JP4905356B2

JP4905356B2 - ライン走査型共焦点顕微鏡装置

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Publication number: JP4905356B2
Application number: JP2007544077A
Authority: JP
Inventors: 久奥川
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2005-11-11
Filing date: 2006-10-16
Publication date: 2012-03-28
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Also published as: EP1947498A4; US20090034062A1; WO2007055082A1; EP1947498A1; JPWO2007055082A1; US8189937B2

Description

本発明は、被観察物の像をライン毎に検出するライン走査型共焦点顕微鏡装置に関する。

一般に、ライン走査型の共焦点顕微鏡装置は、ライン状に集光された照明光で標本を照明し、標本上の照明領域で生じた光を一次元ＣＣＤなどの光検出器で検出するものである（特許文献１など）。二次元の画像を取得するには、照明領域で標本上を走査しながら検出を繰り返せばよい。このように検出をライン毎に行えば、それをポイント毎に行う通常の共焦点顕微鏡装置よりも二次元の画像情報を取得するまでの時間を短縮することができる。
特開２０００−２７５０２７号公報

しかし、ライン走査型の共焦点顕微鏡装置では、照明領域の短手方向に関するクロストークは抑えられるものの、その長手方向に関するクロストークは抑えられないので、その長手方向に分布した標本の観察では、共焦点効果（光軸方向のセクショニング分解能や平面方向のコントラスト）が得られない。
そこで本発明は、被観察物の像をライン毎に検出しながらも高い共焦点効果を得ることのできる共焦点顕微鏡装置を提供することを目的とする。

本発明のライン走査型共焦点顕微鏡装置は、被観察物中の被観察面上の照明領域がライン状となる照明光で前記被観察物を照明する照明光学系と、前記被観察面から射出した光を結像する結像光学系と、前記被観察面の共役面に配置された二次元光検出器と、前記照明領域の長手方向と直交する方向に向けて前記照明光を前記被観察面上で移動させる走査手段とを備えたライン走査型顕微鏡装置であって、前記二次元光検出器は、前記照明光が前記被観察面上の各ライン状領域を照明しているときのそれぞれにおいて、そのライン状領域と共役関係にある特定ラインの画素信号と、その特定ラインの周辺ラインの画素信号とを取得し、前記照明光が前記被観察面上の各ライン状領域を照明しているときのそれぞれにおいて取得された特定ラインの画素信号のクロストーク成分を、それと同じときに取得された周辺ラインの画素信号に基づき補正する補正手段を更に備えたことを特徴とする。

なお、前記周辺ラインには、少なくとも前記特定ラインに隣接したラインが含まれることが望ましい。
また、前記補正手段は、前記特定ラインＬ₀のｊ番目の画素信号Ｓ_(0,j) のクロストーク成分を、少なくとも、その特定ラインＬ₀から１ラインずれたラインＬ₁の（ｊ±１）番目の画素信号Ｓ_(1,j+1)，Ｓ_(1,j-1)に基づき補正するとよい。

また、前記補正手段は、前記特定ラインＬ₀のｊ番目の画素信号Ｓ_(0,j) のクロストーク成分を、前記特定ラインＬ₀からｋラインずれたラインＬ_kの（ｊ±ｋ）番目の画素信号Ｓ_(k,j+k)，Ｓ_(k,j-k)に基づき以下の式で補正してもよい。
Ｓ_(0,j)＝Ｓ_(0,j)−（Ｓ_(1,j+1)＋Ｓ_(1,j-1)）
−（Ｓ_(2,j+2)＋Ｓ_(2,j-2)）
−（Ｓ_(3,j+3)＋Ｓ_(3,j-3)）…
さらに、前記周辺ラインには、少なくとも前記特定ラインの両側に隣接した２つのライ
ンが含まれることが望ましい。

