JP2018128325A - 分光顕微鏡及び、及び分光観察方法 - Google Patents

分光顕微鏡及び、及び分光観察方法 Download PDF

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Abstract

【課題】効率よくスペクトルを測定することができる分光顕微鏡、及び分光観察方法を提供すること。【解決手段】本実施の形態にかかる分光顕微鏡100は、試料37に入射するレーザ光L1を発生する光源11と、試料37上における複数のライン状の照明領域39を照明するよう、レーザ光L2で照明された照明領域39において発生した信号光L3を、光源のレーザ光L1と同じ波長の光から分岐するエッジフィルタ31と、エッジフィルタで分岐された信号光L4が通過する複数のスリットを有し、複数のスリットがスリット幅方向に並んでいるマルチスリット部51と、複数のスリット53を通過した信号光L4を、スリット長方向と直交する分散方向に分散して、2次元アレイ光検出器62で検出する分光器60と、を備えたものである。【選択図】図2

Description

本発明は、分光顕微鏡、及び分光観察方法に関する。
観察対象物の微細構造の観察手法として、ラマン分光顕微鏡が知られている。ラマン分光顕微鏡は、分子や結晶格子の振動数を計測しながら空間分布も取得できるため、材料工学、医療診断、創薬といった幅広い分野に適用できる。
非特許文献1には、ラマンスペクトルを測定するための分光器を備えたラマン顕微鏡が開示されている。非特許文献1のラマン顕微鏡では、レーザ光の光路にビームアレイを生成するマイクロレンズアレイが配置されている。試料は、マイクロレンズアレイによって生成された8×8のビームアレイによって照明されている。そして、ラマン散乱光は、8×8のファイババンドルに入射する。
分光器の入射スリットにおいて、ファイババンドルは1×64に配置されている。すなわち、ファイババンドルの出射端において、64本のファイバが1列に配置されている。そして、ファイババンドルを出射したラマン散乱光が、分光器によって空間的に波長分散されてCCDカメラで検出される。したがって、2次元空間情報と1次元のスペクトル情報が、CCDカメラの受光面上において2次元アレイ情報に変換されて、検出される。試料の多点で発生したラマン散乱光のスペクトルを同時に測定することができる。
Masanari Okuno1 and Hiro-o Hamaguchi,"Multifocus confocal Raman microspectroscopy for fast multimode vibrational imaging of living cells" OPTICS LETTERS / Vol. 35, No. 24 / December 15, 2010
このようなラマン顕微鏡では、1度に検出することができる情報は、CCDカメラの画素数に制限される。そして、特許文献1のラマン顕微鏡では、ビームアレイによって照明された領域からのラマン散乱光が、ファイババンドルによって1ラインに変換されている。このため、2次元空間情報を取得可能な領域が、1ラインの画素数に限定されてしまう。加えて、ビームアレイの各点から情報をCCDカメラで空間的に分離する必要があるため、最大でもCCDカメラの画素数の半分しか利用出来ない。例えば、特許文献1では、64本のファイバが1ラインに変換されているため、試料の64点からのラマン散乱光しか同時に検出することができない。
また、試料の1点からのラマン散乱光が、CCDカメラ全体に分散されている。したがって、測定すべきスペクトルの帯域が狭い場合、一部の画素は、測定に不要な波長の光を検出することになる。このように、分光顕微鏡において、スペクトルをより効率よく測定したいという要望がある。
本発明は、上記の点に鑑みてなされたものであって、効率よくスペクトルを測定することができる分光顕微鏡、及び分光観察方法を提供することを目的とする。
本発明の第1の態様にかかる分光顕微鏡は、励起光を発生する光源と、前記励起光により照明された試料の照明領域を照明するよう、前記励起光を前記試料に導く照明光学系と、前記励起光で照明された試料の照明領域からの信号光が通過する複数のスリットを有し、前記複数のスリットがスリット幅方向に並んでいるマルチスリット部と、前記複数のスリットを通過した信号光を、スリット長方向と交差する分散方向に分散して、2次元アレイ光検出器で検出する分光器と、を備えたものである。これにより、効率よくスペクトルを測定することができる。
上記の分光顕微鏡において、前記試料から前記分光器までの光路中に、前記信号光の波長域を選択する波長選択部を、さらに備えていてもよい。これにより、効率よくスペクトルを測定することができる。
上記の分光顕微鏡において、前記波長選択部で選択する波長域が可変となっていることが好ましい。これにより、測定する波長域を変えることができるため、効率よくスペクトルを測定することができる。
上記の分光顕微鏡において、前記励起光が、試料上における複数のライン状の照明領域を照明していていてもよい。
上記の分光顕微鏡において、前記複数のスリットのスリット幅、位置、及び数の少なくとも一つが可変であってもよい。これにより、波長分解能を変更することができる。
上記の分光顕微鏡において、マルチスリット部が、少なくとも、第1のスリット幅の複数のスリットを有する第1のスリット群と、第2のスリット幅の複数のスリットを有する第2のスリット群と、を備えたスリット板により形成されており、前記スリット板を移動させることで、前記信号光が、前記第1のスリット群の前記スリットを通過して前記分光器に入射する状態と、前記第2のスリット群の前記複数のスリットを通過して前記分光器に入射する状態とが切り替わるようにしてもよい。これにより、簡便な構成で波長分解能を変更することができる。
上記の分光顕微鏡において、前記マルチスリット部が、液晶パネルを有していてもよい。これにより、簡便な構成で波長分解能を変更することができる。
上記の分光顕微鏡において、前記光源から前記試料までの照明光学系が、前記試料上における複数のライン状の照明領域を照明するよう、制御信号に応じて励起光を変調する空間変調器を備えていてもよい。これにより、適切にマルチライン照明を行うことができる。
上記の分光顕微鏡において、前記分光器が、少なくとも、第1の波長帯域の前記信号光を検出する第1の分光器と、前記第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域の前記信号光を検出する第2の分光器とを備え、前記マルチスリット部が、前記第1の分光器と前記第2の分光器のそれぞれの入射側に配置されていてもよい。
上記の分光顕微鏡において、前記2次元アレイ光検出器が、少なくとも、第1の波長帯域の前記信号光を検出する第1の領域と、前記第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域の前記信号光を検出する第2の領域を備え、前記スリットの長手方向において、前記第1の領域と前記第2の領域とが、ずれていてもよい。
上記の分光顕微鏡は、前記マルチスリット部の入射側に配置され、前記信号光を前記複数のスリットに集光するシリンドリカルレンズアレイをさらに備えていてもよい。
上記の分光顕微鏡では、前記光源から前記試料までの照明光学系は、前記光源からの光を前記試料に集光する対物レンズを備え、前記試料の前記対物レンズと反対側には、前記試料で発生した信号光を反射する反射部材が配置され、前記反射部材で反射された信号光が前記対物レンズに入射するようにしてもよい。これにより、分光器で検出される信号光の強度を高くすることができる。
上記の分光顕微鏡で、前記マルチスリット部の入射側に配置され、前記信号光を前記複数のスリットに集光するシリンドリカルレンズアレイをさらに備えていてもよい。
本発明の第1の態様にかかる分光観察方法は、励起光を発生させるステップと、前記励起光を試料に導くステップと、前記励起光で照明された前記試料の照明領域からの信号光を、複数のスリットがスリット幅方向に並んでいるマルチスリット部に入射させるステップと、前記マルチスリット部の前記スリットを通過した信号光を、スリット長方向と交差する分散方向に分散して、2次元アレイ光検出器で検出するステップと、を備えたものである。
本発明によれば、効率よくスペクトルを測定することができる分光顕微鏡、及び分光観察方法を提供すること
本実施形態にかかる分光顕微鏡の概念を説明するための図である。 実施形態1にかかる分光顕微鏡の光学系の構成を示す図である。 試料上の照明領域を撮像した画像である。 マルチスリット部の構成を模式的に示す平面図である。 光検出器の画素と信号光とを示す模式図である。 分光顕微鏡で測定されるスペクトルを示す図である。 変形例1におけるマルチスリットの構成を模式的に示す平面図である。 マルチスリット部の入射側に配置されるマスクを示す斜視図である。 実施の形態2にかかる分光顕微鏡を示す図である。 分光顕微鏡で用いられる構造化照明を説明するための図である。 格子状照明で照明された照明領域とマルチスリット部のスリットの関係を説明するための図である。 実施の形態3にかかる分光顕微鏡の主要部を示す図である。 実施の形態3の変形例2にかかる分光顕微鏡の主要部を示す図である。 本実施の形態4にかかる分光顕微鏡において、シリンドリカルレンズアレイの配置を示す図である。 マルチスリット部の入射側にシリンドリカルレンズアレイを配置した検出光学系を簡略化して示す図である。 実施の形態4の変形例3の光学系を簡略化して示す図である。 実施の形態5の分光顕微鏡の構成を示す図である。 実施の形態6の分光顕微鏡の構成を示す図である。 実施の形態7の分光顕微鏡の主要部の構成を示す図である。 変形例4の主要部の構成を示す図である。 変形例5の主要部の構成を示す図である。 実施の形態8の分光顕微鏡の主要部の構成を示す図である。 変形例6の主要部の構成を示す図である。
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。各図面においては、同一要素には同一の符号が付されており、必要に応じて重複説明は省略される。
本実施の形態にかかる分光顕微鏡の概要について、図1を用いて説明する。本実施形態にかかる分光顕微鏡では、光源(図1では不図示)からの励起光が試料1を照明している。具体的には、試料1の複数のライン状(帯状)の照明領域が励起光によって同時に照明される。照明領域では、ラマン散乱が誘起される。そして、試料1の照明領域で発生したラマン散乱光(以下、信号光とも称する)は検出光学系2を介してマルチスリット部3に入射する。図1では、対物レンズを含む検出光学系2を、簡略化して図示している。
マルチスリット部3は、分光器6の入射側に配置された入射スリットである。マルチスリット部3は、スリット幅方向に並んだ複数のスリットを有している。照明領域からの信号光は、検出光学系2を介して、マルチスリット部3の各スリットに入射する。検出光学系2は、試料1の像をマルチスリット部3に結像する。マルチスリット部3は、試料1の複数のライン状の照明領域からの信号光を分光器6に通過させる。
分光器6は、信号光を分散させて、検出することでラマンスペクトルを測定する。具体的には、分光器6は、波長分散素子4と、光検出器5とを備えている。光検出器5は、分散方向(X方向)、及びスリット長方向(Y方向)に並んだ複数の画素を備えている。光検出器5は2次元アレイ光検出器である。信号光が波長分散素子4によって波長分散されることで、光検出器5のX方向にスペクトル情報が配置される。
マルチスリット部3の隣接するスリットからの信号光は、光検出器5上で重ならないように分光される。これにより、複数のライン状の照明領域からのラマンスペクトルを同時に測定することができる。試料上のより多くの点からのラマン散乱光を同時に測定することができる。このようにすることで、光検出器5の有限の画素を有効に活用することができ、効率よくラマンスペクトルを測定することができる。よって、ラマンスペクトル測定時間を短縮することができる。
実施の形態1.
