DE10117723A1 - Probenträger, insbesondere für biochemische Reaktionen - Google Patents
Probenträger, insbesondere für biochemische ReaktionenInfo
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Abstract
Es wird ein Probenträger (10, 20) mit einer Vielzahl von Reservoiren (13) beschrieben, der aus einer Aufnahmeplatte (10) und einer Einsatzplatte (20) besteht, wobei die Aufnahmeplatte (10) zumindest teilweise aus einem optisch transparenten Material besteht und eine Vielzahl von Ausnehmungen zur Bildung der Reservoire (13) aufweist und die Einsatzplatte (20) eine Vielzahl von Vorsprüngen (21) aufweist, die jeweils eine Membran (22) oder ein Plattenelement tragen und im zusammengesetzten Zustand des Trägers so in die Vertiefungen (13) der Aufnahmeplatte (10) hineinragen, dass die Membran (22) oder das Plattenelement jeweils in der Vertiefung (13) mit Abstand von deren Boden- und Seitenwänden angeordnet ist, wobei die Aufnahmeplatte (10) durch einen Verbund aus einer ebenen Lochplatte (11) und einer ebenen Bodenplatte (12) gebildet ist, die die Lochplatte (11) von einer Seite her verschließt und aus einem Material mit einer derartigen optischen Qualität und Planarität besteht, dass ein störungsfreier Durchtritt des Strahlengangs einer konfokal-optischen Messeinrichtung ermöglicht wird.
Description
Die Erfindung betrifft einen Probenträger mit einer Vielzahl
von Kompartimenten, die zur Aufnahme von Lösungen oder Suspen
sionen biologischer und/oder synthetischer Proben und zur
Durchführung von Reaktionen, Messungen, Manipulationen oder
dergleichen an den Proben eingerichtet sind. Die Erfindung be
trifft insbesondere einen Zellkulturen-Träger mit Kultivie
rungskompartimenten, die zur Aufnahme und Kultivierung biolo
gischer Zellen in flüssigen Medien eingerichtet sind. Die Er
findung betrifft auch Mess- und Manipulationsverfahren, die an
Proben und/oder dem flüssigen Medium in den Kompartimenten
durchgeführt werden.
In der modernen Wirkstoffforschung werden zunehmend Hochdurch
satztests (High-Throughput-Screening, HTS) verwendet, um die
Wechselwirkung von verschiedenen Testsubstanzen mit Targetmo
lekülen, beispielsweise einem Enzym, zu untersuchen. Beim HTS
werden eine Vielzahl von Testsubstanzen in getrennte Probenre
servoire eines Probenträgers eingebracht. Es erfolgt der Zu
satz der Komponenten der Untersuchung, z. B. des Enzymtests,
gegebenenfalls eine Inkubationsphase und schließlich die mess
technische Erfassung der Wechselwirkung der Testsubstanzen mit
dem Enzym. Es erfolgt beispielsweise eine Fluoreszenzmessung
in sämtlichen Probenreservoiren. Mit Blick auf hohe Durchsatz
raten und einen geringen Substanzverbrauch besteht bei her
kömmlichen HTS-Probenträgern ein Interesse, möglichst viele
Probenreservoire mit möglichst geringen Volumina auf einem ge
meinsamen Träger anzuordnen.
In der unveröffentlichten deutschen Patentanmeldung
DE 199 48 087 wird ein Probenträger beschrieben, der durch ei
nen Verbund aus einer strukturierten Silikonmatte und einer
Trägerplatte gebildet wird. Durch die Strukturierung der Sili
konmatte werden die Probenreservoire geformt. Der herkömmliche
Probenträger ist zwar für HTS-Anwendungen geeignet und in Be
zug auf die Miniaturisierbarkeit und Handhabbarkeit vorteil
haft. Es bestehen aber Nachteile in Bezug auf die einge
schränkte Anzahl durchführbarer Testverfahren (Testassays). Es
bestehen insbesondere starke Beschränkungen bei der Kultivie
rung von Zellen und der Umsetzung von Testassays mit Zellen.
Aus EP 590 513 und EP 239 697 sind Einrichtungen zur Zellkul
tivierung bekannt, deren Aufbau aus einer Grundplatte 10' mit
einer Vielzahl von Reservoiren 11' und Zellkultureinsätzen 20'
schematisch in Fig. 10 gezeigt ist. Die Zellkultureinsätze 20'
sind mit seitlichen Rändern 21' auf der Oberfläche der Grund
platte 10' eingehängt. Sie besitzen am Boden jeweils eine
Membran, auf der adhärent wachsende Zellen kultivierbar sind.
Die Grundplatte 10' besteht aus einem transparenten Kunst
stoffmaterial, durch das im Bereich der Böden 12' optische
Transmissionsmessungen durchgeführt werden.
Die dargestellte Kultivierungseinrichtung besitzt die folgen
den Nachteile. Die Reservoire 11' besitzen charakteristische
Volumina im ml-Bereich. Es ergibt sich ein insbesondere für
HTS-Anwendungen unannehmbar hoher Substanzverbrauch. Die Mini
aturisierbarkeit der Einrichtung ist jedoch beschränkt. Die
Zellkultureinsätze besitzen eine spezielle Geometrie, um eine
ausreichende Versorgung der Zellen mit Nährstoffen zu gewähr
leisten. Diese Geometrie erlaubt nicht eine skalierte Umset
zung in kleinere Dimensionen. Eine direkte Miniaturisierung
der herkömmlichen Einrichtungen würde diese z. B. für Trans
portstudien untauglich machen, da der Abstand zwischen der Au
ßenwand der Einsätze und der Innenwand der Reservoire so ge
ring wäre, dass ein Transfer von Flüssigkeiten zwischen be
nachbarten Reservoiren durch Kapillarkräfte auftreten würde.
Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die herkömmlichen
Kultivierungseinrichtungen nur für einfache optische Transmis
sionsmessungen durch die transparente Grundplatte 10' geeignet
sind. Die Grundplatte 10' aus Spritzguss-Kunststoff ergibt
Probleme sowohl in Bezug auf die optische Qualität als auch in
Bezug auf die Planarität. Optische konfokale Messverfahren,
wie z. B. FCS-Verfahren (Fluoreszenz-Korrelations-
Spektroskopie), insbesondere in Verbindung mit HTS, sind an
den herkömmlichen Kultivierungseinrichtungen nicht durchführ
bar.
Wenn bei einem Test im Überstand der kultivierten Zellen ge
messen werden soll, so muss die Membran, auf der die Kultivie
rung der Zellen erfolgt, relativ zum Boden der Grundplatte ex
akt positioniert sein. Nur wenn alle Membranen mit der glei
chen Genauigkeit positioniert sind, werden die Konzentrations
verteilungen z. B. der von den Zellen in die Reservoire sekre
tierten Produkte miteinander vergleichbar. Mit den oben be
schriebenen, aus Kunststoff hergestellten Kultivierungsein
richtungen ist die exakte Positionierung der Membranen nicht
zu gewährleisten. Eine Miniaturisierung wird dadurch weiter
beschränkt. Bei einer Miniaturisierung würden durch das Dimen
sionsverhältnis des Materials der Trägerplatten zu den Reser
voiren mechanische Verwerfungen auftreten, die zu einer unein
heitlichen Geometrie der Reservoire führen würden.
Eine weitere Kultivierungseinrichtung (teilweise in schemati
scher Schnittansicht in Fig. 11 gezeigt) ist aus EP 902 084
bekannt. 24 Reservoire 11' sind ähnlich wie bei einer Mikroti
terplatte in einer Grundplatte 10' aus Kunststoff angeordnet.
Es ist eine Einsatzplatte 20' vorgesehen, die aus einer Viel
zahl von lateral miteinander verbundenen Einsätzen besteht. Am
Boden jedes Einsatzes ist eine Membran 22' zur Kultivierung
der Zellen angeordnet. Dieser Aufbau ist zwar in Bezug auf die
Gleichförmigkeit der Membranpositionierung günstiger als die
oben beschriebenen Einrichtungen mit einzelnen Einsätzen. Al
lerdings besitzt er auch Nachteile hinsichtlich der Miniaturi
sierbarkeit und der Anwendung optisch-konfokaler Messverfah
ren. Eine ähnliche Anordnung mit Reservoiren, die zu einer ge
meinsamen Einsatzplatte verbunden sind, ist auch aus
US 4 828 386 bekannt.
Die Beschränkungen bei der Durchführung herkömmlicher Testver
fahren gelten auch bei der Untersuchung synthetischer Proben.
Analog zur Erfassung der Wechselwirkung biologischer Zellen
mit Wirkstoffen kann eine biochemische Aufgabenstellung bei
spielsweise darin bestehen, die Wechselwirkung von syntheti
schen Oberflächenmodifizierten Partikeln (Beads) mit Wirk
stoffen zu untersuchen.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, einen verbesserten Proben
träger anzugeben, mit dem die Nachteile herkömmlicher Träger
überwunden werden und der insbesondere einen erweiterten An
wendungsbereich in Bezug auf die am Träger durchführbaren
Messverfahren besitzt und einen verringerten Substanzverbrauch
ermöglicht. Der neue Probenträger soll insbesondere zur Durch
führung von HTS-Verfahren geeignet sein. Die Aufgabe der Er
findung ist es auch, neue Anwendungen von Messverfahren mit
Probenträgern bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch einen Probenträger mit den Merkmalen
gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen
und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen
Patentansprüchen.
Die Grundidee der Erfindung ist es, eine gattungsgemäße Pro
benträgereinrichtung mit einer Aufnahmeplatte (Grundplatte)
und einer Einsatzplatte, die eine Vielzahl von Probeneinsät
zen, insbesondere Kultivierungseinsätzen, aufweist, dahinge
hend weiterzuentwickeln, dass die Aufnahmeplatte als Verbund
aus einer Lochplatte und einer Bodenplatte gebildet ist, wobei
die Bodenplatte zum im Wesentlichen störungsfreien Durchtritt
des Strahlengangs einer konfokal-optischen Messeinrichtung
eingerichtet ist. Die Aufnahmeplatte besteht somit zumindest
teilweise aus einem transparenten Material. Der Aufbau der
Aufnahmeplatte aus zwei Komponenten besitzt mehrere Vorteile,
die sich im Rahmen der genannten Aufgabe in Bezug sowohl auf
die Miniaturisierbarkeit als auch auf die Durchführung erwei
terter Messverfahren auswirken. Die Lochplatte kann mit hoher
Genauigkeit hergestellt werden. Die völlig gleichartig her
stellbaren Löcher der Lochplatte bilden die Reservoire (Kom
partimente) in der Aufnahmeplatte. Die Bodenplatte kann unab
hängig von der Lochplatte mit der erforderlichen Planarität
und optischen Qualität hergestellt werden. Das Merkmal des
störungsfreien Durchtritts des Strahlengangs der konfokal-
optischen Messeinrichtung charakterisiert die optische Quali
tät der Bodenplatte, die vorzugsweise aus Glas hergestellt
ist. Das Material der Bodenplatte erlaubt einen im Wesentli
chen störungsfreien Durchtritt der Strahlung, wenn das Materi
al dafür geeignet ist, dass durch die Bodenplatte hindurch
konfokal-optische Messungen durchgeführt werden.