また、前記補正手段は、前記特定ラインＬ₀のｊ番目の画素信号Ｓ_(0,j) のクロストーク成分を、少なくとも、その特定ラインＬ₀から±１ラインずれた２つのラインＬ₁，Ｌ_-1の（ｊ±１）番目の画素信号Ｓ_(1,j+1)，Ｓ_(-1,j+1)，Ｓ_(1,j-1)，Ｓ_(-1,j-1)に基づき補正してもよい。
また、前記補正手段は、前記特定ラインＬ₀のｊ番目の画素信号Ｓ_(0,j) のクロストーク成分を、前記特定ラインＬ₀から±ｋラインずれたラインＬ_k，Ｌ_-kの（ｊ±ｋ）番目の画素信号Ｓ_(k,j+k)，Ｓ_(-k,j+k)，Ｓ_(k,j-k)，Ｓ_(-k,j-k)に基づき以下の式で補正してもよい。

Ｓ_(0,j)＝Ｓ_(0,j)
−［（Ｓ_(1,j+1)＋Ｓ_(-1,j+1)）／２＋（Ｓ_(1,j-1)＋Ｓ_(-1,j-1)）／２］
−［（Ｓ_(2,j+2)＋Ｓ_(-2,j+2)）／２＋（Ｓ_(2,j-2)＋Ｓ_(-2,j-2)）／２］
−［（Ｓ_(3,j+3)＋Ｓ_(-3,j+3)）／２＋（Ｓ_(3,j-3)＋Ｓ_(-3,j-3)）／２］
−…

本発明によれば、被観察物の像をライン毎に検出しながらも高い共焦点効果を得ることのできるライン走査型共焦点顕微鏡装置が実現する。

本顕微鏡装置の全体構成図である。標本８が照明される様子を拡大して示す図である。標本８から撮像面１０ａまでの光路を模式的に描いたものである。撮像面１０ａを正面から見た模式図である。特定ラインＬ₀内の画素間で生じるクロストークを説明する図である。特定ラインＬ₀上の或る画素Ｐ_(0,0)に対し影響を及ぼす像を示す図である。特定ラインＬ₀上の一般の画素Ｐ_(0,j)と、その画素信号のクロストーク成分を表す画素とを示す図である。コンピュータ１１の動作フローチャートである。

［第１実施形態］
以下、図面を参照して本発明の実施形態を説明する。本実施形態は、共焦点顕微鏡装置の実施形態である。
先ず、本顕微鏡装置の全体構成を説明する。
図１は、本顕微鏡装置の全体構成図である。図１に示すように、本顕微鏡装置には、レーザ光源１、シリンドリカルレンズ３、ビームスプリッタ４、レンズ５、スキャナ６、対物レンズ７、標本（生体標本など）８、二次元ＣＣＤ１０、コンピュータ１１、モニタ１２などが配置される。

レーザ光源１から射出したレーザ光２は、シリンドリカルレンズ３によりライン状に集光される。そのレーザ光２は、ビームスプリッタ４を通過した後、レンズ５によって平行光に変換され、スキャナ６内のスキャンミラー６ａで反射して、対物レンズ７を介して標本８上のライン状の領域（照明領域）Ｅに集光する。
照明領域Ｅで発生した光は、対物レンズ７、スキャンミラー６ａ、レンズ５を介してビームスプリッタ４へ戻る。その光は、ビームスプリッタ４で反射し、二次元ＣＣＤ１０の撮像面１０ａ上の特定ラインＬ₀に照明領域Ｅの像を形成する。二次元ＣＣＤ１０は、その撮像面１０ａの輝度分布を検出し、輝度分布データを生成してコンピュータ１１へ送出する。

なお、スキャナ６は、スキャンミラー６ａの配置角度を変化させ、標本８上の照明領域Ｅをその短手方向（走査方向）ＤＳへ移動させることができる。このように照明領域Ｅが標本８上を移動すると、二次元ＣＣＤ１０の特定ラインＬ₀には、標本８上の異なるラインの像が投影されることになる。
また、レーザ光源１、スキャナ６、二次元ＣＣＤ１０などは、コンピュータ１１によって制御される。例えば、コンピュータ１１は、スキャナ６を制御して標本８上を照明領域Ｅで走査しながら、二次元ＣＣＤ１０を制御して輝度分布データを取得する制御処理を行う（詳細は後述）。また、コンピュータ１１は、取得した輝度分布データを処理して標本８の二次元の画像を生成する演算処理を行う（詳細は後述）。また、コンピュータ１１は、その画像をモニタ１２へ表示するための変換処理なども行う。

