JP2012150331A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】画像の明るさムラの補正を高速に行うことが可能な共焦点顕微鏡を提供する。
【解決手段】光源からの照明光を制限する第１遮光部材１０と、第１遮光部材１０で制限された照明光を走査する走査ミラー１２と、走査ミラー１２で走査された照明光を試料２に集光する対物レンズ４と、試料２からの観察光を制限する第２遮光部材２０と、第２遮光部材２０で制限された観察光を検出する検出器２８ａ，２８ｂとを有し、第１遮光部材１０は複数のスリットが並んで形成された遮光部材であり、第２遮光部材２０は第１遮光部材１０の複数のスリットに対応する複数のスリットが並んで形成された遮光部材であり、画像の明るさムラに応じて、検出器２８ａ，２８ｂの検出面を構成する複数の画素のうち、前記観察光の前記検出面上の走査方向と直交する方向に並んだ画素群毎に露出時間を設定する制御部７を有する。
【選択図】図２

Description

本発明は、共焦点顕微鏡に関する。

従来、試料面に照射した１本のライン状の光を走査して観察を行う共焦点顕微鏡が知られている。また、斯かる共焦点顕微鏡等で撮影される画像の明るさムラを補正する方法として、ＣＣＤ等の二次元検出器で取得された画像データを所定の補正データを用いて画素毎に補正する方法が知られている（例えば、特許文献１を参照。）。

特開平６−９８２６１号公報

しかしながら、上述のような従来の補正方法では、画素毎に個別の補正データが必要となるため、データ量が膨大で、データ処理の高速化を図ることができないという問題があった。
そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、画像の明るさムラの補正を高速に行うことが可能な共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために本発明は、
光源からの照明光を制限する第１遮光部材と、
前記第１遮光部材で制限された照明光を走査する走査ミラーと、
前記走査ミラーで走査された照明光を試料に集光する対物レンズと、
前記試料からの観察光を制限する第２遮光部材と、
前記第２遮光部材で制限された観察光を検出する検出器とを有しており、
前記第１遮光部材は、複数のスリットが並んで形成された遮光部材であり、
前記第２遮光部材は、前記第１遮光部材の複数のスリットに対応する複数のスリットが並んで形成された遮光部材であり、
画像の明るさムラに応じて、前記検出器の検出面を構成する複数の画素のうち、前記観察光の前記検出面上の走査方向と直交する方向に並んだ画素群毎に露出時間を設定する制御部を有することを特徴とする共焦点顕微鏡を提供する。

本発明によれば、画像の明るさムラの補正を高速に行うことが可能な共焦点顕微鏡を提供することができる。

本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡を示す図である。 （ａ）は本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡の光学系の構成を示す図であり、（ｂ）は照明側スリット部及び観察側スリット部に備えられたマルチスリットの一例を示すである。 本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡の主要部分のブロック図である。 （ａ）は検出器の検出面上の輝度分布を示す図であり、（ｂ）は走査ミラーを正弦波駆動した場合の検出面におけるスリット光の走査位置（縦軸）と時間（横軸）の関係を示すグラフであり、（ｃ）は検出面とスリット光の様子を示す図である。 本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡の露出時間設定ルーチンを示すフローチャートである。 検出器の各ラインの露出開始時間及び露出時間の一例を示すタイムチャートである。

以下、本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡を添付図面に基づいて説明する。
はじめに、本実施形態に係る共焦点顕微鏡の全体的な構成を説明する。
図１に示すように共焦点顕微鏡１は、試料２を載置するステージ３、対物レンズ４、及び顕微鏡本体５を有している。顕微鏡本体５の側面には、照明光を供給する光源６が備えられており、共焦点顕微鏡１の各部を制御するコンピュータ（ＰＣ）７が接続されている。