Die Probeneinsätze sind als Vorsprünge der Einsatzplatte ge
bildet, die im zusammengesetzten Zustand der Aufnahme- und
Einsatzplatten in die Reservoire der Lochplatte hineinragen,
so dass die an den freien Enden der Vorsprünge angeordneten
Membranen (oder Plattenelemente) mit einem vorbestimmten Ab
stand von der inneren Oberfläche der Bodenplatte angeordnet
sind. Die Probeneinsätze und die Dicke der Lochplatte sind
vorzugsweise so bemessen, dass der Fokus einer konfokal
optischen Messeinrichtung auf einer Membran oder in ihrer un
mittelbaren Umgebung gebildet werden kann. Der Abstand der
Membran von der Außenseite der Bodenplatte ist vorzugsweise
mindestens so groß wie der Fokalabstand der Messeinrichtung,
d. h. vorzugsweise im Bereich von 100 µm bis 2.5 mm, insbesondere
100 µm bis 1 mm. Falls auf der zur Bodenplatte abgewand
ten Seite der Membran gemessen werden soll, kann auch ein
kleinerer Abstand der Membran von der Bodenplatte vorgesehen
sein. Zur Erzielung dieser geometrischen Verhältnisse wird die
Bodenplatte mit einer geringen Dicke ausgeführt, die vorzugs
weise kleiner als 500 µm, besonders bevorzugt kleiner als
200 µm ist.
Der erfindungsgemäße Probenträger ist für die Handhabung von
biologischen und/oder synthetischen Proben geeignet. Besonders
vorteilhaft ist die Anwendung des Probenträgers bei Aufnahme,
Kultivierung, Vermessung und Manipulierung biologischer Zel
len. Der Probenträger wird dann auch als Zellkulturen-Träger
bezeichnet. Mit diesem wird erstmalig die Möglichkeit geschaf
fen, in einer Kultivierungseinrichtung direkt an der Membran,
die auch als Kultivierungsmembran bezeichnet wird, oder im
Überstand Konfokalmessungen und insbesondere FCS-Messungen
durchzuführen.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind durch
die Bereitstellung von gegebenenfalls durchbrochenen, konus-
oder streifenförmigen Vorsprüngen der Einsatzplatte, an denen
jeweils die Membran angeordnet ist, Abstandshaltern und/oder
Elektrodeneinrichtungen an den Kultivierungseinsätzen gekenn
zeichnet. Diese Merkmale ermöglichen besondere Anwendungen des
Probenträgers, insbesondere als Zellkulturen-Träger, die im
Einzelnen unten erläutert sind.
Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Der Probenträger
ist hochgradig miniaturisierbar, ohne dass die Trennung der
Proben zwischen den Reservoiren oder die Wirkstoffzufuhr zu
den Proben, insbesondere Nährstoffversorgung der Zellen, ein
geschränkt wird. Es sind konfokale optische Messungen sowohl
an den Ober-(Innen-) oder Unter-(Außen-)Seiten der Membranen
sowie anwendungsabhängig in definiertem Abstand von den Membranen
möglich. Im Träger sind Proben, insbesondere Zellen,
einfach und störungsfrei kultivierbar. Die Zahl der pro Memb
ran zu kultivierenden Zellen kann von rund 106 und höher, die
bei herkömmlichen Systemen, z. B. gemäß Fig. 10 erforderlich
sind, erfindungsgemäß auf rund 100 bis 5000 vermindert werden.
Es ergeben sich Vorteile in Bezug auf die für einen Test benö
tigte Anzahl von Proben, z. B. von Zellen, sowie den Verbrauch
an erforderlichen Assay- und Testsubstanzen. Wenn die Einsätze
so bemessen sind, dass die Volumina ober- und unterhalb der
Membranen im Wesentlichen gleich sind, ergeben sich z. B. für
Transportstudien, bei denen der Transport einer Testsubstanz
durch eine auf der Membran vorliegende konfluente Zellschicht
verfolgt wird, Vorteile in Bezug auf den Substanzverbrauch und
die Konzentration des in die Aufnahmeplatte transportierten
Stoffes. Die Miniaturisierung und die Ähnlichkeit der Volumina
ober- und unterhalb der Membran ist des Weiteren für Sekreti
onsassays mit biologischen Zellen besonders vorteilhaft. Bei
diesen kann eine geringe Menge der Testsubstanz als Stimulus
in die Kultivierungseinsätze auf die dort kultivierten Zellen
appliziert werden. Die von den Zellen sekretierten Produkte
werden in das vorgelegte Flüssigkeitsvolumen der Aufnahmeplat
te abgegeben. Durch das geringe Volumen in der Aufnahmeplatte
ist die Konzentration der sekretierten Stoffe schon nach kur
zer Inkubationszeit ausreichend, um ein mit den hochempfindli
chen optisch-konfokalen Messverfahren detektierbares Signal zu
verursachen.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich
aus der Beschreibung der beigefügten Zeichnungen. Es zeigen:
Fig. 1, 2 schematische Perspektivansichten von Auf
nahme- und Einsatzplatten erfindungsgemäßer
Probenträger;
Fig. 3 eine schematische Illustration der Proben
handhabung und Messung an erfindungsgemä
ßen Probenträger;
Fig. 4 bis 9 schematische Schnittansichten verschiede
ner Ausführungsformen erfindungsgemäßer
Probenträger; und
Fig. 10, 11 Illustrationen herkömmlicher Kultivie
rungseinrichtungen (Stand der Technik).
