ１５とを備えている。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１０１の動作について、図７を参照して説明する。
まず、部分画像観察領域の設定を行う（ステップＳ２１）。ユーザーは、モニタ１２を参照しながらマウス１３やキーボード１４を操作して、部分画像の取得条件を設定する。具体的には、対物レンズ３の倍率、ズーム倍率、画素分解能、画像サイズ、レーザ強度、ＰＭＴ８の感度、そしてタイムラプスのシリーズ数を指定する。また、ユーザーは、１つの画像として取得したい範囲の中心にＸＹステージ５を移動させ、マウス１３やキーボード１４を使用して現在の観察領域を部分画像観察領域として登録する。登録した際の部分画像取得条件はメモリ１０に保存される。

次に、第１の実施形態と同様に、注目領域の設定が行われ（ステップＳ２２）、１シリーズ目か２シリーズ目であることの判断が行われる（ステップＪ２１）。
まず、１シリーズ目の処理について説明する。
１シリーズ目の処理の場合には、重複領域の大きさの計算（ステップＳ２３）、部分画像観察領域の拡大（ステップＳ２４）、部分画像観察領域の配置（ステップＳ２５）、ステージの移動（ステップＳ２６）、部分画像の取得と保存（ステップＳ２７）、全ての画像を取得したかの判断（ステップＪ２２）、部分画像の読み込み（ステップＳ２８）、部分画像観察領域が視野円よりも大きいかの判断（ステップＪ２３）、部分画像観察領域の外周部分の除去（ステップＳ２９）、画像合成処理（ステップＳ３０）を行う。
これらの処理は第１の実施形態と同様であるため、ここでは説明を省略する。

次に、１シリーズ目であることの判断が行われ（ステップＪ２４）、ＣＰＵ９は、画像合成処理で求まった合成位置とステージの移動誤差が無かったときの理想的な合成位置との差（つまりＸＹステージ５の移動誤差）を計算する（ステップＳ３１）。例えば、Ｘ方向に２μｍ、Ｙ方向に３μｍずれていたとすると、理想的な合成位置からの差は、およそ３．６μｍとなる。この計算を全ての隣接する部分画像間で行い、最大値をメモリ１０またはハードディスク１１に保存されたステージ制御の最大誤差に代入する。

次に、第１の実施形態と同様に全体画像のサイズを調整する（ステップＳ３２）。
全体画像をハードディスク１１に保存する（ステップＳ３３）。これで１シリーズ目の処理は終了である。

次に、２シリーズ目の処理について説明する。
まず、ＣＰＵ９は、重複領域の大きさの計算を更新されたステージ制御の最大誤差を用いて行う（ステップＳ２３）。
次に、ＣＰＵ９は、更新された重複領域の大きさを用いて部分画像観察領域の拡大（ステップＳ２４）、部分画像観察領域の配置（ステップＳ２５）を行う。

そして、ステージの移動（ステップＳ２６）、部分画像の取得と保存（ステップＳ２７）、部分画像の読み込み（ステップＳ２８）、部分画像観察領域の外周部分の除去（ステップＳ２９）、画像合成処理（ステップＳ３０）、全体画像のサイズの調整（ステップＳ３２）、全体画像の保存（ステップＳ３３）を同様に行う。

３シリーズ目以降は、ステージの移動（ステップＳ２６）、部分画像の取得と保存（ステップＳ２７）、全ての画像を取得したかの判断（ステップＪ２２）、部分画像の読み込み（ステップＳ２８）、部分画像観察領域が視野円よりも大きいかの判断（ステップＪ２３）、部分画像観察領域の外周部分の除去（ステップＳ２９）、画像合成処理（ステップＳ３０）、全体画像のサイズ調整（ステップＳ３２）、全体画像の保存（ステップＳ３３）を繰り返し（ステップＪ２５）、全てのシリーズ画像を取得する。

以上のように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１０１によれば、画像合成処理を行うことで求まるＸＹステージ５の移動誤差を次回の重複領域の大きさの計算に使用するため、次回は必要最低限の大きさの重複領域で部分画像の取得ができる。また、標本４が蛍光染色されている場合においては、蛍光の退色が進みやすい領域を減らすことができる。また、生細胞の観察ではレーザによる損傷を減らすことができる。