実施の形態1にかかる分光顕微鏡の構成について、図2を用いて説明する。図2は、分光顕微鏡100の光学系の構成を示す図である。分光顕微鏡100は、光源11と、照明光学系10と、検出光学系40と、分光器60と、マルチスリット部51と、を備えている。ここで、ミラーなどの反射にかかわらず、光軸と平行な方向をZ方向とし、光軸と垂直な平面をXY平面とする。X方向とY方向は互いに直交する方向である。
まず、照明光学系10について説明する。照明光学系10は、試料37上における複数のライン状の照明領域を照明するよう、光源11からの励起光を試料37に導く光学系である。照明光学系10は、グランレーザプリズム12、1/2波長板13、ミラー14、レーザラインフィルタ15、レンズ16、レンズ17、ミラー18、ミラー19、シリンドリカルレンズアレイ20、ミラー21、ミラー22、レンズ23、エッジフィルタ31、ガルバノミラー32と、レンズ33、レンズ34、ミラー35、及び対物レンズ36を備えている。
光源11は、励起光となるレーザ光L1を放出する。光源11は、赤色や緑色の単色光を出射する単色光源である。例えば、光源11は、レーザ光L1として、波長532nmのCW(Continuous Wave)光を放出するNd/YVO4レーザである。光源11は、例えば、スペクトラ・フィジックス社製Millenniaを用いることができる。
光源11からのレーザ光L1は、グランレーザプリズム12によって偏光度の高い直線偏光となって、1/2波長板13に入射する。1/2波長板13は直線偏光の振動方向を回転させる。1/2波長板13を通過したレーザ光L1は、ミラー14で反射されてレーザラインフィルタ15に入射する。レーザラインフィルタ15は、レーザ波長(532nm)中心波長とする狭帯域のバンドパスフィルタである。
レーザラインフィルタ15を通過したレーザ光L1は、レンズ16、レンズ17によって屈折される。レンズ16、及びレンズ17は、レーザ光L1のビーム径を拡大するビームエキスパンダとなる。例えば、レンズ16、レンズ17の焦点距離は、それぞれ75mm、150mmとなっている。レンズ16、レンズ17で屈折されたレーザ光L1は平行光束となって、ミラー18に入射する。ミラー18で反射したレーザ光L1はミラー19に入射する。ミラー19で反射したレーザ光L1は、シリンドリカルレンズアレイ20に入射する。
シリンドリカルレンズアレイ20は、複数のシリンドリカルレンズが配列されている。したがって、シリンドリカルレンズアレイ20を通過したレーザ光L1は複数のライン状の照明光に変換される。シリンドリカルレンズアレイ20の各シリンドリカルレンズは、X方向にレーザ光L1を集光する。ラインの長手方向をY方向とし、複数のラインが並んでいる方向をX方向とする。例えば、シリンドリカルレンズアレイ20のアレイピッチは0.3mm、各シリンドリカルレンズの焦点距離は7.92mm、曲率半径は3.6mmとなっている。
シリンドリカルレンズアレイ20を通過したレーザ光L1は、ミラー21、及び22で反射されて、レンズ23に入射する。レンズ23の焦点距離は200mmとなっている。レンズ23で屈折されたレーザ光はエッジフィルタ31で反射される。エッジフィルタ31は、レーザ波長よりも長いカットオフ波長を有している。よって、エッジフィルタ31は、レーザ波長の光を反射し、レーザ波長よりも長波長のラマン散乱光を透過する。エッジフィルタ31で反射されたレーザ光をレーザ光L2とする。
エッジフィルタ31で反射されたレーザ光L2は、ガルバノミラー32に入射する。例えば、ライン状のレーザ光L2のX方向に走査する。ガルバノミラー32で走査することで試料37の所定の領域を観察することができる。ガルバノミラー32で反射されたレーザ光L2は、レンズ33、レンズ34で屈折される。レンズ33、レンズ34の焦点距離はそれぞれ160mm、200mmとなっている。レンズ34を通過したレンズ34は、ミラー35で反射されて、対物レンズ36に入射する。対物レンズ36としては、例えば、ニコン社製の60×/1.27WIの対物レンズを用いることができる。
対物レンズ36によりレーザ光L2は、試料37上に集光する。シリンドリカルレンズアレイ20は、レーザ光L2がマルチラインとなるように、レーザ光L2を集光している。したがって、レーザ光L2は、試料37上の複数のライン状の照明領域39を形成する。すなわち、マルチライン照明によって、試料37が照明される。レーザ光L2によって試料37に形成される照明領域39は、複数のライン状の領域となっている。すなわち、シリンドリカルレンズアレイ20によって、マルチライン照明が行われる。各ラインの長手方向はY方向となっている。そして、複数のライン38は、X方向に並んでいる。図2では、10本のライン38のうち、1本目をライン38a、2本目を38b、10本目を38jとして示している。図3に試料37上に形成された照明領域39のパターンの画像の一例を示す。
試料37にレーザ光L2が入射した箇所では、ラマン散乱が誘起される。したがって、複数のライン状の照明領域39からはラマン散乱光が発生する。ラマン散乱光の一部は、対物レンズ36に入射する。なお、対物レンズ36に入射したラマン散乱光を信号光L3とする。また、対物レンズ37には、レーザ光L2と同じ波長のレイリー散乱光も入射する。対物レンズ36を通過した信号光L3は、レーザ光L2が伝播した光路を反対方向に伝播していく。なお、試料37は、XY方向に移動可能な駆動ステージ上に配置されていてもよい。駆動ステージを移動することで、試料37の所望の領域を照明することができる。
次に、試料37で発生した信号光L3を分光器60まで導く検出光学系40について、説明する。検出光学系40は、対物レンズ36、ミラー35、レンズ34、レンズ33、ガルバノミラー32、エッジフィルタ31、波長選択部41、レンズ44、マルチスリット部51を備えている。
信号光L3はミラー35で反射してレンズ34に入射する。そして、信号光L3は、レンズ34、及びレンズ33で屈折されて、ガルバノミラー32に入射する。ガルバノミラー32は、信号光L3をデスキャンして、エッジフィルタ31に向けて反射する。
エッジフィルタ31は、波長に応じて、信号光L3をレイリー散乱光と分岐する光分岐手段である。エッジフィルタ31は、レーザ光L2の波長よりも長いカットオフ波長を有している。よって、カットオフ波長よりも長い波長の信号光L3がエッジフィルタ31を透過する。カットオフ波長よりも長い波長の信号光L3は、エッジフィルタ31で反射される。したがって、信号光L3の光路がレーザ光L2の光路から分岐される。エッジフィルタ31を通過した信号光L3を信号光L4とする。
エッジフィルタ31を通過した信号光L4は、波長選択部41に入射する。波長選択部41は、光検出器62で検出される信号光L4の波長域(波数域)を選択する。そのため、波長選択部41は、ローパスフィルタ42と、バンドパスフィルタ43とを備えている。ローパスフィルタ(ロングパスフィルタ)42は、低周波数帯域(長波長域)の成分を通過し、高周波数帯域(低波長域)の成分を遮光するロングパスフィルタである。バンドパスフィルタ43(BPF)は、所定の波長域のみを通過させる。波長選択部41は、信号光L4の通過波長の帯域を選択する。また、光軸に対するローパスフィルタ42の傾きを調整することで、通過する波長域を調整することができる。
波長選択部41は1つ又は2つ以上の光学フィルタを有している。そして、波長選択部41は、信号光L4の波長域を制限する。さらに、波長選択部41に配置する光学フィルタを置き換えたり、光学フィルタの傾きを調整したりすることで、選択される波長域を可変にすることができる。波長選択部41に用いられる光学フィルタはローパスフィルタ42やバンドパスフィルタ43に限られるものではなく、マルチバンドパスフィルタや、ハイパスフィルタ(ショートパスフィルタ)等を用いることができる。もちろん、2以上の光学フィルタを組み合わせ用いてもよい。さらには、液晶等を利用した透過波長可変フィルタ、プリズムと空間マスクを利用した低波長分解の分光器を波長選択部41として用いてもよい。
ローパスフィルタ42、バンドパスフィルタ43を通過した信号光L4はレンズ44に入射する。レンズ44は、試料37の像をマルチスリット部51上に結像する結像レンズである。すなわち、マルチスリット部51と試料37とは、共役な位置に配置されている。レンズ44の焦点距離は、例えば、400mmである。
マルチスリット部51の構成について、図4を用いて説明する。図4は、マルチスリット部51の構成を示すXY平面図である。マルチスリット部51は、スリット板52、及び複数のスリット53a〜53fを有している。スリット板52には、複数のスリット53a〜53fが形成されている。なお、以下の説明において、スリット53a〜53fを識別しない場合、単にスリット53と称する。図4では、スリット板52に10個のスリット53a〜53jが形成されている例が示されているが、スリット53の数は2以上であれば、特に限定されるものではない。
