CN106662530A - 用于液体样品的光学测量的方法和装置 - Google Patents

Abstract

一种用于放置在样品井（3）中的液体样品（2）的光学测量的方法和装置，其中样品井中的样品暴露于来自激发光源（4）第一波长处的激发光（7），该激发光从液体样品中的供体分子生成单重态氧分子的集合，所述单重态氧分子与液体样品中的受体分子反应引起所述受体分子以第二波长发射化学发光发射光（11），该第二波长比所述第一波长短，以及其中用检测器测量由激发光产生的发射光，其特征在于激发光源为LED（4）。

Description

用于液体样品的光学测量的方法和装置

技术领域

本发明涉及液体样品的光学测量。更确切地说，本发明涉及用于放置在样品井中的液体样品的光学测量的方法和装置，其中样品井中的样品暴露于来自激发光源的激发光，以及其中用检测器测量由光的激发产生的光发射。

背景技术

荧光是由已吸收了光或其他电磁辐射的物质进行的光（光子）发射。能量的吸收将分子的轨道电子激发到较高的电子态并且弛豫到基态发射出光子。这是一种发光（luminescence）形式。通常，相比于所吸收的辐射，所发射的光具有较长的波长，并且因此具有较低的能量。

化学发光是由于化学反应导致的光发射（发光）。

荧光团吸收一个波长处的光能，并且作为响应，重新发射另一个较长波长处的光能。每个荧光团具有在该处吸收光的区别性的波长范围，以及在该处发射光的另一个有区别的波长范围。该性质使得它们能够通过分析仪器和技术用于生物制品的特定检测。

从现有技术已知基于光致发光的不同样品测量方法，其中利用进入样品的光的激发获得来自样品的光发射。当测量了由样品发射的光时，可确定样品的不同性质。已知测量方法包括Ullman等人的美国专利6,409,913中描述的AlphaScreen（放大发光邻近均匀测定屏）光化学测量技术和LOCI（发光氧通道免疫测定），其中由光的激发和样品中化学反应两者产生光发射。

AlphaScreen测量技术方法和设备中通常使用的光源为激光，由于产生的光的波长均匀性以及获得的光的高功率密度，该高激发能量有效地引起从涂覆有发光剂的珠形成修改的氧分子。修改的氧分子最终引发化学反应级联，导致所检测的化学发光信号的产生。

AlphaScreen测量方法为基于珠的邻近测定，其中供体珠和受体珠通过可特异性地相互反应和与珠反应的各种生物分析物材料相连接。当用670-690nm波长的红色激光激发连接的供体珠时，该连接的供体珠将周边氧转化为激发单重态。释放的单重态氧扩散到周围的样品井矩阵，以及如果供体珠和受体珠经由待测定的特定生物反应连接，受体珠足够靠近以被单重态激发，并且光发射在520-620nm波长（其是蓝-绿、绿或黄光）之间产生且与相互作用水平成比例。通过测量发射光，有可能确立化学反应已发生的有效程度和正在测定的样品的什么性质。

来自样品的激发光和发射光之间的波长差异允许分离并检测从激发光发射的光。

在AlphaScreen方法中，一般而言激发光和发射光的波长与荧光相比具有相反的关系，即激发光波长比发射光波长更长。

在荧光测量中，通常，向样品发送激发光脉冲，并且有效地实现发射光的测量，而没有诱导延迟。在时间分辨荧光光谱（TRF）中，在一个或多个激发光脉冲之后，根据时间的函数监测样品。利用TRF来减少背景荧光，以及例如在动力学研究中。

激光潜在地为一种通常生成准直光束的精确且强大的光源，该准直光束减少了在分析仪器中使用单独的准直装置的需要，但是使用激光作为激发光源也产生一些问题。产生激光所需要的高电功率也生成热，但是因为激光二极管的谐振器对自己生成的热和温度变化是高度敏感的，所以激光二极管需要诸如珀耳帖冷却器之类的单独设备的经常性主动冷却，这导致增加分析设备的复杂性和尺寸。进一步地，激光二极管也非常昂贵，这提高了利用激光器的分析设备的价格。在实践中已经观察到，当以例如在AlphaScreen应用中的激光源激发样品时，只有一些测量，典型地只有一个测量可以被执行，因为在后续测量中，获得显著降低的发射信号或没有发射信号。

通过使用适当的稳定荧光参考材料（其将较短的波长激发辐射转化为较长的波长发射辐射）可以稳定荧光读取仪器。这些种类的材料可广泛获得并例如用于ThermoScientific的Fluoroskan Ascent微型板荧光计。

在Alphascreen测量中，激发波长（685nm）比发射波长（520nm-620nm）长。不存在将685nm的激发波长转化为较短波长的可用的适当的稳定材料。这是有问题的，因为向较短波长移位事实上为Alphascreen测量的好处之一，因为在测量中不存在光学背景信号。同样，使用的参考材料因为缺乏TRF表现（behavior），不能在包括Alphascreen化学过程的TRF测量中用作参考荧光材料。

