WO2021149227A1 - ラマン散乱測定装置 - Google Patents

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WO2021149227A1
WO2021149227A1 PCT/JP2020/002347 JP2020002347W WO2021149227A1 WO 2021149227 A1 WO2021149227 A1 WO 2021149227A1 JP 2020002347 W JP2020002347 W JP 2020002347W WO 2021149227 A1 WO2021149227 A1 WO 2021149227A1
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WO
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light
raman
intensity
intensity standard
sample
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Application number
PCT/JP2020/002347
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English (en)
French (fr)
Inventor
佐藤　亮
武志 菅
Original Assignee
オリンパス株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering

Definitions

  • the present invention relates to a Raman scattering measuring device, and more particularly to a Raman scattering measuring device having a function of correcting the intensity of Raman scattered light.
  • the intensity of Raman scattered light from the sample apparently changes due to various causes.
  • Various causes include fluctuations in illumination light intensity and light transmission efficiency of the light guide optical system, reflection on the sample surface, light scattering in the sample, light absorption in the sample, and the like.
  • the intensity of Raman scattered light of a substance in a sample is proportional to the concentration of the substance.
  • Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 a method for correcting an apparent change in the intensity of Raman scattered light of a sample has been devised (see, for example, Non-Patent Document 1 and Patent Document 1).
  • an intensity standard substance is placed in the illumination system, the sample is irradiated with the illumination light together with the intensity standard light generated by the intensity standard substance, the intensity standard light from the sample is measured, and the measured intensity standard light is measured.
  • the intensity of the Raman scattered light of the sample is corrected based on the intensity of.
  • diamond and sapphire arranged at the tip of the Raman probe are used as intensity standard substances, respectively, and Raman scattered light from the intensity standard substance is used as intensity standard light. ..
  • the Raman scattered light from the intensity standard substance is irradiated to the sample together with the illumination light, the Raman scattered light from the sample and the Raman scattered light from the intensity standard substance are detected at the same time.
  • the Raman scattered light from the sample and the Raman scattered light from the intensity standard material have the same wavelength, the Raman scattered light is superimposed on each other, and the intensity of each Raman scattered light can be accurately measured.
  • the wavelengths of the Raman scattered light from the sample and the Raman scattered light from the intensity standard material are different from each other. Then, the intensity of each Raman scattered light is measured at a wavelength in which each has a specific Raman peak, and the intensity of the sample Raman scattered light is corrected using the measured intensity.
  • FIG. 8A describes the wavelength of each light in the Raman scattering measurement and the absorption coefficient of each light by the sample
  • FIG. 8B describes the wavelength of each light in the Raman scattering measurement and the scattering coefficient of each light by the sample.
  • the non-resonant Raman measurement light having a wavelength of ⁇ ex away from the absorption wavelength of the substance in the sample is used as the illumination light for exciting Raman scattering.
  • the absorption coefficient Ast at the wavelength ⁇ st of the intensity standard light is substantially equal to the absorption coefficient Asa at the wavelength ⁇ sa of the sample Raman scattered light.
  • the wavelength ⁇ ex of the illumination light is usually a near-infrared wavelength, and the wavelength dependence of the scattering coefficient of the sample is small at the near-infrared wavelength. Therefore, even if the wavelength ⁇ st of the intensity standard light is far from the wavelength ⁇ sa of the sample Raman scattered light, the absorption coefficient Ast and the scattering coefficient SCst at the wavelength ⁇ st of the intensity standard light are absorbed at the wavelength ⁇ sa of the sample Raman scattered light. It is substantially equal to the coefficient Asa and the scattering coefficient SCsa. Therefore, the intensity of the Raman scattered light of the sample can be corrected based on the absorption coefficient Ast and the scattering coefficient SCst at the wavelength ⁇ st of the intensity standard light.
  • the first reason why the correction error occurs is as follows.
  • the wavelength ⁇ st of the Raman scattered light generated by the intensity standard substance is detuned from the wavelength ⁇ sa of the Raman scattered light from the sample.
  • the intensity standard substance is sapphire
  • the Raman peak wavelength ⁇ st of sapphire and the predetermined Raman peak wavelength ⁇ sa of the sample are separated by about 20 nm in the resonance Raman measurement by general green light or blue light excitation.
  • the wavelength ⁇ ex of the illumination light is tuned to the light absorption wavelength band of the sample.
  • the wavelength ⁇ sa of the Raman scattered light from the sample is located at the foot of the absorption wavelength band in which the light absorption coefficient of the sample fluctuates sharply with respect to the wavelength.
  • the absorption coefficient Ast at the wavelength ⁇ st of the intensity standard light is significantly different from the absorption coefficient Asa at the predetermined Raman peak wavelength ⁇ sa of the sample.
  • the ratio Ast / Asa of the absorption amount at each wavelength is not constant. Therefore, if the apparent intensity change of the Raman scattered light due to the absorption of the sample is corrected based on the absorption coefficient Ast at the wavelength ⁇ st of the intensity standard light, an error occurs.
  • the scattering coefficient of the sample depends on the wavelength, and when the sample is a living tissue, the wavelength dependence of the scattering coefficient is small at the near infrared wavelength and large at the visible wavelength. In resonance Raman measurement, light of visible wavelength with a large change in the scattering coefficient of the sample is generally used. Therefore, for example, in the case of resonance Raman measurement by blue light excitation, the scattering coefficient SCst at the wavelength ⁇ st of the intensity standard light is different from the scattering coefficient SCsa at the wavelength ⁇ sa of the sample Raman scattered light.
  • the apparent reduction in Raman scattered light due to light scattering in the sample depends on the scattering coefficient of the sample.
  • the scattering coefficient SCst at the wavelength ⁇ st of the intensity standard light is different from the scattering coefficient SCsa at the wavelength ⁇ sa of the sample Raman scattered light.
  • the apparent reduction cannot be calculated.
  • the scattering coefficients SCsa and SCst change depending on the sample state at the observation point, the ratio SCst / SCsa of the scattering coefficients at each wavelength is not constant. Therefore, if the apparent intensity change of the Raman scattered light due to the light scattering of the sample is corrected based on the scattering coefficient SCst at the wavelength ⁇ st of the intensity standard light, an error occurs.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and in the measurement of the resonance Raman scattered light of a sample, the apparent change in the intensity of the Raman scattered light due to the influence of absorption and scattering in the sample is accurately corrected. It is an object of the present invention to provide a Raman scattering measuring device capable of capable of providing a Raman scattering measuring device.
  • One aspect of the present invention is a light source that generates Raman excitation light tuned to the light absorption wavelength band of a substance in a sample, and an intensity standard light that is excited by the Raman excitation light.
  • An intensity standard light generating unit having the same wavelength as Raman scattered light having a predetermined wavelength from a substance, an illumination light switching unit that selectively emits the Raman excitation light and the intensity standard light, and the illumination light.
  • the sample is irradiated with the Raman excitation light and the intensity standard light selectively emitted from the switching unit, and the Raman scattered light from the substance and the intensity standard light diffusely reflected from the sample are received.
  • Raman spectrum is obtained by receiving the Raman scattered light and the intensity standard light via the Raman probe and dispersing the Raman scattered light, and the intensity is obtained by dispersing the intensity standard light.
  • It is a Raman scattering measuring apparatus including a spectroscopic analysis unit that acquires a standard spectrum and an intensity correction unit that corrects the intensity of the Raman spectrum based on the intensity information of the intensity standard spectrum.
  • the resonance Raman scattering of the substance in the sample is measured by using the Raman excitation light tuned to the light absorption wavelength band of the substance in the sample. That is, the Raman excitation light generated by the light source is applied to the substance in the sample via the Raman probe.
  • the Raman scattered light generated by the substance is incident on the spectroscopic analysis unit via the Raman probe, and the spectroscopic analysis unit acquires a Raman spectrum, which is a spectrum of the Raman scattered light.
  • the light supplied to the Raman probe is switched by the illumination light switching unit, so that the intensity standard light generated by the intensity standard light generating unit is irradiated to the sample at a timing different from that of the Raman excitation light.