図２は、標本８が照明される様子を拡大して示す図である。照明光は、標本８中の被観察面８ａ上に集光し、被観察面８ａの上下層では広がりを持つ。よって、以下では、被観察面８ａ上の照明領域Ｅのことを、特に「照明ラインＥ」と称す。
図３は、標本８から撮像面１０ａまでの光路を模式的に描いたものである。図３（Ａ），（Ｂ）には、９０°異なる角度から光路を見た様子を示した。

図３（Ａ），（Ｂ）に示すとおり、被観察面８ａの共役面に撮像面１０ａが位置しており、撮像面１０ａの特定ラインＬ₀が照明ラインＥと共焦点関係にある。照明ラインＥ上の或る１点で発生した光は、特定ラインＬ₀上に集光し、その特定ラインＬ₀の１つの画素上にその点の像を形成する。つまり、特定ラインＬ₀の各画素には、照明ラインＥ上の各点の像が形成される。

但し、実際には、照明ラインＥの上下層のラインＥ’でも光（フレア）が発生している。そのラインＥ’上の或る１点で発生したフレアは、特定ラインＬ₀よりも手前又は奥に集光するので、特定ラインＬ₀の複数の画素上にその点のボケた像を形成する。つまり、特定ラインＬ₀の各画素には、ラインＥ’上の各点のボケた像が重なって形成される。
その結果、特定ラインＬ₀の各画素には、走査方向ＤＳに関するクロストークは生じないものの、ライン方向ＤＬに関するクロストークは発生する。

次に、ライン方向ＤＬに関するクロストークを詳細に説明する。
図４は、撮像面１０ａを正面から見た模式図である。図４に示すとおり、特定ラインＬ₀は、撮像面１０ａの中央の辺りに位置している。図４の下部には、特定ラインＬ₀及びその周辺ラインの一部を拡大して示した。以下、図４に示すように、特定ラインＬ₀からｉラインだけずれたラインを「ラインＬ_i」と称す。

図５の左側に示すのは、標本８の一部の断面の模式図であり、右側に示すのは撮像面１０ａの模式図である。図５中、符号Ｚで示すのは光軸方向であり、符号ＤＬで示すのは照明ラインＥ及び特定ラインＬ₀のライン方向である。
図５（Ａ）に示すとおり、照明ラインＥ上の或る点Ａ₀₀が撮像面１０ａの特定ラインＬ₀上の微小な円形領域に像Ａ₀₀’を形成するときには、点Ａ₀₀の上下層の点Ａ₀₁は、像Ａ₀₀’と同じ点を中心としてボケた像Ａ₀₁’を形成し、その形成範囲内の画素に対しクロストークを及ぼす。また、点Ａ₀₁の上下層の点Ａ₀₂は、像Ａ₀₀’と同じ点を中心としてさらに大きくボケた像Ａ₀₂’を形成し、その形成範囲内の画素に対しクロストークを及ぼす。

つまり、点Ａ₀₀の上下層の点Ａ₀₁，Ａ₀₂，…は、像Ａ₀₀’と同じ点を中心としてボケた像Ａ₀₁’，Ａ₀₂’，…を形成し、その形成範囲内の画素に対しクロストークを及ぼす。なお、ボケの大きい像ほど、１つの画素に与えるクロストーク量は小さい。
これと同じことが、照明ラインＥ上の別の点やその上下層の点についても当てはまる（図５（Ｂ），（Ｃ）参照）。図５（Ｂ），（Ｃ）では、図５（Ａ）と同様、標本８中の点Ａ及び撮像面１０ａ上の像Ａ’の互いに対応するもの同士には同じ添え字を付した。

次に、特定ラインＬ₀の画素信号に生じるクロストーク成分を説明する。
図６では、特定ラインＬ₀上の或る画素Ｐ_(0,0)に着目し、その画素Ｐ_(0,0)に対し影響を及ぼす像のみを示した。なお、Ｐ_(i,j)は、ラインＬ_iのｊ番目の画素である。
図６に示すように、画素Ｐ_(0,0)に影響を及ぼすのは、画素Ｐ_(0,0)上に形成される像Ａ₀₀’と、画素Ｐ_(0,0)からライン方向ＤＬへずれた位置（×印）に中心を持ち、かつそのずれ量の分だけボケた像Ａ₁₁’，Ａ_-11’，Ａ₂₂’，Ａ_-22’，…である。