发明内容

本发明提供一种用于液体样品的光学测量的新颖的方法和装置，当激发光生成单重态氧（其进而导致发射化学发光的光）时，使得激发光的波长大于观察到的化学发光发射光的波长。

该方法和装置可用于液体样品的光学测量，例如用于利用荧光Alphascreen或其他基于单重态氧通道测定的化学反应，诸如在AlphaScreen、AlphaLISA和类似的光学测量方法中。该单重态氧通道测定可意味着基于由单重态氧导致的化学发光的测定，其中激发光波长比观察到的化学发光发射光的波长更长。

激发光源可以为LED（发光二极管）。在使用LED的情况下，可获得与使用半导体激光器相同的光功率，而没有由温度变化导致的激发光的质量（鉴于激光二极管可受到甚至单摄氏度的温度变动的影响）的问题。LED的使用也允许测量设备的结构更加紧凑。

然而，在Alphascreen或基于其他单重态氧通道测定的化学反应应用中使用LED作为激发光源的主要优点在于，所测得的样品的发射不会以与使用激光的测量相同的方式减少，这意味着相同的样品在不同的时间点（动力学研究）可被激发和测量几次（至少两次）。动力学测量通常用于研究各种酶促反应。示例1和图5A至图5C中描述了动力学实验的实例，其中在化学反应的过程期间，相同的样品在各设置时间点被测量多次，以便监测反应化学动力学。

在本发明中，在适当的时间段之后，可利用单个激发曝光和单个发射读取来实行TRF测量，例如300ms曝光、50ms延迟和500ms发射读取。可替代地，在期望的测量时间内，利用多个连续的测量循环可实行TRF测量，其中短激发脉冲之后是短发射测量，例如由5ms激发之后是5ms发射读取组成的10ms激发和发射读取循环在期望的测量时间上不断地重复。

当背景的量减少时，仪器变得更加敏感，并且可更可靠地检测较低的分析物浓度。

可以许多方式减少背景产物的问题。仪器硬件可设计为减少背景但例如滤波器通常不是100%准确，因为一些激发光可穿过发射滤波器，反之亦然。在某个时间段之后，背景发射耗尽。在发射被读取的同时，TRF激发光不被照射，并且在读取时，大多数背景发射也已经降低。同样在Alphascreen或其他基于单重态氧通道测定的技术中，发射波长小于激发波长，这意味着大于激发波长的背景荧光信号在样品发射相同的波长处不被读取。使用共焦光学装置也通过最小化样品液体之外的其他部分上的照射而减少了生成的背景信号的量。

在本发明的一种用于放置在样品井中的液体样品的光学测量的方法中，样品井中的样品暴露于来自激发光源第一波长处的激发光，该激发光从液体样品中的供体分子生成单重态氧分子的集合，所述单重态氧分子与液体样品中的受体分子反应从而导致所述受体分子以第二波长发射化学发光发射光，第二波长比所述第一波长短，并且这里用检测器测量由激发光产生的发射光，其中激发光源为LED。

在本发明方法的一个实施例中，来自LED的激发光被聚焦在样品井的开口区域，并且利用共焦布置从样品井的开口区域收集发射光。本实施例提供了样品的有效和均匀的照射，以及高度敏感的测量结果。

在本发明的上下文中，术语“共焦”的使用意思是激发光的焦点和发射光集合的焦点实际上是一个，以及布置的相同焦点和发射光的光学路径共享至少一个共同的光学元件，诸如透镜、反射镜或分束器。

在本发明方法的一个实施例中，激发光被导入样品井，并且从共焦布置中的样品井收集发射光，其中激发光源的图像被聚焦在样品井的开口顶部上，以及检测器的光接收区域的图像被聚焦在样品井的开口顶部上。在此实施例中，激发光源的所述图像可小于样品井的开口，以及检测器的光接收区域的所述图像可大于样品井的开口。

在本发明方法的一个实施例中，向样品发送激发光脉冲，并且从激发光脉冲的发送已经过去预定的时间段之后，实行发射光的测量。预定的时间段可以是30-70ms，例如通常为50ms。

在本发明方法的一个实施例中，激发光和发射光被校准。优选利用单独和独立的校准过程来实行该校准。

在本发明方法的一个实施例中，所用的LED在680nm波长处发射光。

在本发明方法的一个实施例中，样品井的内壁由漫反射材料形成或涂覆有漫反射材料。井的这种内壁为激发光和发射光两者提供良好的漫反射表面，这提高了测量过程的质量。适当材料的示例为具有白颜色物质的聚苯乙烯，例如氧化钛。

本发明的一种用于放置在样品井中的液体样品的光学测量的装置包括用于在第一波长处向激发光暴露样品井中的样品的激发光源，以及用于在第二波长处从样品检测并测量化学发光发射光的检测器，该第二波长小于所述第一波长，其中激发光源为LED。

