CN101346673B - 用于分析细胞的样本的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

一种通过数字全息显微镜的手段而分析含有透明的活细胞和/或死细胞的样本的非破坏性方法和装置，其中所述样本(8)暴露于来自激光器(2)的光线之下。穿过样本中的细胞的光线与穿过周围介质的光线相比将在光通路长度上产生差异，并且因此由细胞出射的波阵面会发生相移。这一畸变可在数字全息图中以相差或相移的形式被检测，并由此产生一个数字全息图，所述数字全息图由数字传感器(17)(例如CCD或CMOS)检测到的干涉模式重建。然后使用所述全息图中的每个要素的相移来分析样本中细胞的特征。

Description

用于分析细胞的样本的方法和装置
技术领域
本发明总体上涉及细胞分析领域。更具体而言，本发明涉及一种通过使用数字全息显微镜的手段，来分析和表征细胞培养容器中含有活细胞和/或死细胞的样本的非破坏性方法和装置。这可以用于测量样本中细胞的增殖和存活率。
背景技术
为了对几乎为透明的细胞进行分析，通常要对细胞进行染色或通过某种方式使其变得可见。因为这种方法可能会杀死标本，而又需要研究标本的生活过程，因此上述方法在很多方面都不令人满意。例如在测定细胞培养容器中的细胞数量时，上述方法还很耗费时间，因此成本较高。
因此，目前需要一种不影响样本的用于分析样本的新方法。
数字全息(DH)显微镜使用全息原理对目标成像。用激光器照射目标，散射光就会与由同一激光器发出的参比光源的光线发生干涉。可以在照相底板或数字传感器(例如CCD传感器)上记录干涉模式。
与例如相衬比显微镜或共焦显微镜的常规显微镜不同，在DH显微镜上可以同时记录相衬比图像和振幅衬比(amplitude contrast)图像。“同时的振幅衬比和相衬比图像”指的是所述目标的两个图像可以记录在同一个全息图上，其中一个图像具有振幅衬比，而另一个图像具有相衬比。可以对上述图像分别进行分析或彼此对比。可将它们含有的信息用于建立目标的计算机化三维图像。
在D.Carl等人出版于APPLIED OPTICS，vol.43，No.36，20 December2004的文献“Parameter-optimized digital holographic microscope forhigh-resolution living-cell analysis”中公开的实验结果显示，数字全息显微术可提供快速、非破坏性、全视野、高分辨率的定量振幅衬比和相衬比显微术，还能够检测在干涉仪灵敏度方向上的光通路长度的改变。所公开的方法是用来分析单个细胞的细胞结构。
现有技术的问题是不能够分析大量细胞的特征和测定样本中活细胞和/或死细胞的数量。
因此，需要一种新的非破坏性的方法和装置，用于分析包括多个细胞的样本和测量样本中细胞的增殖和存活率。
因此，一种改进的方法和装置，特别是灵活性更高和耗时更少的非破坏性方法是有利的。
发明内容
因此，本发明优选地通过提供一种用于分析包括透明的活细胞和/或死细胞的样本的方法、用途和装置，试图单独地或以任何组合的方式来缓解、减少或消除一种或多种上述的现有技术中的缺陷和弱点，并至少解决上述的问题。
根据本发明的一个方面，提供了一种通过数字全息显微术的手段以分析包括透明的活细胞和/或死细胞的样本的方法，其中所述样本被置于细胞培养容器中并暴露于来自激光器的光线之下，所述方法包括产生一个全息图，所述全息图包括至少一个矩阵元素，其中所述矩阵元素包括相和振幅信息。所述方法包括下述步骤：使用所述相信息计算在所述全息图中的每一矩阵元素的相移；使用所述振幅信息或组合的相和振幅的信息测定所述细胞的焦点深度；使用所述全息图中每一矩阵元素的相移构建所述全息图的相图像。此外，所述方法还包括：通过使用所述相图像测定所述样本中所述细胞的特征；以及使用所述特征分析所述细胞的发育阶段。
此外，所述方法还包括使用总相移测定样本中活细胞的体积分数的步骤。所述方法还可包括使用所述特征分析活细胞体积中细胞发育阶段的步骤。分析活细胞体积中细胞发育阶段的步骤可包括：记录至少两个全息图；在至少两个不同的时间点计算每一矩阵元素的相移，即第一相移和至少第二相移；并比较所述第一相移和至少第二相移。可以使用所述相移重建相图像和使用所述振幅信息重建振幅图像，将所述相移显示于所述相图像中或将所述振幅信息显示于所述振幅图像中，或以不同的灰色阴影或不同的颜色在组合的相和振幅图像中显示相移和振幅信息。所述方法可以使用相衬比显微镜采集的相衬比图像组合所述相图像。可使用计算机来进行计算和分析步骤。