スリット53に入射した信号光L3はマルチスリット部51を通過して、分光器60で検出される。スリット板52のスリット53以外の位置に入射した信号光L3は、マルチスリット部51で遮光され、分光器60で検出されない。
スリット53a〜53fのそれぞれは、長手方向(スリット長方向)をY方向、短手方向(スリット幅方向)をX方向となっている。複数のスリット53は、X方向に並んで配置されている。図4では、10個のスリット53a〜53fは等間隔でX方向に並んでいる。スリット53a〜53fは同じスリット幅、及び同じスリット長を有している。Y方向において、スリット53a〜53jは同じ位置に配置されている。
スリット53a〜53jのそれぞれは、試料37上の照明領域39のライン38と対応している。例えば、1列目のライン38aで発生したラマン散乱光は、スリット53aを通過する。同様に、2列目のライン38bで発生したラマン散乱光は、スリット53bを通過する。10列目のライン38jで発生したラマン散乱光は、スリット53jを通過する。
マルチスリット部51を通過した信号光L4は、分光器60に入射する。分光器60は、分光部61と光検出器62とを備えている。分光部61は、回折格子やプリズムなどの波長分散素子を備えている。さらに、分光部61は、凹面鏡やレンズなどを備えていてもよい。分光部61は、X方向に信号光L4を分散する。
光検出器62は、2次元CCDカメラなどの2次元アレイ光検出器である。光検出器62は、アレイ状に配列された複数の画素を備えたイメージセンサである。光検出器62は、例えば、CCD(Charge Coupled Device)カメラやCMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)イメージセンサである。光検出器62は、各画素の検出光量に応じた検出信号を処理装置(不図示)に出力する。処理装置は、パーソナルコンピュータなどであり、検出信号の値を画素のXY座標に対応付けて、メモリなどに記憶する。
例えば、光検出器62は、X方向に2048、Y方向に2048の画素が配列された冷却CCDカメラである。光検出器62の画素は、スリット53に対応する方向に沿って配置されている。したがって、光検出器62の画素の一方の配列方向はスリット長方向(Y方向)と一致し、他方の配列方向は、分光部61の分散方向(X方向)と一致する。光検出器62のX方向における光強度の分布はラマンスペクトルの分布を示すことになる。マルチスリット部51において異なるスリット53を通過した信号光L4は、異なる画素で検出される。
図5を用いて、光検出器62の画素と信号光L4とを説明する。図5では、光検出器62の受光面を模式的に示す平面図である。図5に示すように、複数の画素63がX方向、及びY方向に配列されている。図5では、スリット53aを通過した信号光L4を信号光L4aとし、スリット53bを通過した信号光L4を信号光L4bとして説明する。
なお、図5では、光検出器62の複数の画素63のX座標をX1〜Xk、Y座標をY1〜Ymとして示している。k、mはそれぞれ2以上の整数である。信号光L4は、Y方向に延びるスリット53を通過しているため、Y座標Y1〜Ymの画素63で検出される。すなわち、試料37において、Y方向に異なる位置で発生したラマン散乱光は、異なるY座標の画素63で検出される。
信号光L4aは、X方向におけるn個の画素63に分散されている。具体的には、信号光L4aが入射する画素63のX座標を(a1)〜(an)とする。例えば、試料37の上の一点で発生した信号光L4aは、波長に応じて、(a1,Y1)〜(an,Y1)の画素に分散される。X座標(a1)の画素63、及びX座標(an)の画素63の一方が、短波長側に対応し、他方が長波長側に対応する。したがって、(a1)〜(an)の範囲において、画素63のX座標が信号光L4aの波長に対応する。信号光L4aは、(a1,Y1)〜(an,Ym)の(n×m)個の画素63で検出される。nは2以上の整数である。
信号光L4bも、同様に、X方向におけるn個の画素63に分散されている。信号光L4bが入射する画素63のX座標を(b1)〜(bn)とする。例えば、試料37の上の一点で発生した信号光L4bは、波長に応じて、(b1,Y1)〜(bn,Y1)の画素に分散される。X座標(b1)の画素63、及びX座標(bn)の画素63の一方が、短波長側に対応し、他方が長波長側に対応する。したがって、(b1)〜(bn)の範囲において、画素63のX座標が信号光L4bの波長に対応する。信号光L4aは、(b1,Y1)〜(bn,Ym)の(n×m)個の画素63で検出される。したがって、同様の波長域における信号光L4aのラマンスペクトルと信号光L4bのラマンスペクトルとを同時に取得することができる。
他のスリット53c〜53jを通過した信号光L4についても、同様に分散されて、(n×m)個の画素63で検出される。このように、1つのスリット53を通過した信号光L4は、(n×m)個の画素63で検出される。画素63のY座標が試料37のY方向位置に対応する。画素63のX座標が信号光L4の波長に対応する。また、隣接するスリット53を通過する信号光L4は、X座標の異なる画素63で検出される。よって、試料上における2次元の空間情報と、ラマン散乱光の波長情報を、受光面の2次元情報に変換することができる。よって、光検出器62の1フレームで、試料37の複数のライン状の照明領域39で発生したラマンスペクトルを測定することができる。
異なるスリット53を通過した信号光L4は、X方向において異なる画素63で検出される。例えば、信号光L4aが入射する画素と信号光L4bが入射する画素とは、X方向にずれている。したがって、波長分散された信号光L4a、及び信号光L4bは、光検出器62の受光面で重なっていない。光検出器62が2000×2000の画素63を有しており、スリット53の数が5である場合、1つのスリット53には400×2000の画素63が割り当てられる。すなわち、1つのスリット53に割り当てられた検出波長数が400個となる。そして、10000(=2000画素×5スリット)の観察点からのラマンスペクトルを同時に取得することができる。
光検出器62の画素数は有限である。よって、スリット数が増加すると、観察点の数を増やすことができる一方で、測定されるスペクトル点数(波数軸)が減少する。しかしながら、観察対象や観察目的に応じては、多くのスペクトル点数を必要としないことがある。すなわち、測定すべき波長域が狭い場合、多くのスペクトル点数は必要ない。
例えば、測定すべき波長域が狭いアプリケーションの場合、マルチスリット部51を用いることで、光検出器62のX方向における全ての画素63を効率よく利用することができる。よって、効率よくラマンスペクトルを利用することができる。一度にスペクトル測定することができる観察点の数を増やすことができるため、測定時間を短縮することができる。
なお、分光部61による分散方向は、X方向と平行な方向に限られるものではなく、X方向から傾いた斜め方向であってもよい。すなわち、画素の配列方向であるX方向と分散方向は完全に一致する方向でなくてもよい。XY平面において、分散方向はスリット長方向と交差する方向であればよい。この構成であっても、画素の多いカメラを有効に活用できる。各点のスペクトルは、ひし形画像を矩形画像に変形する等の画像処理により、抽出できる。
照明領域38のライン数、及びライン間隔、マルチスリット部51のスリット数、及びスリット間隔、分光器60の光学系等を調整することで、測定される波長域やスペクトル点数を任意に設定することができる。例えば、スリット数の異なるスリット板52、シリンドリカルレンズ数の異なるシリンドリカルレンズアレイ20を複数用意しておき、アプリケーションに応じて、スリット数、及びシリンドリカルレンズ数を変えればよい。よって、観察対象、及び観察目的毎に、ラマンスペクトルの測定時間を短縮することができる。
なお、隣接するスリット53を通過した信号光L4が光検出器62の受光面において重ならないように、分光部61が信号光L4を分光している。具体的には、X座標(a1)〜(an)と、X座標(b1)〜(bn)とが、完全に重複しておらず、分離されている。X座標(b1)の値が、(an)の値よりも大きい整数となっている。スリット53の間隔や、波長選択部41で選択される波長域を適宜調整することで、隣接するスリット53を通過した信号光L4が受光面において重ならないようにすることができる。もちろん、スペクトル測定が不要な一部の波長については、隣接するスリット53を通過した信号光が同じ画素に入射してもよい。例えば、X座標(a1)〜(an)の画素63と、(b1)〜(bn)の画素63の一部が重なっていてもよい。あるいは、X座標(a1)の画素63とX座標(b1)の画素63との間に信号光が入射しない画素があってもよい。
