JP7046211B2 - 判定方法 - Google Patents

Description

開示の技術は、複数の細胞の凝集体の状態を判定する判定方法に関する。

細胞の状態を評価または判定する技術として、例えば、以下の技術が知られている。特許文献１には、一細胞の表面の平坦度又は細胞集団の表面の平坦度を分化の度合いの指標として用いた多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法が記載されている。

特許文献２には、撮像画像における輝度に基づいて、分化した多能性幹細胞を含む分化コロニーと未分化多能性幹細胞のみを含む未分化コロニーと多層に重なった多能性幹細胞を含む多層コロニーとを識別する方法が記載されている。この方法では、輝度の第１の閾値より明るい輝度の領域を有するコロニーを分化コロニーであると判断する。また、第１の閾値に等しいかこれより暗い輝度の領域のみを有するコロニーを未分化コロニーであると判断する。また、第１の閾値に等しいかこれより暗く第２の閾値に等しいかこれより明るい輝度の領域のみを有するコロニーを未分化コロニーであると判断する。また、第２の閾値より暗い輝度の領域を有するコロニーを多層コロニーであると判断する。

特許文献３には、神経分化過程の細胞を撮像した撮像画像を入力する画像入力ステップと、神経分化過程の細胞に出現する神経突起を撮像画像に基づく原画像から抽出する神経突起抽出ステップと、抽出された神経突起の状態を判定する神経突起対応判定ステップと、を備えることを特徴とする細胞評価方法が記載されている。

特許文献４には、細胞状態を提示する方法であって、該細胞に由来する遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子に関連する遺伝子状態を経時的にモニタすることより該細胞の経時プロファイルを得る工程と該経時プロファイルを提示する工程とを含む方法が記載されている。

ＷＯ２０１４／０４１９３５号公報 特開２０１６－０２８６０７号公報 特開２０１３-２３６５６４号公報 特表２００６-５２２６０５号公報

細胞の大量生産が可能な培養手法として、細胞の凝集体であるスフェアを培地中に浮遊させた状態で培養する三次元培養法が知られている。三次元培養による細胞の製造工程においては、工程管理の容易性の観点から、細胞の品質をスフェアの状態のまま非破壊且つ簡便に評価する技術が求められる。しかしながら、現時点においては、三次元空間中にランダムに存在する様々なサイズのスフェアを評価する手法が確立されておらず、特にスフェアの内部における細胞の密度及び生存状況について直接観察することは困難である。このため、特許文献１－３にも記載されているように、従来の二次元培養の手法を適用した評価がなされているが、培養する細胞の数の増加に伴って、評価工数が増えるため、多くの人手及び多くの時間が必要となる。従来の二次元培養の手法を適用した評価では、スフェアを単一細胞に分解したり、特許文献４に記載されているように、蛍光色素を添加したりするといった細胞の破壊を伴う処理が必要とされる。

開示の技術は、三次元培養により形成される複数の細胞の凝集体の状態を非破壊且つ簡便に判定することを目的とする。

開示の技術に係る判定方法は、複数の細胞の凝集体を撮像したホログラムから凝集体の内部のスライス位置における断面の位相差画像を生成し、位相差画像を構成する複数の画素の各々の位相差量を積算した値である位相差量総和を凝集体の体積で除算した位相差量密度を導出し、前記位相差量密度に反映される前記凝集体の状態について、位相差量密度の時間推移に基づいて、凝集体の状態を判定することを含む。開示の技術に係る判定方法によれば、三次元培養により形成される複数の細胞の凝集体の状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。

凝集体を構成する細胞が幹細胞である場合、開示の技術に係る判定方法は、幹細胞を胚葉に分化させる第１の処理を含み、第１の処理を実施した後の位相差量密度の時間推移に基づいて、凝集体における胚葉への分化の状態を判定することを含み得る。これにより、凝集体における胚葉への分化の状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。

開示の技術に係る判定方法は、第１の処理の実施前における位相差量密度からの、第１の処理の実施後における位相差量密度の変化の程度に基づいて、幹細胞のうち、胚葉に分化した細胞の割合を判定することを含む。これにより胚葉に分化した細胞の割合を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。

開示の技術に係る判定方法は、第１の処理の実施後に、胚葉に分化した細胞を特定の細胞に更に分化させる第２の処理を含み、第２の処理を実施した後の位相差量密度の時間推移に基づいて、特定の細胞への分化の状態を判定することを含み得る。これにより、特定の細胞への分化の状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。

開示の技術に係る判定方法は、第２の処理の実施前における位相差量密度からの、第２の処理の実施後における位相差量密度の変化の程度に基づいて、特定の細胞に分化した細胞の割合を判定することを含み得る。これにより、特定の細胞に分化した細胞の割合を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。

凝集体を構成する細胞が幹細胞である場合、開示の技術に係る判定方法は、幹細胞を胚葉に分化させる第１の処理と、第１の処理の実施後に、胚葉に分化した細胞を特定の細胞に更に分化させる第２の処理とを含み、第１の処理を実施してから第２の処理の実施後所定期間が経過するまでの位相差量密度の時間推移に基づいて、複数の凝集体を含む判定対象ロットについて判定を行うことを含み得る。これにより、判定対象ロットについて非破壊且つ簡便に判定を行うことが可能となる。

開示の技術に係る判定方法は、判定対象ロットについて取得した、第１の処理を実施してから第２の処理の実施後所定期間が経過するまでの位相差量密度の時間推移の、基準データに対する乖離の程度に基づいて、判定対象ロットについて判定を行うことを含み得る。これにより、判定対象ロットについて非破壊且つ簡便に判定を行うことが可能となる。

開示の技術に係る判定方法は、判定対象ロットに含まれる複数の凝集体の位相差量密度の凝集体の粒径に対する依存性を抑制するように判定対象ロットに含まれる複数の凝集体の位相差量密度の各々について補正値を導出し、補正値の時間推移に基づいて判定対象ロットについて判定を行うことを含み得る。これにより、判定対象ロットについての判定をより適確に行うことが可能となる。