  • the intensity standard light diffusely reflected in the sample is incident on the spectroscopic analysis unit via the Raman probe, and the spectroscopic analysis unit acquires an intensity standard spectrum which is a spectrum of the intensity standard light.
  • the intensity standard light has the same wavelength as the Raman scattered light having a predetermined wavelength of the substance. That is, the absorption coefficient and the scattering coefficient of the sample with respect to the intensity standard light are equal to the absorption coefficient and the scattering coefficient of the sample with respect to the Raman scattered light having a predetermined wavelength, respectively. Therefore, it is possible to accurately estimate the amount of attenuation of Raman scattered light of a predetermined wavelength due to the influence of absorption and scattering in the sample from the intensity of the intensity standard spectrum. Thereby, the intensity correction unit can accurately correct the apparent change in the intensity of the Raman scattered light having a predetermined wavelength due to the influence of absorption and scattering in the sample based on the intensity of the intensity standard spectrum.
  • the intensity standard light generating unit has a light emitting body and an aperture, the light emitting body generates the intensity standard light by photoexcitation by the Raman excitation light, and the opening generates the Raman excitation light. Passing as it is, the illumination light switching unit has the intensity between the position where the light emitter is arranged in the optical path of the Raman excitation light from the light source and the position where the opening is arranged in the optical path.
  • the standard light generator may be displaced. According to this configuration, intensity standard light can be generated easily and inexpensively simply by arranging a light emitter in the optical path of Raman excitation light, and a dedicated light source and light guide optical system for intensity standard light can be prepared. Not needed. In addition, the intensity standard light and the Raman excitation light can be switched at high speed, which makes it possible to reduce the deviation of the irradiation position of the intensity standard light and the Raman excitation light on the sample easily and inexpensively. can.
  • the light emitter may be a phosphor that emits fluorescence as the intensity standard light.
  • the phosphor has a wide wavelength band emission characteristic. Therefore, by using a phosphor, it is possible to obtain an intensity standard spectrum for Raman scattered light of a plurality of wavelengths of the substance in the sample. As a result, it is possible to correct an apparent change in the intensity of Raman scattered light having a plurality of wavelengths.
  • the light emitting body may be a Raman scattering body that generates Raman scattered light as the intensity standard light.
  • the intensity of Raman scattered light as standard light is equivalent to the intensity of Raman scattered light of the substance in the sample. Therefore, both the intensity standard spectrum and the Raman spectrum of the sample can be measured without switching the gain of the photodetector of the spectroscopic analyzer. Further, unlike a phosphor, a Raman scatterer does not deteriorate in light emission due to fading, and can continue to generate standard intensity light having a stable intensity.
  • the intensity standard light generating unit may have a filter for removing the Raman excitation light transmitted through the illuminant.
  • the sample is irradiated with intensity standard light that does not contain Raman excitation light. This makes it possible to prevent the influence of the stray light component caused by the Raman excitation light and accurately measure the spectrum of the intensity standard light reflected from the sample.
  • the intensity standard light generating unit may have an LED light source that generates light having the same wavelength as the Raman scattered light having the predetermined wavelength.
  • the LED light source has a wide wavelength band emission characteristic. Therefore, by using an LED light source, it is possible to obtain an intensity standard spectrum for Raman scattered light having a plurality of wavelengths of the substance in the sample. As a result, it is possible to correct an apparent change in the intensity of Raman scattered light having a plurality of wavelengths.
  • the wavelength of the intensity standard light generated by the LED light source is not limited to a wavelength longer than the wavelength of the Raman excitation light. That is, by using an LED light source having an emission band on the shorter wavelength side (anti-Stokes side) than the Raman excitation light, the apparent change in the intensity of the anti-Stokes Raman scattered light generated on the shorter wavelength side than the Raman excitation light. Can be corrected.
  • the present invention in the measurement of the resonance Raman scattered light of a sample, it is possible to accurately correct the apparent change in the intensity of the Raman scattered light due to the influence of absorption and scattering in the sample.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the other structural example of an intensity standard light generation part and illumination light switching part. It is a figure explaining the relationship between the light absorption spectrum of a sample, the intensity standard light generated by an LED light source, and the wavelength of Raman scattered light from a sample. It is a figure explaining the relationship between the light absorption characteristic of a sample in non-resonance Raman measurement and resonance Raman measurement, and the wavelength of illumination light, intensity standard light and Raman scattered light. It is a figure explaining the relationship between the light scattering characteristic of a sample in non-resonance Raman measurement and resonance Raman measurement, and the wavelength of illumination light, intensity standard light and Raman scattered light.
  • the Raman scattering measuring device 1 includes a light source 2, an intensity standard light generating unit 3, an illumination light switching unit 4, a Raman probe 5, a spectroscopic analysis unit 6, and the like.
  • a control unit 7, an intensity correction unit 8, and a storage unit 9 are provided.
  • the light source 2, the intensity standard light generation unit 3, the illumination light switching unit 4, the spectroscopic analysis unit 6, the control unit 7, the intensity correction unit 8, and the storage unit 9 are provided in the housing 10.
  • the Raman probe 5 is optically connected to the illumination light switching unit 4 and the spectroscopic analysis unit 6 via the connector 10a of the housing 10.
  • the light source 2 generates Raman excitation light that excites Raman scattering of substance B in sample A as illumination light.
  • the Raman excitation light is monochromatic light tuned to the light absorption wavelength band of the substance B. That is, the Raman scattering measuring device 1 measures the resonance Raman scattering of the substance B using the illumination light.
  • the intensity standard light generation unit 3 is arranged in the optical path of the illumination light from the light source 2, and generates the intensity standard light from the illumination light.
  • the intensity standard light is for correcting the intensity of Raman scattered light having a predetermined wavelength from the substance B excited by the Raman excitation light, and is an optical component having the same wavelength as the predetermined wavelength. At least include.
  • the intensity standard light may further contain an optical component having the same wavelength as the Raman excitation light.
  • the illumination light switching unit 4 selectively emits the illumination light and the intensity standard light to switch the light supplied to the Raman probe 5 via the connector 10a between the illumination light and the intensity standard light. ..
  • FIG. 2A and 2B show a configuration example of the intensity standard light generation unit 3 and the illumination light switching unit 4.
  • the intensity standard light generation unit 3 is provided in the illumination light switching unit 4.
  • the illumination light from the light source 2 is guided by the optical fiber 11, is formed into parallel light by the lens 12, and is incident on the intensity standard light generation unit 3.
  • the intensity standard light generating unit 3 has a light emitting body 3a and an opening 3b.
  • the light emitter 3a generates intensity standard light by photoexcitation by illumination light.
  • the opening 3b allows the illumination light to pass through as it is.
  • the illumination light switching unit 4 displaces the intensity standard light generation unit 3 between the position where the light emitting body 3a is arranged in the optical path of the illumination light and the position where the aperture 3b is arranged in the optical path of the illumination light. Therefore, the illumination light switching unit 4 has a drive unit (not shown) such as a motor for displacing the intensity standard light generation unit 3.
  • the intensity standard light is supplied to the Raman probe 5.
  • the aperture 3b is arranged in the optical path of the illumination light, only the illumination light, that is, the Raman excitation light is supplied to the Raman probe 5.
  • the intensity standard light generating unit 3 has a disk-shaped member 3c that can rotate around an axis parallel to the optical axis of the illumination light.
  • the light emitting body 3a and the opening 3b are held by the disk-shaped member 3c and are arranged in the circumferential direction around the axis.
  • the illumination light switching unit 4 selectively arranges the light emitting body 3a and the opening 3b in the optical path of the illumination light by rotating the disk-shaped member 3c, and switches between the intensity standard light and the illumination light.
  • An example of the light emitter 3a is a fluorescent material such as fluorescent glass containing a fluorescent substance that emits fluorescence as intensity standard light. Fluorescence may be photoluminescence light in which trace impurities contained in glass emit light as a color center.
  • the phosphor is excited by the illumination light to generate fluorescence containing the same wavelength as the Raman scattered light of a predetermined wavelength from the sample A. Since the phosphor has a broad emission spectrum, fluorescence having the same wavelength as the Raman scattered light having a plurality of wavelengths from the sample A can be generated as the intensity standard light. By using such intensity standard light, it is possible to correct the apparent change in the intensity of each of the Raman scattered lights of a plurality of wavelengths from the sample A.