また、測定すべき波長域は、波長選択部41によって選択することができる。波長選択部41の光学フィルタを変えることで、測定すべき波長域を可変にすることができる。この点について、図6を用いて説明する。
図6は、波長域を変えた場合のラマンスペクトルを説明するための図である。図6において、波長選択部41で選択された2つの波長域をそれぞれ、第1の波長域B1、第2の波長域B2とする。第1の波長域B1と第2の波長域B2の間の波長域を第3の波長域B3とする。第3の波長域B3は、スペクトル測定が不要な波長域である。
まず、波長選択部41において、第1の波長域B1を選択するように、光学フィルタを設定する。波長選択部41のローパスフィルタ42、バンドパスフィルタ43が波長域B1の光を透過して、波長域B1以外の波長域を遮光する。分光器60が信号光L4を検出すると、第1の波長域B1におけるラマンスペクトルを測定することができる。
次に、波長選択部41が選択する波長域を第1の波長域B1から第2の波長域B2に切り替える。波長選択部41のローパスフィルタ42、バンドパスフィルタ43が波長域B2の光を透過して、波長域B2以外の波長域を遮光する。そして、分光器60が信号光L4を検出すると、第2の波長域B2におけるラマンスペクトルを測定することができる。
このようにすることで、測定すべき波長域のみのスペクトルが測定可能になる。すなわち、不要な第3の波長域B3を測定せずに、測定すべき第1の波長域B1、及び第2の波長域B2のみを測定することができる。例えば、ラマンスペクトルには、サイレント領域と呼ばれる散乱光が生じない波長域(波数域)がある。このような、サイレント領域である第3の波長域B3を除いて、ラマンスペクトルを測定することができる。すなわち、第3の波長域B3よりも高い波長域のスペクトルと低い波長域B1のラマンスペクトルをそれぞれ測定することができる。これにより、効率よくラマンスペクトルを測定することができる。
なお、図6において、測定すべき2つ以上の波長域B1、B2は、連続していないが、連続していてもよい。なお、波長選択部41で選択する波長域を変えた場合、分光器60が所望の波長域のスペクトルを測定できるように、分光部61における光路を調整してもよい。波長選択部41は、エッジフィルタ31から分光器60までの光路中に配置されていればよいため、波長選択部41の位置は、図2に示す配置に限定されるものではない。
(変形例1)
次に、実施の形態1の変形例1について、図7を用いて説明する。図7は、変形例1で用いられるマルチスリット部51の構成を示す平面図である。マルチスリット部51は、スリット板52と、第1のスリット群153と、第2のスリット群154と、第3のスリット群154と、を備えている。なお、マルチスリット部51以外の構成については、上記の分光顕微鏡100と同様であるため、説明を省略する。
スリット幅を可変とするため、スリット板52には、第1のスリット群153と、第2のスリット群154と、第3のスリット群155と、が形成されている。第1のスリット群153と、第2のスリット群154と、第3のスリット群155とは、Y方向における位置が異なっている。すなわち、Y方向において、第2のスリット群154は、第1のスリット群153と第3のスリット群155との間に配置されている。マルチスリット部51の前面は、XY方向に移動可能に配置されている。
第1のスリット群153は、複数のスリット53を有している。複数のスリット53は、Y方向をスリット長方向とし、X方向をスリット幅方向としている。複数のスリット53は、X方向に等間隔で並んでいる。
第2のスリット群154、複数のスリット54を有している。第3のスリット群155も同様に複数のスリット55を有している。第1のスリット群153と、第2のスリット群154と、第3のスリット群155とは、同じ数のスリットを有している。複数のスリット53、複数のスリット54、複数のスリット55は同じスリット長を有している。第1のスリット群153と、第2のスリット群154と、第3のスリット群155とにおいて、スリットのピッチは等しくなっている。
スリット53、スリット54、及びスリット55は、スリット幅のみが異なっている。スリット54のスリット幅はスリット53よりも広く、スリット55よりも狭くなっている。そして、分光器60の前面には、マルチスリット部51がXY平面内において、移動可能に配置されている。第1のスリット群153と、第2のスリット群154と、第3のスリット群155のうちの一つのスリット群のみが、信号光L4の光路に配置される。第1のスリット群153と、第2のスリット群154と、第3のスリット群155の一つのスリット群が選択的に分光測定に用いられる。よって、同じスリット幅のスリットのみが、分光測定に用いられる。
このようにすることで、波長分解能を可変とすることができる。例えば、波長分解能を高くする場合、幅狭の第1のスリット群153を分光器60の入射側に配置する。すなわち、信号光L4が第1のスリット群153のみに入射するように、マルチスリット部51を配置する。これにより、信号光L4は、第2のスリット群154、第3のスリット群155に入射しなくなる。そして、スリット53を通過した信号光L4が分光器60で検出される。
一方、波長分解能を低くする場合、幅広の第3のスリット群155を分光器60の入射側に配置する。これにより、幅広のスリット55を通過した信号光L4のみが分光器60で検出される。スリット幅は、信号光L4の強度、及び波長分解能に応じて設定すればよい。すなわち、信号光L4の強度が低い場合、幅広の第3のスリット群155を用い、信号光L4の強度が高い場合は、幅狭の第1のスリット群154を用いればよい。そして、スリット幅を変える場合、スリット板52をY方向に移動させればよい。信号光L4の強度、及び分解能に応じて、適宜、スリット幅を切り替えることができる。
なお、図6では、3つのスリット幅のスリット53〜55が形成されているマルチスリット部51について説明したが、切り替えるスリット幅の数は2つであってもよく、4つ以上であってもよい。すなわち、スリット板52には、少なくとも第1のスリット幅の複数のスリット53を有する第1のスリット群153と、第1のスリット幅よりも広い第2のスリット幅の複数のスリット54を有する第2のスリット群154と、が形成されていればよい。スリット板52を移動させることで、信号光L4が、第1のスリット群153のスリット53を通過して分光器60に入射する状態と、第2のスリット群154の複数のスリット54を通過して分光器60に入射する状態とが切り替わるようになる。複数のスリット群の内の一つが選択的に分光測定に用いられる。これにより、簡便な構成で、波長分解能を変更することができる。
また、スリット幅が異なるだけでなく、スリット間隔、及びスリット数が異なるスリット群を用意してもよい。これにより、スリット間隔、及びスリット数の調整を容易に行うことができる。
さらに、マルチスリット部51の前面に、図8に示すような遮光マスク70を配置してもよい。図8は、遮光マスク70の構成を示す斜視図である。マルチスリット部51の入射側に、遮光マスク70を配置することで、迷光によるノイズを低減することができる。
遮光マスク70は、開口部74を有する遮光板72を備えている。XY平面内において、開口部74は、矩形状になっている。開口部74が分光器60の入射側に配置されるように、遮光マスク70が固定される。さらに、開口部74の周りには−Z側に突出した庇73が設けられている。開口部74の4辺には庇73が設けられている。
例えば、第2のスリット群154が分光測定に用いられる場合、開口部74の後方に第2のスリット群154が配置される。第1のスリット群153、第3のスリット群155の前面には、遮光板72が配置される。したがって、第1のスリット群153、第3のスリット群155を通過して、分光器60に入射する光を遮光板72で遮光することができる。これにより、ノイズとなる迷光がスリット53、スリット55を介して、分光器60に入射するのを防ぐことができる。庇73を設けているため、迷光が開口部74から斜め方向に第1のスリット群153、第3のスリット群155に入射するのを防ぐことができる。よって、効果的にノイズを低減することができる。
なお、波長分解能を変えるために、マルチスリット部51が、液晶パネルにより構成してもよい。すなわち、複数の画素がアレイ状に配置された液晶パネルをマルチスリット部51として、分光器60の入射側に配置する。そして、各画素の透過率を制御する電気信号により、光を通過するスリット幅を変えるようにしてもよい。この場合、アプリケーションに応じて、スリット53の幅、間隔、及び数を自在に変更することができる。
実施の形態2.