開示の技術に係る判定方法は、評価基準ロットに含まれる複数の凝集体の粒径の頻度分布の各階級における頻度を、判定対象ロットに含まれる複数の凝集体の粒径の頻度分布の、対応する階級における頻度で除算した値を、それぞれ補正係数として導出し、判定対象ロットに含まれる複数の凝集体の各々について取得した位相差量密度について、対応する補正係数を乗算することで、判定対象ロットに含まれる複数の凝集体の位相差量密度の補正値を導出し、補正値の平均値の時間推移に基づいて、判定対象ロットについて判定を行うことを含み得る。これにより、判定対象ロットについての判定をより適確に行うことが可能となる。

開示の技術に係る判定方法は、判定対象ロットに含まれる複数の凝集体について、位相差量密度と凝集体の粒径との相関性を示す指標値を導出し、指標値の時間推移に基づいて、判定対象ロットについて判定を行うことを含み得る。これにより、判定対象ロットについての判定をより適確に行うことが可能となる。

開示の技術によれば、三次元培養により形成される複数の細胞の凝集体の状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。

開示の技術の実施形態に係る判定方法の実施に用いる撮像システムの構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る判定方法の実施に用いるホログラムの一例を示す図である。 スフェアのフーリエ変換画像の一例を示す図である。 スフェアのアンラッピング前の位相差画像の一例を示す図である。 スフェアのアンラッピング後の位相差画像の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る位相差画像の概念を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る位相差画像の焦点合わせに関する説明図である。 開示の技術の実施形態に係るオートフォーカス処理を行うコンピュータのハードウェア構成の一例である。 開示の技術の実施形態に係るオートフォーカス処理の流れの一例を示すフローチャートである。 開示の技術の実施形態に係るスフェアの位相差画像における焦点位置と位相差量のばらつきとの関係の一例を示すグラフである。 分化誘導を開始してからの位相差量密度の時間推移の一例を示すグラフである。 未分化性マーカの発現量（相対値）の時間推移の一例を示すグラフである。 心筋トロポニンタンパクの発現量（相対値）の時間推移の一例を示すグラフである。 位相差量密度の変化量と心筋トロポニンタンパクの発現効率との関係を示す検量線の一例を示す図である。 良ロット及び不良ロットについて取得した、位相差量密度の時間推移を示すグラフである。 不良ロットについて取得した未分化性マーカの発現量（相対値）の時間推移を示すグラフである。 不良ロットについて取得した心筋トロポニンタンパクの発現量（相対値）の時間推移を示すグラフである。 第１及び第２の想定ケースにおける位相差量密度の時間推移の一例を示すグラフである。 不良ロット、第１の想定ケース及び第２の想定ケースにおける、良ロットに対する残差二乗和の時間推移の一例を示すグラフである。 判定対象ロット及び評価基準ロットに含まれる複数のスフェアについて取得したスフェア粒径と位相差量密度との相関性の一例を示すグラフである。 判定対象ロット及び評価基準ロットに含まれる複数のスフェアについて取得したスフェア粒径の頻度分布である。 図１６Ａに示す頻度分布の各階級について導出された補正係数を示す図である。 分化誘導を開始後のある時点におけるスェア粒径と位相差量密度との相関性の一例を示すグラフである。 スェア粒径と位相差量密度との相関性の一例を示すグラフである。 分化誘導を開始してからの定数Ａの時間推移の一例を示すグラフである。 分化誘導を開始してからの定数Ｇの時間推移の一例を示すグラフである。

以下、本発明の実施形態について図面を参照しつつ説明する。尚、各図面において、実質的に同一又は等価な構成要素又は部分には同一の参照符号を付している。

開示の技術の実施形態に係る判定方法は、複数の細胞の凝集体であるスフェアを撮像したホログラムから該スフェアの位相差画像を生成し、位相差画像を構成する複数の画素の各々の位相差量を積算した値である位相差量総和を該スフェアの体積で除算した位相差量密度を導出し、位相差量密度の時間推移に基づいて、該スフェアの状態を判定するというものである。この判定方法によれば、後述するように、スフェアの状態の判定を非破壊的且つ簡便に行うことが可能である。

図１は、開示の技術の実施形態に係る判定方法の実施に用いる撮像システム１の構成の一例を示す図である。撮像システム１は、公知のデジタルホログラフィ技術を用いてスフェアのホログラムを取得するためのホログラム光学系１０を含んで構成されている。

デジタルホログラフィ技術は、物体を透過または反射した物体光と、物体光に対してコヒーレントである参照光との干渉によって生じる像をイメージセンサで撮像し、撮像によって得られた画像について、光伝搬に基づく数値計算を実施することによって、物体からの光波の波面を復元する技術である。デジタルホログラフィ技術によれば、物体の位相分布を定量化し、また、焦点位置を機械的に移動させることなく、物体の三次元情報を取得することができる。

ホログラム光学系１０は、レーザ光源１１、ビームスプリッタ１２、１８、コリメートレンズ１３、２１、対物レンズ１５、ダイクロイックミラー３４、結像レンズ１７及びＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）カメラ１９を含んで構成されている。サンプルステージにセットされる試料１４としてのスフェアは、コリメートレンズ１３と対物レンズ１５との間に配置される。

レーザ光源１１には、例えば波長６３２．８ｎｍのＨｅＮｅレーザを用いることが可能である。レーザ光源１１から出射されたレーザ光は、ビームスプリッタ１２により、２つのレーザ光に分割される。２つのレーザ光の一方は物体光とされ、他方は参照光とされる。物体光は、コリメートレンズ１３によって平行光とされた後、サンプルステージにセットされた試料１４であるスフェアに照射される。スフェアを透過した物体光による像は、対物レンズ１５によって拡大される。対物レンズ１５を透過した物体光は、ダイクロイックミラー３４を透過して、結像レンズ１７によって再び平行光とされた後、ビームスプリッタ１８を介してＣＭＯＳカメラ１９の撮像面に結像される。一方、参照光は、光ファイバ２０によってコリメートレンズ２１の手前まで導かれる。光ファイバ２０から出射した参照光は、コリメートレンズ２１によって平行光とされ、ビームスプリッタ１８を介してＣＭＯＳカメラ１９の撮像面に入射する。物体光と参照光との干渉によって生じるホログラムが、ＣＭＯＳカメラ１９によって記録される。なお、ＣＭＯＳカメラ１９の撮像面に入射する物体光と参照光の光軸方向が互いに異なったオフアキシャル光学系が構成されていてもよい。