  • the light emitter 3a is a Raman scattering body such as glass or plastic that generates Raman scattered light as intensity standard light.
  • the Raman scattering body is excited by the illumination light to generate Raman scattered light having the same wavelength as the Raman scattered light having a predetermined wavelength from the sample A.
  • the intensity of the Raman scattered light generated by the Raman scattering body is equivalent to the intensity of the Raman scattered light generated by the substance B in the sample A. Therefore, both the intensity standard spectrum and the Raman spectrum of sample A can be measured without switching the gain of the photodetector of the spectroscopic analyzer 6.
  • the Raman scatterer does not have luminescence deterioration due to fading, so that it can continue to generate intensity standard light having a stable intensity.
  • the Raman probe 5 includes an illumination optical fiber (not shown) that guides the illumination light and the intensity standard light from the illumination light switching unit 4, and a light receiving light that guides the Raman scattered light and the intensity standard light from the sample A. It has a fiber (not shown).
  • the Raman probe 5 guides the illumination light and the intensity standard light by the illumination optical fiber, and irradiates the sample A with the illumination light and the intensity standard light from the tip.
  • the illumination light excites the Raman scattering of the substance B in the sample A, and the Raman scattered light having a predetermined wavelength is emitted from the sample A.
  • the intensity standard light is reflected from the sample A as a diffuse reflected ray.
  • the Raman probe 5 receives the Raman scattered light from the substance B and the intensity standard light from the sample A at the tip, and guides the Raman scattered light and the intensity standard light by the light receiving optical fiber.
  • the spectroscopic analysis unit 6 receives the Raman scattered light and the intensity standard light from the sample A via the Raman probe 5 and the connector 10a, and has a Raman spectrum which is a spectrum of the Raman scattered light and an intensity which is a spectrum of the intensity standard light. Measure with the standard spectrum.
  • the intensity standard spectrum is the fluorescence spectrum of the phosphor.
  • the intensity standard spectrum is the Raman spectrum of the Raman scatterer.
  • the spectroscopic analysis unit 6 has a spectroscope and a photodetector such as a two-dimensional CCD image sensor.
  • the spectroscopic analysis unit 6 disperses the Raman scattered light into a spectrum by a spectroscope and detects the spectrum by an optical detector to acquire Raman spectrum data. Further, the spectroscopic analysis unit 6 acquires the data of the intensity standard spectrum by splitting the intensity standard light into a spectrum by a spectroscope and detecting the spectrum by a photodetector.
  • the data of the Raman spectrum and the intensity standard spectrum are stored in the storage unit 9.
  • the control unit 7 controls the timing of switching between the illumination light and the intensity standard light by the illumination light switching unit 4. Further, the control unit 7 controls the timing of measurement of the Raman spectrum and the intensity standard spectrum by the spectroscopic analysis unit 6. 3 and 4 show the control of the illumination light switching unit 4 and the spectroscopic analysis unit 6 by the control unit 7.
  • the control unit 7 switches the light supplied to the Raman probe 5 to the intensity standard light generated by the intensity standard light generation unit 3 by controlling the illumination light switching unit 4, whereby the intensity standard is obtained.
  • the sample A is irradiated with light (step S1).
  • the control unit 7 causes the spectroscopic analysis unit 6 to measure the intensity standard spectrum in synchronization with the switching to the intensity standard light (step S2).
  • the data of the intensity standard spectrum is transferred from the spectroscopic analysis unit 6 to the storage unit 9.
  • the control unit 7 switches the light supplied to the Raman probe 5 to the illumination light by controlling the illumination light switching unit 4, thereby irradiating the sample A with the illumination light (step). S3). Further, in the period t3, the control unit 7 causes the spectroscopic analysis unit 6 to measure the Raman spectrum in synchronization with the switching to the illumination light (step S4). In the period t4 following the period t3, the Raman spectrum data is transferred from the spectroscopic analysis unit 6 to the storage unit 9. The control unit 7 repeats steps S1 to S4 until the measurement of the resonance Raman scattering of the sample A is completed (step S5).
  • the control unit 7 has a processor, and the processor executes the above processing.
  • the storage unit 9 stores data of a true intensity standard spectrum acquired in advance.
  • the true intensity standard spectrum is a spectrum of intensity standard light that is unaffected by absorption and scattering by Sample A.
  • the intensity correction unit 8 reads out the data of the actually measured intensity standard spectrum and the actually measured Raman spectrum acquired by the spectroscopic analysis unit 6 and the data of the true intensity standard spectrum from the storage unit 9. Then, the intensity correction unit 8 corrects the intensity of the actually measured Raman spectrum using the actually measured intensity standard spectrum and the true intensity standard spectrum, and corrects the apparent change in intensity due to absorption and scattering in the sample A. Get the true Raman spectrum.
  • the intensity correction unit 8 calculates the true Raman spectrum Fsam ( ⁇ ) of the substance B in the sample A from the following equation (1).
  • Fsam ( ⁇ ) Osam ( ⁇ ) / Ost ( ⁇ ) ⁇ Gst ( ⁇ )...
  • Osam ( ⁇ ) is a Raman spectrum of substance B measured by the spectroscopic analysis unit 6.
  • Ost ( ⁇ ) is an intensity standard spectrum actually measured by the spectroscopic analysis unit 6.
  • Gst ( ⁇ ) is a true intensity standard spectrum without the effects of absorption and scattering by Sample A.
  • the intensity correction unit 8 has a processor, and the above processing is executed by the processor.
  • FIG. 5 illustrates the equation (1).
  • the intensity standard light has a broad spectrum
  • the intensity standard light contains a plurality of wavelengths which are the same as the Raman scattered light of the plurality of wavelengths of the substance B.
  • the wavelength ⁇ of the wavelength band in which the wavelength of the intensity standard light and the wavelength of the Raman scattered light overlap each other between the Raman scattered light from the substance B in the sample A and the intensity standard light from the sample A.
  • SCsam ( ⁇ ) is the attenuation rate of the intensity of Raman scattered light of substance B due to scattering in sample A.
  • SCst ( ⁇ ) is the attenuation rate of the intensity of the intensity standard light from the sample A due to the scattering in the sample A.
  • Asam ( ⁇ ) is the attenuation rate of the intensity of Raman scattered light of substance B due to absorption in sample A.
  • Ast ( ⁇ ) is the attenuation rate of the intensity of the intensity standard light from the sample A due to the absorption in the sample A.
  • the control unit 7 selectively supplies the intensity standard light and the illumination light from the illumination light switching unit 4 to the Raman probe 5.
  • the intensity standard light and the illumination light are selectively applied to the sample A from the tip of the Raman probe 5.
  • the intensity standard light diffusely reflected in the sample A and the Raman scattered light generated by the substance B in the sample A are selectively received by the Raman probe 5, and are selectively incident on the spectroscopic analysis unit 6 from the Raman probe 5. do.
  • the control unit 7 controls the spectroscopic analysis unit 6 in synchronization with the switching between the intensity standard light and the illumination light by the illumination light switching unit 4, and measures the intensity standard spectrum at the timing when the sample A is irradiated with the intensity standard light.
  • the spectroscopic analysis unit 6 is made to execute, and the spectroscopic analysis unit 6 is made to perform the measurement of the Raman spectrum at the timing when the sample A is irradiated with the illumination light.
  • the reflected intensity standard light is dispersed into a spectrum, and the intensity standard spectrum is acquired.
  • the Raman scattered light of the substance B is separated into a spectrum, and the Raman spectrum of the substance B is acquired.
  • the intensity correction unit 8 corrects the intensity of the Raman spectrum at a predetermined wavelength by using the intensity information of the intensity standard spectrum.
  • the light containing the light component having the same wavelength as the Raman scattered light having a predetermined wavelength from the substance B is intense. Used as standard light.
  • the attenuation rate of the intensity of standard light due to absorption and scattering in sample A Ast ( ⁇ ) ⁇ SCst ( ⁇ ) is the attenuation rate of the intensity of Raman scattered light due to absorption and scattering in sample A. It is equivalent to ( ⁇ ) ⁇ SCsam ( ⁇ ).