このうち、像Ａ₀₀’は、画素Ｐ_(0,0)によって検出されるべき像であって、画素Ｐ_(0,0)に対し信号成分を発生させる像である。それ以外の像Ａ₁₁’，Ａ₂₂’，Ａ_-11’，Ａ_-22’，…が、画素Ｐ_(0,0)に対しクロストーク成分を発生させる。
ここで、像Ａ₁₁’が画素Ｐ_(0,0)に及ぼすクロストーク量は、画素Ｐ_(0,0)と斜め方向に並ぶ画素Ｐ_(1,1)又は画素Ｐ_(-1,1)の画素信号に現れるとみなせる。

なぜなら、第１に、画素Ｐ_(1,1)，Ｐ_(-1,1)は、像Ａ₁₁’から受けるクロストーク量が画素Ｐ_(0,0)のそれと同じである。第２に、画素Ｐ_(1,1)，Ｐ_(-1,1)は、特定ラインＬ₀から外れたライン上に存在するので、信号成分を持たない。
同様に考えると、像Ａ_-11’が画素Ｐ_(0,0)に及ぼすクロストーク量は、画素Ｐ_(1,-1)又は画素Ｐ_(-1,-1)の画素信号に現れるとみなせる。

また、像Ａ₂₂’が画素Ｐ_(0,0)に及ぼすクロストーク量は、画素Ｐ_(2,2)又は画素Ｐ_(-2,2)からの画素信号に現れるとみなせる。
また、像Ａ_-22’が画素Ｐ_(0,0)に及ぼすクロストーク量は、画素Ｐ_(2,-2)又は画素Ｐ_(-2,-2)の画素信号に現れるとみなせる。
したがって、画素Ｐ_(1,1)，Ｐ_(-1,1)，Ｐ_(1,-1)，Ｐ_(-1,-1)，Ｐ_(2,2)，Ｐ_(-2,2)，Ｐ_(2,-2)，Ｐ_(-2,-2)，…の画素信号Ｓ_(1,1)，Ｓ_(-1,1)，Ｓ_(1,-1)，Ｓ_(-1,-1)，Ｓ_(2,2)，Ｓ_(-2,2)，Ｓ_(2,-2)，Ｓ_(-2,-2)，…が、画素Ｐ_(0,0)の画素信号Ｓ_(0,0)に含まれるクロストーク成分を表す。

なお、画素Ｐ_(1,1)と画素Ｐ_(-1,1)、画素Ｐ_(1,-1)と画素Ｐ_(-1,-1)などは、特定ラインＬ₀に関し対称の関係にあるので、原理的には同じ画素信号を出力するはずである。両者の画素信号に差異が生じたら、それはノイズの影響である。したがって、両者の画素信号の平均値（平均画素信号）が、クロストーク成分をより正確に表す。
また、１つの像Ａ’のボケ量が大きいほど、その画素Ａ’が１つの画素に及ぼすクロストーク量は小さくなるので、画素Ｐ_(1,1)，Ｐ_(-1,1)，Ｐ_(1,-1)，Ｐ_(-1,-1)，Ｐ_(2,2)，Ｐ_(-2,2)，Ｐ_(2,-2)，Ｐ_(-2,-2)，…のうち、特定ラインＬ₀に近接したラインの画素ほど、画素Ｐ_(0,0)に対しより支配的なクロストーク成分を表す。

さらに、以上の説明は、特定ラインＬ₀上の各画素についてそれぞれ当てはまる。図７には、特定ラインＬ₀上の一般の画素Ｐ_(0,j)と、その画素Ｐ_(0,j)の画素信号Ｓ_(0,j)に含まれるクロストーク成分を表す画素とを、一般の画素番号「ｊ」を用いて示した。これらの画素のうち、特定ラインＬ₀に関し対称な２つの画素の平均画素信号は、クロストーク成分をより正確に表す。また、特定ラインＬ₀に近接したラインの画素ほど、画素Ｐ_(0,j)に対しより支配的なクロストーク成分を表す。