Die Erfindung wird im folgenden am Beispiel eines ebenen Trä
gers beschrieben, bei dem 16 Probenreservoire in geraden Rei
hen und Spalten angeordnet sind. Die Umsetzung der Erfindung
ist jedoch nicht auf diese Anzahl von Reservoiren und diese
Geometrie beschränkt, sondern auch mit wesentlich mehr Reser
voiren mit beliebigen geometrischen Anordnungen und Formen
möglich. Die Reservoire werden vorzugsweise entsprechend der
Probengeometrie von Mikro- oder Nanotiterplatten angeordnet,
besonders bevorzugt sind Anordnungen aus 8.12 = 96 Reservoi
ren mit einem Reservoirabstand von 9 mm oder Anordnungen aus
12.32 = 384 Reservoiren mit einem Reservoirabstand von 4.5 mm
vorgesehen.
Des Weiteren wird im Folgenden die Erfindung unter Bezug auf
die Anwendung des erfindungsgemäßen Probenträgers als Zellkul
turen-Träger mit Kultivierungsmembranen beschrieben. Die An
wendung des Probenträgers ist jedoch nicht auf biologische
Proben beschränkt. In entsprechender Weise können auch synthe
tische Beads untersucht werden, von denen beispielsweise Mole
küle abgespalten werden, deren Transport durch die Membran
oder ein Plattenelement oder auch durch eine Zellschicht beo
bachtet wird.
Die Fig. 1 und 2 illustrieren als Teile erfindungsgemäßer
Probenträger in Perspektivansicht die Aufnahmeplatte 10 (Fig.
1) und die Einsatzplatte 20 (Fig. 2). Die Aufnahmeplatte 10
besteht aus einer Lochplatte 11 und einer Bodenplatte 12. In
der Lochplatte 11 sind durchgehende Ausnehmungen oder Löcher
13 in Matrixanordnung ausgebildet. Die Ausnehmungen 13 bilden
im zusammengesetzten Probenträger (siehe z. B. Fig. 3) die
Reservoire oder Kompartimente, in denen die Kultivierungsein
sätze der Einsatzplatte 20 aufgenommen werden. Jede Ausnehmung
ist mit einer seitlichen Ausbuchtung 13a versehen, die beim
Einführen eines Kultivierungsmediums oder von für das Testsys
tem erforderlichen Assay-Komponenten als Führung für eine Pi
petier- oder Dispensiervorrichtung dient.
Entsprechend zu den seitlichen Ausbuchtungen 13a der Aufnahme
platte 10 können in der oberen Fläche der Einsatzplatte 20 je
weils am Rand der Vorsprünge 21 Durchtrittsöffnungen vorgese
hen sein. Die Durchtrittsöffnungen (nicht dargestellt) sind so
positioniert, dass im zusammengesetzten Zustand des Probenträ
gers eine durchgehende, vertikale oder leicht geneigte Verbin
dungsöffnung zum Inneren der Reservoire gebildet wird. Diese
Öffnung ermöglicht das Einsetzen der Pipettier- oder Dispen
siervorrichtung in die Reservoire im zusammengesetzten Zustand
des Probenträgers und/oder die Einführung von Sensoren oder
Elektroden. Die Ausbuchtungen 13a mit den (in Fig. 2 nicht
illustrierten) Durchtrittsöffnungen können zur Anbringung wei
terer Messeinrichtungen, insbesondere nach Durchführung einer
Kultivierung, vorgesehen sein. In die Ausbuchtungen 13a können
beispielsweise Kapillaren zur Durchführung einer Kapillare
lektrophorese oder Elektroden zur Durchführung von Wider
standsmessungen eingesetzt werden.
Aus Widerstandsmessungen, die erfindungsgemäß erstmalig an mi
niaturisierten Systemen durchgeführt werden, kann auf den Kon
fluenzgrad einer Zellschicht rückgeschlossen werden. Ein relativ
hoher Widerstand an der Membran bedeutet einen hohen Kon
fluenzgrad der Zellschicht. Die Ausbuchtungen 13a sind vor
zugsweise sämtlich jeweils auf einer Seite der Ausnehmungen 13
angeordnet. Falls die Verwendung einer Pipette, einer Kapilla
re oder dergleichen nicht vorgesehen ist, kann auf die Aus
buchtungen 13a verzichtet werden.
Die Lochplatte 11 besteht vorzugsweise aus Kunststoff, z. B.
Polycarbonat. Das Kunststoffmaterial kann anwendungsabhängig
zumindest teilweise transparent oder nicht-transparent (licht-
undurchlässig) sein. Die Lochplatte 11 kann mit einer Metall
rahmung (nicht dargestellt) ausgestattet sein, die der Stabi
lisierung und Erhöhung der Planarität der Lochplatte und der
Positionierung einerseits der Bodenplatte 12 und andererseits
der Einsatzplatte 20 dient. Die Dicke der Lochplatte beträgt
beispielsweise 1 bis 5 mm. Alternativ kann die Lochplatte 11
auch aus anderen Kunststoffen, z. B. Polypropylen oder Po
lystyrol bestehen.
Alternativ können die Lochplatte 11 und/oder die Einsatzplatte
20 mehrkomponentig aufgebaut sein. Im Kunststoffmaterial ist
ein plattenförmiger Kern mit den jeweiligen Ausnehmungen vor
gesehen. Der Kern besteht aus einem relativ zum Kunststoff hö
her schmelzenden Material, vorzugsweise Metall. Durch den
mehrkomponentigen Aufbau kann die Planarität der Teile erhöht
werden. Außerdem werden Verformungen des Probenträgers bei
Wärmebehandlungen (z. B. Thermostatierungen) vermieden.