  • the attenuation factor Ast ( ⁇ ) ⁇ SCst ( ⁇ ) is obtained as the intensity ratio Ost ( ⁇ ) / Gst ( ⁇ ) between the true intensity standard spectrum and the actually measured intensity standard spectrum. Therefore, using the intensity of the measured intensity standard spectrum and the true intensity standard spectrum at a predetermined wavelength, the apparent change in the intensity of the Raman spectrum at a predetermined wavelength due to the influence of absorption and scattering in the sample A can be accurately changed. It can be corrected.
  • the intensity standard light generating unit 3 having the light emitting body 3a the intensity standard light can be generated easily and inexpensively by using a single light source 2 common to the illumination light, and the intensity standard light can be generated. No dedicated light source or light guide optical system is required. Further, according to the intensity standard light generation unit 3 and the illumination light switching unit 4 of FIGS. 2A and 2B, the intensity standard light and the illumination light can be switched at high speed by the rotation of the disk-shaped member 3c. In order to correct the intensity of Raman scattered light with high accuracy by using the intensity standard light, it is required that the irradiation positions of the illumination light and the intensity standard light on the sample A are the same as each other.
  • the Raman probe 5 When the Raman scattering is measured while aligning the Raman probe 5 held by the user with respect to the sample A, the Raman probe 5 may be displaced with respect to the sample A due to camera shake or the like during the measurement.
  • the intensity standard light and the illumination light By switching between the intensity standard light and the illumination light at high speed, it is possible to reduce the deviation of the irradiation position of the intensity standard light and the illumination light on the sample A due to camera shake, etc., and correct the apparent intensity change more accurately. be able to.
  • the intensity standard light generating unit 3 may have an optical filter 3d arranged after the light emitting body 3a.
  • the optical filter 3d removes the Raman excitation light that has passed through the light emitter 3a, and transmits the fluorescence or Raman scattered light that has a longer wavelength than the Raman excitation light and is generated by the light emitter 3a. According to this configuration, the spectrum of the intensity standard light from the sample A can be accurately measured without the influence of the stray light component due to the diffuse reflection of the Raman excitation light by the sample A.
  • the intensity standard light generation unit 3 is provided with the light source 3a that generates the intensity standard light, but instead, as shown in FIG. 6, the intensity standard light generation unit 3 is used. It may have an LED light source 3e.
  • the LED light source 3e generates intensity standard light having the same wavelength as the Raman scattered light having a predetermined wavelength of the substance B in the sample A.
  • the intensity standard light generated by the LED light source 3e is guided to the optical path of the illumination light by the combiner 13 arranged in the optical path of the illumination light and combined with the illumination light.
  • the illumination light switching unit 4 has a shutter 4a arranged between the LED light source 3e and the combiner 13.
  • the illumination light switching unit 4 switches the light supplied to the Raman probe 5 between the illumination light and the intensity standard light by opening and closing the shutter 4a according to the control by the control unit 7. That is, when the shutter 4a is closed, only the illumination light is supplied to the Raman probe 5, and when the shutter 4a is open, the intensity standard light is supplied to the Raman probe 5 together with the illumination light.