本実施形態に係る撮像システム１によれば、スフェアを破壊することなく、またスフェアを構成する細胞にダメージを与えることなくスフェアの位相差画像を取得することができる。なお、上記した撮像システム１の構成は、一例にすぎず、上記の構成に限定されるものではない。開示の技術に係る判定方法の実施には、デジタルホログラム技術を用いてホログラムを取得することができる、あらゆる撮像システムを利用することが可能である。

以下に、撮像システム１を用いて取得したスフェアのホログラムから、スフェアの位相差画像を取得する方法の一例について説明する。

はじめに、ＣＭＯＳカメラ１９によって取得した図２Ａに例示するホログラムを、二次元フーリエ変換することにより、物体光のみの複素振幅成分を抜き出す。図２Ｂは、この処理によって得られるスフェアのフーリエ変換画像の一例である。

次に、例えば角スペクトル法を適用して任意の空間位置のスフェアの位相を示す画像を復元する。図２Ｃは、この処理によって得られるスフェアのアンラッピング前の位相差画像の一例である。この時点におけるスフェアの位相は、０～２πの値に畳みこまれている。そこで、例えば、Unweighted Least Squares（重みなし最小２乗法）またはFlynn's Algorithm（フリンのアルゴリズム）などの位相接続（アンラッピング）手法を適用して２π以上の部分も接合していくことで、図２Ｄに例示するような最終的なスフェアの位相差画像を得ることができる。なお、アンラッピングの手法は数多く提案されており、位相不整合を生じない適切なものを適宜選択すればよい。

図３は、位相差画像Ｉ_Ｐの概念を示す図である。図３の下段は、位相差画像Ｉ_Ｐの各画素ｋにおける位相差量を３次元表示したものである。図３の上段は、位相差画像Ｉ_Ｐの各画素ｋにおける位相差量を平面上にグレースケールで示したものである。

ここで、位相差画像Ｉ_Ｐにおける位相差量θは、位相差画像Ｉ_Ｐの同一焦点面内に存在するバックグラウンド（スフェアの存在しない領域）の位相をθ_Ｂとし、スフェアの存在する領域の位相をθ_Ｓとしたとき、下記の（１）式によって表わされる。また、本明細書中における「位相」という用語は、光を電磁波とみなした場合の電場振幅の位相であり、より一般的な意味で使用される。

また、位相差画像Ｉ_Ｐの各画素ｋにおける位相差量θ_ｋは、下記（２）式によって表わすことができる。但し、ｎ_ｋは位相差画像Ｉ_Ｐの各画像ｋに対応する部位におけるスフェアの屈折率であり、ｄ_ｋは位相差画像Ｉ_Ｐの各画素ｋに対応する部位におけるスフェアの厚さであり、λはホログラム光学系１０における物体光の波長である。

スフェアの位相差画像は、スフェアを透過した物体光の光路長分布を示した画像である。スフェア内における光路長は、スフェアの屈折率とスフェアの厚さの積に相当することから、スフェアの位相差画像は、（２）式にも示されているように、スフェアの屈折率及び厚さ（形状）の情報を含んでいる。

スフェアに対して焦点が合っていない位相差画像からは、回折による広がりの影響によりスフェアの実態に合致した正確な情報が得られない。従って、ＣＭＯＳカメラ１９によって取得したホログラムから位相差画像を取得する際に、スフェアに焦点を合わせることが好ましい。ここで、「スフェアに焦点を合わせる」とは、球形状のスフェアの中央付近でスライスした位相差画像を得ることを意味する。スフェアに焦点が合った位相差画像を用いてスフェアの状態を判定することによって、より正確な判定結果を得ることができる。

位相差画像の焦点合わせは、人手によらず、自動化することが好ましい。焦点合わせを自動化することによって、作業者による任意性を排除し、更に、処理時間の短縮を図ることができる。本発明者らは、以下に説明する自動化可能な焦点合わせの手法を見出した。

図４の左のグラフは、スフェアの位相差画像における平面方向の位置と位相差量との関係の一例を示すグラフであり、実線がスフェアに焦点が合っている状態に対応し、点線がスフェアに焦点が合っていない状態に対応する。スフェアに焦点が合っている場合、位相差画像における特定の位置に急峻なピークが現れる。一方、スフェアに焦点が合っていない場合、焦点が合っている場合と比較してピークが低く且つなだらかになる。

図４の右のグラフは、スフェアの位相差画像における位相差量のヒストグラムの一例であり、実線がスフェアに焦点が合っている状態に対応し、点線がスフェアに焦点が合っていない状態に対応する。スフェアに焦点が合っている場合、カーブの半値幅ｗ（位相差量のばらつき）は、相対的に大きくなり、スフェアに焦点が合っていない場合、カーブの半値幅ｗ（位相差量のばらつき）は、相対的に小さくなる。

従って、互いに異なる焦点位置（スライス位置）毎にスフェアの位相差画像を取得し、取得した位相差画像の各々について、位相差量のヒストグラムにおけるカーブの半値幅ｗ（位相差量のばらつき）を求め、求めた半値幅ｗのうち、最大の半値幅ｗを有する位相差画像を、スフェアに焦点が合った位相差画像として抽出することで焦点合わせを実現できる。

上記の焦点合わせは、コンピュータを用いて自動化することが可能である。図５は、上記の焦点合わせを自動で行うオートフォーカス処理を行うコンピュータ５００のハードウェア構成の一例である。