次に、以上のことを踏まえて本顕微鏡装置のコンピュータ１１の動作を詳細に説明する。
図８は、コンピュータ１１の動作フローチャートである。各ステップを順に説明する。
（ステップＳ１）
コンピュータ１１は、図１に示したスキャナ６及び二次元ＣＣＤ１０を同期制御し、標本８上を照明領域Ｅで走査しながら照明領域Ｅが標本８上の各ラインにあるときのそれぞれにおいて輝度分布データを取得する（ステップＳ１）。ここで取得されたＮ個の輝度分布データを取得順にＩ₁，Ｉ₂，Ｉ₃，…，Ｉ_Nとおく。

輝度分布データＩ₁，Ｉ₂，Ｉ₃，…，Ｉ_Nの各々に含まれる特定の画素信号列Ｓ₀が、前述した特定ラインＬ₀からの画素信号列である。輝度分布データＩ₁の画素信号列Ｓ₀、輝度分布データＩ₂の画素信号列Ｓ₀、輝度分布データＩ₂の画素信号列Ｓ₀、…、輝度分布データＩ_Nの画素信号列Ｓ₀には、標本８上の互いに異なるラインの情報が反映されている。
（ステップＳ２）
コンピュータ１１は、輝度分布データＩ₁の画素信号列Ｓ₀と、その周辺の画素信号列Ｓ₁，Ｓ_-1，Ｓ₂，Ｓ_-2，…とを参照し、前者を後者に基づき補正する。なお、画素信号列Ｓ_iは、ラインＬ_iの画素信号列であり、画素信号列Ｓ_i内の画素信号Ｓ_(i,j)は、画素Ｐ_(i,j)の画素信号である。

この補正では、画素信号列Ｓ₀内の各画素信号Ｓ_(0,j)は、それぞれ以下の式（１）により補正される。
Ｓ_(0,j)＝Ｓ_(0,j)
−［（Ｓ_(1,j+1)＋Ｓ_(-1,j+1)）／２＋（Ｓ_(1,j-1)＋Ｓ_(-1,j-1)）／２］
−［（Ｓ_(2,j+2)＋Ｓ_(-2,j+2)）／２＋（Ｓ_(2,j-2)＋Ｓ_(-2,j-2)）／２］
−［（Ｓ_(3,j+3)＋Ｓ_(-3,j+3)）／２＋（Ｓ_(3,j-3)＋Ｓ_(-3,j-3)）／２］
−… …（１）
この式（１）の右辺において、大括弧で括った各項が補正項である。

式（１）の１番目の補正項は、特定ラインＬ₀から１ラインずれたラインＬ₁，Ｌ_-1上の４つの画素Ｐ_(1,j+1)，Ｐ_(-1,j+1)，Ｐ_(1,j-1)，Ｐ_(-1,j-1)による補正を意味している（図７参照）。
式（１）の２番目の補正項は、特定ラインＬ₀から２ラインずれたラインＬ₂，Ｌ_-2上の４つの画素Ｐ_(2,j+2)，Ｐ_(-2,j+2)，Ｐ_(2,j-2)，Ｐ_(-2,j-2)による補正を意味している（図７参照）。

同様に、式（１）のｋ番目の補正項は、特定ラインＬ₀からｋラインずれたラインＬ_k，Ｌ_-k上の４つの画素Ｐ_(k,j+k)，Ｐ_(-k,j+k)，Ｐ_(k,j-k)，Ｐ_(-k,j-k)による補正を意味している。
したがって、１番目の補正項によると、画素信号Ｓ_(0,j)において最も支配的なクロストーク成分が除去され、２番目の補正項によると、画素信号Ｓ_(0,j)において次に支配的なクロストーク成分が除去され、ｋ番目の補正項によると、画素信号Ｓ_(0,j)においてｋ番目に支配的なクロストーク成分が除去される。