  • the LED light source 3e Since the LED light source 3e has a broad emission spectrum, it is possible to obtain an intensity standard spectrum having the same wavelength component with respect to Raman scattered light having a plurality of wavelengths from the sample A. Such an intensity standard spectrum can be used to correct the intensity of Raman scattered light of multiple wavelengths from sample A. Further, the emission intensity of the LED light source 3e can be easily adjusted. Therefore, by adjusting the intensity of the intensity standard light generated by the LED light source 3e to the same intensity as the intensity of the Raman scattered light of the sample A, the intensity standard spectrum and the Raman spectrum of the sample A can be adjusted to the gain of the light detector. It can be measured without switching.
  • the LED light source 3e it is possible to correct an apparent change in the intensity of not only the Stoke Raman scattered light but also the anti-Stoke Raman scattered light.
  • the wavelength of the intensity standard light generated by the phosphor or Raman scatterer is limited to a wavelength longer than the wavelength of the Raman excitation light. Therefore, in this case, the Raman scattered light that can be corrected by the intensity standard light is limited to the Stoke Raman scattered light generated on the longer wavelength side than the wavelength of the Raman excitation light.
  • the wavelength of the intensity standard light generated by the LED light source 3e is not limited to a wavelength longer than the wavelength of the Raman excitation light. That is, by using an LED light source that generates intensity standard light having an optical component having a wavelength shorter than the wavelength of the Raman excitation light as the LED light source 3e, anti-Stoke Slamant scattering generated on the shorter wavelength side than the Raman excitation light.
  • the apparent change in light intensity can be corrected.
  • the substance B in sample A is quantified based on the corrected anti-Stoke Raman scattered light intensity without being affected by the fluorescent noise of sample A. be able to.

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Abstract

ラマン散乱測定装置（１）は、サンプル（Ａ）中の物質（Ｂ）の光吸収波長帯に同調したラマン励起光を発生する光源（２）と、物質（Ｂ）からの所定の波長のラマン散乱光と同一の波長を有する強度標準光を発生する強度標準光発生部（３）と、ラマン励起光と強度標準光とを択一的に放射する照明光切替部（４）と、ラマン励起光および強度標準光をサンプル（Ａ）へ照射し、物質（Ｂ）からのラマン散乱光およびサンプル（Ａ）からの強度標準光を受光するラマンプローブ（５）と、受光されたラマン散乱光および強度標準光の分光によってラマンスペクトルおよび強度標準スペクトルを取得する分光分析部（６）と、強度標準スペクトルの強度情報に基づいてラマンスペクトルの強度を補正する強度補正部（７）と、を備える。

Description

ラマン散乱測定装置
　本発明は、ラマン散乱測定装置に関し、特に、ラマン散乱光の強度を補正する機能を有するラマン散乱測定装置に関するものである。
　サンプル中の物質のラマン散乱を測定するにおいて、サンプルからのラマン散乱光の強度は、様々な原因によって見かけ上変化する。様々な原因は、照明光の強度および導光光学系の光伝送効率の変動、サンプル表面での反射、サンプル中での光散乱、サンプル中での光吸収等を含む。サンプル中の物質のラマン散乱光の強度は、物質の濃度に比例する。上記のようにラマン散乱光の強度が見かけ上変化する場合、ラマン散乱光の強度に基づく濃度の定量に誤差が生じる。
　そこで、サンプルのラマン散乱光の強度の見かけの変化を補正する方法が考案されている（例えば、非特許文献１および特許文献１参照。）。従来技術では、照明系に強度標準物質を配置し、照明光を強度標準物質が発生する強度標準光と一緒にサンプルへ照射し、サンプルからの強度標準光を測定し、測定された強度標準光の強度に基づいてサンプルのラマン散乱光の強度を補正する。例えば、非特許文献１および特許文献１では、強度標準物質として、ラマンプローブの先端に配置されたダイヤモンドおよびサファイアをそれぞれ使用し、強度標準物質からのラマン散乱光を強度標準光として使用している。
　従来技術では、強度標準物質からのラマン散乱光を照明光と一緒にサンプルへ照射するので、サンプルからのラマン散乱光と強度標準物質からのラマン散乱光とが同時に検出される。このとき、サンプルからのラマン散乱光と強度標準物質からのラマン散乱光とが同一波長である場合、ラマン散乱光が相互に重畳してしまい、各ラマン散乱光の強度を正確に測定することができない。そのため、サンプルからのラマン散乱光と強度標準物質からのラマン散乱光の波長は、相互に異なっている。そして、各々が特異的なラマンピークを有する波長において各ラマン散乱光の強度を測定し、測定された強度を用いてサンプルのラマン散乱光の強度を補正する。
　図８Ａは、ラマン散乱測定における各光の波長およびサンプルによる各光の吸収係数を説明し、図８Ｂは、ラマン散乱測定における各光の波長およびサンプルによる各光の散乱係数を説明している。
　非共鳴ラマン測定では、ラマン散乱を励起する照明光として、サンプル中の物質の吸収波長から離れた波長λｅｘの光が使用される。非共鳴ラマン測定の場合、強度標準光の波長λｓｔにおける吸収係数Ａｓｔは、サンプルのラマン散乱光の波長λｓａにおける吸収係数Ａｓａと略等しい。また、非共鳴ラマン測定において、通常、照明光の波長λｅｘは近赤外波長であり、近赤外波長ではサンプルの散乱係数の波長依存性は小さい。したがって、強度標準光の波長λｓｔがサンプルのラマン散乱光の波長λｓａから離れていたとしても、強度標準光の波長λｓｔにおける吸収係数Ａｓｔおよび散乱係数ＳＣｓｔは、サンプルのラマン散乱光の波長λｓａにおける吸収係数Ａｓａおよび散乱係数ＳＣｓａと略等しい。そのため、強度標準光の波長λｓｔにおける吸収係数Ａｓｔおよび散乱係数ＳＣｓｔに基づいて、サンプルのラマン散乱光の強度を補正することができる。
X.　Zheng、外５名、"Self-Referencing　Raman　Probes　for　Quantitative　Analysis"、Applied　Spectroscopy、2001年4月1日、Vol.　55、Num.　4、pp.382-388
米国特許出願公開第２０１４／２６８１２９号明細書
　図８Ａおよび図８Ｂに示されるように、共鳴ラマン測定では、ラマン散乱を励起する照明光として、サンプル中の物質の吸収波長帯に同調した光が使用される。そのため、共鳴ラマン測定の場合、従来技術とは異なり、強度標準光の波長λｓｔにおける吸収係数Ａｓｔおよび散乱係数ＳＣｓｔを用いて、サンプルでの吸収および散乱による見かけのラマン散乱光の強度の変化を補正すると、補正誤差が発生するという問題がある。
　補正誤差が発生する第１の理由は次の通りである。