［第１の変形例］
以下に、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１０１の第１の変形例について説明する。
ＸＹステージ５の移動誤差は、ＸＹステージ５の位置や動かす距離に強く依存すると考えられる。そこで、本変形例では、同じ領域を同じ条件で画像を取得する場合に、それぞれの場所ごとに誤差を計算し、それを次回の重複領域の大きさの計算に使用してもよい。これによって、さらに小さい重複領域で部分画像を取得することができる。

［第２の変形例］
以下に、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１０１の第２の変形例について説明する。
本変形例では、２シリーズ目で部分画像観察領域の拡大を行って、１シリーズ目と部分画像観察領域の大きさを変更するときに、ガルバノミラー２の駆動範囲は維持したまま、レーザ光を照射する範囲と画像化する範囲を変更してもよい。これにより、駆動範囲を変える電気信号を生成する必要も無くなり、また途中で駆動範囲を変更することが困難な共振型ガルバノミラーをガルバノミラー２の代わりに用いることもできるようになる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態および各変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

１ レーザ光源
２ ガルバノミラー（走査部）
３ 対物レンズ
４ 標本
５ ＸＹステージ
６ ダイクロイックミラー
７ ピンホール
８ ＰＭＴ（光検出部）
９ ＣＰＵ（拡大部分画像生成部、画像合成部、制御部）
１０ メモリ
１１ ハードディスク（拡大部分画像蓄積部）
１２ モニタ
１３ マウス
１４ キーボード
１５ ＰＣ
１００，１０１ 走査型レーザ顕微鏡

Claims (9)

1. 標本上においてレーザ光を２次元走査する走査部と、
   該走査部により走査されたレーザ光を前記標本に集光する対物レンズと、
   前記標本からの光を検出する光検出部と、
   該光検出部により検出された光の強度と前記走査部の走査位置情報に基づいて、相互に重複せずに隣接する前記標本の部分画像を含み、且つ、該部分画像よりも大きな拡大部分画像を、前記部分画像と同じ画素分解能で生成する拡大部分画像生成部と、
   該拡大部分画像生成部により生成された複数の前記拡大部分画像を蓄積する拡大部分画像蓄積部と、
   該拡大部分画像蓄積部に蓄積された複数の前記拡大部分画像を互いに一部重複するように合成して、前記標本の全体画像を生成する画像合成部とを備える走査型レーザ顕微鏡。
2. 前記拡大部分画像生成部が、前記走査部による走査範囲を広げることで、前記拡大部分画像を生成する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
3. 前記拡大部分画像生成部が、前記部分画像を重複領域の半分の大きさだけ拡大させて拡大部分画像を生成する請求項１または請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡。
4. 前記対物レンズの光軸に直交する方向に、前記標本を前記対物レンズに対して相対的に移動させるステージを備え、
   前記拡大部分画像生成部が、前記ステージの移動誤差に基づいて、前記部分画像の拡大および前記拡大部分画像の重複領域の設定を行う請求項１から請求項３のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
5. 前記拡大部分画像生成部が、画像合成の結果得られた合成位置から前記ステージの移動誤差を算出する請求項４に記載の走査型レーザ顕微鏡。
6. 前記対物レンズの光軸に直交する方向に、前記標本を前記対物レンズに対して相対的に移動させるステージを備え、
   前記画像合成部が、前記ステージの移動誤差に基づいて画像の合成位置を探索する範囲を設定する請求項１から請求項５のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
7. 前記画像合成部が、前記光検出部まで前記標本からの光が届かなかった前記拡大部分画像の外周部分を除いてから画像合成を行う請求項１から請求項６のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
8. 前記画像合成部が、前記全体画像の大きさを調整する請求項１から請求項７のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
9. 前記走査部の走査範囲を維持したまま、前記標本上でレーザ光を照射する範囲および画像化する範囲を変えるように前記走査部および前記光検出部を制御する制御部を備える請求項１から請求項８のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。

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