在本发明装置的一个实施例中，该装置包括用于聚焦在样品井的开口区域中激发光源的图像的聚焦设备，以及用于聚焦在样品井的开口区域中的检测器的光接收区域的图像的设备，这里共焦点实际上在样品井的开口的水平上。

在本发明装置的一个实施例中，激发光源为脉冲激发光源。

在本发明装置的一个实施例中，该装置也包括激发光滤波器、发射光滤波器、激发和发射光分束器和样品井上面的杂散光屏蔽物。

在本发明装置的一个实施例中，该装置也包括激发光分束器和用于校准激发光的激发参考检测器，和/或发射参考光源以及用于校准发射检测器的白色反射散射表面。

在本发明装置的一个实施例中，激发LED为680nm波长处的LED发射光。

在本发明装置的一个实施例中，检测器为光电倍增管。

限定本发明方法的特征更精确地表述于权利要求1，以及限定本发明装置的特征更精确地表述于权利要求17。从属权利要求公开了本发明的有利特征和实施例。

附图说明

在以下实例中，将参照附图更详细地描述一些实施例，其中

图1通过示例的方式示意地示出了根据本发明的测量布置，

图2A和图2B通过示例的方式示意地示出了利用本发明获得的激发和发射图案，

图3通过示例的方式示意地图示了本发明中使用的图像，

图4通过示例的方式示意地示出了图1中测量布置的改进实施例，以及

图5A至图5C示出了利用根据本发明的仪器实行的动力学测量的结果。

具体实施方式

图1中示意地示出的用于实现适当的基于单重态氧通道测定的测量技术应用（诸如例如AlphaScreen或AlphaLISA）的测量布置包括在位于样品井3中的液体样品2的光学测量期间本发明的光学测量设备1，该样品井例如可以是384微孔板的一部分。

光学测量设备1包括利用透镜布置5和滤波器6形成设备的激发光源的LED4。LED4在680nm波长处发射光，用透镜布置5将该光收集到光束并利用滤波器6对其进行滤波以保证这样获得的激发光束7的适当的波长。

然后用在680nm波长处反射光的分束器8朝着样品井3反射激发光束7。在激发光束7离开测量设备1之前利用透镜布置9将激发光束7聚焦，使得激发光束的焦点位于样品井3的开口区域中。

当激发光束7在样品井3的开口区域中被聚焦时，该样品井3的内表面为白色，该样品井表现为像乌布利希（Ulbricht）积分球一样，并有效地点亮位于样品井内部的整个液体样品2。稍后参照图2A和图2B更密切地讨论这点。

从相同的共焦焦点而不是激发光束在样品井3的开口区域中被聚焦的地方收集利用激发光束7从液体样品2获得的发射光。带有孔径的串扰屏蔽物10位于接近样品井3的开口上面，这通过光学杂散光最小化了来自相邻井的可能的激发光。

从液体样品2收集的发射光被定向到通常具有520nm至620nm波长的发射光束11。这些波长不被分束器8反射并且穿过分束器8。分束器8也可以为部分反射的宽带反射镜，这在需要自由波长选择时是有用的。用滤波器12对发射光束11滤波并用透镜13将发射光束11聚焦在检测器部件14的检测表面上，该检测器部件14在本实施例中为光电倍增管的阴极。

利用图1的测量设备1，可生成激发射束7并与发射信号射束11的收集和测量同时发送激发射束7（归因于分束器8），但是优选地，激发光束被生成为一个或多个脉冲，并且从发送脉冲已经过去预定的时间之后，实行发射信号的收集和测量（TRF测量）。

图2A和图2B示意地示出了利用本发明获得的激发和发射图案。图2A示出了根据朗伯余弦定律的激发接收图案，以及图2B示出了根据朗伯余弦定律的发射辐射图案。

白色微孔3或者具有白色内表面的微孔表现为像乌布利希积分球一样。乌布利希积分球上的开口表现为像理想的漫辐射表面一样，并且因而遵循朗伯余弦定律。辐射图案为井3开口顶部上的圆圈。当接收辐射（激发）和传输辐射（发射）时，开口均表现为相同。

通过将激发共焦点正好放置在井3的开口上，最大立体角可用于激发，以及通过将发射共焦点放置在井的开口上，最大立体角可用于发射读取。

当将准直光束拟合到井3的开口时，可使用焦距非常短的光学装置。这意味着LED输出的放大可保持为低，并且在板开口处的LED聚焦图像小于开口的尺寸。这导致高的激发效率。进一步地，由于开口上的LED图像小于开口的尺寸，井的位置不是关键的。