コンピュータ５００は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）５０１、一時記憶領域としての主記憶装置５０２、不揮発性の補助記憶装置５０３、ＣＭＯＳカメラ１９との間において通信を行うための通信Ｉ／Ｆ（InterFace）５０４、及び液晶ディスプレイ等の表示部５０５を含んで構成されている。ＣＰＵ５０１、主記憶装置５０２、補助記憶装置５０３、通信Ｉ／Ｆ５０４、及び表示部５０５は、それぞれ、バス５０７に接続されている。補助記憶装置５０３には、上記のオートフォーカス処理の手順を記述したオートフォーカスプログラム５０６が格納されている。コンピュータ５００は、ＣＰＵ５０１がオートフォーカスプログラム５０６を実行することによって、オートフォーカス処理を行う。

図６は、コンピュータ５００において実施されるオートフォーカス処理の流れの一例を示すフローチャートである。

ステップＳ１において、ＣＰＵ５０１は、ＣＭＯＳカメラ１９からスフェアのホログラムを取得する。

ステップＳ２において、ＣＰＵ５０１は、取得したホログラムから、焦点位置（スライス位置）が互いに異なる複数の位相差画像を生成する。より具体的には、焦点距離（スライス位置）を指定刻みでスイープしながら再生計算を行って、焦点距離毎の位相像をストックする。

ステップＳ３において、ＣＰＵ５０１は、焦点位置（スライス位置）毎の位相差画像の各々について、位相差量のばらつきを導出する。ＣＰＵ５０１は、例えば、焦点位置（スライス位置）毎の位相像についてスフェアの存在領域を特定し、位相差画像における位相差量の最大値と最小値との差分を、当該位相差画像における位相差量のばらつきとして導出してもよい。

ステップＳ４において、ＣＰＵ５０１は、焦点位置（スライス位置）が互いに異なる複数の位相差画像のうち、ステップＳ３にて導出した位相差量のばらつきが最大となる位相差画像を、焦点が合った位相差画像として抽出する。

図７は、スフェアの位相差画像における焦点位置（スライス位置）と位相差量のばらつきとの関係の一例を示したグラフである。図７には、焦点位置が、－４００μｍ、－２００μｍ、０μｍ、＋２００μｍ、及び＋４００μｍに対応するスフェアの位相差画像が、グラフとともに例示されている。なお、図７では、位相差量のばらつきが最大となる焦点位置を０μｍとしている。上記のオートフォーカス処理によれば、位相差量のばらつきが最大となる焦点位置０μｍに対応する位相差画像が、焦点が合った位相差画像として抽出される。位相差量のばらつきが最大となる焦点位置０μｍに対応する位相差画像において、スフェアの輪郭が最も鮮明となる。

上記のように、開示の技術の実施形態に係る判定方法においては、位相差画像を構成する複数の画素の各々の位相差量を積算した値である位相差量総和θ_Ａを該スフェアの体積で除算した位相差量密度Ｄ_Ｐを導出することを含む。

位相差量総和θ_Ａは、下記の（３）式によって表わされる。但し、ｓは位相差画像の各画素ｋの面積であり、ｖ_ｋは位相差画像の各画素ｋに対応する部位におけるスフェアの体積である。（３）式に示されるように、位相差量総和θ_Ａは、スフェアの位相差画像の画素毎の位相差量θ_ｋを、全ての画素ｋについて積算したものに相当する。なお、（３）式におけるｄ_ｋは画素ｋに投影されたスフェア部分の厚みを示し、ｎ_ｋはバックグラウンドである培養液とスフェア内部との屈折率差を表す。（３）式では、ｖ_ｋ＝ｄ_ｋ・sを用いた。ここで、（３）式により、位相差量総和θ_Ａの単位は面積のスケールとなって、例えば[μｍ^２]であるが、イメージセンサ間で比較を行わない場合には単に１ピクセルあたりの画素毎の位相差量θ_ｋの和として位相差量総和θ_Ａの単位を[pixel]とし、つまりs＝1[pixel]として扱ってもよい。

位相差量密度Ｄ_Ｐは、下記の（４）式によって表わされる。但し、Ｖはスフェアの体積である。（４）式に示されるように、位相差量密度Ｄ_Ｐは、位相差量総和θ_Ａを当該スフェアの体積Ｖで除算したものに相当する。健全な細胞は、その恒常性から内部の屈折率は、媒質の屈折率とは異なる一定の値を維持するものと考えられる。一方、死細胞は、恒常性を喪失し、内部の屈折率が媒質の屈折率と略同じになるものと考えられる。従って、位相差量密度Ｄ_Ｐを、細胞の状態を示す指標として用いることが可能である。なお、２π／λは、定数として扱うことができるので、位相差量密度Ｄ_Ｐの導出に際し、２π／λの乗算を省略してもよい。ここで、スフェアの体積平均屈折率差Ｎ_ａｖｅをＮ_ａｖｅ=Σｎ_ｋ・（Ｖ_ｋ／Ｖ）とすると、（４）式は、Ｄ_Ｐ＝（２π／λ）×Ｎ_ａｖｅとなることから、位相差密度は体積平均したスフェアの屈折率差を波長の長さで規格化したものである。本明細書において、スフェアの体積Ｖはスフェアの位相像の断面画像から球相当径を算出して求めた。より正確に楕円球とすることも可能である。

開示の技術の実施形態に係る判定方法は、位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移に基づいて、当該スフェアの状態を判定することを含む。当該スフェアを構成する細胞が、例えばｉＰＳ細胞(induced pluripotent stem cells）及びＥＳ細胞（embryonic stem cells）等の幹細胞である場合、スフェアを培地中に浮遊させた状態で培養する三次元培養法が適用され得る。幹細胞を再生医療に用いる場合、スフェアを構成する幹細胞を心筋細胞等の特定の細胞に分化させる分化誘導が行われる。

分化誘導は、スフェアを構成する幹細胞を、内胚葉、中胚葉及び外胚葉のうちのいずれかの胚葉に分化させる第１の処理と、胚葉に分化した幹細胞を心筋細胞等の特定の細胞に更に分化させる第２の処理とを含み得る。