また、ｋ番目の補正項における（Ｓ_(k,j+k)＋Ｓ_(-k,j+k)）／２は、特定ラインＬ₀に関し対称な２つの画素Ｐ_(k,j+k)，Ｐ_(-k,j+k)の平均画素信号を表す。したがって、式（１）における各補正項によれば、各種のクロストーク成分をそれぞれ高精度に除去することができる。
なお、式（１）における補正項の数は、２，１などの小さい数に設定してもよい。なぜなら、ｋの大きい補正項（つまり特定ラインＬ₀から離れたライン）ほど補正効果が弱いからである。補正項の数が抑えられれば、ステップＳ２においてコンピュータ１１が参照すべき画素信号列の数、及びコンピュータ１１の演算負荷を減らすことができる。一方、補正項の数を多くするほど原理的には補正精度を高めることが可能だが、実際には、ｋの大きい補正項（つまり特定ラインＬ₀から離れたライン）ほどＳ／Ｎが悪いので、補正項の数が多すぎると補正精度が逆に悪化する可能性もある。このため、補正項の数は、予めの実験やシミュレーションなどにより最適な値に選定されることが望ましい。

同様に、コンピュータ１１は、輝度分布データＩ₂の画素信号列Ｓ₀を、その周辺の画素信号列Ｓ₁，Ｓ_-1，Ｓ₂，Ｓ_-2，…に基づき補正する。同様に、コンピュータ１１は、輝度データＩ₃，Ｉ₄，Ｉ₅，Ｉ₆，…，Ｉ_Nの画素信号列Ｓ₀も補正する。
なお、以上の本ステップにおいて輝度データＩ₁から得られた補正後の画素信号列Ｓ₀をＳ₁₀、輝度データＩ₂から得られた補正後の画素信号列Ｓ₀をＳ₂₀、…、輝度データＩ_Nから得られた補正後の画素信号列Ｓ₀をＳ_N0と置き換える。

（ステップＳ３）
コンピュータ１１は、補正後の画素信号列Ｓ₁₀，Ｓ₂₀，Ｓ₃₀，…，Ｓ_N0をこの順で並べて合成し、１枚の画像データＩを作成する。この画像データＩが、標本８の二次元の画像を表す。
以上、本顕微鏡装置は、ライン走査型の共焦点顕微鏡装置であるので、走査方向ＤＳに関するクロストークは生じないものの、ライン方向ＤＬに関するクロストークは生じる。しかし、本顕微鏡装置では、照明ラインＥに対応する特定ラインＬ₀だけでなくその周辺ラインを含む二次元の輝度分布を検出し、前者の画素信号を後者の画素信号に基づき補正する。この補正により、ライン方向ＤＬに関するクロストークが抑えられる。したがって、本顕微鏡装置は、ライン走査型でありながらも高い共焦点効果を得ることができる。

しかも、本顕微鏡装置のコンピュータ１１は、補正に当たり、特定ラインＬ₀に関し対称な２つの画素の平均画素信号を用いるので（式（１）参照）、その補正精度を高めることができる。
（その他）
また、ステップＳ２における補正では、式（１）の代わりに式（２）を用いてもよい。

Ｓ_(0,j)＝Ｓ_(0,j)
−（Ｓ_(1,j+1)＋Ｓ_(1,j-1)）
−（Ｓ_(2,j+2)＋Ｓ_(2,j-2)）
−（Ｓ_(3,j+3)＋Ｓ_(3,j-3)）
−… …（２）
この式（２）の右辺において、括弧で括った各項が補正項である。

式（２）の１番目の補正項は、特定ラインＬ₀から１ラインずれたＬ₁上の２つの画素Ｐ_(1,j+1)，Ｐ_(1,j-1)による補正を意味している（図７参照）。
式（２）の２番目の補正項は、特定ラインＬ₀から２ラインずれたラインＬ₂上の２つの画素Ｐ_(2,j+2)，Ｐ_(2,j-2)による補正を意味している（図７参照）。
同様に、式（２）のｋ番目の補正項は、特定ラインＬ₀からｋラインずれたラインＬ_k上の２つの画素Ｐ_(k,j+k)，Ｐ_(k,j-k)による補正を意味している。