激发射束在井3的内部是完全平滑的，为井内部提供温和照射。颗粒和液体成分从上面、下面和侧面被均匀地照射。这最小化了许多漂白效应的风险。

在发射读取中，使用同样焦距非常短的透镜，以便设想井3的开口符合通过干涉滤波器的第一准直光束，以及然后发射射束被聚焦在光电倍增管的阴极上。短焦距透镜可以非常大的角度收集来自井3开口的光，这产生了高的发射收集效率。并且，由于井开口的图像小于光电倍增管的阴极，井的定位不是关键的。

可使用另外的遮光罩以通过光学杂散光最小化相邻井的激发。相同的遮光罩也最小化了发射读取中的发射串扰。例如，组合的杂散光屏蔽可以是1：10000。

图3示意地图示了本发明使用的图像。图3中示出了激发光LED4在井3的开口上的图像15，该井为包括多个井3的井板的一部分。与井3的开口区域相比，光电倍增管的阴极14的图像16很大。使用串扰屏蔽物10（其开口17稍微大于井3的开口）有效地阻止相邻井到阴极14的泄漏发射。

图4示出了图1中测量布置的改进实施例，其中光学测量设备1’配备有用于激发光和发射光两者的校准系统。

仪器读取响应为激发效率和发射响应的乘积。因此，在本发明的该改进实施例中，通过单独地校准激发效率和发射响应可稳定光学测量设备1’，以便校准被分为两个独立的校准过程：激发校准和发射校准。

激发效率相对于短期和长期变化被校准。

短期变化存在于由功率LED4发射的、通常为100ms至500ms长的激发光脉冲的内部。这些种类的LED在需要的功率电平上不是热稳定的，因此激发光脉冲幅度可在脉冲时间期间变化。这会改变生成的LED激发脉冲的精确的计时效果。激发脉冲形状（即波长范围和每个波长处产生的光量）必须是可重复的以保存精确定时，并且测量脉冲的平均或峰值激发光功率是不够的。LED输出电平在激发脉冲时间内必须被连续地控制和调整，以便维持恒定的有效光输出。

在图4的实施例中，分束器18位于激发光路中，其向激发参考检测器19分离了一小部分的激发射束7。通过控制和调整到LED4的电流，来自激发参考检测器19的输出信号被保持恒定。可用控制电路（未示出）实现控制和调整到LED4的电流，该控制电路包括比例积分控制器（PI-控制器）和生成到LED的电流的功率级。该激发校准系统在本发明的光学测量设备1’中生成精确恒定幅度的激发光脉冲。

该激发校准系统也为井到井以及板到板测量的激发光提供了长期的激发稳定性。

在发射校准中，光电倍增管20随着操作时间的输出变化被称为漂移，并且这些漂移分为短期漂移和长期漂移。

通过使用稳定的发射参考光源21校准这些漂移。稳定的发射参考光源21可以是LED，例如温度尤其稳定的飞利浦LXML-PR00-0500。LED发射的光的波长为460nm。这些种类的LED对于该目的而言为过于强大的发射器，并且输出应被强烈地衰减（例如利用中性密度滤波器）。

在图4的实施例中，发射滤波器12为旋转发射滤波器轮，其中存在用于八个发射滤波器的位置、不具有滤波器的用于测量的孔以及用于发射背景信号测量遮蔽（shutter）操作实心部分。在遮蔽位置上，存在被发射参考光源21照射的白色反射散射表面。在发射校准期间，发射滤波器轮在遮蔽位置上转动，以及发射滤波器轮上的白色反射散射表面用发射参考光源21照射，被散射的反射光均匀地照射光电倍增管20的阴极14，并且测量了校准水平。

对于发射校准，原始光电倍增管校准水平可在其制造期间存储在光学测量设备1’中。例如可在每次微型板读取之前实行发射校准，以及通过比较测量的校准结果和存储的原始光电倍增管校准水平值计算校正因子。

系统的最终响应为激发量和发射信号的乘积。这尤其在TRF测量中极为重要的。当光源（发射）的强度被设置为恒定时，测量激发量（并且不需要其他校正）足以定义系统响应。

装置1可以布置成通过聚焦LED4的光在样品井3的开口的顶部形成LED4聚焦图像15。装置1可包括透镜布置9，通过聚焦LED的光来提供聚焦射束，使得在聚焦射束的焦点处形成聚焦图像15。透镜布置9的数值孔径（NA）例如可大于0.15，大于0.20，大于0.30，大于0.40，大于0.50或甚至大于0.80。使用大的立体角并在开口顶部聚焦图像可为样品井3中含有的样品2提供有效并均匀的照射。通过使用漫反射样品井3和大的立体角，装置1可被布置成从上面、下面和侧面均匀地照射样品2。均匀照射可减小光漂白效应的风险。