本実施の形態2にかかる分光顕微鏡について、図9を用いて説明する。図9は、分光顕微鏡200の光学系の構成を示す図である。なお、本実施の形態の分光顕微鏡200においても、実施の形態1の分光顕微鏡100と同様に、マルチライン照明により試料137を照明している。そして、複数のライン状の照明領域で発生した試料からのラマン散乱光がマルチスリット部142、146を介して分光器に入射している。本実施の形態において、実施の形態1と同様の内容については適宜説明を省略し、さらに一部の構成については図示を省略している。
本実施の形態では、分光顕微鏡200が、2つのマルチスリット部142、146と、2つの分光器143、147を有している点で、実施の形態1の分光顕微鏡と異なっている。さらに、マルチライン照明を形成するための手段として、シリンドリカルレンズアレイ20の代わりに、空間位相変調器112、及びDMD114を用いている点で、実施の形態1の分光顕微鏡100と異なっている。
実施の形態2にかかる分光顕微鏡200は、空間位相変調器112と、レンズ113と、DMD(Digital Micromirror Device)114と、レンズ115と、レンズ116と、第1のダイクロイックミラー121と、第2のダイクロイックミラー122と、対物レンズ136と、レンズ141と、第1のマルチスリット部142と、第1の分光器143と、レンズ145、第2のマルチスリット部146と、第2の分光器147と、を備えている。
空間位相変調器112と、レンズ113と、DMD114と、レンズ115と、レンズ116と、第1のダイクロイックミラー121と、第2のダイクロイックミラー122と、対物レンズ136と、が照明光学系110を構成する。対物レンズ136と、第1のダイクロイックミラー121と、第2のダイクロイックミラー122と、レンズ141と、第1のマルチスリット部142と、レンズ145、第2のマルチスリット部146と、が検出光学系130を構成する。
レーザ光源(図9では、不図示)からのレーザ光L11は、空間位相変調器112に入射する。空間位相変調器112は、例えば、複数の画素を有する液晶パネルである。空間位相変調器112の各画素は、制御信号に応じて、レーザ光L11の位相を変調する。
空間位相変調器112を通過したレーザ光L11は、レンズ113を介して、DMD113に入射する。DMD113は、空間振幅変調器であり、レーザ光L11の振幅を変調する。DMD113は、複数のマイクロミラーを備えている。複数のマイクロミラーは、アレイ状に配列されて、画素となる。そして、制御信号によって電極が駆動することで、複数のマイクロミラーのON状態とOFF状態が独立して制御される。これにより、DMD113の反射パターンを制御することができる。
DMD113は、試料137上において、レーザ光L11が複数のライン状の照明領域を照明するように、レーザ光L11を反射する。DMD113、及び空間位相変調器112を空間変調器117として用いることで、マルチライン照明で試料137を照明することができる。すなわち、空間変調器117は、試料138上における複数のライン状の照明領域を照明するよう、制御信号に応じてレーザ光L11を変調する。また、空間変調器117として、DMD113、及び空間位相変調器112の一方のみを用いてもよい。また、DMD113は、対物レンズの瞳と共役な位置ではなく、試料137と共役な位置に配置されていてもよい。
DMD114で反射したレーザ光L11は、第1のダイクロイックミラー121と第2のダイクロイックミラー122とを通過する。第1のダイクロイックミラー121と、第2のダイクロイックミラー122とは、レーザ波長の光を透過して、レーザ波長よりも長波長の光を反射する。第2のダイクロイックミラー122を通過したレーザ光L11をレーザ光L12とする。後述するように、第1のダイクロイックミラー121と第2のダイクロイックミラー122とは、波長選択部120を構成している。
そして、第1のダイクロイックミラー121と、第2のダイクロイックミラー122とを通過したレーザ光L12は、対物レンズ136により集光されて、試料137に入射する。実施の形態1と同様に、試料137上の複数のライン状の照明領域が照明されている。また、試料137は、ステージ138上に載置されている。ステージ138は、駆動ステージである。ステージ138をXY方向に駆動することで、試料137の任意の位置を照明することができる。
試料137の照明領域でラマン散乱光が発生する。ここで、試料137で発生したラマン散乱光のうち、対物レンズ136に入射するラマン散乱光を信号光L13とする。また、対物レンズ136には、レーザ光L12と同じ波長のレイリー散乱光も入射する。信号光L13は対物レンズ136を介して、第2のダイクロイックミラー122に入射する。第2のダイクロイックミラー122は、波長に応じて、信号光L13とレイリー散乱光を分岐する光分岐手段となる。さらに、第2のダイクロイックミラー122は、信号光L13のうちの一部の帯域の波長のレーザ光を反射する。第2のダイクロイックミラー122で反射した信号光L13を信号光L14とする。
信号光L14は、レンズ145に入射する。レンズ145は、信号光L4を第2のマルチスリット部146に集光する結像レンズである。第2のマルチスリット部146に、ライン状の照明領域で照明された試料137が結像される。そして、第2のマルチスリット部146の各スリットを通過した信号光L4が第2の分光器147で分散されて、検出される。これにより、信号光L14のラマンスペクトルを測定することができる。
また、第2のダイクロイックミラー122を通過した信号光L13は第1のダイクロイックミラー121で反射される。第1のダイクロイックミラー121は、波長に応じて、信号光L13とレーザ光L11との光路を分岐する光分岐手段となる。第1のダイクロイックミラー121で反射した信号光L13を信号光L15とする。
ここで、第2のダイクロイックミラー122と第1のダイクロイックミラー121とは、波長特性が異なっている。例えば、第2のダイクロイックミラー122は、波長域B14の光を反射して、波長域B15の光とレーザ波長の光とを透過する。また、一方、第1のダイクロイックミラー121は、波長域B15の光を反射し、レーザ波長の光を透過する。
これにより、第2のダイクロイックミラー122で反射された信号光L14が第2のマルチスリット部146を介して、第2の分光器147で検出される。したがって、第2の分光器147は、波長域B14のラマンスペクトルを測定する。
第1のダイクロイックミラー121で反射した信号光L15は、第1のマルチスリット部142を介して、第1の分光器143で検出される。よって、第2の分光器147は、波長域B15のラマンスペクトルを測定することができる。
このように、波長選択部120が、第1のダイクロイックミラー121、第2のダイクロイックミラー122を用いて、信号光L14の波長域B14と信号光L15の波長域B15とを選択している。すなわち、波長域B14の信号光L14と波長域B15の信号光L15とが波長選択部120で分岐されて、別々の分光器143、147で検出される。
このようにすることで、2つの波長域B14、B15のラマンスペクトルを同時に測定することができる。よって、一度に測定されるラマンスペクトル点数を増やすことでき、測定時間を短縮することが可能となる。さらに、分離した2つの波長域B14、B15のラマンスペクトルを同時に測定することができる。
もちろん、波長選択部120には、第1のダイクロイックミラー121、第2のダイクロイックミラー122に限らず、光学フィルタなどを用いて、波長を選択してもよい。また、1つ以上のダイクロイックミラーと、1つ以上の光学フィルタとを組み合わせて、波長選択部120を構成してもよい。
また、実施の形態1のように、単一の分光器を用いる場合であっても、Y方向に波長域(波数域)を分割することで、スペクトル検出に必要なX方向の画素数を低減することができる。Y方向に複数の波長域を変えるように光学フィルタを配置する。具体的には、Y方向に延びるスリットの+Y側半分と−Y側半分で信号光の波長を変えるように光学フィルタを配置する。これにより、有限の画素をさらに有効に活用することができる。したがって、分光器の光検出器が、第1の波長帯域の前記信号光を検出する第1の領域と、第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域の前記信号光を検出する第2の領域を備えている。そして、スリットの長手方向において、第1の領域と記第2の領域とが、ずれている。
なお、ステージ138による走査の代わりに、ガルバノラー等の光スキャナにより、レーザ光を走査してもよい。すなわち、DMD114、及び空間変調器117を用いてマルチライン照明を形成した場合においても、図2で示したガルバノミラー32などの光スキャナを用いて、マルチライン照明を走査することが可能である。
(構造化照明)
さらに、本実施の形態2では、構造化照明を用いて、マルチライン照明を行うことができる。構造化照明を用いることで、空間分解能を向上している。構造化照明については、例えば、国際公開2016/027453明細書、及びKozue Watanabe et. al, ”Structured line illumination Raman microscopy” Nature Communications 2015に詳細に記載されている。以下、本実施の形態で用いることができる構造化照明の概略について説明する。
図10は、構造化照明の照明パターンを説明するための図である。図10の左列は対物レンズ136の瞳上のレーザ強度を示している。図10の中央列(左から2列目)は試料137上での照明パターンを示している。図10の右列は、マルチスリット部の1つのスリットを通して検出される領域を示している。また、図10は構造化ライン照明A(上から1列目)、構造化ライン照明B(上から2列目)、格子状照明C(下から1列目)の照明パターンを示している。さらに、図10に示すように、9個の画像を画像a、画像b、画像c、画像e,画像f、画像g、画像h、画像i、画像jとして説明する。
構造化照明A、Bでは、画像b、画像fに示されるように、点線状の照明パターンのライン照明を用いている。すなわち、ライン状の照明光に周期構造を持たせている。試料上において、Y方向に複数のスポットが1列に並んだ状態でライン照明がなされる。スポットが一定間隔でY方向に並んでいる。このようにすることで、ライン照明に平行な方向(Y方向)の空間分解能を向上させることができる。