根据本发明的另一方面，提供了一种通过数字全息显微术手段来分析包括透明的活细胞和/或死细胞的样本的装置，其中所述样本被置于细胞培养容器中并暴露于来自激光器的光线之下，所述装置包括：产生全息图的手段，所述全息图包括至少一个矩阵元素，所述矩阵元素包括相和振幅信息；通过使用所述相信息计算所述全息图中每一矩阵元素的相移的手段；使用所述振幅信息或组合的相和振幅信息测定所述细胞的焦点深度的手段；以及构建所述全息图的相图像的手段，包括累加所述全息图中每一矩阵元素的所述相移的手段。所述装置还包括使用所述相图像来测定所述样本中所述细胞的特征的手段；以及使用所述特征分析所述细胞的发育阶段的手段。此外，用于测定所述细胞的特征的手段包括用于测定细胞的体积、细胞的大小和细胞的折射率的手段。
此外，所述装置可包括使用所述总相移来测定活细胞的体积分数和细胞存活率的手段。为了分析活细胞体积的发育阶段，所述装置可包括：用于记录至少两个全息图的手段；用于在至少两个不同的时间点计算每一矩阵元素的相移即第一相移和至少第二相移的手段；用于比较所述第一相移和至少第二相移的手段；以及使用不同时间点的所述第一相移和第二相移来测定所述细胞样本的增殖的手段。
所述装置还可包括使用所述相移重建相图像或使用所述振幅信息重建振幅图像的手段，其中所述相移或振幅信息可显示于所述相图像或振幅图像中，或以不同的灰色阴影或不同的颜色显示于组合的相和振幅图像中。
所述装置可包括使用由相衬比显微镜采集的相衬比图像组合所述相图像的手段。
用于全息显微术的手段可由一种装置提供，所述装置产生菲涅耳全息图或傅立叶全息图.
根据本发明的又另一方面，提供了数字全息显微术用于分析包括透明的活细胞和/或死细胞的样本的用途。所述分析可用于测定所述样本中活细胞的体积分数。此外，所述分析可用于测定所述样本中所述细胞的特征。
本发明与现有技术相比的优势在于，通过结合与常规光学显微镜相近的分辨率，在不需将样本移出细胞培养容器的条件下，它为检测包括活细胞和/或死细胞的未染色细胞样本在一段时间内的形状变化和相改变提供了新的可能。在其后的一段时间内还能够进行分析，还能够定量甚至自动地设置合适的焦点深度。这将简化和补充目前的分析方法。
附图说明
在参考附图和一些实施方案的描述之后，本发明的其他目的、特征和优点将可显而易见，附图中：
图1为用于实行本发明方法的实验装置的侧视图；
图2为图1中附图标记9所显示的束流收集器装置内部的一部分的放大图；
图3为用于实行本发明方法的傅立叶全息设备的实验装置的示意图；
图4为包括移动超出样本的波阵面的样本的示意图；
图5a为一张照片，显示了T1时间点的根据本发明的样本的相图像；
图5b为一张照片，显示了T2时间点的根据本发明的样本的相图像；
图6为一张照片，显示了根据本发明的组合的相图像和相衬比图像。
具体实施方式
下文主要针对本发明使用数字全息显微术，在不影响细胞的条件下分析细胞的样本的装置和方法的实施方案进行了描述。
图1中显示的实施方案包括相衬比显微镜1。所述实施方案还包括发射633nm波长的光的激光器2，例如为He-Ne激光器。来自激光器2的光束通过反射镜3被导向至第一分束器4，所述第一分束器4将光束分为目标光束和参比光束。目标光束穿过空间滤光器5射向第二分束器7。放置样本8以使得目标光束穿过样本后到达束流收集器装置9。参比光束穿过空间滤光器6，然后被反射镜10反射，反射镜10使参比光束转向射向束流收集器装置9。如图2所示，参比光束18和透过样本的目标光束15在分束器16处被组合在一起并彼此干涉，然后被数字传感器17(例如CCD或CMOS)收集，由此产生一个数字全息图。还可以通过使用数字相机和光源11与此同时产生一个相衬比图像，而且还可以通过显微镜物镜14获得常规的可视显微图。
图1所示的装置使用了菲涅耳全息装置。目标光束穿过样本8之后进入聚焦透镜系统，该系统将衍射的目标光束聚焦后使其进入束流收集器装置9。使用透镜系统来放大图像(在这种情况下为干涉模式)。
也可以使用图3所示的傅立叶全息装置。目标光束21通过目标22之后进入分束器23。参比光束24通过透镜26之后在分束器处与衍射的目标光束21相组合，然后被数字传感器25(例如CCD或CMOS)收集，在此处产生一个数字全息图。使用透镜26来产生参比光束之外的一个点光源。
在根据所述实施方案的方法中，可以对例如生物标本的透明目标成像，而无需任何准备步骤，也无需将样本从细胞培养容器中移出。在现有技术中，要对标本进行常规染色。而这种方法在很多方面都不令人满意。例如，染色可能会杀死标本，而又需要研究标本的生活过程。此外，只有从细胞培养容器中移出的样本才能进行分析，在分析结束后样本就没有用处了。