由于定位不精确，样品井3的开口可相对于焦点稍微（水平地）移置。均匀照射可减小关于测量结果的水平定位错误的效应。

样品井3中含有的液体样品的上表面的垂直位置也可具有关于测量结果的效应。实际上，上表面的实际位置可稍微偏离参考位置。均匀照射可减小关于测量结果的所述偏差的效应。

LED可由耦合至LED的电流供电。LED的输出强度与电流的比在LED的操作点附近可以是基本线性的。通过使用电流供应，可容易地控制LED。因此，通过控制耦合至LED的电流可容易地稳定LED的输出强度。通过减小单个激发光脉冲内部的短期变化，可进一步减小光漂白效应的风险。装置1在单个激发光脉冲期间可被布置成维持基本恒定的有效光输出。通过使用激发参考检测器19来监测激发光脉冲的强度可控制激发光脉冲的瞬时强度。该方法可包括调整LED4的电流，使得来自激发参考检测器19的输出信号在激发光脉冲期间被保持为基本恒定的。例如通过使用基于从激发参考检测器19获得的输出信号的比例积分控制器（PI-控制器）可生成LED4的电流。激发光脉冲的一部分光可光学耦合至参考检测器19，以便提供输出信号。所述部分可光学耦合至参考检测器19，例如通过使用分束器18。

LED4可有具有精确限定和稳定尺寸的发光区域。强度分布在发光区域的表面上可以是空间上基本均匀的。LED4的发光区域可具有基本上平坦的输出表面。发光区域的图像可被聚焦在样品井3的开口顶部上。发光区域可具有稳定的长度和宽度，使得发光区域的图像的位置和尺寸也可以是极其稳定的。LED可具有基本矩形的发光区域或基本圆形的发光区域，并且样品井3可具有基本矩形或圆形的开口。可选择发光区域的形状，以便匹配样品井3的开口形状（或反之亦然）。因此，矩形或圆形发光区域的图像形状可匹配样品井3的开口形状。在一个实施例中，样品板的样品井3可以以矩形阵列来布置，使得板的井具有基本矩形的开口，并且矩形发光区域的图像可被聚焦在所述井板的井3的开口顶部上。

LED可提供非相干激发光7，这可减小光漂白效应的风险。

多亏了通过使用LED的均匀和受控的照射，光漂白在从样品发射的化学发光的光强度方面可具有减小的效应。样品可被几个连续的激发光脉冲激发，使得所述连续的激发光脉冲的最后激发光之后检测的化学发光的光强度仍然可基本上大于零。特别地，在激发光脉冲期间样品中的结合程度激保持相同的情况下，样品可被第一激发光脉冲和被第二激发光脉冲激发，使得第二激发光脉冲之后发射的化学发光的光的强度大于在第一激发光脉冲之后发射的化学发光的光的强度的80%或甚至90%。

在珠上俘获的分子的结合可对从单重态氧向受体珠的能量传输具有影响。因而，化学发光发射光的强度和/或能量可指示样品中的结合程度。多亏了减小的光漂白，由激发光脉冲生成的单重态氧分子的量可维持基本恒定的或以很慢的速率减少。这可允许样品中结合程度的更精确的监测。

该方法可包括：

-用第一激发光脉冲照射样品2，以便从样品2的供体分子生成单重态氧分子的第一集合，

-通过从单重态氧分子的第一集合向样品2的受体分子传输能量引起第一化学发光发射光的发射，

-测量第一化学发光发射光，

-用第二激发光脉冲照射相同的样品2，以便从样品的供体分子生成单重态氧分子的第二集合，

-通过从单重态氧分子的第二集合向样品2的受体分子传输能量引起第二化学发光发射光的发射，以及

-测量第二化学发光发射光，

其中，样品2被第一激发光脉冲和被第二激发光脉冲照射，使得由第二激发光脉冲生成的单重态氧分子的量在由第一激发光脉冲生成的单重态氧分子的量的80%到100%的范围内。

该方法可包括：

-用第一激发光脉冲照射样品2，以便从样品2的供体分子生成单重态氧分子的第一集合，

-通过从单重态氧分子的第一集合向样品2的受体分子传输能量引起第一化学发光发射光的发射，

-测量第一化学发光发射光，

-用第二激发光脉冲照射相同的样品2，以便从样品的供体分子生成单重态氧分子的第二集合，

-通过从单重态氧分子的第二集合向样品2的受体分子传输能量引起第二化学发光发射光的发射，

-测量第二化学发光发射光，

其中样品2被第一激发光脉冲和被第二激发光脉冲照射，使得第二化学发光发射光的最大强度大于或等于第一化学发光发射光的最大强度的80%，以及其中样品中的结合程度在第一激发光脉冲和第二激发光脉冲期间保持相同。

该方法可包括：

-用第一激发光脉冲照射样品2，以便从样品2的供体分子生成单重态氧分子的第一集合，

-通过从单重态氧分子的第一集合向样品2的受体分子传输能量引起第一化学发光发射光的发射，

-测量第一化学发光发射光，

-用第二激发光脉冲照射相同的样品2，以便从样品的供体分子生成单重态氧分子的第二集合，

-通过从单重态氧分子的第二集合向样品2的受体分子传输能量引起第二化学发光发射光的发射，

-测量第二化学发光发射光，

其中样品2被第一激发光脉冲和被第二激发光脉冲照射，使得第二化学发光发射光的最大强度大于或等于第一化学发光发射光的最大强度的90%，以及其中样品中的结合程度在第一激发光脉冲和第二激发光脉冲期间保持相同。

