JP5112694B2 - 生体物質の分析 - Google Patents
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Description
a)複数の生体物質にマーカーを付与する段階であって、マーカーが、画像形成装置を用いて検出する際に複数の生体物質中の対象を同定できるものであり、マーカーの付与方法が、マーカーが第1の期間では対象を同定することができるが第2の期間では対象の同定能力が落ちるようになされる段階と、
b)第1の期間中、対象の空間定義をマーカーから特定することが可能なマークアップ画像を、記録する段階と、
c)第2の期間中、複数の生体物質の第1の画像を記録する段階と、
d)マークアップ画像から得られたデータを使用して、第1の画像内に、対象に関する空間定義を作成する段階と
を含む。
a)複数の生体物質からマークアップ画像を得る段階であって、マークアップ画像は、複数の生体物質に付与されたマーカーが、複数の生体物質中の対象を同定することが可能な第1の期間中に記録されたものである段階と、
b)複数の生体物質の第1の画像を得る段階であって、第1の画像は、マーカーが対象をそれほど同定することのできない第2の期間中に記録されたものである段階と、
c)マークアップ画像から得られたデータを使用して、第1の画像に関して対象の空間定義を作成する段階と
を含む。
図1は、本発明の実施形態の、線走査共焦点顕微鏡を含む画像形成装置を示す。この顕微鏡は、例えば光の範囲が350〜750nmの電磁放射線源100又は110、円柱レンズ120、第1のスリットマスク130、第1のリレーレンズ140、2色性ミラー150、対物レンズ170、サンプルウェル182の2次元アレイを含むマイクロタイタープレート180、チューブレンズ190、フィルタ200、第2のスリットマスク210及び検出器220を含む。これらの要素は、図1の平面に垂直に延び且つマスク130、210内のスリットアパーチャ132、212を備える光軸OAに沿って、配置されている。レンズ140、170及び190の焦点距離と、これらレンズ同士の間隔、並びにマスク130とレンズ140との間隔、対物レンズ170とマイクロタイタープレート180との間隔、レンズ190とマスク210との間隔は、共焦点顕微鏡が得られるようなものである。この実施形態で、ランプ100又はレーザ110からの電磁放射線は、円柱レンズ120を使用することにより線状に集束される。この線の形状は、第1のスリットマスク130によって最適化される。スリットマスク130は、光学システムの像平面、即ち対象平面に共役な平面に示される。スリットマスク130のアパーチャ132によって形成された照明ストライプは、レンズ140、2色性ミラー150及び対物レンズ170によって、サンプルウェル182の2次元アレイを含むマイクロタイタープレート180上へと中継される。図示する便宜上、図1の光学要素を断面で示し、ウェルプレートを斜視図で示す。ウェルプレート180上への照明ラインの投影を、線184で示し、これもやはり図1の平面に垂直であると理解される。矢印A及びBで示すように、ウェルプレート180は、図示しない手段によって、アレイの次元に平行な2次元(X,Y)内で移動させることができる。
軸方向の幅:zd=√2ad√tanα
但し、Mは倍率であり、ddはアパーチャ212の幅であり、αは、対物レンズ170によって範囲が定められた半角である。照明アパーチャ132、又はアパーチャを持たない実施形態でそれと均等なもの及び検出アパーチャ212は、独立に制御可能であることが、本発明の重要な部分である。
多波長蛍光画像形成が可能な画像形成装置を使用する、別の実施形態は、ある特定のタイプのアッセイに好ましい。この方法では、同時に複数の異なるカラーチャネルで画像形成された、同じ領域に関して、画像データを作成することができる。
本発明のいくつかの実施形態では、ビデオ速度で画像をフレーム処理することによって、迅速なデータ取得が行われる。ビデオ速度画像形成によって、1秒当たり最高30フレーム又は60フレームも得ることは可能になる。本発明の使用では、30Hz程度の大きさのフレーム速度を意味するものとする。好ましい実施形態で、ビデオ速度画像形成は、サンプル平面の1次元方向に照明し、それに垂直な方向で照明ビームを走査して、照明とサンプルとの相対的な並進が行われるようにすることにより、実現される。走査ステージは、一般に重量のあるものである。その結果、十分迅速に動かすことができない。
本発明の好ましい実施形態で、サンプルは、画像形成システムの対象平面内に在る。したがって、そのシステムの対象平面内で、画像形成システムの視野内にサンプル部分を維持する、オートフォーカス機構が使用される。平面度の精度は、このシステムの被写界深度によって決定される。好ましい実施形態で、被写界深度は約10μmであり、視野は約1mm2である。