三次元培養法を適用して分化誘導を行ったｉＰＳ細胞のスフェアを、図１に示す撮像システム１のサンプルステージにセットし、複数のスフェアのホログラムをＣＭＯＳカメラ１９によって撮影した。取得した各スフェアのホログラムに対してコンピュータによる数値計算を実施することで、スフェアの中央付近でスライスした位相差画像を取得した。得られた各スフェアの位相差画像について、（４）式によって示される位相差量密度Ｄ_Ｐを導出した。

図８は、分化誘導を開始してからの位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移の一例を示すグラフである。なお、図８に示すグラフの各プロットは、複数のスフェアについて取得した位相差量密度Ｄ_Ｐの平均値である。図８に示すグラフにおいて、スフェアを構成するｉＰＳ細胞を中胚葉に分化させる第１の処理を開始した日を０日目とした。中胚葉に分化したｉＰＳ細胞を心筋細胞に更に分化させる第２の処理を７日目から開始した。なお、図８に示すグラフにおける６日目のプロットは、第２の処理の開始前に取得した位相差量密度Ｄ_Ｐに基づくものである。図８に示すように、位相差量密度Ｄ_Ｐは、第１の処理を開始してから第２の処理の開始前（７日目）まで日を追うごとに低下し、第２の処理の開始後（７日目以降）に増加に転じた。

図９Ａは、第１の処理を開始してからの（０日目以降の）未分化性マーカ（ＴＲＡ１－６）の発現量（相対値）の時間推移を示すグラフである。図９Ｂは、第２の処理を開始してからの（７日目以降の）心筋トロポニンタンパク（ｃＴｎＴ）の発現量（相対値）の時間推移を示すグラフである。図９Ａに示すように、未分化性マーカ（ＴＲＡ１－６）の発現量は、第１の処理を開始してから日を追うごとに低下した。また、図９Ｂに示すように、心筋トロポニンタンパク（ｃＴｎＴ）の発現量は、第２の処理を開始してから日を追うごとに増加した。これらの結果から、第１の処理を開始してから第２の処理の開始前の６日目までは、ｉＰＳ細胞から中胚葉への分化が進行し、第２の処理の開始後は中胚葉から心筋細胞への分化が進行しているといえる。なお、未分化性マーカ（ＴＲＡ１－６）の発現量及び心筋トロポニンタンパク（ｃＴｎＴ）の発現量の測定は、別途採取した細胞懸濁液を用いて、市販の一般的なフローサイトメーター（BD社 ACCURI）を用いて測定した。

ｉＰＳ細胞から中胚葉への分化の進行は、図８に示すグラフにおける第１の処理の開始後６日目までの位相差量密度Ｄ_Ｐの低下に反映されている。また中胚葉から心筋細胞への分化の進行は、図８に示すグラフにおける、６日目以降の位相差量密度Ｄ_Ｐの増加に反映されている。すなわち、ｉＰＳ細胞から中胚葉への分化が進行することで位相差量密度Ｄ_Ｐが低下し、その後、中胚葉から心筋細胞への分化が進行することによって位相差量密度Ｄ_Ｐが増加することが判明した。従って、位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移をモニタすることによって、スフェアの状態を判定することが可能である。

ｉＰＳ細胞から心筋細胞に分化する過程においては、位相差量密度Ｄ_Ｐは、図８に示すように、一旦減少した後増加に転じるという、単調ではない変動を示すので、単にある一時点における位相差量密度Ｄ_Ｐを取得するだけでは、スフェアの状態を適確に判断することは困難である。例えば、第２の処理の実施後のある時点における位相差量密度Ｄ_Ｐのみからでは、中胚葉から心筋細胞への分化が順調に進行しているのか、ｉＰＳ細胞から中胚葉への分化の進行が遅れているのかを判別することは困難である。分化誘導後における位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移をモニタすることで、ｉＰＳ細胞から中胚葉への分化の進行状態及び中胚葉から心筋細胞への分化の進行状態を把握することが可能である。

開示の技術の実施形態に係る判定方法は、第１の処理を実施した後の位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移に基づいて、当該スフェアにおける胚葉への分化の状態を判定することを含み得る。具体的には、第１の処理の実施前（０日目またはそれよりも前）における位相差量密度Ｄ_Ｐからの、第１の処理の実施後（０日目以降）における位相差量密度Ｄ_Ｐの変化の程度（例えば変化量または変化率など）に基づいて、ｉＰＳ細胞のうち中胚葉に分化したものの割合を推定することができる。

例えば、ｉＰＳ細胞から中胚葉への分化の誘導効率Ｅ１は、下記の（５）式から推定することができる。（５）式においてＤ_Ｐ１は、第１の処理の実施前（０日目またはそれよりも前）における位相差量密度であり、Ｄ_Ｐ２は、第１の処理の実施後（０日目以降）における位相差量密度である。Ｄ_ＰＸ１は、第１の処理の実施後に到達し得る位相差量密度の最小値である。Ｄ_ＰＸ１は、例えば、過去の実績データ等から推定することが可能である。なお、簡易的に、Ｄ_Ｐ１－Ｄ_Ｐ２またはＤ_Ｐ２／Ｄ_Ｐ１からｉＰＳ細胞のうち中胚葉に分化したものの割合を推定してもよい。

また、開示の技術の実施形態に係る判定方法は、第２の処理を実施した後の位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移に基づいて、特定の細胞への分化の状態を判定することを含み得る。具体的には、第１の処理の実施後且つ第２の処理の実施前（６日目）における位相差量密度Ｄ_Ｐからの、第２の処理の実施後（７日目以降）における位相差量密度Ｄ_Ｐの変化の程度（変化量または変化率）に基づいて、中胚葉から心筋細胞に分化したものの割合を推定することができる。

例えば、中胚葉から心筋細胞への分化の誘導効率Ｅ２は、下記の（６）式から推定することができる。（６）式においてＤ_Ｐ３は、第１の処理の実施後且つ第２の処理の実施前（６日目）における位相差量密度であり、Ｄ_Ｐ４は、第２の処理の実施後（７日目以降）における位相差量密度である。Ｄ_ＰＸ２は、第２の処理の実施後に到達し得る位相差量密度の最大値である。Ｄ_ＰＸ２は、例えば、過去の実績データ等から推定することが可能である。なお、簡易的に、Ｄ_Ｐ４－Ｄ_Ｐ３またはＤ_Ｐ４／Ｄ_Ｐ３から中胚葉から心筋細胞に分化したものの割合を推定してもよい。