　強度標準物質が発生するラマン散乱光の波長λｓｔは、サンプルからのラマン散乱光の波長λｓａから離調している。例えば、強度標準物質がサファイアである場合、サファイアのラマンピーク波長λｓｔとサンプルの所定ラマンピーク波長λｓａは、一般的な緑色光または青色光励起による共鳴ラマン測定において、２０ｎｍ程度離れている。
　共鳴ラマン測定では、照明光の波長λｅｘをサンプルの光吸収波長帯に同調させる。このとき、サンプルからのラマン散乱光の波長λｓａは、サンプルの光吸収係数が波長に対して急激に変動する吸収波長帯の裾部に位置する。この場合、強度標準光の波長λｓｔでの吸収係数Ａｓｔは、サンプルの所定ラマンピーク波長λｓａでの吸収係数Ａｓａとは大きく異なる。また、サンプルの吸収係数の波長特性は、観察点でのサンプルの状態に依存して変化するので、各波長における吸収量の比Ａｓｔ／Ａｓａは一定でない。したがって、強度標準光の波長λｓｔでの吸収係数Ａｓｔに基づいてサンプルの吸収によるラマン散乱光の見かけの強度変化を補正すると、誤差が生じる。
　補正誤差が発生する第２の理由は、次の通りである。
　サンプルの散乱係数は波長に依存し、サンプルが生体組織である場合、散乱係数の波長依存性は、近赤外波長では小さく、可視波長では大きい。共鳴ラマン測定では、一般に、サンプルの散乱係数の変化が大きい可視波長の光が使用される。したがって、例えば、青色光励起による共鳴ラマン測定の場合、強度標準光の波長λｓｔでの散乱係数ＳＣｓｔは、サンプルのラマン散乱光の波長λｓａでの散乱係数ＳＣｓａとは異なる。
　サンプルでの光散乱によるラマン散乱光の見かけの減少量はサンプルの散乱係数に依存する。共鳴ラマン測定の場合、強度標準光の波長λｓｔでの散乱係数ＳＣｓｔが、サンプルのラマン散乱光の波長λｓａでの散乱係数ＳＣｓａとは異なるので、散乱係数ＳＣｓｔに基づいて、サンプルのラマン散乱光の見かけの減少量を算出することができない。また、散乱係数ＳＣｓａ，ＳＣｓｔは観察点でのサンプル状態に依存して変化するので、各波長における散乱係数の比ＳＣｓｔ／ＳＣｓａは一定でない。したがって、強度標準光の波長λｓｔでの散乱係数ＳＣｓｔに基づいてサンプルの光散乱によるラマン散乱光の見かけの強度変化を補正すると、誤差が生じる。
　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、サンプルの共鳴ラマン散乱光の測定において、サンプルでの吸収および散乱の影響によるラマン散乱光の強度の見かけの変化を精度良く補正することができるラマン散乱測定装置を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
　本発明の一態様は、サンプル中の物質の光吸収波長帯に同調したラマン励起光を発生する光源と、強度標準光を発生し、該強度標準光が、前記ラマン励起光によって励起される前記物質からの所定の波長のラマン散乱光と同一の波長を有する、強度標準光発生部と、前記ラマン励起光と前記強度標準光とを択一的に放射する照明光切替部と、該照明光切替部から択一的に放射される前記ラマン励起光および前記強度標準光を前記サンプルへ照射し、かつ、前記物質からの前記ラマン散乱光および前記サンプルから拡散反射される前記強度標準光を受光するラマンプローブと、該ラマンプローブを経由して前記ラマン散乱光および前記強度標準光を受光し、前記ラマン散乱光を分光することによってラマンスペクトルを取得すると共に前記強度標準光を分光することによって強度標準スペクトルを取得する分光分析部と、前記強度標準スペクトルの強度情報に基づいて、前記ラマンスペクトルの強度を補正する強度補正部と、を備えるラマン散乱測定装置である。
　本態様によれば、サンプル中の物質の光吸収波長帯に同調したラマン励起光を使用して、サンプル中の物質の共鳴ラマン散乱が測定される。すなわち、光源が発生したラマン励起光がラマンプローブを経由してサンプル中の物質に照射される。物質が発生したラマン散乱光は、ラマンプローブを経由して分光分析部に入射し、分光分析部によって、ラマン散乱光のスペクトルであるラマンスペクトルが取得される。
　また、ラマンプローブに供給される光が照明光切替部によって切り替えられることによって、強度標準光発生部が発生した強度標準光が、ラマン励起光とは異なるタイミングでサンプルに照射される。サンプルにおいて拡散反射された強度標準光は、ラマンプローブを経由して分光分析部に入射し、分光分析部によって強度標準光のスペクトルである強度標準スペクトルが取得される。
　この場合に、強度標準光は、物質の所定の波長のラマン散乱光と同一の波長を有する。すなわち、強度標準光に対するサンプルの吸収係数および散乱係数は、所定の波長のラマン散乱光に対するサンプルの吸収係数および散乱係数とそれぞれ等しい。したがって、強度標準スペクトルの強度から、サンプルでの吸収および散乱の影響による所定の波長のラマン散乱光の減衰量を精度良く見積もることができる。これにより、強度補正部によって、強度標準スペクトルの強度に基づき、サンプルでの吸収および散乱の影響による所定の波長のラマン散乱光の強度の見かけの変化を精度良く補正することができる。
　上記態様において、前記強度標準光発生部が、発光体と開口とを有し、前記発光体が、前記ラマン励起光による光励起によって前記強度標準光を発生し、前記開口が、前記ラマン励起光をそのまま通過させ、前記照明光切替部は、前記発光体が前記光源からの前記ラマン励起光の光路中に配置される位置と、前記開口が前記光路中に配置される位置との間で前記強度標準光発生部を変位させてもよい。
　この構成によれば、ラマン励起光の光路中に発光体を配置するだけで、簡便かつ安価に強度標準光を発生することができ、強度標準光の専用の光源および導光光学系の用意が不要である。また、強度標準光とラマン励起光とを高速に切り替ることができ、これにより、強度標準光とラマン励起光のサンプル上での照射位置のずれの低減を、簡便かつ安価に実現することができる。
　上記態様において、前記発光体が、前記強度標準光として蛍光を発生する蛍光体であってもよい。
　蛍光体は広波長帯域の発光特性を有する。したがって、蛍光体を用いることによって、サンプル中の物質の複数の波長のラマン散乱光に対して強度標準スペクトルを取得することができる。これにより、複数の波長のラマン散乱光の強度の見かけの変化を補正することができる。
　上記態様において、前記発光体が、前記強度標準光としてラマン散乱光を発生するラマン散乱体であってもよい。
　ラマン散乱体が発生する強度標準光としてのラマン散乱光の強度は、サンプル中の物質のラマン散乱光の強度と同等である。したがって、強度標準スペクトルとサンプルのラマンスペクトルの両方を、分光分析部の光検出器のゲインを切り替えることなく、測定することができる。さらに、蛍光体とは異なり、ラマン散乱体は、退色による発光劣化が無く、強度の安定した強度標準光を発生し続けることができる。
　上記態様において、前記強度標準光発生部が、前記発光体を透過した前記ラマン励起光を除去するフィルタを有していてもよい。
　この構成によれば、ラマン励起光を含まない強度標準光がサンプルに照射される。これにより、ラマン励起光に起因する迷光成分の影響を防ぎ、サンプルから反射された強度標準光のスペクトルを精度良く測定することができる。
　上記態様において、前記強度標準光発生部が、前記所定の波長のラマン散乱光と同一の波長を有する光を発生するＬＥＤ光源を有していてもよい。
　ＬＥＤ光源は広波長帯域の発光特性を有する。したがって、ＬＥＤ光源を用いることによって、サンプル中の物質の複数の波長のラマン散乱光に対して強度標準スペクトルを取得することができる。これにより、複数の波長のラマン散乱光の強度の見かけの変化を補正することができる。
　また、発光体を使用してラマン励起光による光励起によって強度標準光を発生させる場合とは異なり、ＬＥＤ光源が発生する強度標準光の波長は、ラマン励起光の波長よりも長い波長に限定されない。すなわち、ラマン励起光よりも短波長側（アンチストークス側）に発光帯域を有するＬＥＤ光源を使用することによって、ラマン励起光よりも短波長側に発生するアンチストークスラマン散乱光の強度の見かけの変化を補正することができる。
　本発明によれば、サンプルの共鳴ラマン散乱光の測定において、サンプルでの吸収および散乱の影響によるラマン散乱光の強度の見かけの変化を精度良く補正することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係るラマン散乱測定装置の全体構成図である。 強度標準光発生部および照明光切替部の一構成例を示す図である。 図２Ａの強度標準光発生部の一構成例を示す図である。 図２Ａの強度標準光発生部の他の構成例を示す図である。 ラマン散乱測定装置の動作を示すフローチャートである。 ラマン散乱測定装置の動作を示すタイミングチャートである。 サンプルでの吸収および散乱による、ラマンスペクトルおよび強度標準スペクトルの強度の見かけの変化を説明する図である。 強度標準光発生部および照明光切替部の他の構成例を示す図である。 サンプルの光吸収スペクトルと、ＬＥＤ光源が発生する強度標準光およびサンプルからのラマン散乱光の波長との関係を説明する図である。 非共鳴ラマン測定および共鳴ラマン測定における、サンプルの光吸収特性と、照明光、強度標準光およびラマン散乱光の波長との関係を説明する図である。 非共鳴ラマン測定および共鳴ラマン測定における、サンプルの光散乱特性と、照明光、強度標準光およびラマン散乱光の波長との関係を説明する図である。
　以下に、本発明の一実施形態に係るラマン散乱測定装置１について図面を参照して説明する。