つまり、式（２）は、式（１）において、補正に用いるラインの本数を半分にしたものに相当する。この式（２）には平均画素信号を算出するための演算が含まれないので、補正演算の速度を高めることができる。
なお、式（２）を用いる場合も補正項の数を、２，１などの小さい数に設定してもよい。なぜなら、ｋの大きい補正項（つまり特定ラインＬ₀から離れたライン）ほど補正効果が弱いからである。補正項の数が抑えられれば、ステップＳ２においてコンピュータ１１が参照すべき画素信号列の数、及びコンピュータ１１の演算負荷を減らすことができる。一方、補正項の数を多くするほど原理的には精度を高めることが可能だが、実際には、ｋの大きい補正項（つまり特定ラインＬ₀から離れたライン）ほどＳ／Ｎが悪いので、補正項の数が多すぎると補正精度が逆に悪化する可能性もある。このため、補正項の数は、予めの実験やシミュレーションなどにより最適な値に選定されることが望ましい。

また、本実施形態では、撮像面１０ａのサイズについて言及しなかったが、補正に用いられるラインの本数が少ない場合は、それに応じて二次元ＣＣＤの撮像面１０ａのサイズを小さくしてもよい。
例えば、補正式として式（１）を用いると共に、その補正項の数が２であるときには、補正に４ラインしか用いないので、撮像面１０ａは、特定ラインＬ₀，ラインＬ₁，Ｌ_-1，Ｌ₂，Ｌ_-2の５ラインさえ有していれば十分である。

また、補正式として式（２）を用いると共に、その補正項の数が２であるときには、補正に２ラインしか用いないので、撮像面１０ａは、特定ラインＬ₀，ラインＬ₁，Ｌ₂の３ラインさえ有していれば十分である。
また、本顕微鏡装置では、二次元光検出器として二次元ＣＣＤが用いられたが、特定ライン及びその周辺ラインに同時に形成される輝度分布を検出することができるのであれば、他のタイプの二次元光検出器が用いられてもよい。

また、本顕微鏡装置は、ライン走査型の共焦点顕微鏡に本発明を適用したものであるが、スポット走査型の共焦点顕微鏡であっても、場合によっては本発明の適用が有効となる。それは、スポット走査を高速化し、ＣＣＤなどの電荷蓄積型の光検出器で標本の像をライン毎に検出するような場合である。電荷蓄積型の光検出器は、有限期間内に入射した光強度の時間積分を検出するものなので、ＣＣＤ上のずれた位置にずれたタイミングで入射した光同士であっても、それらの入射タイミングがＣＣＤの電荷蓄積期間内に収まっているときには、互いの信号にクロストークを及ぼす。しかし、本発明を適用すれば、このクロストークを抑えることができる。

また、本顕微鏡装置を利用して蛍光観察を行ってもよい。因みに、蛍光観察の際には、標本８として蛍光物質で標識された標本を配置し、ビームスプリッタ４としてダイクロイックミラーを配置し、そのダイクロイックミラーの周辺の適当な位置に必要に応じてフィルタを配置すればよい。
また、本顕微鏡装置のコンピュータ１１による処理の一部又は全部を、コンピュータ１１の代わりに回路に実行させてもよい。回路を利用すれば、共焦点画像を表示するまでの時間を短縮することも可能である。