また、図１０に示すように、第２の処理の実施後（７日目以降）の位相差量密度Ｄ_Ｐの変化量と、心筋トロポニンタンパク（ｃＴｎＴ）の発現効率との関係を示す検量線を取得しておき、第２の処理の実施後（７日目以降）に取得した位相差量密度Ｄ_Ｐと上記検量線から心筋細胞への分化の進行状態を推定してもよい。

開示の技術の実施形態に係る判定方法は、第１の処理を実施してから第２の処理の実施後所定期間が経過するまでの位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移に基づいて、複数のスフェアを含む判定対象ロットについて判定を行うことを含み得る。

図１１は、心筋細胞への分化の進行が順調である良ロット（実線）及び心筋細胞への分化の進行が順調ではない不良ロット（点線）について取得した、位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移を示すグラフである。なお、不良ロットにおいては、分化後の心筋細胞からは拍動が確認されなかった。図１１における各プロットは、当該ロットに属する複数のスフェアの各々について取得した位相差量密度Ｄ_Ｐの平均値の、０日目を１とした相対値である。図１１に示すように、良ロットと不良ロットとの間で、位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移に明確な差異が確認された。すなわち、不良ロットにおいては、位相差量密度Ｄ_Ｐの変化量が良ロットと比較して小さくなった。

図１２Ａは、上記の不良ロットについて取得した未分化性マーカ（ＴＲＡ１－６）の発現量（相対値）の時間推移を示すグラフである。図１２Ｂは、上記の不良ロットについて取得した心筋トロポニンタンパク（ｃＴｎＴ）の発現量（相対値）の時間推移を示すグラフである。不良ロットにおいては、図１２Ａに示すように、未分化性マーカ（ＴＲＡ１－６）の発現量は日を追うごとに低下しており、中胚葉への分化が進行していることが確認された。しかしながら、不良ロットにおいては、図１２Ｂに示すように、心筋トロポニンタンパク（ｃＴｎＴ）の発現量は殆ど増加しておらず、心筋細胞への分化の進行が順調ではないことが確認された。このように不良ロットにおいて、心筋細胞への分化の進行が順調でないことは、図１１に示されるグラフにおいて、不良ロットの位相差量密度Ｄ_Ｐの変化が、良ロットと比較して小さいことに反映されている。このことは、位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移に基づいて判定対象ロットについて判定を行うことが可能であることを示している。

例えば、判定対象ロットについて取得した、第１の処理を実施してから第２の処理の実施後所定期間が経過するまでの位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移の、基準データに対する乖離の程度に基づいて、判定対象ロットについて判定を行ってもよい。すなわち、判定対象ロットについて取得した位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移が、基準データからどれだけ乖離しているかに基づいて判定対象ロットについて判定を行ってもよい。

位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移に対応する分化誘導の結果が既知であれば、その位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移を、基準データとして用いることが可能である。例えば、中胚葉への分化及び心筋細胞への分化の進行が順調であることが確認された良ロットについて取得した位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移を基準データとして用いることが可能である。この場合、例えば、判定対象ロットについて取得した位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移の、基準データに対する乖離の大きさが閾値を超える場合に、当該判定対象ロットを不良ロットであると判定し、基準データに対する乖離の大きさが閾値未満である場合に、当該判定対象ロットを良ロットであると判定してもよい。乖離の大きさを示す指標値として、例えば、残差二乗和を用いてもよい。また、過去の複数の培養ロットについて取得した位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移を平均化したものを、基準データとして用いることも可能である。

また、例えば、良ロットにおける位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移に基づいて導出した仮想的な時間推移を、基準データとして用いてもよい。例えば、図１３に示す第１の想定ケースに対応する時間推移を、基準データとして用いることが可能である。第１の想定ケースは、中胚葉への分化は順調に進行し、その後の心筋細胞への分化が標準的なケースと比較して若干遅れているものの心筋機能としては問題のないケースである。例えば、判定対象ロットの位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移が、第１の想定ケースと同様のパターンを示す場合、当該判定対象ロットを良ロットであると判定してもよい。また、判定対象ロットの位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移における、心筋細胞への分化の進行が、第１の想定ケースよりも更に遅れる場合（すなわち、７日目以降の位相差量密度Ｄ_Ｐが、第１の想定ケースを下回る場合）には、当該判定対象ロットを不良ロットであると判定してもよい。

また、例えば、図１３に示す第２の想定ケースに対応する時間推移を、基準データとして用いることも可能である。第２の想定ケースは、中胚葉への分化が不十分であり、心筋細胞の純度が低く、心筋機能としても不十分な場合ケースである。例えば、判定対象ロットの位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移が、第２の想定ケースと同様のパターンを示す場合、当該判定対象ロットを不良ロットであると判定してもよい。

図１４は、不良ロット、第１の想定ケース及び第２の想定ケースの、良ロットに対する残差二乗和の時間推移を示すグラフである。例えば、ある時点において判定対象ロットについて取得した位相差量密度Ｄ_Ｐの、良ロットに対する差分二乗和が、図１４に示すグラフの第１の想定ケースのラインを上回る場合に、当該判定対象ロットを不良ロットであると判定してもよい。

幹細胞の分化誘導プロセスは比較的長い時間を要する上、基準データとして適当なサンプルを再現性良く作成することも困難であることから、実測に基づく基準データを用意することは容易ではない。位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移に基づいて判定対象ロットの判定を行う開示の技術の実施形態に係る判定方法によれば、上記のように、判定に用いる基準データを仮想的に設定することが可能であり、実測に基づく基準データを用意しなくても、適切な判定を行うことが可能である。