含有细胞的样本被置于用于细胞培养的瓶、微孔板、皿或管中。分析可在不将样本从细胞培养容器中移出的条件下进行，这一点在多种细胞应用中都具有优势，因为这样不会干扰样本。也可以从培养瓶中取样并置于物镜下。
在根据所述实施方案的方法中，待分析的包括样本8的细胞培养容器被置于相衬比显微镜1中的合适位置。然后获得样本的单个全息图。所述全息图包括的信息可被用于产生所述样本的三维图像。可以保留或储存所述全息图。随后可以产生样本的图像，并在以后进行分析。如果需要，可以使用计算机程序来产生样本的图像。
所述全息图为包括一些矩阵元素的矩阵。每一矩阵元素包括相信息。使用这种相信息来计算每一矩阵元素的相移。由于全息图是根据透射过透明样本的光波记录的，因此振幅衬比与吸收和散射的改变相关，而相衬比依赖于样本的厚度和/或折射率的变化，或者更广义地依赖于光通路长度的变化。因此，每一矩阵元素中的相移依赖于两个因素：样本的厚度和该具体元素的积分折射率。
在一个实施方案中，使用含有透明细胞的样本，例如生物标本。所述细胞基本上不吸收任何光，但是穿过所述细胞的光线与穿过周围介质的光线相比会在光通路长度上产生差异。因此如图4所示，由细胞出射的波阵面会发生相移。这一畸变可在数字全息图中以相差或相移的形式被检测到，所述数字全息图由数字传感器17(例如CCD或CMOS)检测到的干涉模式重建。由所述数字全息图可以定量地(numerically)重建相图像和振幅图像或它们的组合。用于重建全息图的方法可为任何常规的重建方法，在本文中不予详述。
然后可使用相图像中的每一元素的相移来分析样本中细胞的特征。细胞的特征可为细胞的体积和积分折射率，可使用它们来分析细胞处于哪个发育阶段，例如细胞是否正在死亡或仍在增殖。
由于认为死细胞的有效折射率与周围的介质基本相同，即死细胞产生的相差或相移要比活细胞小得多，因此可以检测出死细胞并将其从总相移中去除。
在不同时间点重复测定总相移。分析总相移的测量值并用于测定样本中的细胞发育阶段，例如细胞是否正在死亡或仍在增殖。如图5a和图5b所示，这两个图为在不同时间点T1(图5a)和T2(图5b)的来自同一样本的两个不同相图像。
在T1时间点，活细胞被显示为图5a中的灰色或黑色的点。显示为黑点的少数几个细胞表明具有较大的相移。这意味着相移较大，表明所述细胞形成高密度的球体并可能接近细胞分裂期。在T2时间点，如图5b中更多的黑色和灰色点所示，可以看到更多的细胞，表明样本中具有更多的活细胞，也就是说样本从T1时间点至T2时间点发生了增殖。
还可以通过对图像中细胞核通过视觉及手动计数或使用专门的计算机软件自动计数，获得正在增殖和死亡的细胞的总数。
上述构建的全息图中的每个像素代表光穿过位于该像素的目标时产生的相移值。这种相移可用于产生相图像。可以通过计算机程序来产生图像以表示相移，其中所述的相可在图像中显示为，例如，不同的灰色阴影或不同的颜色。还可通过计算机程序来测定具有比周围介质的折射率更大或更小的不同目标的数量。由相图像可得出样本中相变化的图谱，由此可得出折射率或光通路长度的变化。
另一个可用的参数为细胞的面积。在相图像中每一细胞由几个像素组成。每一像素的面积是已知的，因此可测得细胞的面积。
根据本发明，可将由数字全息图重建的相图像与相衬比显微镜采集的相衬比图像相组合。图6显示了一个这样的图像。进行上述组合的目的是为了得到一个增强显示的图像。使用者熟悉由相衬比图像产生的图像，并且因为相图像而增加了额外的维度。不同的灰色阴影代表光强度。图6显示了具有不同特征的细胞。长方形或梨形的细胞生长于细胞培养容器的底部。从底部脱离的细胞会形成高密度的圆球体。有一些细胞呈薄层分布并且密度很低。
此外，还可以描绘包括透明细胞的样本的振幅图像和相图像。全息图可以被记录在透射几何体系(transmission geometry)中。由于样本是透明的，因此重建的振幅图像中显示的细节要比相图像中少，因为相图像中的衬比取决于样本的折射率和/或厚度的不同。活细胞产生相移并显示在该图像中。在图像中，在折射率高于(低于)周围介质的区域，相会降低(升高)。
此外，还可以组合同时采集自同一样本的相图像和振幅图像。这样可以得出关于细胞特征的更多的信息。
上文参考附图中显示的具体实施方案描述了本发明。然而，本领域技术人员在阅读本说明书之后可以认识到在实施方案中指出的各种特征的其他组合，而本发明的范围也意在包括这些组合。本发明的范围仅由后附的权利要求书限定。

Claims (18)