対象平面に共役な平面内に、マニホールド、独立した検出要素を有する検出器を、使用する。上記論じたように、迅速な画像形成を必要とする用途では、主に線照明が有利である。しかし点照明に対して、線照明の平行性に固有の潜在的な速度の増大は、画像形成システムが、照明ラインに沿ってサンプルの各ポイントから放出された光を同時に検出可能な場合にしか実現されない。
本発明の実施形態では、アッセイを生細胞で実施する。生細胞のアッセイは、適正に実施するために、生理条件に適切に近い状態をしばしば必要とする。重要なパラメータの中には、温度がある。特にサンプル温度を37℃に維持するため、温度を上下させる手段を組み込むことが望ましい。別の実施形態では、生細胞の生存可能性を維持するために、相対湿度及び/又はCO2及び/又はO2を制御することが必要である。さらに、蒸発が最小限に抑えられるよう湿度を制御することは、サンプルの体積が小さい場合に重要である。
図6は、本発明により構成されたシステムの、データ処理構成要素の概略図を示す。このシステムは、Amersham Biosciences IN Cell Analyzer(商標)システムをベースとしたもので、検出器D1、D2、D3、D4、D5、スイッチSW、制御ユニット401、画像データ記憶装置402及び入力/出力(I/O)デバイス404を含む、上述の共焦点顕微鏡400を含む。関連するコンピュータターミナル405は、中央演算処理装置(CPU)408、メモリ410、ハードディスクドライブ412などのデータ記憶装置及びI/Oデバイス406であって、コンピュータとMDPUとの相互接続、さらにスクリーンI/Oデバイス430を介したコンピュータとスクリーン428の表示素子432との相互接続をそれぞれ容易にするものを含む。オペレーティングシステムプログラム414は、ハードディスクドライブ412に記憶され、コンピュータターミナル405の低レベルのオペレーションを、既知の手法で制御する。プログラムファイル及びデータ420も、ハードディスクドライブ412に記憶され、既知の方法で、関連するデバイスを介してオペレータへの出力を制御し、ハードディスクドライブに記憶させたデータを出力する。関連するデバイスには、スクリーン428の要素としてのディスプレイ432、ポインティングデバイス(図示せず)及びキーボード(図示せず)が含まれ、これらは、別のI/Oデバイス(図示せず)を介してオペレータから入力を受信し、またオペレータに情報を出力するものである。ハードドライブ412に記憶されたプログラムファイル420には、画像処置及び分析アプリケーション416と、アッセイ制御アプリケーション418と、顕微鏡400から受信された画像データ及びデータ処理中に生成された出力ファイルを記憶するためのデータベース422とが含まれる。画像処理及び分析アプリケーション416は、Media Cybernetics製のImage−Pro(商標)など、既知の画像処理及び分析ソフトウェアパッケージを、注文に合わせて作成したものでよい。
図7は、複数の生体物質の画像と、複数の生体物質中の対象の、何組かの空間定義との、概略図を示す。
Claims (23)
- 画像形成装置を使用して、複数の生体細胞を分析する方法であって、
a)複数の生体細胞に核染色剤又は核マーカーを付与する段階であって、核染色剤又は核マーカーが、画像形成装置を用いて検出する際に複数の生体細胞中の生体細胞核を同定できるものであり、核染色剤又は核マーカーの付与方法が、核染色剤が第1の期間に添加され、第2の期間には存在しないか、或いは核マーカーが第1の期間では生体細胞核を同定することができるが第2の期間では生体細胞核の同定能力が落ちるようになされ、第1の期間が第2の期間の後である段階と、
b)第1の期間中、生体細胞核の空間定義を核染色剤又は核マーカーから特定することが可能なマークアップ画像を、記録する段階と、
c)第2の期間中、複数の生体細胞の第1の画像を記録する段階と、
d)マークアップ画像から得られたデータを使用して、第1の画像内に、生体細胞核に関する空間定義を作成する段階と
を含む方法。 - 第1の画像を記録した後に、核染色剤又は核マーカーを複数の生体細胞に添加することを含む、請求項1記載の方法。
- 核染色剤又は核マーカーが、経時的に変化するシグナルを有する、請求項1又は請求項2記載の方法。
- 作成空間定義が、生体細胞核の空間範囲及び位置データの少なくとも1つを含む、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
- 作成空間定義を、マークアップ画像から検出された生体細胞核の空間定義を使用して作成する、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