Claims

被観察物中の被観察面上の照明領域がライン状となる照明光で前記被観察物を照明する照明光学系と、
前記被観察面から射出した光を結像する結像光学系と、
前記被観察面の共役面に配置された二次元光検出器と、
前記照明領域の長手方向と直交する方向に向けて前記照明光を前記被観察面上で移動させる走査手段と、
を備えたライン走査型顕微鏡装置であって、
前記二次元光検出器は、前記照明光が前記被観察面上の各ライン状領域を照明しているときのそれぞれにおいて、そのライン状領域と共役関係にある特定ラインの画素信号と、その特定ラインの周辺ラインの画素信号とを取得し、
前記照明光が前記被観察面上の各ライン状領域を照明しているときのそれぞれにおいて取得された特定ラインの画素信号のクロストーク成分を、それと同じときに取得された周辺ラインの画素信号に基づき補正する補正手段を更に備えた
ことを特徴とするライン走査型共焦点顕微鏡装置。
請求項１に記載のライン走査型共焦点顕微鏡装置において、
前記周辺ラインには、
少なくとも前記特定ラインに隣接したラインが含まれる
ことを特徴とするライン走査型共焦点顕微鏡装置。
請求項２に記載のライン走査型共焦点顕微鏡装置において、
前記補正手段は、
前記特定ラインＬ_０のｊ番目の画素信号Ｓ_{（０，ｊ）} のクロストーク成分を、少なくとも、その特定ラインＬ_０から１ラインずれたラインＬ_１の（ｊ±１）番目の画素信号Ｓ_{（１，ｊ＋１）}，Ｓ_{（１，ｊ−１）}に基づき補正する
ことを特徴とするライン走査型共焦点顕微鏡装置。
請求項３に記載のライン走査型共焦点顕微鏡装置において、
前記補正手段は、
前記特定ラインＬ_０のｊ番目の画素信号Ｓ_{（０，ｊ）} のクロストーク成分を、前記特定ラインＬ_０からｋラインずれたラインＬ_ｋの（ｊ±ｋ）番目の画素信号Ｓ_{（ｋ，ｊ＋ｋ）}，Ｓ_{（ｋ，ｊ−ｋ）}に基づき以下の式で補正する
Ｓ_{（０，ｊ）}＝Ｓ_{（０，ｊ）}−（Ｓ_{（１，ｊ＋１）}＋Ｓ_{（１，ｊ−１）}）
−（Ｓ_{（２，ｊ＋２）}＋Ｓ_{（２，ｊ−２）}）
−（Ｓ_{（３，ｊ＋３）}＋Ｓ_{（３，ｊ−３）}）…
ことを特徴とするライン走査型共焦点顕微鏡装置。
請求項１に記載のライン走査型共焦点顕微鏡装置において、
前記周辺ラインには、
少なくとも前記特定ラインの両側に隣接した２つのラインが含まれる
ことを特徴とするライン走査型共焦点顕微鏡装置。
請求項５に記載のライン走査型共焦点顕微鏡装置において、
前記補正手段は、
前記特定ラインＬ_０のｊ番目の画素信号Ｓ_{（０，ｊ）} のクロストーク成分を、少なくとも、その特定ラインＬ_０から±１ラインずれた２つのラインＬ_１，Ｌ_−１の（ｊ±１）番目の画素信号Ｓ_{（１，ｊ＋１）}，Ｓ_{（−１，ｊ＋１）}，Ｓ_{（１，ｊ−１）}，Ｓ_{（−１，ｊ−１）}に基づき補正する
ことを特徴とするライン走査型共焦点顕微鏡装置。
請求項６に記載のライン走査型共焦点顕微鏡装置において、
前記補正手段は、
前記特定ラインＬ_０のｊ番目の画素信号Ｓ_{（０，ｊ）} のクロストーク成分を、前記特定ラインＬ_０から±ｋラインずれたラインＬ_＋ｋ，Ｌ_−ｋの（ｊ±ｋ）番目の画素信号Ｓ_{（ｋ，ｊ＋ｋ）}，Ｓ_{（−ｋ，ｊ＋ｋ）}，Ｓ_{（ｋ，ｊ−ｋ）}，Ｓ_{（−ｋ，ｊ−ｋ）}に基づき以下の式で補正する
Ｓ_{（０，ｊ）}＝Ｓ_{（０，ｊ）}
−［（Ｓ_{（１，ｊ＋１）}＋Ｓ_{（−１，ｊ＋１）}）／２＋（Ｓ_{（１，ｊ−１）}＋Ｓ_{（−１，ｊ−１）}）／２］
−［（Ｓ_{（２，ｊ＋２）}＋Ｓ_{（−２，ｊ＋２）}）／２＋（Ｓ_{（２，ｊ−２）}＋Ｓ_{（−２，ｊ−２）}）／２］
−［（Ｓ_{（３，ｊ＋３）}＋Ｓ_{（−３，ｊ＋３）}）／２＋（Ｓ_{（３，ｊ−３）}＋Ｓ_{（−３，ｊ−３）}）／２］
−…
ことを特徴とするライン走査型共焦点顕微鏡装置。