図１５は、判定対象ロット及び評価基準ロットに含まれる複数のスフェアについて取得した、スフェア粒径と位相差量密度Ｄ_Ｐとの相関性の一例を示すグラフである。なお、スフェア粒径のばらつきが比較的小さい培養ロットが評価基準ロットとして適用され得る。例えば、ロット内におけるスフェア粒径の標準偏差が所定値以下である培養ロットを評価基準ロットとして適用してもよい。

図１５に示すように、スフェア粒径が大きくなる程、位相差量密度Ｄ_Ｐが小さくなる傾向があることが判明した。位相差量密度Ｄ_Ｐにおけるスフェア粒径依存性は、細胞株、三次元培養プロセス及び分化誘導プロセスの特徴を表わしている考えることができる。具体的には、ガス濃度及び誘導因子の透過性に起因して、粒径が小さいスフェアは分化の進行が均一となりやすい一方、粒径が大きいスフェアは分化の進行が不均一となりやすいこと、及び培養・分化誘導プロセスに応じてスフェア内の細胞密度のサイズ依存性が異なるといったことが、位相差量密度Ｄ_Ｐがスフェア粒径依存性を持つ要因となると考えられる。

位相差量密度Ｄ_Ｐは、スフェアの屈折率に関連する指標値として機能することを想定しているため、位相差量密度Ｄ_Ｐがスフェア粒径依存性を有していると、位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移に基づくスフェアの状態判定を適切に行うことが困難となる場合ある。従って、位相差量密度Ｄ_Ｐにおけるスフェア粒径依存性を抑制することが好ましい。位相差量密度Ｄ_Ｐのスフェア粒径依存性を抑制する方法として、スフェアの粒径分布に応じた補正係数を導出し、この補正係数を用いて位相差量密度Ｄ_Ｐの補正値を導出する方法が挙げられる。以下に、この方法について詳述する。

図１６Ａは、判定対象ロット及び評価基準ロットに含まれる複数のスフェアについて取得したスフェア粒径の頻度分布である。はじめに、評価基準ロットにおけるスフェア粒径の頻度分布の各階級における頻度を、判定対象ロットのスフェア粒径の頻度分布の、対応する階級における頻度で除算した値を、それぞれ補正係数として導出する。図１６Ｂは、図１６Ａに示す頻度分布の各階級について導出された補正係数を示す図である。例えば、評価基準ロットにおける頻度分布のある階級Ａにおける頻度がａであり、判定対象ロットにおける頻度分布の階級Ａにおける頻度がｂである場合、階級Ａについての補正係数Ｋ_Ａは、ａ／ｂである。

次に、判定対象ロットに含まれる複数のスフェアの各々について取得した位相差量密度Ｄ_Ｐについて、対応する補正係数を乗算することで、各スフェアの位相差量密度Ｄ_Ｐの補正値を導出する。すなわち、判定対象ロットのある階級に属するスフェアについては、その階級について導出された補正係数を、そのスフェアについて取得した位相差量密度Ｄ_Ｐに乗算する。これにより、そのスフェアの位相差量密度Ｄ_Ｐの補正値が得られる。例えば、頻度分布の階級Ａに属するあるスフェアの位相差量密度Ｄ_ＰＡの補正値は、階級Ａにおける補正係数をＫ_Ａとした場合、Ｋ_Ａ×Ｄ_ＰＡとなる。上記のように、判定対象ロットの位相差量密度を補正することで、判定対象ロットが評価基準ロットと同じスフェア粒径分布を持つものとして扱うことができ、位相差量密度に基づくロット判定を適正に行うことが可能となる。

開示の技術の実施形態に係る判定方法は、上記のように、判定対象ロットに含まれる複数のスフェアの各々について位相差量密度Ｄ_Ｐの補正値を導出し、導出した補正値の、複数のスフェアにおける平均値の時間推移に基づいて判定対象ロットについて判定を行うことを含み得る。位相差量密度Ｄ_Ｐの補正値を用いることで、位相差量密度Ｄ_Ｐにおけるスフェア粒径依存性が抑制されるので、判定対象ロットの判定をより適確に行うことが可能となる。

上記では説明では、位相差量密度Ｄ_Ｐの時間推移に基づく判定において、位相差量密度Ｄ_Ｐのスフェア粒径依存性を抑制する場合を例示したが、位相差量密度Ｄ_Ｐのスフェア粒径依存性を利用して判定対象ロットを判定してもよい。例えば、判定対象ロットに含まれる複数のスフェアについて、位相差量密度Ｄ_Ｐとスフェア粒径との相関性を示す指標値を導出し、この指標値の時間推移に基づいて、判定対象ロットについて判定を行ってもよい。

図１７は、分化誘導の開始後のある時点におけるスェア粒径と位相差量密度Ｄ_Ｐとの相関性の一例を示すグラフである。図１７に示されるスェア粒径と位相差量密度Ｄ_Ｐとの相関性は、例えば、下記の（７）式に示される関数によってフィッティングすることが可能である。すなわち、スェア粒径と位相差量密度Ｄ_Ｐとの相関性は、（７）式の関数による近似式によって表わすことができる。（７）式においてＸはスフェア粒径であり、Ｙは位相差量密度Ｄ_Ｐであり、Ａ及びＢは定数である。

図１７に示される相関性は、下記の（７）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝－０．０５２ｌｎＸ＋０．０３３４２と表わすことができる。（７）式における定数Ａは、スェア粒径と位相差量密度Ｄ_Ｐとの相関性を示す指標値として用いることができる。ここで、図１８は、未分化状態を維持しているｉＰＳ細胞の、ロット内における割合（以下、未分化率という）がそれぞれ、８７％及び９９％である２つのロットのそれぞれに含まれる複数のスフェアについて取得した、スフェア粒径と位相差量密度Ｄ_Ｐとの相関性を示すグラフである。スェア粒径と位相差量密度Ｄ_Ｐとの相関性は、図１８に例示するように、細胞の未分化率に応じて変化することから、分化誘導を開始してからの定数Ａの時間推移をモニタすることで、判定対象ロットについて判定を行うことが可能であると考えられる。