- e)第1の期間中、複数の生体細胞の追加の画像を記録する段階と、
f)追加の画像からデータを得る段階と
を含み、段階d)では、追加の画像から得られたデータを使用して、第1の画像を分析する、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。 - 追加の画像を、第1のカラーチャネルに記録し、マークアップ画像を、第2の異なるカラーチャネルに記録する、請求項6記載の方法。
- 第1の画像を、第1のカラーチャネルに記録する、請求項7記載の方法。
- 段階f)では、マークアップ画像から得られたデータを使用して、追加の画像からデータを得ることを含む、請求項6、請求項7又は請求項8記載の方法。
- 段階f)で得られたデータが、生体細胞核に関連した1以上の特性の、1以上の値を含む、請求項6乃至請求項9のいずれか1項記載の方法。
- 1以上の特性が、平均強度、標準偏差、分散、尖度、自動相関関数、空間相関測度、テキスト相関測度、自動相関関数、フラクタル次元、面積、周辺、主軸の長さ、主軸の幅、コンパクト度及びオリエンテーションの少なくとも1つを含む、請求項10記載の方法。
- 段階d)が、
i)複数の試験空間定義の1つを定義する段階と、
ii)試験空間定義を使用して、第1の画像の1以上の特性の値を計算する段階と、
iii)複数の試験空間定義の別の1つに関して、段階i)〜ii)を繰り返す段階と、
iv)段階ii)で計算した1以上の値に従って、複数の試験空間定義の1つを選択する段階と
を含む、請求項1乃至請求項11のいずれか1項記載の方法。 - 当該方法が、請求項6乃至請求項10のいずれか1項で定義した段階e)及びf)をさらに含んでおり、段階iv)が、段階ii)で計算した値を、段階f)において前記追加の画像に対して請求項12で定義した段階i)及びii)を繰り返すことによって追加の画像から得られた値と比較する段階を含む、請求項12記載の方法。
- 比較する段階が、ユークリッド距離Eを計算する段階を含み、ユークリッド距離が、下記の関係式によって計算されるものであり、段階ii)で計算した値と、段階f)において追加の画像から得られた値との両方が、整数Kの特性iに関係したベクトル、即ちそれぞれZN-1及びZNである、請求項13記載の方法。
- 段階iv)が、ユークリッド距離Eの実質的に最小限の値を選択する段階を含む、請求項14記載の方法。
- 比較する段階が、シティブロック関数、チェビシェフ距離、ミンコフスキーのm次関数、2次関数、Q正定関数、キャンベラ距離、非近距離関数、又は角分離の少なくとも1つを計算する段階を含む、請求項13記載の方法。
- 第1の画像内の複数の生体細胞核に関し、複数の空間定義を作成するために、段階d)を繰り返すことを含む、請求項1乃至請求項16のいずれか1項記載の方法。
- 複数の作成空間定義を、品質基準に従ってフィルタリングする、請求項17記載の方法。
- 段階d)が、マークアップ画像から検出された生体細胞核の周囲空間を決定する段階であって、周囲空間が、該周囲空間を、近接した別の生体細胞核の少なくとも1つの別の周囲空間から切り離す境界を有するものである段階と、生体細胞核の決定された周囲空間内に作成空間定義があるように構成する段階とを含む、請求項17又は請求項18記載の方法。
- ボロノイアルゴリズムを使用して、生体細胞核の周囲空間を決定する段階を含む、請求項19記載の方法。
- 方法が、第2の別の核染色剤又は核マーカーを複数の生体細胞に付与する段階をさらに含み、第1の画像内の生体細胞核に関する空間定義を作成するのに、第2の核染色剤又は核マーカーをさらに使用する、請求項1乃至請求項20のいずれか1項記載の方法。
- 作成空間定義を使用して、第1の画像を分析することにより、複数の生体細胞の特性を分析する段階をさらに含む、請求項1乃至請求項21のいずれか1項記載の方法。
- 画像形成装置を使用して生成された画像から、複数の生体細胞を分析するための、画像分析方法であって、
a)複数の生体細胞のマークアップ画像を得る段階であって、マークアップ画像は、複数の生体細胞に付与された核染色剤又は核マーカーが複数の物質内の生体細胞核を同定することが可能な第1の期間中に、記録されるものである段階と、
b)複数の生体細胞の第1の画像を得る段階であって、第1の画像は、核染色剤が存在しないか或いは核マーカーが生体細胞核をそれほど同定することのできない第2の期間中に記録されるものであり、第1の期間が第2の期間の後である、段階と、
c)マークアップ画像から得られたデータを使用して、第1の画像に関する生体細胞核の空間定義を作成する段階と
を含む方法。
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