図２（ａ）に示すように顕微鏡本体５内の光路１００上には、光源６側から順に励起フィルタホイール８、照明側スリット部９、及び第１ダイクロイックミラー１１が備えられている。
第１ダイクロイックミラー１１の反射光路１０１上には走査ミラー１２が備えられており、さらに走査ミラー１２の表側反射面の反射光路１０２上にはレンズ１３、反射ミラー１４、及び対物レンズ４が順に備えられている。また、走査ミラー１２から見て第１ダイクロイックミラー１１の透過光路１０３上には、レンズ１６、反射ミラー１７、観察側スリット部１９、反射ミラー２１、レンズ２２、及び反射ミラー２３が順に備えられている。
反射ミラー２３から見て走査ミラー１２の裏側反射面の反射光路１０４上には、蛍光フィルタホイール２４、レンズ２５、及び第２ダイクロイックミラー２６が順に備えられている。そして、第２ダイクロイックミラー２６の透過光路１０５上には集光レンズ２７ａと検出器２８ａが順に備えられており、反射光路１０６上には集光レンズ２７ｂと検出器２８ｂが順に備えられている。なお、レンズ２５は、図１（ａ）に示されたように単一レンズではなく、複数のレンズから構成されたものでもよく、また複数のレンズの間隔を変えてズームレンズ群にしてもよい。

励起フィルタホイール８は、波長透過特性の異なる複数の励起フィルタを回転切り替え可能に保持するものであり、これにより光源６から発せられた照明光のうち、所望の波長の照明光を試料２に対して選択的に照射することができる。
蛍光フィルタホイール２４は、励起フィルタホイール８と同様に波長透過特性の異なる複数の蛍光フィルタを回転切り替え可能に保持するものであり、これにより試料２で生じた蛍光のうち、所望の波長の蛍光を選択的に観察することができる。
検出器２８ａ，２８ｂには、ＣＭＯＳカメラが用いられている。また、検出器２８ａ，２８ｂには、図３に示すように検出器２８ａ，２８ｂを制御するための検出器制御部２９ａ，２９ｂがそれぞれ備えられている。なお、検出器制御部２９ａ，２９ｂには、走査ミラー１２の動作に合わせて検出器２８ａ，２８ｂを制御するためのタイミング信号を検出器制御部２９ａ，２９ｂへ出力する信号発生回路３０ａ，３０ｂが備えられている。

照明側スリット部９と観察側スリット部１９は、いずれも対物レンズ４の物体側の所定の位置に対して光学的に共役な位置に配置されている。
照明側スリット部９は、複数種類のマルチスリット１０を切替可能に保持する回転切替部材である。各マルチスリット１０は、図２（ｂ）にその一例を示すように複数の細長い長方形状のスリットが並んで形成された遮光部材であって、本実施形態ではマルチスリット幅Ｌの異なる３つのマルチスリット１０が照明側スリット部９に保持されている。ここで、マルチスリット幅Ｌとは、全てのスリット幅と全てのスリット間隔を合計した長さであって、スリット数、スリット幅、及びスリット間隔によって定められるものである。なお、本実施形態における３つのマルチスリット１０は、いずれもスリット間隔がスリット幅の２．５倍以上に設計されている。これにより、各スリットを通過したスリット光どうしの干渉を防止することができる。具体的には、図２（ｂ）に示したマルチスリットの一例は、黒塗り部分が各スリットを示しており、スリット数が１０、スリット長が５ｍｍ、スリット幅が１０μｍ、スリット間隔が９０μｍ、マルチスリット幅Ｌが８９０μｍである。
斯かる構成の照明側スリット部９には、図３に示すようにＰＣ７のＣＰＵ３０からの指示に基づいて照明側スリット部９を回転させるための駆動部３１が備えられており、これによって３つのマルチスリット１０を切り替えて光路中に選択的に配置することができる。

観察側スリット部１９は、上記照明側スリット部９が保持する３つのマルチスリット２０と同じ構成、即ち同じマルチスリット幅Ｌの３つのマルチスリット２０を切替可能に保持する回転切替部材である。この観察側スリット部１９には、図３に示すようにＰＣ７のＣＰＵ３０からの指示に基づいて観察側スリット部１９を回転させるための駆動部３２が備えられており、これによって３つのマルチスリット２０を切り替えて光路中に選択的に配置することができる。
なお、上記構成の照明側スリット部９が保持する３つのマルチスリット１０と、観察側スリット部１９が保持する３つのマルチスリット２０は、観察に際して、同じマルチスリット幅Ｌのものどうしが光路中に配置して使用される。また、照明側スリット部９及び観察側スリット部１９のいずれにもスリットが設けられていない開口部を有していてもよい。
走査ミラー１２には、ガルバノミラーが用いられており、図３に示すようにＰＣ７のＣＰＵ３０からの指示に基づいて走査ミラー１２の動作を制御するためのミラー制御部３３が備えられている。