　本実施形態に係るラマン散乱測定装置１は、図１に示されるように、光源２と、強度標準光発生部３と、照明光切替部４と、ラマンプローブ５と、分光分析部６と、制御部７と、強度補正部８と、記憶部９とを備える。光源２、強度標準光発生部３、照明光切替部４、分光分析部６、制御部７、強度補正部８および記憶部９は、筐体１０内に設けられている。ラマンプローブ５は、筐体１０のコネクタ１０ａを経由して、照明光切替部４および分光分析部６と光学的に接続されている。
　光源２は、照明光として、サンプルＡ中の物質Ｂのラマン散乱を励起するラマン励起光を発生する。ラマン励起光は、物質Ｂの光吸収波長帯に同調した単色光である。すなわち、ラマン散乱測定装置１は、照明光を使用して物質Ｂの共鳴ラマン散乱を測定する。
　強度標準光発生部３は、光源２からの照明光の光路中に配置され、照明光から強度標準光を発生する。後述するように、強度標準光は、ラマン励起光によって励起される物質Ｂからの所定の波長のラマン散乱光の強度を補正するためのものであり、前記所定の波長と同一の波長の光成分を少なくとも含む。強度標準光は、ラマン励起光の波長と同一の波長の光成分をさらに含んでいてもよい。
　照明光切替部４は、照明光と強度標準光とを択一的に放射することによって、コネクタ１０ａを経由してラマンプローブ５に供給される光を照明光と強度標準光との間で切り替える。
　図２Ａおよび図２Ｂは、強度標準光発生部３および照明光切替部４の一構成例を示している。図２Ａの例において、強度標準光発生部３は、照明光切替部４内に設けられている。
　光源２からの照明光は、光ファイバ１１によって導光され、レンズ１２によって平行光に形成され、強度標準光発生部３に入射する。
　強度標準光発生部３は、図２Ｂに示されるように、発光体３ａと、開口３ｂとを有する。発光体３ａは、照明光による光励起によって強度標準光を発生する。開口３ｂは、照明光をそのまま通過させる。照明光切替部４は、発光体３ａが照明光の光路中に配置される位置と開口３ｂが照明光の光路中に配置される位置との間で、強度標準光発生部３を変位させる。したがって、照明光切替部４は、強度標準光発生部３を変位させるためのモータのような駆動部（図示略）を有する。発光体３ａが照明光の光路中に配置されているとき、強度標準光がラマンプローブ５に供給される。一方、開口３ｂが照明光の光路中に配置されているとき、照明光、すなわちラマン励起光のみがラマンプローブ５に供給される。
　図２Ｂの例において、強度標準光発生部３は、照明光の光軸と平行な軸線回りに回転可能な円板状の部材３ｃを有する。発光体３ａおよび開口３ｂは、円板状の部材３ｃに保持され、軸線回りの周方向に配列している。照明光切替部４は、円板状の部材３ｃを回転させることによって、発光体３ａおよび開口３ｂを照明光の光路中に択一的に配置し、強度標準光と照明光とを切り替える。
　発光体３ａの一例は、強度標準光として蛍光を発生する、蛍光物質を含む蛍光ガラス等の蛍光体である。蛍光は、ガラス中に含まれる微量不純物が色中心として発光するフォトルミネッセンス光であってもよい。蛍光体は、照明光によって励起され、サンプルＡからの所定の波長のラマン散乱光と同一の波長を含む蛍光を発生する。蛍光体は、ブロードな発光スペクトルを有するため、サンプルＡからの複数の波長のラマン散乱光と同一の波長を有する蛍光を強度標準光として発生することができる。このような強度標準光を使用することによって、サンプルＡからの複数の波長のラマン散乱光の各々の強度の見かけの変化を補正することができる。
　発光体３ａの他の例は、強度標準光としてラマン散乱光を発生する、ガラスまたはプラスチック等のラマン散乱体である。ラマン散乱体は、照明光によって励起され、サンプルＡからの所定の波長のラマン散乱光と同一の波長を含むラマン散乱光を発生する。ラマン散乱体が発生するラマン散乱光の強度は、サンプルＡ中の物質Ｂが発生するラマン散乱光の強度と同等である。したがって、分光分析部６の光検出器のゲインを切り替えることなく、強度標準スペクトルおよびサンプルＡのラマンスペクトルの両方を測定することができる。さらに、蛍光体とは異なり、ラマン散乱体は、退色による発光劣化が無いので、強度の安定した強度標準光を発生し続けることができる。
　ラマンプローブ５は、照明光切替部４からの照明光および強度標準光を導光する照明用光ファイバ（図示略）と、サンプルＡからのラマン散乱光および強度標準光を導光する受光用光ファイバ（図示略）とを有する。ラマンプローブ５は、照明用光ファイバによって照明光および強度標準光を導光し、照明光および強度標準光を先端からサンプルＡへ照射する。照明光は、サンプルＡ中の物質Ｂのラマン散乱を励起し、所定の波長のラマン散乱光がサンプルＡから放射される。強度標準光は、サンプルＡにおいて散乱された結果、拡散反射光線としてサンプルＡから反射される。ラマンプローブ５は、物質Ｂからのラマン散乱光およびサンプルＡからの強度標準光を先端において受光し、ラマン散乱光および強度標準光を受光用光ファイバによって導光する。
　分光分析部６は、ラマンプローブ５およびコネクタ１０ａを経由してサンプルＡからのラマン散乱光および強度標準光を受光し、ラマン散乱光のスペクトルであるラマンスペクトルと、強度標準光のスペクトルである強度標準スペクトルとを測定する。発光体３ａが蛍光体である場合、強度標準スペクトルは蛍光体の蛍光スペクトルである。発光体３ａがラマン散乱体である場合、強度標準スペクトルはラマン散乱体のラマンスペクトルである。
　例えば、分光分析部６は、分光器と、２次元ＣＣＤイメージセンサのような光検出器とを有する。分光分析部６は、ラマン散乱光を分光器によってスペクトルに分光し、スペクトルを光検出器によって検出することで、ラマンスペクトルのデータを取得する。また、分光分析部６は、強度標準光を分光器によってスペクトルに分光し、スペクトルを光検出器によって検出することで、強度標準スペクトルのデータを取得する。ラマンスペクトルおよび強度標準スペクトルのデータは、記憶部９に記憶される。
　制御部７は、照明光切替部４による照明光および強度標準光の切り替えのタイミングを制御する。また、制御部７は、分光分析部６によるラマンスペクトルおよび強度標準スペクトルの測定のタイミングを制御する。
　図３および図４は、制御部７による照明光切替部４および分光分析部６の制御を示している。
　期間ｔ１において、制御部７は、照明光切替部４を制御することによって、ラマンプローブ５に供給される光を強度標準光発生部３によって発生された強度標準光に切り替え、それにより、強度標準光をサンプルＡに照射させる（ステップＳ１）。また、期間ｔ１において、制御部７は、強度標準光への切り替えに同期して、分光分析部６に強度標準スペクトルの測定を実行させる（ステップＳ２）。
　期間ｔ１に続く期間ｔ２において、強度標準スペクトルのデータが分光分析部６から記憶部９に転送される。
　次に、期間ｔ３において、制御部７は、照明光切替部４を制御することによって、ラマンプローブ５に供給される光を照明光に切り替え、それにより、照明光をサンプルＡに照射させる（ステップＳ３）。また、期間ｔ３において、制御部７は、照明光への切り替えに同期して、分光分析部６にラマンスペクトルの測定を実行させる（ステップＳ４）。
　期間ｔ３に続く期間ｔ４において、ラマンスペクトルのデータが分光分析部６から記憶部９に転送される。
　制御部７は、サンプルＡの共鳴ラマン散乱の測定が終了するまでステップＳ１からＳ４を繰り返す（ステップＳ５）。
　制御部７はプロセッサを有し、上記処理をプロセッサによって実行する。
　記憶部９には、予め取得された真の強度標準スペクトルのデータが記憶されている。真の強度標準スペクトルは、サンプルＡによる吸収および散乱の影響を受けない、強度標準光のスペクトルである。
　強度補正部８は、分光分析部６によって取得された実測の強度標準スペクトルおよび実測のラマンスペクトルのデータと、真の強度標準スペクトルのデータとを記憶部９から読み出す。そして、強度補正部８は、実測の強度標準スペクトルと真の強度標準スペクトルとを用いて実測のラマンスペクトルの強度を補正し、サンプルＡでの吸収および散乱による強度の見かけの変化が補正された真のラマンスペクトルを得る。
　具体的には、強度補正部８は、下式（１）から、サンプルＡ中の物質Ｂの真のラマンスペクトルＦｓａｍ（λ）を算出する。
　Ｆｓａｍ（λ）＝Ｏｓａｍ（λ）／Ｏｓｔ（λ）　×　Ｇｓｔ（λ）　　…（１）
　Ｏｓａｍ（λ）は、分光分析部６によって実測された物質Ｂのラマンスペクトルである。Ｏｓｔ（λ）は、分光分析部６によって実測された強度標準スペクトルである。Ｇｓｔ（λ）は、サンプルＡによる吸収および散乱の影響が無い、真の強度標準スペクトルである。
　強度補正部８はプロセッサを有し、上記処理をプロセッサによって実行する。
　図５は、式（１）を説明している。図５の例において、強度標準光はブロードなスペクトルを有し、強度標準光は、物質Ｂの複数の波長のラマン散乱光と同一の複数の波長を含む。強度標準光の波長とラマン散乱光の波長とが相互に重複する波長帯域の波長λにおいて、サンプルＡ中の物質Ｂからのラマン散乱光と、サンプルＡからの強度標準光との間には、以下の関係がある。
　ＳＣｓａｍ（λ）＝ＳＣｓｔ（λ）
　Ａｓａｍ（λ）＝Ａｓｔ（λ）
　ＳＣｓａｍ（λ）は、サンプルＡでの散乱による、物質Ｂのラマン散乱光の強度の減衰率である。ＳＣｓｔ（λ）は、サンプルＡでの散乱による、サンプルＡからの強度標準光の強度の減衰率である。Ａｓａｍ（λ）は、サンプルＡでの吸収による、物質Ｂのラマン散乱光の強度の減衰率である。Ａｓｔ（λ）は、サンプルＡでの吸収による、サンプルＡからの強度標準光の強度の減衰率である。