図2の画像a、画像b、画像e、画像fに示すように、周期構造の細かさとラインの幅(X方向における大きさ)は、トレードオフの関係にある。構造化ライン照明Bでは、点線のピッチが狭くなっている一方、各スポットがX方向に広がってしまう。よって、X方向とY方向との空間分解能を同時に向上することが困難となる。
したがって、本実施の形態では、格子状の照明パターンを有する格子状照明Cを用いるようにしている。これにより、上記した空間分解能のトレードオフを軽減することができ、X方向の空間分解能を向上させることができる。マルチスリット部において、X方向の低空間周波数成分をマスクすることで、実効的な空間分解能を向上させることができる。カットオフ周波数は変化しないが、高周波数成分が強調されることにより、ノイズに埋もれていた微細な構造を観察できるようになる。
格子状照明Cでは、画像iに示すように、ライン照明LLと垂直方向(X方向)に多数のサイドローブLSが生まれる。すなわち、ライン照明LLの両側にサイドローブLSが発生する。サイドローブLSで発生したラマン散乱光は、マルチスリット部で遮光される。
図11を用いて、マルチスリット部に入射するラマン散乱光について説明する。図11は、マルチスリット部のスリット板52、及びスリット53a、53bに入射するラマン散乱光を模式的に示している。図11において、ライン照明LLにより発生したラマン散乱光をラマン散乱光L31a、L31bとする。また、ラマン散乱光L31aは、マルチライン照明における1本目のラインにより発生したラマン散乱光であり、ラマン散乱光L31bは、マルチライン照明における2本目のラインにより発生したラマン散乱光である。ラマン散乱光L31aは、1つ目のスリット53aを通過し、ラマン散乱光L31bは、2つ目のスリット53bを通過する。
サイドプローブLSにより発生したラマン散乱光をラマン散乱光L32a、L32bとする。ラマン散乱光L32aは、1本目のライン照明LLのサイドローブLSにより発生したラマン散乱光であり、ラマン散乱光L32bは、2本目のライン照明LLのサイドローブLSにより発生したラマン散乱光である。ラマン散乱光L32a、L32bは、スリット板52で遮光される。すなわち、ラマン散乱光L32a、L32bは、X方向において、スリット53a、53bからずれた位置に入射するため、スリット53a、53bを通過できない。
試料上におけるサイドローブLSとライン照明LLとの間隔は、スリット間隔に対応する間隔よりも狭くなっている。したがって、ラマン散乱光L31aのみ1本目のスリット53aを通過して、ラマン散乱光L32bはスリット板52で遮光される。同様に、ラマン散乱光L31bのみ、2本目のスリット53bを通過して、ラマン散乱光L32bはスリット板52で遮光される。すなわち、サイドローブLSで発生したラマン散乱光L32a、L32bは、スリット53の外側に入射して、スリット板52で遮光される。よって、サイドローブLSで発生したラマン散乱光L32a、L32bによるラマンスペクトルへの影響を低減することができる。よって、空間分解能を向上することができる。
図9に示す分光顕微鏡200では、対物レンズ136の瞳に共役な位置にDMD114を配置している。そして、DMD114の反射パターン、すなわち瞳関数を制御する。これにより、さまざまなパターンの格子状照明を形成することができる。DMD114は、解像度が高いため、高精度な瞳関数を設定することができる。さらに、DMD114は、損傷閾値が高いため、高強度レーザ光との組み合わせに適している。
一方、反射パターンによっては、DMD114の反射後のレーザ高強度が著しく低下してしまう恐れがある。その場合は、空間位相変調器112を用いてホログラフィックに大まかな強度パターンをDMD114上に形成する。そして、詳細な瞳関数はDMD114で決定する。このように、空間位相変調器112とDMD114とを用いて、格子状照明を行う。このようにすることで、XY方向の空間分解能を同時に向上することができる。
さらに、マルチライン照明を行っているため、実施の形態1と同様に、高速な撮像が可能となる。高解像度な観察像の構築するために必要であった複数箇所の画像計測を1度で行うことができる。これにより、時間分解能を向上することができる。
なお、図10の画像に示すような格子状照明を行うために、グリッドマスク、またはレンズアレイを用いてもよい。DMD114、及び空間位相変調器112の代わりに、グリッドマスク、またはレンズアレイを用いて、マルチスポットを形成することも可能である。
実施の形態3.
本実施の形態3にかかる顕微鏡の構成について、図12を用いて説明する。図12は、実施の形態3にかかる顕微鏡の主要部の構成を示す図である。具体的には、図12は、試料303の周辺の構成を模式的に示す図である。
本実施の形態の構成は、実施の形態1、2で示したマルチスリット部を用いていない分光顕微鏡にも適用可能である。すなわち、本実施の形態の構成は、シングルライン照明の分光顕微鏡や、スポット照明の分光顕微鏡にも適用可能である。さらには、本実施の形態に示す構成は、分光測定を行わない顕微鏡についても適用可能である。そして、照明光学系や検出光学系の構成は特に限定されるものではないため、図示を省略する。
ラマン散乱光は、通常、試料303の観察点から全方位に放出される。しかしながら、ラマン顕微鏡では、対物レンズに入射した信号光しか検出することができない。そのため、本実施の形態では、信号光の強度を高くするために、図12に示す構成を用いている。
図12では、試料303が、ダイクロイックミラー307と、透明なカバーバラス302との間に配置されている。なお、本実施の形態では、薄片化された、光透過性の試料303を観察している。ダイクロイックミラー307は、試料303の対物レンズ301と反対側に配置されている。すなわち、ダイクロイックミラー307と対物レンズ301との間に、試料303が配置されている。なお、試料303の対物レンズ301と反対側を透過側として、対物レンズ301側と反射側とする。
対物レンズ301は、光源からのレーザ光L41を集光する。そして、対物レンズ301により集光されたレーザ光L41がカバーガラス302を介して、試料303に入射する。そして、励起光であるレーザ光L41が試料303に入射すると、試料303でラマン散乱光が発生する。上記のように、ラマン散乱光は全方位に放出される。ここで、試料で発生したラマン散乱光のうち、反射側に放出されたラマン散乱光をラマン散乱光L43とする。ラマン散乱光L43は、カバーガラス302を介して、対物レンズ301に入射する。試料で発生したラマン散乱光のうち、透過側に放出されたラマン散乱光をラマン散乱光L44とする。ラマン散乱光L44は、ダイクロイックミラー307で反射される。そして、ラマン散乱光L44は、試料303、及びカバーガラス302を通過して、対物レンズ301に入射する。
よって、試料303の透過側に放出したラマン散乱光L44と、試料303の反射側に放出したラマン散乱光L43が、共通の検出光学系を伝播する。この構成により、透過側に放出されたラマン散乱光L44と試料303の反射側に放出したラマン散乱光L43とを同じ光検出器で検出することができる。よって、信号光の強度を高くすることができる。
なお、ダイクロイックミラー307の代わりに、通常の反射ミラーを用いてもよい。この場合、試料303を透過したレーザ光L41がミラーで反射して対物レンズ301に戻ることになるが、レーザ光L41の戻り光は検出光学系に設けられたエッジフィルタ31やダイクロイックミラー122でラマン散乱光から分岐することができる。ダイクロイックミラー307やミラーを試料303のステージとして用いればよい。すなわち、試料303がダイクロイックミラー307、又はミラーの上に配置されていればよい。
(変形例2)
実施の形態3の変形例について図13を用いて説明する。図13は、変形例2にかかる顕微鏡の主要部の構成を示す図である。なお、図12と共通する構成については、適宜説明を省略する。
試料303は、透明なカバーガラス302と透明なカバーガラス304との間に配置されている。さらに、試料303の対物レンズ301と反対側には、透過側の対物レンズ305が配置されている。すなわち、反射側の対物レンズ301と透過側の対物レンズ305との間に、試料303が配置されている。透過側の対物レンズ305は、カバーガラス304とダイクロイックミラー307との間に配置されている。
励起光であるレーザ光L41は対物レンズ301により、試料303に集光される。そして、試料303においてラマン散乱光が発生する。試料303で発生したラマン散乱光のうち、対物レンズ301側に発生したラマン散乱光をラマン散乱光L43とし、対物レンズ305側に発生したラマン散乱光をラマン散乱光L44とする。ラマン散乱光L43はカバーガラス302を介して、対物レンズ301に入射する。
ラマン散乱光L44は、カバーガラス304を介して、対物レンズ305に入射する。対物レンズ305で集光されたラマン散乱光L44は、ダイクロイックミラー307で反射する。ダイクロイックミラー307で反射したラマン散乱光L44をラマン散乱光L45とする。
ラマン散乱光L45は、対物レンズ305で集光される。対物レンズ305で屈折されたラマン散乱光L45は、カバーガラス304、試料303、カバーガラス302を介して、対物レンズ301に入射する。したがって、ラマン散乱光L43とラマン散乱光L45とは、共通の検出光学系を伝播する。この構成により、ラマン散乱光L45とラマン散乱光L43とを同じ光検出器で検出することができる。よって、信号光の強度を高くすることができる。
本実施の形態では、顕微鏡が、励起光であるレーザ光L41を試料303に集光する対物レンズ301と、試料303の対物レンズ301と反対側に配置されたミラーと、を備えている。そして、ミラーは、試料から対物レンズ301と反対側に放出したラマン散乱光L44を対物レンズ301に向けて反射する。
これにより、試料303の透過側に放出したラマン散乱光L44と、試料303の反射側に放出したラマン散乱光L43とが、共通の対物レンズ301に入射する。したがって、ラマン散乱光L43とラマン散乱光L44とが共通の検出光学系を介して、光検出器で検出される。よって、光検出器で検出されるラマン散乱光の強度を高くすることができる。
なお、試料303の対物レンズ301と反対側に配置されたミラーは、ダイクロイックミラー307であることが好ましい。これにより、レーザ光L41の戻り光の影響を低減することができる。例えば、ミラーなどの反射部材で反射されたレーザ光L41の戻り光により、ラマン散乱光が発生するのを防ぐことができる。もちろん対物レンズ305と反射部材との間に光学フィルタなどを配置して、レーザ光L41の戻り光を除去してもよい。
実施の形態4.