以上の構成の下、光源６から射出された照明光は、所定波長の光（励起光）のみが励起フィルタホイール８の励起フィルタを透過し、照明側スリット部９のマルチスリット１０を通過することで複数のスリット光となる。この複数のスリット光は、第１ダイクロイックミラー１１で反射され、さらに走査ミラー１２の表側反射面で反射され、レンズ１３、反射ミラー１４、及び対物レンズ４を順に介してステージ３上の試料２に照射される。これにより励起された試料２から発せられた観察光（蛍光）は、再び対物レンズ４、反射ミラー１４、及びレンズ１３を順に介し、走査ミラー１２の表側反射面で反射された後、第１ダイクロイックミラー１１を透過する。そしてこの観察光は、レンズ１６と反射ミラー１７を介して、観察側スリット部１９の位置に試料２に投影されたマルチスリット１０の像が形成される。その像を形成する光線がマルチスリット２０を通過することで試料２における観察側スリット部１９と共役な位置からの光線のみが取り出されて、複数のスリット光となる。この複数のスリット光は、反射ミラー２１、レンズ２２、及び反射ミラー２３を順に経て走査ミラー１２の裏側反射面で反射され、さらに所定波長の光のみが蛍光フィルタホイール２４の蛍光フィルタを透過した後、ズームレンズ２５を介して第２ダイクロイックミラー２６に入射する。そして、第２ダイクロイックミラー２６を透過した光は、集光レンズ２７ａを介して検出器２８ａで検出され、第２ダイクロイックミラー２６で反射された光は、集光レンズ２７ｂを介して検出器２８ｂで検出される。
ここで、試料２に照射される複数のスリット光は、走査ミラー１２によって試料面上を一次元的に走査されるため、各検出器２８ａ，２８ｂでは試料２の観察領域全体にわたって観察光が検出されることとなる。これによりＰＣ７は、各検出器２８ａ，２８ｂから観察光の検出信号を取得し、これに基づいて試料２の二次元画像を生成してＰＣ７のモニタ７ａに表示させる。これにより使用者は、試料２の共焦点画像を観察することが可能となる。

以上のように本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、試料面に対して複数のスリット光を照射して走査する構成であるため、同じ領域を複数のスリット光が照明するので、スリット光が試料面に照射されている時間を上述のような従来の共焦点顕微鏡よりも長く確保することができ、強度の弱い光で照明していても、試料２からの光量の増加を図ることができる。このため、低い強度の照明光によって試料２の明るい共焦点画像を撮影することができる。したがって、従来の共焦点顕微鏡のように高い強度の照明光が試料に悪影響を及ぼしてしまうという光毒性の問題を解消することができる。また、従来の共焦点顕微鏡では走査ミラーを高い駆動周波数で動作させた際に暗くて観察できなかった試料の共焦点画像でも、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、照明光の光量の増加によって観察することが可能になり、即ち試料２の高速な現象を捉えることが可能になる。

次に、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１で撮影される試料２の共焦点画像の補正について説明する。
ここで、走査ミラーの駆動方法には、正弦波駆動、三角波駆動、ノコギリ波駆動等の複数の駆動方法が知られている。これらの駆動方法によって走査ミラーを動作させる場合、検出器の検出面上に形成される観察像には、駆動方法に応じて走査ミラーの動作速度の変化に起因する明るさムラが発生してしまう。なお、均一に蛍光を発する物体を試料として観察し、走査ミラーが一定速度で動作する場合には、明るさムラが発生しないものとする。
また、特に正弦波駆動によれば走査ミラーの高速な動作が可能であることが知られている。このような場合、図４（ａ）に示すように検出器の検出面上には、スリット光の走査方向において中心部分が暗く周辺部分が明るい輝度パターン（明るさムラのパターン）が発生する。なお、この明るさムラのパターンは、スリット光の走査方向と直交する方向においては輝度が一様である。このような明るさムラのパターンは、走査ミラーの駆動周波数とその振幅に依存する。