Die Bodenplatte 12 besteht vorzugsweise aus Glas. Es wird bei
spielsweise ein Deckglas mit einer Dicke im Bereich von 150 µm
bis 200 µm, z. B. 170 µm, und einer Dickentoleranz von weniger
als ±20%, vorzugsweise weniger als ±10%, verwendet. Die
Bodenplatte 12 ist aus Übersichtlichkeitsgründen mit einer ü
berhöhten Dicke eingezeichnet. Die Verwendung von Glas als Bo
denplatte besitzt den zusätzlichen Vorteil, dass in der Glasplatte
ausgeprägte Lichtreflexe gebildet werden können, die
zur Autofokus-Einstellung des Mikroskops verwendet werden kön
nen.
Die Loch- und Bodenplatten 11, 12 werden miteinander adhärent
verbunden. Dies erfolgt beispielsweise unter Verwendung eines
inerten Klebstoffs oder einer inhärenten Haftfähigkeit der
Lochplatte 11.
Die Einsatzplatte 20 bildet ein zur Aufnahmeplatte 10 komple
mentäres Gegenstück mit einer Vielzahl von Vorsprüngen 21, die
entsprechend der Matrixanordnung der Ausnehmungen 13 ausge
richtet sind. In Fig. 2 ist die im zusammengesetzten Zustand
des Probenträgers zur Aufnahmeplatte 10 hin weisende Seite der
Einsatzplatte 20 dargestellt. Jeder Vorsprung 21 trägt an sei
nem freien Enden eine Membran 22. Die Membran ist eben (siehe
Fig. 4 bis 7, 9) oder gekrümmt (siehe Fig. 8) ausgebildet
und im Wesentlichen parallel zu den Ebenen der Aufnahme- und
Einsatzplatten 10, 20 ausgerichtet. Unter im wesentlichen pa
ralleler Ausrichtung wird hier verstanden, dass die Ebene der
Membran anwendungsabhängig parallel oder auch gegenüber der
Bodenplatte geringfügig verkippt oder eine in sich gekrümmte
Membran relativ zur Bodenplatte so angeordnet ist, dass eine
horizontale oder parallele oder geringfügig verkippte Orien
tierung des gekrümmten Bauteils gegeben ist. Die Einsatzplatte
20 besitzt einen äußeren Rahmen 23, der der Ausrichtung rela
tiv zur Aufnahmeplatte 10 und der Handhabung der Einsatzplatte
20 dient. Die Einsatzplatte 20 besteht wie die Lochplatte 11
aus einem Kunststoffmaterial, sie wird im Spritzgussverfahren
hergestellt.
In Fig. 3 ist ein erfindungsgemäßer Probenträger beispielhaft
im Einsatz gezeigt. Der Probenträger liegt in einem Messplatz
30 auf einer Halterung 31, die vorzugsweise in allen Raumrich
tungen verfahrbar ist und die Bodenseite des Trägers frei
lässt. Mit einer Flüssigkeit-Fördereinrichtung 32 (z. B. Pi
pette, Dispenser oder dergleichen) werden die Reservoire 13
des Probenträgers mit einem oder verschiedenen Kultivierungs
medien oder mit Assaykomponenten bzw. Testsubstanzen be
schickt. Die Flüssigkeitsfördereinrichtung 32 kann auch zur
Beschickung der Reservoire der Aufnahmeplatte durch die oben
beschriebenen Durchtrittsöffnungen und Ausbuchtungen 13a die
nen. Es ist ein Konfokalmikroskop 33 vorgesehen, das so ange
ordnet ist, dass sein Strahlengang durch die Bodenplatte 12 in
das Innere der Reservoire 13 gerichtet ist. Schließlich kann
noch eine weitere Beobachtungseinrichtung 34 für optische
Transmissions- oder Fluoreszenzmessungen vorgesehen sein, die
wie dargestellt von der Oberseite oder alternativ auch von der
Bodenseite her angeordnet sein kann. Am Messplatz 30 kann fer
ner eine Einrichtung zur optischen Manipulation von Partikeln
in den Reservoiren mit optischen Käfigen (Laser tweezer, opti
sche Pinzette) vorgesehen sein.
Für Konfokalmessungen wie z. B. FCS-Messungen werden vorzugs
weise die folgenden Messanordnungen verwendet. In einer Grund
form ist das Mikroskop 33 mit einem Immersionsobjektiv mit ho
her numerischer Apertur (stark fokussierend, lichtstark) aus
gestattet. Es erfolgt die Messung unter Verwendung von Immer
sionsflüssigkeit von unten durch die Bodenplatte 12. Der Ar
beitsabstand zwischen dem Objektiv und dem Fokus ist vorzugs
weise kleiner als 1 mm, typischerweise im Bereich von 300 bis
400 µm. Von der Innenseite der Bodenplatte 12 bis zum Fokus
ergibt sich ein freier Abstand von rund 150 µm. Dies ermög
licht vorteilhafterweise eine direkte Messung an Zellen, die
auf der Unterseite der Membran nahe der Bodenplatte angeordnet
sind, oder in einem definierten Abstand zwischen Zellschicht
und Bodenplatte. Fig. 6 zeigt zwei Beispiele von Einsätzen,
bei denen die Zellen auf der Unterseite der Membran angeordnet
sind. Die Kultivierung auf der Unterseite erfolgt vorzugsweise
vor der eigentlichen Probenbehandlung, indem die Einsatzplatte
20 in umgekehrter Ausrichtung als Kultivierungsträger verwen
det wird. In einer abgewandelten Anordnung erfolgt die Messung
von oben ebenfalls mit einem Immersionsobjektiv, wobei die
Einsatzplatte 20 mit einem Deckglas abgedeckt ist. In diesem
Fall sind besondere Vorkehrungen zur hochgradig parallelen
Ausrichtung des Deckglases relativ zur Ebene des Trägers zu
treffen. Schließlich kann die Messung alternativ auch von oben
ohne ein Deckglas und ohne Immersionsflüssigkeit erfolgen.