本実施の形態では、図14に示すように、マルチスリット部51の前にシリンドリカルレンズアレイ46が配置されている。分光顕微鏡の基本的な構成は、図2に示した分光顕微鏡100と同様であるため、説明を省略する。
図14に示すように、マルチスリット部51の入射側にシリンドリカルレンズアレイ46が配置されている。したがって、信号光L3は、シリンドリカルレンズアレイ46を介して、マルチスリット部51に入射する。シリンドリカルレンズアレイ46の各シリンドリカルレンズは、Y方向(紙面と垂直方向)を長手方向としている。シリンドリカルレンズアレイ46に設けられた複数のシリンドリカルレンズはX方向(紙面内における上下方向)に並んでいる。
そして、シリンドリカルレンズアレイ46の各シリンドリカルレンズはX方向に信号光L3を集光する。シリンドリカルレンズアレイ46の各シリンドリカルレンズは対応するスリット53に光を集光する。マルチスリット51には、シリンドリカルレンズアレイ46で集光された信号光L3が入射する。そして、スリット53を通過した信号光L3が分光器60で検出される。
図15にシリンドリカルレンズアレイ46を用いた場合の検出光学系40を簡略化して示す。図15では、検出光学系40の対物レンズ36、シリンドリカルレンズ46、マルチスリット部51のみを示しており、その他の光学素子については省略している。すなわち、図2で示したエッジフィルタ31、波長選択部41などについては省略されている。
試料37は、ライン状の照明領域39によって照明されている。照明領域39の各ライン38は、それぞれ紙面と垂直な方向を長手方向としている。そして、照明領域39の各ライン38から発生した信号光L3は、対物レンズ36に入射する。対物レンズ36からの信号光L4は、結像レンズ44で集光されて、シリンドリカルレンズアレイ46に入射する。シリンドリカルレンズアレイ46は、信号光L4をマルチスリット部51の複数のスリット53に集光する。そして、複数のスリット53を通過した信号光L4は、分光器60で検出される。
マルチスリット部51の入射側にシリンドリカルレンズアレイ46を配置することで、分光器60への集光角を増すことができる。よって、波数分解能、計測波数ピクセル数を増やすことができる。また、本実施の形態で説明したシリンドリカルレンズアレイ46は、実施の形態1、2で示したマルチライン照明に限らず、実施の形態3で示した格子状照明と組み合わせることも可能である。
(変形例3)
実施の形態4の変形例3について、図16を用いて説明する。図16は変形例3にかかる分光顕微鏡の検出光学系の構成を簡略化して示す図である。実施の形態4では、照明領域がマルチライン照明であってが、変形例3では、一様照明39aとなっている点が、実施形態4と異なっている。
具体的には、図2に示す分光顕微鏡100からシリンドリカルレンズアレイ20を取り除くことで、試料37上に一様照明を形成することができる。したがって、試料37の照明領域39aが一様に照明される。照明領域39aは、Y方向だけでなく、X方向にも延びた二次元領域である。そして、2次元の照明領域39が均一に照明される。
試料37の全体から信号光L3が生成されたとしても、シリンドリカルレンズ46を用いることで、X方向に分離した光分布を生成することができる。よって、分光器60でスペクトルと空間分布を同時に取得することができる。
実施の形態5.
実施形態5にかかる分光顕微鏡について、図17を用いて説明する。図17は、本実施の形態にかかる分光顕微鏡400を示す図である。本実施の形態に分光顕微鏡400は、ラマンスペクトルではなく、試料からの反射スペクトルを測定するものである。そのため、実施の形態2で示した図2の構成の光源11、及びエッジフィルタ31が白色光源411、及びビームスプリッタ431にそれぞれ置き換わっている。また、レーザラインフィルタ15が光路から取り除かれている。なお、実施の形態1と同様の構成については、適宜説明を省略する。
白色光源411は、例えば、ランプ光源、シングルモードのスーパーコンティニューム光源などであり、照明光となる白色光L41を発生する。エッジフィルタ31がビームスプリッタ431に置き換わっている。ビームスプリッタ431で反射された白色光L42が、試料37を照明する。白色光L42は、実施の形態1と同様にマルチライン照明を行う。試料37により白色光が反射して、信号光L43となる。信号光L43は、試料37に応じた反射スペクトルを有している。
そして、信号光L43は、ビームスプリッタ431を通過して、信号光L44となる。信号光L44は波長選択部41により波長帯が選択されて、マルチスリット部51に入射する。そして、マルチスリット部51を通過した信号光L44は、分光器61によって分光測定される。
このようにすることで、試料37の反射スペクトルを効率よく測定することができる。本実施の形態では、波長に応じて、励起光L2と信号光L3とを分離する光分岐手段(エッジフィルタ31等)が設けられていない構成となる。なお、奥行方向の空間分解能が不要の場合には、マルチライン照明を行わずに、試料を白色光で一様照明しても良い。
実施の形態6.
実施の形態6の分光顕微鏡について、図18を用いて説明する。図18は分光顕微鏡500の構成を示す図である。分光顕微鏡500は、透過分光イメージングを行うための透過照明光学系501を備えている。透過照明光学系501は、試料37の対物レンズ36と反対側から励起光L52を試料37に照射する。
なお、透過照明光学系501以外の構成、例えば、検出光学系40は図2と同様であるため、説明を省略する。透過照明光学系501は、レーザ光L52によりマルチライン照明を行う。なお、透過照明光学系501は、実施の形態1〜3で示した手法と同等の手法により、マルチライン照明を行うことができるため、詳細な説明については省略する。そして、分光器61は、試料37からの信号光L4を検出する。このようにすることで、試料37を透過したラマン散乱光を分光測定することができる。あるいは、マルチライン照明を行わずに、試料を一様照明しても良い。また、光源を白色光として透過光を分光測定しても良い。あるいは、光源と試料の間、および対物レンズ36とマルチスリット51の間に、偏光板、DIC(Differential interference contrast)プリズムを挿入することで、微分干渉観察を行ってもよい。あるいは、光源と試料の間に輪帯マスクを挿入し、対物レンズ36とマルチスリット51の間に位相板を挿入することで、位相差観察を行ってもよい。
実施の形態7.
実施の形態7では、図2の分光顕微鏡100に対して、試料37に入射するレーザ光L2の空間分布を一様にするための構成が追加されている。例えば、光検出器62の1回の露光時間中にレーザ光L1を走査するための構成が追加されている。レーザ光L1を走査する構成以外については、図2と同様であるため説明を省略する。
具体的には、図19に示すように、シリンドリカルレンズ20の前に透明な平行平板601を配置している。平行平板601は入射側の面と出射側の面が平行な平面となっている。平行平板601を通過したレーザ光L1がシリンドリカルレンズアレイ20に入射する。平行平板601は、入射面の角度を変えることができるように、モータなどのアクチュエータに取り付けられている。
そして、光検出器62の1回の露光時間中に、平行平板601が矢印Aの方向に動作する。すなわち、平行平板601の傾きを変えることで、レーザ光L1が矢印Bの方向に走査される。レーザ光L1の角度を保ったままで、シリンドリカルレンズアレイ20への入射位置を変えることができる。したがって、試料37に入射するマルチライン照明を実質的に一様にすることができる。なお、図19では、紙面内の走査のみ示しているが、紙面奥行方向についても同様に走査することが好ましい。これにより、マルチライン照明を、より均一化することができる。
変形例4.
変形例4においても、図2の分光顕微鏡100に対して、試料37に入射するレーザ光L1の空間分布を一様にするための構成が追加されている。具体的には、図20に示すように、光軸に対して傾いた透明な平行平板601がシリンドリカルレンズ20の前に配置されている。光軸と平行な軸を回転軸として、平行平板601が矢印Aのように回転すると、レーザ光L1が矢印Bの方向(XY平面(紙面に垂直な面)内での回転方向)に走査される。このようにすることで、上記と同様に、レーザ光L1の角度を保ったままで、シリンドリカルレンズアレイ20への入射位置を変えることができる。よって、試料37に入射するマルチライン照明を実質的に一様にすることができる。
変形例5.
変形例5においても、図2の分光顕微鏡100に対して、試料37に入射するレーザ光L1の空間分布を一様にするための構成が追加されている。具体的には、図21に示すように、シリンドリカルレンズ20の前に、ミラー602、走査ミラー603、ミラー604、ミラー605が配置されている。走査ミラー603は、矢印Aの方向に角度を変えるよう、アクチュエータに取り付けられている。すなわち、走査ミラー603の反射面の傾きが矢印Aのように変化する。
ミラー602で反射したレーザ光L1が走査ミラー603に入射する。走査ミラー603で反射されたレーザ光L1は、ミラー604、605で反射されて走査ミラー603に再度入射する。走査ミラー603で再度反射したレーザ光L1がシリンドリカルレンズアレイ20に入射する。走査ミラー603が矢印Aの方向に動作することで、シリンドリカルレンズ20に入射するレーザ光L1が矢印Bの方向に走査される。このようにすることで、上記と同様に、レーザ光L1の角度を保ったままで、シリンドリカルレンズアレイ20への入射位置を変えることができる。よって、試料37に入射するマルチライン照明を実質的に一様にすることができる
実施の形態8.