第一激发光脉冲的最大强度可基本上等于第二激发光脉冲的最大强度，以及第一激发光脉冲的能量可基本上等于第二激发光脉冲的能量。从LED发射的激发光脉冲的强度在激发光脉冲期间也可保持基本恒定。可选择光脉冲的持续时间，使得第二激发光脉冲导致的化学发光发射光的最大强度例如高于装置1的最小检测极限的十倍。可选择第一激发光脉冲的强度和第二激发光脉冲的强度，使得由第二激发光脉冲导致的化学发光发射光的最大强度高于例如装置1的最小检测极限的10倍。最小检测极限可意味着能够与背景噪声相区分的发射的最小强度。当强度例如高于最小检测极限的十倍时，可以合理的精度测量强度的量值。

在第一激发光脉冲和第二激发光脉冲之间的检测时间段期间，可测量由第一激发光脉冲导致的激发光的强度。第一激发光脉冲结束和第二激发光脉冲开始之间的时间延迟例如可大于或等于30ms。可选择时间延迟使得第二激发光脉冲在测量第一激发光脉冲导致的化学发光发射所用的检测时间段结束之前不会开始。激发光的强度在所述检测时间段期间可基本上等于零。时间延迟例如可大于30ms，大于100ms，大于500ms，大于1s，大于10s，大于60s，大于10min，大于1h，大于2h，大于12h或甚至大于24小时。可在已经用第一激发光脉冲照射样品之后用第二激发光脉冲照射样品2。第一激发光脉冲的最大强度可基本上等于第二激发光脉冲的最大强度。可选地，从检测器获得的信号可以是积分的，以及检测时间段也可被称为积分时间段。

从相同样品几次获得化学发光发射光可提供更可靠和/或更精确的测量结果。从相同样品几次获得化学发光发射光可促进时间依赖现象的分析。

在一个实施例中，可用至少十个连续的激发脉冲均匀地照射样品，使得化学发光发射光的强度甚至在第十个激发光脉冲之后基本上大于零。可选择激发光脉冲的持续时间和/或强度，使得第十个激发脉冲导致的化学发光发射光的最大强度例如可大于第一激发脉冲导致的化学发光发射光的最大强度的50%。第十个激发脉冲导致的发射的最大强度甚至可大于第一激发脉冲导致的发射的最大强度的75%。激发光脉冲可具有基本上类似的强度和持续时间。

激发波长例如可基本上等于680nm。可选择LED4使得LED4的峰值波长与激发波长匹配，以便提供最大效率。可选择LED4使得LED4的峰值波长例如在675nm到685nm的范围内。特别地，LED4的峰值波长例如可基本上等于680nm。

从样品2接收到的光可包括例如发射光11、反射光和/或散射光。接收光的光谱分量的波长可处于光谱检测带内或光谱检测带之外。可以以光谱选择的方式测量来自样品2的发射光11，使得检测带之外的光谱分量不被传送到检测器20。可以以光谱选择的方式测量发射光11，使得检测带之外的光谱分量不被检测器20检测到。特别地，可选择检测带使得激发光的波长（例如，680nm）处于检测带之外。装置1的检测器20可被布置成检测波长处于检测带内的接收光的那些光谱分量，以及装置1可被布置成阻止波长处于检测带之外的接收光的那些光谱分量的传播。光谱检测带为第一截止波长和第二截止波长限定的波长范围。检测带的第一截止波长例如可长于或等于520nm，以及检测带的第二截止波长例如可短于或等于620nm。可选择检测带使得检测器20能够检测化学发光发射光11，并且使得可以基本阻止激发光7向检测器20的传播。装置1可包括用来限定检测带的一个或多个光谱选择分量。例如可通过使用二向色分束器8和/或通过使用一个或多个滤波器来限定检测带。

该方法可以是基于珠的邻近测定，其中供体珠和受体珠通过可特异性地相互反应和/或与珠反应的一个或多个生物分析物材料相连接。当用670-690nm波长（例如以680nm波长）的红色激光激发供体珠时，其可将周边氧转化为激发单重态。释放的单重态氧可扩散到周围的样品井矩阵。如果供体珠和受体珠经由待检查的特定生物反应相连接，受体珠可足够靠近，以被单重态激发，并且可产生光发射。发射的光的波长例如可在520-620nm范围内。在520-620nm范围内的波长可对应例如蓝-绿、绿或黄光。光的发射可与相互作用水平成比例。通过测量发射光，有可能确立化学反应已发生的有效程度和/或正在测定样品的什么性质。