Weitere Messvorgänge und Testansätze (Assays) werden beispiel
haft unten erläutert.
In den Fig. 4 bis 9 sind verschiedene Ausführungsformen er
findungsgemäßer Probenträger illustriert, die sich insbesonde
re in Bezug auf die Gestaltung der Einsatzplatten unterschei
den. Einander entsprechende Komponenten sind in den Figuren
mit identischen Bezugszeichen versehen.
Fig. 4 illustriert eine Grundform des Trägers mit der Aufnah
meplatte 10, bestehend aus der Lochplatte 11 und der Boden
platte 12, und der Einsatzplatte 20 mit den Vorsprüngen 21.
Die zylinderförmigen Ausnehmungen 13, 13b, c der Lochplatte
11 bilden die Reservoire, die mit einem Kultivierungsmedium
oder einem Testmedium gefüllt sind (der Flüssigkeitsspiegel
ist gestrichelt eingezeichnet). Die Vorsprünge 21 besitzen die
Form eines Konus oder Kegelstumpfes mit einem sich zum freien
Ende der Vorsprünge verjüngenden Querschnitt. An den Enden der
Vorsprünge 21 ist jeweils eine Membran 22 angeordnet. Die
Membranen bestehen aus den an sich für die Herstellung von po
rösen Membranen bekannten Materialien, wie z. B. Polycarbonat,
und sind an den Enden der Vorsprüngen 21 angeschweißt. Der
Durchmesser der Membranen liegt vorzugsweise im Bereich von
10 µm bis 1 mm. Die Membranen besitzen vorzugsweise Porengrö
ßen im Bereich von 0,3 µm bis 20 µm. Die Zellen 40 können auf
einer oder beiden Seiten der Membranen 22 kultiviert sein. Anwendungsabhängig
können die Membranen auch durch FCS-taugliche
Plattenelemente ersetzt werden.
Bei der in Fig. 5 gezeigten Ausführungsform der Erfindung
sind zwischen der Einsatzplatte 20 und der Lochplatte 11 Ab
standshalter 24 vorgesehen. Die Abstandshalter 24 sind als in
tegraler Bestandteil der Einsatzplatte 20 auf deren Unterseite
oder alternativ auch der Oberseite der Lochplatte 11 ange
bracht. Sie besitzen eine Dicke von rund 100 bis 1000 µm, z. B.
200 µm. Die Aufgabe der Abstandshalter 24 ist es, ein Wan
dern des Testmediums zwischen den Reservoiren unter Wirkung
von Kapillarkräften zu unterbinden. Die Abstandshalter 24 wer
den bevorzugt insbesondere bei stark miniaturisierten Ausfüh
rungsformen der Erfindung angebracht. Eine weitere Funktion
der Abstandshalter 24 kann darin bestehen, den Abstand der
Membranen 22 von der Innenseite der Bodenplatte 12 und damit
den Arbeitsabstand des Konfokalmikroskops einzustellen. Der
Abstand der Unterseite der Membranen 22 (oder entsprechender
Plattenelemente) von der Außenseite der Bodenplatte 12 liegt
z. B. im Bereich von 0.1 bis 2.5 mm und beträgt vorzugsweise
weniger als 1 mm.
Die Abstandshalter können auch der vereinfachten Kultivierung
von Zellen in der Einsatzplatte dienen. Hierzu kann die
Einsatzplatte nach dem Animpfen mit Zellen in einem Behälter
mit Medium positioniert werden. Die Abstandshalter stellen si
cher, dass die Membranen nicht auf dem Boden des Behälters
aufliegen und die Nährstoffe des Mediums ungehindert auch
durch die Membranen auf die Unterseite der Vorsprünge diffun
dieren können.
Ein Kriechen des Mediums zwischen den Reservoiren wird auch
bei der Gestaltung gemäß Fig. 6 vermieden. Die Lochplatte 11
ist so geformt, dass an den von der Bodenplatte 12 abgewandten
Seiten der Ausnehmungen 13 kegelförmige Ausschnitte 14 gebildet
werden. Die Neigung der Ausschnitte 14 relativ zur Boden
platte 12 ist geringer als die Neigung der konusförmigen Vor
sprünge 21. Des Weiteren ist der senkrechte Abstand der Aufla
gepunkte 15 der Vorsprünge auf der Lochplatte 11 von der
Grundfläche 16 der Einsatzplatte 20 größer als der senkrechte
Abstand der Auflagepunkte 15 von der Oberseite der Lochplatte
11. Dadurch wird wie mit den Abstandshaltern 24 zwischen der
Lochplatte 11 und der Einsatzplatte 20 eine Lücke gebildet,
die ein Wandern des Kultivierungsmediums verhindert.
Die Vorsprünge 21 können, wie in Fig. 7 gezeigt ist, an ihren
konusförmig geneigten Seitenflächen Durchtrittsöffnungen 25
aufweisen, die die Flüssigkeitsbewegung in den Reservoiren 13
und insbesondere die Überführung von sekretierten Stoffen von
der Innen- zur Außenseite der Vorsprünge 21 fördern. In diesem
Fall können die porösen Membranen 22 auch durch undurchlässige
Plattenelemente ersetzt werden. Anstelle der Membranen können
beispielsweise Glasplatten geringer Dicke vorgesehen sein, die
wie die Bodenplatte 12 Konfokalmessungen, wie z. B. FCS-
Messungen ermöglichen. Die Durchtrittsöffnungen 25 können ab
weichend von der Darstellung auch im größeren Abstand von der
Membran in einem oberen Bereich der Vorsprünge 21 vorgesehen
sein. Die Durchtrittsöffnungen 25 können auch der Durchführung
von Pipettenspitzen, Elektroden oder dergleichen dienen.