実施の形態8の分光顕微鏡では、複数のライン状の照明領域を形成する構成が、図2と異なっている。図22に、実施の形態8の分光顕微鏡の主要部の構成を示す。図22の矩形枠で囲まれた部分Cが、図2のシリンドリカルレンズアレイ20に置き換わっている。すなわち、図2のシリンドリカルレンズアレイ20の代わりに、点線の矩形枠で囲まれた部分が配置されている。なお、図22の点線の矩形枠で囲まれた部分以外の構成については、上記の実施の形態と同様であるため、説明を省略する。
レンズ23の前には、ホログラム素子701、シリンドリカルレンズ702、マスク705が配置されている。ホログラム素子701は、レーザ光L1を複数の回折光L71に分割する。回折光L71は回折次数に応じた角度となっている。したがって、複数の回折光L71は異なる角度で、ホログラム素子701から出射する。そして、複数の回折光L71はシリンドリカルレンズ702に入射する。シリンドリカルレンズ702は、回折光L71をマスク705に集光する。なお、シリンドリカルレンズ702は、X方向に回折光L71を集光する。シリンドリカルレンズ702が試料37上においてマルチライン照明を形成する。
なお、シリンドリカルレンズ702の後には、マスク705が設けられている。マスク705はマルチスリット部51と同様に複数のスリット705aを備えている。そして、スリット705aは、Y方向を長手方向としている。マスク705は0次光、及び不要な回折光を遮光する。マスク705を通過した回折光L71がレンズ23に入射する。なお、マスク705を設けられていなくてもよい。
変形例6.
変形例6について、図23を用いて説明する。図22に、変形例6の分光顕微鏡の主要部の構成を示す。変形例6においても、実施の形態8と同様に、図23の矩形枠で囲まれた部分Cが、図2のシリンドリカルレンズアレイ20に置き換わっている。レンズ23の前には、ホログラム素子701、シリンドリカルレンズ702、レンズ703、及びマスク705が配置されている。図22の構成に対して、レンズ703が追加されている。さらに、シリンドリカルレンズ702の向きが図22の構成と異なっている。なお、図22と共通の構成については適宜説明を省略する。
ホログラム素子701は、レーザ光L1を複数の回折光L71に分割する。複数の回折光L71は異なる角度で、ホログラム素子701から出射する。そして、複数の回折光L71はシリンドリカルレンズ702に入射する。シリンドリカルレンズ702は、紙面と垂直な方向(Y方向)に集光する。シリンドリカルレンズ702からの回折光L71は、レンズ70で集光され。このように、シリンドリカルレンズ702とレンズ703の組み合わせによって、マルチライン照明を形成することができる。
なお、レンズ703の後には、マスク705が設けられている。マスク705はマルチスリット部51と同様に複数のスリット705aを備えている。そして、スリット705aは、Y方向を長手方向としている。マスク705は0次光、及び不要な回折光を遮光する。マスク705を通過した回折光L71がレンズ23に入射する。なお、マスク705を設けられていなくてもよい。
実施の形態1〜8の構成は適宜組み合わせることができる。実施の形態1〜8では、マルチラインのレーザ光を走査して、試料の2次元画像を生成することができる。なお、上記の実施の形態では、主として、信号光がラマン散乱光であるとして説明したが、信号光は、ラマン散乱光以外の光であってもよい。したがって、本実施の形態にかかる分光顕微鏡は、ラマン分光顕微鏡以外の分光顕微鏡であってもよい。例えば、励起光によって励起される蛍光を検出する分光顕微鏡や、赤外吸収スペクトルや近赤外吸収スペクトルを測定する分光顕微鏡であってもよい。これらの分光顕微鏡でも、短時間で、スペクトルの測定を行うことができる。特に、高速計測や繰り返し計測を求められる分光顕微鏡に好適である。分光顕微鏡の用途は、イメージングに限られるものではない。試料が溶液などの一様な試料の場合は広い面積を同時に計測できるので信号量が増し、測定時間を短くできる。この場合計測されたスペクトルは積算される。
以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は既に述べた実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることはいうまでもない。
1 試料
2 検出光学系
3 マルチスリット部
4 波長分散素子
5 光検出器
10 照明光学系
11 光源
12 グランレーザプリズム
13 1/2波長板
14 ミラー
15 レーザラインフィルタ
16 レンズ
17 レンズ
18 ミラー
19 ミラー
20 シリンドリカルレンズアレイ
21 ミラー
22 ミラー
23 レンズ
31 エッジフィルタ
32 ガルバノミラー
33 レンズ
34 レンズ
35 ミラー
36 対物レンズ
37 試料
40 検出光学系
41 波長選択部
42 ローパスフィルタ
43 バンドパスフィルタ
44 レンズ
46 シリンドリカルレンズアレイ
51 マルチスリット部
52 スリット板
53 スリット
60 分光器
61 分光部
62 光検出器
63 画素
100 分光顕微鏡
110 照明光学系
112 空間位相変調器
113 レンズ
114 DMD
115 レンズ
116 レンズ
117 空間変調器
121 第1のダイクロイックミラー
122 第2のダイクロイックミラー
136 対物レンズ
137 試料
138 ステージ
141 レンズ
142 第2のマルチスリット部
143 第2の分光器
145 レンズ
146 第2のマルチスリット部
147 第2の分光器
200 分光顕微鏡
301 対物レンズ
302 カバーガラス
303 試料
304 カバーガラス
305 対物レンズ
307 ダイクロイックミラー
411 白色光源
431 ビームスプリッタ
501 透過照明光学系
601 平行平板
701 ホログラム素子
702 シリンドリカルレンズ
705 マスク

Claims (13)

  1. 光を発生する光源と、
    前記光で照明された試料の照明領域からの信号光が通過する複数のスリットを有し、前記複数のスリットがスリット幅方向に並んでいるマルチスリット部と、
    前記複数のスリットを通過した信号光を、スリット長方向と交差する分散方向に分散して、2次元アレイ光検出器で検出する分光器と、
    を備えた分光顕微鏡。
  2. 前記試料から前記分光器までの光路中に、前記信号光の波長域を選択する波長選択部を、さらに備えた請求項1に記載の分光顕微鏡。
  3. 前記波長選択部で選択する波長が可変となっている請求項2に記載の分光顕微鏡。
  4. 前記光が、試料上における複数のライン状の照明領域を照明している請求項1〜3のいずれか1項に記載の分光顕微鏡。
  5. 前記複数のスリットのスリット幅、位置、及び数の少なくとも一つが可変である請求項1〜4のいずれ1項に記載の分光顕微鏡。
  6. マルチスリット部が、少なくとも、
    第1のスリット幅の複数のスリットを有する第1のスリット群と、
    第2のスリット幅の複数のスリットを有する第2のスリット群と、を備えたスリット板により形成されており、
    前記スリット板を移動させることで、前記信号光が、前記第1のスリット群の前記スリットを通過して前記分光器に入射する状態と、前記第2のスリット群の前記複数のスリットを通過して前記分光器に入射する状態とが切り替わる請求項5に記載の分光顕微鏡。
  7. 前記マルチスリット部が、液晶パネルを有している請求項5に記載の分光顕微鏡。
  8. 前記光源から前記試料までの照明光学系が、試料上における複数のライン状の照明領域を照明するよう、制御信号に応じて光を変調する空間変調器を備えている請求項7に記載の分光顕微鏡。
  9. 前記分光器が、少なくとも、第1の波長帯域の前記信号光を検出する第1の分光器と、前記第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域の前記信号光を検出する第2の分光器とを備え、
    前記マルチスリット部が、前記第1の分光器と前記第2の分光器のそれぞれの入射側に配置されている請求項1〜8のいずれか1項に記載の分光顕微鏡。
  10. 前記2次元アレイ光検出器が、少なくとも
    第1の波長帯域の前記信号光を検出する第1の領域と、
    前記第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域の前記信号光を検出する第2の領域を備え、
    前記スリットの長手方向において、前記第1の領域と前記第2の領域とが、ずれている請求項1〜8のいずれか1項に記載の分光顕微鏡。
  11. 前記光源から前記試料までの照明光学系は、前記光源からの光を前記試料に集光する対物レンズを備え、
    前記試料の前記対物レンズと反対側には、前記試料で発生した信号光を反射する反射部材が配置され、
    前記反射部材で反射された信号光が前記対物レンズに入射する請求項1〜8のいずれか1項に記載の分光顕微鏡。
  12. 前記マルチスリット部の入射側に配置され、前記信号光を前記複数のスリットに集光するシリンドリカルレンズアレイをさらに備える請求項1〜9のいずれか1項に記載の分光顕微鏡。
  13. 光を発生させるステップと、
    前記光を試料に導くステップと、
    前記光で照明された試料の照明領域からの信号光を、複数のスリットがスリット幅方向に並んでいるマルチスリット部に入射させるステップと、
    前記マルチスリット部の前記スリットを通過した信号光を、スリット長方向と交差する分散方向に分散して、2次元アレイ光検出器で検出するステップと、を備えた分光観察方法。
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