そこで、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、検出器２８ａ，２８ｂの検出面のライン毎の露出時間を調整する、即ち検出面上を走査する複数のスリット光が露出時間中に各ラインに入射する数を調整することで、上記明るさムラのパターンの補正を行う。なお、ラインとは、図４（ｃ）に示すように検出器２８ａ，２８ｂの検出面を構成する複数の画素のうち、スリット光の走査方向と直交する方向に並んだ画素の集合（画素群）をいう。また、露出時間とは、検出器２８ａ，２８ｂの各画素において、検出器２８ａ，２８ｂの各画素におけるフォトダイオードで電荷を貯め込む時間に相当するものである。また、ラインとは、検出器２８ａ，２８ｂの画素がスリット像の長手方向と同じ方向に配列している並び方向を示す。露出開始時間は、検出器２８ａ，２８ｂの各画素におけるフォトダイオードの電荷を貯め始めるタイミングに相当するものである。
本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、具体的には、検出器２８ａ，２８ｂの各ラインの露出時間を設定するための図５に示す露出時間設定ルーチンを実行可能に構成されている。
ここで、本実施形態において、図３に示すＰＣ７の記憶部３５には、走査ミラー１２を正弦波駆動する際の駆動周波数とその振幅によって異なる明るさムラのパターンの情報（ライン毎の輝度情報）が予め記憶されている。

図５に示す露出時間設定ルーチンは、使用者が本ルーチンの開始の指示をＰＣ７へ入力することで開始される。
ステップＳ１：ＰＣ７のＣＰＵ３０が、使用者によって走査ミラー１２の所望の駆動周波数と振幅、及び所望の露出時間がＰＣ７へ入力されているか否かを判定する。これらがＰＣ７へ入力されている場合はステップＳ２へ進み、そうでない場合は本ステップＳ１を再度実行する。なお、前記所望の露出時間は、各ラインの露出時間を設定する上で基準となるものである。
ステップＳ２：ＣＰＵ３０が、ステップＳ１で得られた走査ミラー１２の所望の駆動周波数と振幅に対応する明るさムラのパターンの情報を記憶部３５から読み出す。

ステップＳ３：ＣＰＵ３０が、ステップＳ１で得られた所望の露出時間とステップＳ２で得られた明るさムラのパターンの情報に基づいて、当該明るさムラのパターンを解消するための各ラインの露出時間を算出する。またＣＰＵ３０が、ステップＳ１で得られた走査ミラー１２の所望の駆動周波数と振幅に基づいて、検出器２８ａ，２８ｂの検出面上を走査する複数のスリット光のうち、先頭のスリット光の各ラインへの到達時間（先頭のスリット光が走査し始めてから各ラインへ到達するまでの時間）を算出する。
ステップＳ４：ＣＰＵ３０が、ステップＳ３で得られた先頭のスリット光の各ラインへの到達時間を各ラインの露出開始時間として、各ラインの露出開始時間と露出時間からなる制御テーブルを作成する。
ステップＳ５：ＣＰＵ３０が、ステップＳ４で作成した制御テーブルの情報を検出器制御部２９ａ，２９ｂへ出力し、本ルーチンが終了する。

本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、上記露出時間設定ルーチンを実行することで、走査ミラー１２の所望の駆動周波数と振幅及び所望の露出時間に合わせて、明るさムラのパターンを解消するための各ラインの露出開始時間と露出時間の制御テーブルを作成し、これを検出器制御部２９ａ，２９ｂへ出力することができる。
これにより、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１において、検出器２８ａ，２８ｂが試料２からの観察光を検出する、即ち露出を行う際には、上記制御テーブルに基づいて信号発生回路３０ａ，３０ｂがタイミング信号を出力する。そして、このタイミング信号にしたがって検出器制御部２９ａ，２９ｂが検出器２８ａ，２８ｂの各ラインの露出動作を制御することで、各ラインの露出開始時間と露出時間を適切に制御することができる（図６を参照。）。即ち、検出器２８ａ，２８ｂの検出面上を走査する複数のスリット光が各ラインの露出時間中にそれぞれのラインに入射する数を制御し、これによって明るさムラのパターンを解消することができる。このようにして検出器２８ａ，２８ｂは、明るさムラのパターンを解消しながら観察光を検出することができ、その結果、明るさムラのない試料２の共焦点画像を取得することができる。