1.一种通过数字全息显微术的手段以分析包括透明的活细胞和/或死细胞的样本的方法，其中所述样本被置于细胞培养容器中并暴露于来自激光器的光线之下，所述方法包括下述步骤：
(1)在第一时间点产生一个第一全息图，所述全息图包括至少一个矩阵元素，其中所述矩阵元素包括相和振幅信息；
(2)使用所述相信息计算在所述第一全息图中的每一矩阵元素的相移；
(3)使用所述振幅信息或组合的相和振幅的信息测定所述细胞的焦点深度；
(4)使用所述第一全息图中每一矩阵元素的所述相移构建所述第一全息图的第一相图像，
其特征在于：
分析所述第一相图像中的至少一个像素的相移的量，以测定与所述第一相图像中的所述至少一个像素相对应的所述样本中的细胞的发育阶段。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述计算、构建、测定和分析是通过计算机进行。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于使用所述第一相图像测定所述样本中活细胞的体积分数。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于测定所述样本中细胞的体积、细胞的大小和细胞的折射率。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于基于所述第一相图像测定所述样本中细胞的数量。
6.根据权利要求1的方法，还包括：
通过重复(1)产生、(2)计算、(3)测定和(4)构建的步骤，构建一个第二相图像，其中所述重复进行的(1)产生的步骤是在第二时间点进行，以及比较所述第一相图像中的相移和所述第二相图像中的相移，以测定所述细胞样本的细胞增殖。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于使用所述相移重建相图像和使用所述振幅信息重建振幅图像，将所述相移显示于所述相图像中或将所述振幅信息显示于所述振幅图像中，或以不同的灰色阴影或不同的颜色在组合的相和振幅图像中显示相移和振幅信息。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于使用相衬比显微镜采集的相衬比图像组合所述相图像。
9.根据权利要求1的方法用于区分细胞样本中的活细胞、正在增殖的细胞、正在死亡的细胞和已死亡细胞的用途。
10.根据权利要求9的用途，所述用途是用于测定所述样本中活细胞的分数。
11.一种通过数字全息显微术手段来分析包括透明的活细胞和/或死细胞的样本的装置(1)，其中所述样本(8)被置于细胞培养容器中并暴露于来自激光器(2)的光线之下，所述装置包括：
在第一时间点产生一个第一全息图的手段，所述全息图包括至少一个矩阵元素，所述矩阵元素包括相和振幅信息；
通过使用所述相信息计算所述第一全息图中每一矩阵元素的相移的手段；
使用所述振幅信息或组合的相和振幅信息测定所述细胞的焦点深度的手段；
使用所述第一全息图中每一矩阵元素的相移构建所述第一全息图的第一相图像的手段，
其特征在于
分析所述第一相图像中的至少一个像素的相移的量，以测定与所述第一相图像中的所述至少一个像素相对应的所述样本中的细胞的发育阶段的手段。
12.根据权利要求11的装置，其特征在于使用所述第一相图像来测定所述样本中活细胞的体积分数的手段。
13.根据权利要求11的装置，其特征在于用于测定所述样本中细胞的体积、细胞的大小和细胞的折射率的手段。
14.根据权利要求12的装置，其特征在于所述装置包括基于所述第一相图像来分析所述活细胞体积分数中所述细胞的发育阶段的手段。
15.根据权利要求12的装置，其特征在于分析活细胞的所述体积的发育阶段的手段包括：通过应用产生的手段、计算的手段和测定的手段并通过应用第二全息图中的每一矩阵元素的所述相移来构建一个第二相图像的手段，其中所述第二全息图是在第二时间点产生的，
以及比较所述第一相图像中的相移和第二相图像中的相移，以测定所述细胞样本的细胞增殖的手段。
16.根据权利要求11的装置，其特征在于使用所述相移重建相图像或使用所述振幅信息重建振幅图像的手段，其中所述相移或振幅信息可显示于所述相图像或振幅图像中，或以不同的灰色阴影或不同的颜色显示于组合的相和振幅图像中。
17.根据权利要求15的装置，其特征在于使用由相衬比显微镜采集的相衬比图像组合所述相图像的手段。
18.根据权利要求11的装置，其特征在于全息显微术的手段由产生菲涅耳全息图或傅立叶全息图的装置提供。
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