从单重态氧向受体珠的能量传输可花费一些时间，以及当激发光脉冲的结束和测量由所述激发光脉冲导致的化学发光之间存在时间延迟时，可提高测量的信噪比。更确切地说，所述时间延迟可意味着激发光脉冲的结束和测量由所述激发光脉冲导致的化学发光发射所用的检测时间段的开始之间的时间段。时间延迟的长度例如可大于1ms。时间延迟的长度例如可基本上等于50ms。从激发光脉冲的发送已经过去预定的时间段之后，可以实行发射光11的测量，其中预定的时间段例如可长于1ms。

通过使用长于检测带的第二截止波长的激发波长，可基本上减小或消除常规荧光导致的干扰背景。化学发光的光的测量可在光谱上与激发光脉冲分离，从而减少背景。化学发光的光的测量可暂时地与样品2和/或井3发射的荧光分离达例如50ms。当测量单重态氧导致的化学发光发射时，激发波长可长于检测带的第二截止波长。背景荧光发射的波长可长于激发波长。因此，可选择用于测量化学发光发射的检测带，使得检测带在光谱上不与荧光发射重叠。

从发射检测器20获得的瞬时信号可与化学发光发射光11的瞬时强度基本上成比例。单个激发光脉冲之后从发射检测器20获得的瞬时信号的积分可与在所述单个激发光脉冲之后积分时间段期间从样品发射的化学发光发射光11的强度的积分基本上成比例。装置1可被布置成提供从发射检测器获得的瞬时信号的积分。积分可指示AlphaScreen信号。可选地，可通过使用激发光脉冲的能量或强度来标准化该积分。可选地，该积分可除以积分时间段的长度，以便提供平均值。可选地，两个或多个积分值可以被求和或求平均，以便改善测量精度。

通过使用发射参考光源和散射表面可校准发射检测器20。散射表面可被布置成暂时地向发射检测器20反射参考光源的光。从散射表面反射的光可以可选地被耦合至发射检测器20，以便校准发射检测器20的响应。散射表面例如可以为白色散射表面或灰色散射表面。检测器20可通过使用灰色散射表面来校准微弱信号。通过使用两个或多个具有不同阴影的散射表面，发射检测器20的动态范围可被校准。

示例1

使用来自Perkin Elmer的AlphaScreen磷酸酪氨酸（PT66）检测试剂盒（产品编号6760602M）实行AlphaScreen信号的长时间动力学测量。

在该测定中，AlphaScreen供体珠和受体珠用生物素化的磷酸肽结合在一起。这形成了AlphaScreen复合物，其中供体珠和受体珠距离很近，其经由单重态氧机理生成AlphaScreen信号。因此，该测定中测量的AlphaScreen信号正比于生物素化的LCK-P肽的量。

Perkin Elmer使用25µl总体积利用384井Alphaplate（产品编号6005359）实行动力学AlphaScreen测定的试验。按照制造商的指示，混合供体珠和受体珠。然后，将15µl珠混合物和10µl不同浓度的生物素化的LCK-P肽加入到微型板井以达到0.5、1.5、5、15和50fmol/井的最终浓度。使用八个重复井测量肽稀释液，以及缓冲空白包括有16个重复。在黑暗中在室温下温育测定板一小时，之后使用根据本发明的仪器在室温下测量该板。测量设置为：激发波长680nm，发射波长570nm，激发时间300ms，延迟时间40ms以及积分时间300ms。在22小时的总时间里，以动力学格式每两个小时实行一次测量。

图5A示出了用生物素化肽进行AlphaScreen信号的此长时间动力学测量的结果。

示例2

使用与示例1中相同的测定，试验了AlphaScreen测量的短时间动力学稳定性。用AlphaScreen珠（8个重复）温育0.5 fmol/井的生物素化肽两分钟，以及使用与上文相同的仪器设置利用根据本发明的仪器测量AlphaScreen信号。以六秒间隔重复该测量20次。

图5B示出了利用生物素化肽的AlphaScreen信号的此短时间动力学测量的结果。

示例3

全向珠（Omnibead）是已设计用于在AlphaScreen技术中使用的仪器的验证和校准的特殊类型的AlphaScreen珠（Perkin Elmer，产品编号6760626M）。全向珠仅含有生成强AlphaScreen信号的单个类型的珠。

在该测定中，用10 mM PBS缓冲液稀释全向珠，用八个重复将pH 7.2和25 µl的每个稀释液加入到384-井Alphaplate中。移液之后立即开始动力学测量，并且在室温下利用本发明的仪器在12小时里每30分钟测量一次测定板。测量设置如上：激发波长680nm，发射波长570nm，激发时间300ms，延迟时间40ms以及积分时间300ms。

图5C示出了用全向珠校正珠进行AlphaScreen信号的此长时间动力学测量的结果。

从图5A-5C可以看出，在TRF测量序列中，示例性测量的结果保持相当恒定。

附图和以上讨论中所示出的本发明的特定例证性实施例不应被解释为限制。本领域技术人员可以以许多明显的方式在所附权利要求范围内修改和改变这些实施例。因而，本发明不仅仅限制于以上描述的实施例。