以上、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、前述のように検出器２８ａ，２８ｂの露出時間をライン毎に設定する構成である、言い換えればラインを構成する各画素の露出時間を共通にしている。このため、検出器で取得された画像データを画素毎に補正する上記従来の明るさムラの補正方法に比べて、取り扱うデータ量が少なく、高速なデータ処理を実現することができる。
また、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、明るさムラを解消した画像データが検出器２８ａ，２８ｂで取得されるため、従来の補正方法のように検出器で取得された画像データを補正する必要がなく、画像データを補正するための画像補正回路も不要となる。

なお、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、走査ミラー１２を正弦波駆動する際の明るさムラを補正する例を示しているが、これに限られるものではない。例えば、走査ミラー１２を三角波駆動する場合の明るさムラのパターンの情報をＰＣ７の記憶部３５に予め記憶しておけば、走査ミラー１２を三角波駆動する際の明るさムラを補正することが可能となる。また例えば、記憶部３５に走査ミラー１２を正弦波駆動する場合、三角波駆動する場合、及びノコギリ波駆動する場合の、それぞれの明るさムラのパターンの情報を予め記憶しておき、上記露出時間設定ルーチンのステップＳ１で使用者が所望の駆動方法をさらに入力する構成とすれば、前記所望の駆動方法に合わせて明るさムラを補正することが可能となる。
また、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、走査ミラー１２を三角波駆動する場合の明るさムラのパターンの情報をＰＣ７の記憶部３５が予め記憶しているが、これに限られるものではない。例えば、走査ミラー１２を所望の駆動方法で動作させて明るさムラのある状態の画像を撮影し、この画像に基づいてＣＰＵ３０が明るさムラのパターンを算出して記憶部３５に保存する構成としてもよい。これにより、前記所望の駆動方法に合わせて、より正確な明るさムラのパターンの情報を用いることができ、より正確に明るさムラを補正することが可能となる。

１ 共焦点顕微鏡
２ 試料
４ 対物レンズ
７ ＰＣ
９ 照明側スリット部
１０ マルチスリット
１２ 走査ミラー
１９ 観察側スリット部
２０ マルチスリット
２８ａ，２８ｂ 検出器
２９ａ，２９ｂ 検出器制御部
３０ａ，３０ｂ 信号発生回路
３０ ＣＰＵ
３５ 記憶部

Claims (5)

1. 光源からの照明光を制限する第１遮光部材と、
   前記第１遮光部材で制限された照明光を走査する走査ミラーと、
   前記走査ミラーで走査された照明光を試料に集光する対物レンズと、
   前記試料からの観察光を制限する第２遮光部材と、
   前記第２遮光部材で制限された観察光を検出する検出器とを有しており、
   前記第１遮光部材は、複数のスリットが並んで形成された遮光部材であり、
   前記第２遮光部材は、前記第１遮光部材の複数のスリットに対応する複数のスリットが並んで形成された遮光部材であり、
   画像の明るさムラに応じて、前記検出器の検出面を構成する複数の画素のうち、前記観察光の前記検出面上の走査方向と直交する方向に並んだ画素群毎に露出時間を設定する制御部を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記走査ミラーの駆動周波数及び振幅に応じて異なる画像の明るさムラの情報を記憶した記憶部を有し、
   前記制御部は、前記走査ミラーの駆動周波数及び振幅に対応する前記情報を前記記憶部から取得し、前記情報に基づいて前記画素群毎の露出時間を設定することを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記制御部は、前記走査ミラーの駆動周波数及び振幅に基づいて、前記画素群毎の露出開始時間を設定することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記制御部が、前記画素群毎の露出時間を一定として前記検出器で取得された画像に基づいて画像の明るさムラの情報を算出し、算出した前記情報に基づいて前記画素群毎の露出時間を設定することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記検出器としてＣＭＯＳカメラを有することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。

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