Auch die in Fig. 8 dargestellte Ausführungsform ermöglicht
einen Transport von sekretierten Stoffen auf die Unterseite
der hier gekrümmt ausgeführten Membranen 26, die entsprechend
durch undurchlässige sphärisch gekrümmte Plattenelemente er
setzt sein können. Die sphärisch gekrümmten Membranen oder
Plattenelemente sind parallel zur Bodenplatte ausgerichtet.
Dies bedeutet, dass die gekrümmten Elemente eine im Wesentli
chen horizontal ausgerichtete Aufnahme bilden. Bei dieser Ges
taltung sind die Vorsprünge 21 als von der Grundfläche 16 der
Einsatzplatte 20 in die Ausnehmungen 13 ragende Streifen ge
bildet, an deren Enden die Elemente 26 angebracht sind.
Zur Kombination von optischen mit elektrischen Messungen kann
erfindungsgemäß vorgesehen sein, dass einzelne oder mehrere
Ausnehmungen 13 der Lochplatte 11 und/oder einzelne oder meh
rere Vorsprünge 21 mit Elektrodeneinrichtungen 50 ausgestattet
sind (siehe Fig. 9). Die Elektrodeneinrichtungen 50 umfassen
insbesondere streifenförmige Mikroelektroden 51, die zur Be
aufschlagung mit Manipulations- und/oder Messspannungen mit
einer nicht dargestellten Steuereinrichtung verbunden sind.
Die Durchführung elektrischer Messungen an Zellen, Zellbe
standteilen oder Makromolekülen ist an sich aus der Mikrosys
temtechnik bekannt und wird daher hier im Einzelnen nicht be
schrieben. Die Mikroelektroden 51 bestehen aus Metall oder
Halbleitern. Es können auch Mikroelektroden 51 aus transparen
ten Schichtmaterialien (z. B. ITO) vorgesehen sein.
Im Folgenden werden Testverfahren (Assays) genannt, die zwar
an sich aus dem Stand der Technik bekannt sind, mit besonderen
Vorteilen jedoch mit dem erfindungsgemäßen Probenträger imple
mentiert werden können.
Zur Untersuchung des Transports von Wirkstoffen durch eine
Zellschicht (z. B. Epithel- oder Endothelzellen) wird eine Mo
noschicht der Zellen auf der Unter- oder Oberseite der Membran
22 erzeugt und der Wirkstoff in die obere Kammer 13b (siehe
Fig. 4) gegeben. Zum Nachweis des Wirkstoffs in der unteren
Kammer 13c wird ein biologisches Assaysystem (z. B. Antikör
per, ein spezifisches Enzym oder dergleichen) in das Kultivie
rungsmedium gegeben und dessen charakteristische Fluoreszenz
selektiv und mit hoher Empfindlichkeit mit dem FCS-Verfahren
detektiert. Bei dieser Anwendung zeigt sich ein wichtiger Vorteil
der Erfindung. Mit dem FCS-tauglichen Probenträger können
erstmalig Kinetiken des Wirkstofftransports durch Zelischich
ten aufgenommen und ausgewertet werden, da die Messung direkt
im Zellkulturen-Träger erfolgt.
Gegenstand von Transmigrations-Assays ist die Untersuchung des
Transports von Zellen durch Zellschichten (z. B. von Leukozy
ten durch Endothelzellen) und seiner Abhängigkeit von zusätz
lichen Wirksubstanzen. Ziel der Tests ist beispielsweise die
Suche nach Wirksubstanzen, die den Durchtritt der Zellen durch
die Zellschichten unterbinden, was beispielsweise bei Entzün
dungsprozessen von Bedeutung ist. Für diesen Assay werden vor
zugsweise Membranen mit Membranporen verwendet, deren Durch
messer größer als 2 µm, z. B. 3 µm, ist. Auf der Membranen
(mit Bezugszeichen 40 in Fig. 4) wird eine Zellschicht kulti
viert. In die obere Kammer 13b der Ausnehmung 13 werden die zu
untersuchende Substanz und die Zellen, deren Durchtritt er
fasst werden soll, in das Kultivierungsmedium gegeben. Die
Zellen (z. B. Leukozyten) sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff
markiert. Die in der unteren Kammer eintreffenden Zellen wer
den z. B. mit dem FCS-Verfahren detektiert. Wiederum ergibt
sich als besonderer Vorteil die Möglichkeit der Aufnahme von
Kinetiken.
Bei der Untersuchung von Sekretionsprodukten von Zellen nach
Induktion durch einen Wirkstoff werden die basolaterale Sekre
tion und die apikale Sekretion unterschieden. Im ersten Fall
werden Zellen auf der Oberseite der Membranen kultiviert und
dem von oben zugegebenen Wirkstoff ausgesetzt. Für diese An
wendung sind insbesondere die Ausführungsformen gemäß den
Fig. 7 und 8 geeignet. Zum Nachweis des Sekretionsprodukts in
der unteren Kammer wird wiederum ein biologisches Assaysystem
(z. B. Antikörper oder ein spezifisches Enzym) in das Kulti
vierungsmedium gegeben und dessen charakteristische Fluores
zenz z. B. mit dem FCS-Verfahren detektiert. Im zweiten Fall
erfolgt die Kultivierung auf der Unterseite der Membranen.
Bei diesem Assay wird ein durch einen Wirkstoff induziertes
Sekretionsprodukt eines Zelltyps durch einen in einem defi
nierten Abstand angeordneten zweiten Zelltyp aufgenommen, der
auf das Sekretionsprodukt mit einem charakteristischen Signal
(Fluoreszenzsignal) reagiert. Es sind beispielsweise Kultivie
rungen des ersten Zelltyps auf der Oberseite der Membran und
des zweiten Zelltyps auf der Innenseite der Bodenplatte 12
oder des ersten Zelltyps auf der Oberseite und des zweiten
Zelltyps auf der Unterseite der Membran vorgesehen.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den
Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl
einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirkli
chung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltung den
von Bedeutung sein.