　実測のラマンスペクトルＯｓａｍ（λ）と真のラマンスペクトルＦｓａｍ（λ）との関係は、減衰率Ａｓａｍ（λ），ＳＣｓａｍ（λ）を用いて下記のように表される。
　Ｏｓａｍ（λ）＝Ｆｓａｍ（λ）×Ａｓａｍ（λ）×ＳＣｓａｍ（λ）
　実測の強度標準スペクトルＯｓｔ（λ）と真の強度標準スペクトルＧｓｔ（λ）との関係は、減衰率Ａｓａｍ（λ），ＳＣｓｔ（λ）を用いて下記のように表される。
　Ｏｓｔ（λ）＝Ｇｓｔ(λ)×Ａｓａｍ（λ）×ＳＣｓｔ（λ）
　実測のラマンスペクトルＯｓａｍ（λ）を実測の強度標準スペクトルＯｓｔ（λ）で割ると、下式が得られる。
　Ｏｓａｍ（λ）／Ｏｓｔ（λ）＝Ｆｓａｍ（λ）／Ｇｓｔ（λ）
　上式から、式（１）が導かれる。
　次に、ラマン散乱測定装置１の作用について説明する。
　制御部７は、照明光切替部４を制御することによって、強度標準光および照明光を択一的に照明光切替部４からラマンプローブ５に供給させる。
　強度標準光および照明光は、ラマンプローブ５の先端からサンプルＡへ択一的に照射される。サンプルＡにおいて拡散反射された強度標準光およびサンプルＡ中の物質Ｂが発生したラマン散乱光は、択一的にラマンプローブ５によって受光され、ラマンプローブ５から分光分析部６に択一的に入射する。
　制御部７は、照明光切替部４による強度標準光と照明光との切り替えと同期して分光分析部６を制御し、サンプルＡに強度標準光が照射されるタイミングで強度標準スペクトルの測定を分光分析部６に実行させ、サンプルＡに照明光が照射されるタイミングでラマンスペクトルの測定を分光分析部６に実行させる。分光分析部６において、反射された強度標準光はスペクトルに分光され、強度標準スペクトルが取得される。また、分光分析部６において、物質Ｂのラマン散乱光はスペクトルに分光され、物質Ｂのラマンスペクトルが取得される。
　次に、強度補正部８において、強度標準スペクトルの強度の情報を用いて、ラマンスペクトルの所定の波長での強度が補正される。
　このように、本実施形態によれば、サンプルＡ中の物質Ｂからの共鳴ラマン散乱光を測定するにおいて、物質Ｂからの所定の波長のラマン散乱光と同一波長の光成分を含む光が強度標準光として使用される。所定の波長λにおいて、サンプルＡでの吸収および散乱による強度標準光の強度の減衰率Ａｓｔ（λ）×ＳＣｓｔ（λ）は、サンプルＡでの吸収および散乱によるラマン散乱光の強度の減衰率Ａｓａｍ（λ）×ＳＣｓａｍ（λ）と同等である。減衰率Ａｓｔ（λ）×ＳＣｓｔ（λ）は、真の強度標準スペクトルと実測の強度標準スペクトルとの強度比Ｏｓｔ（λ）／Ｇｓｔ（λ）として得られる。したがって、実測の強度標準スペクトルおよび真の強度標準スペクトルの所定の波長での強度を用いて、サンプルＡでの吸収および散乱の影響による所定の波長でのラマンスペクトルの強度の見かけの変化を精度良く補正することができる。
　また、発光体３ａを有する強度標準光発生部３によれば、照明光と共通の単一の光源２を使用して、簡易かつ安価に強度標準光を発生することができ、強度標準光の専用の光源および導光光学系が不要である。
　また、図２Ａおよび図２Ｂの強度標準光発生部３および照明光切替部４によれば、円板状の部材３ｃの回転によって、強度標準光と照明光とを高速で切り替えることができる。強度標準光を使用してラマン散乱光の強度を高精度に補正するためには、照明光と強度標準光のサンプルＡへの照射位置が相互に同一であることが要求される。ユーザが手に持ったラマンプローブ５をサンプルＡに対して位置合わせしながらラマン散乱を測定する場合、測定の最中に、手振れ等によるラマンプローブ５のサンプルＡに対する位置ずれが生じ得る。強度標準光と照明光との高速の切り替えによって、手振れ等による強度標準光と照明光のサンプルＡ上での照射位置のずれを低減することができ、より精度良く見かけ上の強度変化を補正することができる。
　本実施形態において、図２Ｃに示されるように、強度標準光発生部３が、発光体３ａの後段に配置された光学フィルタ３ｄを有していてもよい。光学フィルタ３ｄは、発光体３ａを透過したラマン励起光を除去し、ラマン励起光よりも長波長であり発光体３ａが発生する蛍光またはラマン散乱光を透過させる。
　この構成によれば、ラマン励起光がサンプルＡで拡散反射されることによる迷光成分の影響無く、サンプルＡからの強度標準光のスペクトルを精度良く測定することができる。
　本実施形態において、強度標準光発生部３が、強度標準光を発生する発光体３ａを有することとしたが、これに代えて、図６に示されるように、強度標準光発生部３が、ＬＥＤ光源３ｅを有していてもよい。
　ＬＥＤ光源３ｅは、サンプルＡ中の物質Ｂの所定の波長のラマン散乱光と同一の波長を有する強度標準光を発生させる。ＬＥＤ光源３ｅが発生した強度標準光は、照明光の光路中に配置された合波器１３によって、照明光の光路へ導光され照明光と合波される。
　照明光切替部４は、ＬＥＤ光源３ｅと合波器１３との間に配置されたシャッタ４ａを有する。照明光切替部４は、制御部７による制御に従ってシャッタ４ａを開閉することによって、ラマンプローブ５に供給される光を照明光と強度標準光との間で切り替える。すなわち、シャッタ４ａが閉じているとき、照明光のみがラマンプローブ５に供給され、シャッタ４ａが開いているとき、強度標準光が照明光と一緒にラマンプローブ５に供給される。
　ＬＥＤ光源３ｅはブロードな発光スペクトルを有するため、サンプルＡからの複数の波長のラマン散乱光に対して、同一の波長成分を有する強度標準スペクトルを取得することができる。このような強度標準スペクトルを使用して、サンプルＡからの複数の波長のラマン散乱光の強度を補正することができる。
　また、ＬＥＤ光源３ｅの発光強度は容易に調整可能である。したがって、ＬＥＤ光源３ｅが発生する強度標準光の強度を、サンプルＡのラマン散乱光の強度と同等の強度に調整することによって、強度標準スペクトルおよびサンプルＡのラマンスペクトルを、光検出器のゲインの切り替え無しで測定することができる。
　さらに、ＬＥＤ光源３ｅを使用することによって、ストークスラマン散乱光のみならずアンチストークスラマン散乱光の強度の見かけの変化を補正することができる。
　蛍光体またはラマン散乱体が発生する強度標準光の波長は、ラマン励起光の波長よりも長波長に限られる。したがって、この場合、強度標準光によって補正することができるラマン散乱光は、ラマン励起光の波長よりも長波長側に発生するストークスラマン散乱光に限られる。
　これに対し、図７に示されるように、ＬＥＤ光源３ｅが発生する強度標準光の波長は、ラマン励起光の波長よりも長波長に限られない。すなわち、ＬＥＤ光源３ｅとして、ラマン励起光の波長よりも短波長の光成分を有する強度標準光を発生するＬＥＤ光源を使用することによって、ラマン励起光よりも短波長側に発生するアンチストークスラマン散乱光の強度の見かけの変化を補正することができる。アンチストークスラマン散乱光強度の見かけの変化を補正することによって、サンプルＡの蛍光ノイズの影響を受けることなく、補正されたアンチストークスラマン散乱光の強度に基づいてサンプルＡ中の物質Ｂを定量することができる。
１　ラマン散乱測定装置
２　光源
３　強度標準光発生部
３ａ　発光体
３ｂ　開口
３ｃ　円板状の部材
３ｄ　光学フィルタ
３ｅ　ＬＥＤ光源
４　照明光切替部
５　ラマンプローブ
６　分光分析部
７　制御部
８　強度補正部
９　記憶部
１０　筐体
１０ａ　コネクタ
Ａ　サンプル
Ｂ　物質

Claims (6)

  1. 　サンプル中の物質の光吸収波長帯に同調したラマン励起光を発生する光源と、
    　強度標準光を発生し、該強度標準光が、前記ラマン励起光によって励起される前記物質からの所定の波長のラマン散乱光と同一の波長を有する、強度標準光発生部と、
    　前記ラマン励起光と前記強度標準光とを択一的に放射する照明光切替部と、
    　該照明光切替部から択一的に放射される前記ラマン励起光および前記強度標準光を前記サンプルへ照射し、かつ、前記物質からの前記ラマン散乱光および前記サンプルから拡散反射される前記強度標準光を受光するラマンプローブと、
    　該ラマンプローブを経由して前記ラマン散乱光および前記強度標準光を受光し、前記ラマン散乱光を分光することによってラマンスペクトルを取得すると共に前記強度標準光を分光することによって強度標準スペクトルを取得する分光分析部と、
    　前記強度標準スペクトルの強度情報に基づいて、前記ラマンスペクトルの強度を補正する強度補正部と、を備えるラマン散乱測定装置。
  2. 　前記強度標準光発生部が、発光体と開口とを有し、前記発光体が、前記ラマン励起光による光励起によって前記強度標準光を発生し、前記開口が、前記ラマン励起光をそのまま通過させ、
    　前記照明光切替部は、前記発光体が前記光源からの前記ラマン励起光の光路中に配置される位置と、前記開口が前記光路中に配置される位置との間で前記強度標準光発生部を変位させる、請求項１に記載のラマン散乱測定装置。
  3. 　前記発光体が、前記強度標準光として蛍光を発生する蛍光体である、請求項２に記載のラマン散乱測定装置。
  4. 　前記発光体が、前記強度標準光としてラマン散乱光を発生するラマン散乱体である、請求項２に記載のラマン散乱測定装置。
  5. 　前記強度標準光発生部が、前記発光体を透過した前記ラマン励起光を除去するフィルタを有する、請求項３または請求項４に記載のラマン散乱測定装置。
  6. 　前記強度標準光発生部が、前記所定の波長のラマン散乱光と同一の波長を有する光を発生するＬＥＤ光源を有する、請求項１に記載のラマン散乱測定装置。
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