Claims (23)

1.一种用于放置在样品井（3）中的液体样品（2）的光学测量的方法，其中所述样品井中的样品暴露于来自激发光源（4）第一波长处的激发光（7），该激发光从液体样品中的供体分子生成单重态氧分子的集合，所述单重态氧分子与液体样品中的受体分子反应导致所述受体分子以第二波长发射化学发光发射光（11），该第二波长比所述第一波长短，以及其中用检测器测量由该激发光产生的发射光，其特征在于，该激发光源为LED（4）。

2.根据权利要求1所述的方法，其中来自LED（4）的激发光（7）被聚焦在样品井（3）的开口区域，以及用共焦布置（9）从该样品井的开口区域收集发射光（11）。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该激发光（7）被导入该样品井（3）并且从共焦布置（9）中的样品井收集发射光（11），其中该激发光源（4）的图像（15）被聚焦在该样品井的开口顶部上，以及该检测器的光接收区域（14）的图像（16）被聚焦在该样品井的开口顶部上。

4.根据权利要求3所述的方法，其中该激发光源（4）的所述图像（15）小于该样品井（3）的开口。

5.根据权利要求3所述的方法，其中检测器的该光接收区域（14）的所述图像（16）大于该样品井（3）的开口。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中向样品（2）发送激发光脉冲，以及从激发光脉冲的发送已经过去预定的时间段之后，实行发射光（11）的测量。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述预定的时间段长于1ms。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中优选利用单独和独立的校准过程校准该激发光和发射光。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，包括：

-耦合一部分激发光脉冲到激发参考检测器（19），以及

-基于激发参考检测器（19）的输出调节到LED（4）的电流，使得来自激发参考检测器（19）的输出信号在所述激发光脉冲期间被保持为基本恒定的。

10.根据权利要求9所述的方法，包括通过使用比例积分控制器向LED（4）提供电流。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该LED（4）在680nm波长处发射光。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该LED（4）的峰值波长在675nm到685nm的范围内。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中以光谱选择的方式测量该发射光（11），使得检测带之外的光谱分量不被传送到该检测器（20），激发光源（4）的第一波长（680nm）在检测带之外，装置（1）的检测带的第一截止波长长于或等于520nm，以及检测带的第二截止波长短于或等于620nm。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中该样品被激发，以及对应的发射被读取至少两次。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，包括：

-用第一激发光脉冲照射该样品（2），以便从样品（2）的供体分子生成单重态氧分子的第一集合，

-通过从单重态氧分子的第一集合向样品（2）的受体分子传输能量引起第一化学发光发射光（11）的发射，

-测量该第一化学发光发射光（11），

-用第二激发光脉冲照射该样品（2），以便从样品的供体分子生成单重态氧分子的第二集合，

-通过从单重态氧分子的第二集合向样品（2）的受体分子传输能量引起第二化学发光发射光（11）的发射，以及

-测量该第二化学发光发射光（11），

其中该样品（2）被第一激发光脉冲和被第二激发光脉冲照射，使得该第二化学发光发射光的最大强度大于或等于该第一化学发光发射光的最大强度的80%，以及其中该第一激发光脉冲的结束和第二激发光脉冲之间的时间延迟大于30ms。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，包括使用透镜布置（9）通过聚焦该LED（4）的光来提供聚焦射束，使得在该聚焦射束的焦点处形成该LED（4）的聚焦图像（15），其中该透镜布置（9）的数值孔径（NA）大于0.20。

17.一种用于放置在样品井（3）中的液体样品（2）的光学测量的装置（1），该装置包括用于在第一波长处向激发光（7）暴露样品井中的样品的激发光源（4），以及用于在第二波长处从样品检测并测量化学发光发射光（11）的检测器，该第二波长小于所述第一波长，其特征在于，该激发光源为LED（4）。

18.根据权利要求17所述的装置（1），其中该装置（1）包括用于聚焦在样品井（3）的开口区域中的激发光源（4）的图像（15）的聚焦设备（9），以及用于聚焦在样品井的开口区域中的检测器的光接收区域（14）的图像（16）的设备（9）。

19.根据权利要求17或18所述的装置（1），其中该激发光源（4）为脉冲激发光源。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的装置（1），其中该装置包括激发光滤波器（6）、发射光滤波器（12）、激发和发射光分束器（8）和样品井（3）上面的杂散光屏蔽物（10）。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的装置（1），其中该装置包括激发光分束器（18）和用于校准激发光（7）的激发参考检测器（19），和/或发射参考光源（21）以及用于校准发射检测器的白色反射散射表面。

22.根据权利要求17至21中任一项所述的装置（1），其中该LED（4）为680nm波长处的LED发射光。

23.根据权利要求17至22中任一项所述的装置（1），其中该检测器为光电倍增管（20）。