Claims (17)
1. Probenträger (10, 20) mit einer Vielzahl von Reservoiren
(13), der aus einer Aufnahmeplatte (10) und einer Einsatzplat
te (20) besteht, wobei die Aufnahmeplatte (10) zumindest teil
weise aus einem optisch transparenten Material besteht und ei
ne Vielzahl von Ausnehmungen zur Bildung der Reservoire (13)
aufweist und die Einsatzplatte (20) eine Vielzahl von Vor
sprüngen (21) aufweist, die jeweils eine Membran (22) oder ein
Plattenelement tragen und im zusammengesetzten Zustand des
Trägers so in die Vertiefungen (13) der Aufnahmeplatte (10)
hineinragen, dass die Membran (22) oder das Plattenelement je
weils in der Vertiefung (13) mit Abstand von deren Boden- und
Seitenwänden angeordnet ist,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Aufnahmeplatte (10) durch einen Verbund aus einer ebenen
Lochplatte (11) und einer ebenen Bodenplatte (12) gebildet
wird, die die Lochplatte (11) von einer Seite her verschließt
und aus einem Material mit einer derartigen optischen Qualität
und Planarität besteht, dass ein störungsfreier Durchtritt des
Strahlengangs einer konfokal-optischen Messeinrichtung ermög
licht wird.
2. Probenträger gemäß Anspruch 1, bei dem die Aufnahme- und
Einsatzplatten (10, 20) so bemessen sind, dass auf der Membran
(22) oder dem Plattenelement oder in deren unmittelbarer Umge
bung ein Fokus einer konfokal-optischen Messeinrichtung gebil
det werden kann.
3. Probenträger gemäß Anspruch 2, bei dem die Membran (22)
oder das Plattenelement in einem senkrechten Abstand von der
Außenseite der Bodenplatte (12) angeordnet ist, der im Bereich
von 100 µm bis 2.5 mm, vorzugsweise kleiner 1 mm liegt.
4. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
dem die Dicke der Bodenplatte (12) geringer als 500 µm, vor
zugsweise geringer als 200 µm, ist.
5. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
dem die Dickeninhomogenität der Bodenplatte geringer als 20%,
vorzugsweise geringer als 10%, ist.
6. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
dem jeder Vorsprung (21) der Einsatzplatte die Form eines sich
von der Ebene der Einsatzplatte zum freien Ende des Vorsprungs
verjüngenden Konus besitzt, wobei am Ende des Vorsprungs die
Membran (22) angeordnet ist.
7. Probenträger gemäß Anspruch 6, bei dem in der Wand der ko
nusförmigen Vorsprünge seitliche Austrittsöffnungen (25) vor
gesehen sind.
8. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1
bis 5, bei dem jeder Vorsprung (21) der Einsatzplatte die Form
eines von der Ebene der Einsatzplatte abstehenden, in die je
weilige Vertiefung ragenden Streifens besitzt, an dessen Ende
die Membran (26) angeordnet ist.
9. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
dem jede Vertiefung (13) die Form eines geraden Kreiszylinders
besitzt, an dessen freiem, zur Bodenplatte entgegengesetzten
Rand jeweils eine Ausbuchtung (13a) zur zeitweiligen Positio
nierung und Ausrichtung von Manipulations- oder Messeinrich
tungen vorgesehen ist.
10. Probenträger gemäß Anspruch 9, bei dem die Einsatzplatte
(20) Durchtrittsöffnungen aufweist, die im zusammengesetzten
Zustand der Aufnahme- und Einsatzplatten (10, 20) freie Ver
bindungen mit den Ausbuchtungen (13a) bilden.
11. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
dem zwischen der Bodenplatte (12) und der Einsatzplatte (20)
eine Abstandshaltereinrichtung (24) vorgesehen ist, mit der
der Abstand der Membran (22) oder dem Plattenelement von der
Bodenplatte (12) festgelegt ist.
12. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
dem jede Vertiefung (13) die Form eines geraden Kreiszylinders
besitzt, an dessen freien, zur Bodenplatte entgegengesetzten
Rand jeweils ein Ausschnitt (14) zur Bildung eines Abstandes
zwischen der Lochplatte (11) und der Einsatzplatte (20) vorge
sehen ist.
13. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
denen die Vorsprünge (21) und/oder die Innenwände der Reser
voire (13) mit einer Elektrodeneinrichtung (50) ausgestattet
sind.
14. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
denen die Reservoire (13) entsprechend dem Format von Mikro-
oder Nanotiterplatten angeordnet sind, wobei vorzugsweise An
ordnungen aus 96 oder 384 Reservoiren vorgesehen sind.
15. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, der
einen Zellkulturen-Träger bildet.
16. Verfahren zur Untersuchung von Zellen, Zellbestandteilen
oder suspendierten oder gelösten Stoffen in den Reservoiren
eines Probenträgers gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche,
bei denen eine konfokal-mikroskopische Untersuchung, vorzugs
weise eine FCS-Messung, durchgeführt werden.
17. Verwendung eines Probenträgers gemäß einem der Ansprüche 1
bis 15, für HTS-Transportstudien von pharmazeutischen Wirk
stoffen, Transmigrations-Assays, Sekretions-Assays und/oder
parakrine Sekretions-Assays und/oder Studien zur Wechselwir
kung synthetischer Probenpartikel mit synthetischen und/oder
biologischen Testsubstanzen.
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