図１９は、分化誘導を開始してからの定数Ａの時間推移の一例を示すグラフである。定数Ａは、図８に示すグラフと同様、第２の処理の開始日である６日目において極値をとっている。このことは、定数Ａの時間推移をモニタすることで、判定対象ロットについて適確に判定を行うことが可能であることを示している。

また、図１７に示されるスェア粒径と位相差量密度Ｄ_Ｐとの相関性は、例えば、下記の（８）式に示される関数によってフィッティングすることも可能である。すなわち、スェア粒径と位相差量密度Ｄ_Ｐとの相関性は、（８）式の関数による近似式によって表わすことができる。（８）式においてＸはスフェア粒径であり、Ｙは位相差量密度Ｄ_Ｐであり、Ｆ及びＧは定数である。

（８）式における定数Ｇは、スェア粒径と位相差量密度Ｄ_Ｐとの相関性を示す指標値として用いることができる。スェア粒径と位相差量密度Ｄ_Ｐとの相関性は、幹細胞の分化の進行状態に応じて変化することが想定されることから、分化誘導を開始してからの定数Ｇの時間推移をモニタすることで、判定対象ロットについて判定を行うことが可能である。

図２０は、分化誘導を開始してからの定数Ｇの時間推移の一例を示すグラフである。定数Ｇは、図８に示すグラフと同様、第２の処理の開始日である６日目において極値をとっている。このことは、定数Ｇの時間推移をモニタすることで、判定対象ロットについて適確に判定を行うことが可能であることを示している。

このように、開示の技術の実施形態に係る判定方法は、判定対象ロットに含まれる複数のスフェアについて、位相差量密度Ｄ_Ｐとスフェア粒径との相関性を示す指標値の時間推移に基づいて判定対象ロットについて判定を行うことを含み得る。このように、位相差量密度Ｄ_Ｐとスフェア粒径との相関性を利用することで、判定対象ロットの判定をより適確に行うことが可能となる。

以上の説明から明らかなように、開示の技術の実施形態に係る判定方法によれば、三次元培養により形成される複数の細胞の凝集体の状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。なお、本実施形態においては、三次元の胚様体（スフェロイド）形態に対して位相差量密度で解析を行う場合を例示したが、二次元の平面培養細胞に対して取得した位相量密度の時間推移を用いて、当該細胞の状態を判定してもよい。

１ 撮像システム

１０ ホログラム光学系

１１ レーザ光源

１２ ビームスプリッタ

１３ コリメートレンズ

１４ 試料

１５ 対物レンズ

１７ 結像レンズ

１８ ビームスプリッタ

１９ ＣＭＯＳカメラ

２０ 光ファイバ

２１ コリメートレンズ

３４ ダイクロイックミラー

５００ コンピュータ

５０２ 主記憶装置

５０３ 補助記憶装置

５０４ 通信インターフェース

５０５ 表示部

５０６ オートフォーカスプログラム

５０７ バス

Ｄ_Ｐ 位相差量密度

Ｉ_Ｐ 位相差画像

θ 位相差量

θ_Ｂ バックグランドの位相

θ_Ｓ スフェアの存在する領域の位相

θ_Ａ 位相差量総和

θ_ｋ １画素の位相差量

Ｖ スフェアの体積

ｖ_ｋ 位相差画像の各画素ｋに対応する部位におけるスフェアの体積

ｋ 画素

ｗ カーブの半値幅

Claims (10)

1. 複数の細胞の凝集体を撮像したホログラムから前記凝集体の所定のスライス位置における断面の位相差画像を生成し、
   前記位相差画像を構成する複数の画素の各々の位相差量を積算した値である位相差量総和を前記凝集体の体積で除算した位相差量密度を導出し、
   前記位相差量密度に反映される前記凝集体の状態について、前記位相差量密度の時間推移に基づいて、前記凝集体の状態を判定する判定方法。
2. 前記凝集体を構成する細胞が幹細胞であり、
   前記幹細胞を胚葉に分化させる第１の処理を含み、
   前記第１の処理を実施した後の前記位相差量密度の時間推移に基づいて、前記凝集体における前記胚葉への分化の状態を判定する
   請求項１に記載の判定方法。
3. 前記第１の処理の実施前における前記位相差量密度からの、前記第１の処理の実施後における前記位相差量密度の変化の程度に基づいて、前記幹細胞のうち、胚葉に分化した細胞の割合を判定する
   請求項２に記載の判定方法。
4. 前記第１の処理の実施後に、胚葉に分化した前記細胞を特定の細胞に更に分化させる第２の処理を含み、
   前記第２の処理を実施した後の前記位相差量密度の時間推移に基づいて、前記特定の細胞への分化の状態を判定する
   請求項２または請求項３に記載の判定方法。
5. 前記第２の処理の実施前における前記位相差量密度からの、前記第２の処理の実施後における前記位相差量密度の変化の程度に基づいて、前記特定の細胞に分化した前記細胞の割合を判定する
   請求項４に記載の判定方法。
6. 前記凝集体を構成する細胞が幹細胞であり、
   前記幹細胞を胚葉に分化させる第１の処理と、前記第１の処理の実施後に、胚葉に分化した細胞を特定の細胞に更に分化させる第２の処理とを含み、
   前記第１の処理を実施してから前記第２の処理の実施後所定期間が経過するまでの前記位相差量密度の時間推移に基づいて、複数の前記凝集体を含む判定対象ロットについて判定を行う
   請求項１に記載の判定方法。
7. 前記判定対象ロットについて取得した、前記第１の処理を実施してから前記第２の処理の実施後所定期間が経過するまでの前記位相差量密度の時間推移の、基準データに対する乖離の程度に基づいて、前記判定対象ロットについて判定を行う
   請求項６に記載の判定方法。
8. 前記判定対象ロットに含まれる複数の前記凝集体の位相差量密度の前記凝集体の粒径に対する依存性を抑制するように前記判定対象ロットに含まれる複数の前記凝集体の位相差量密度の各々について補正値を導出し、
   前記補正値の時間推移に基づいて前記判定対象ロットについて判定を行う
   請求項６または請求項７に記載の判定方法。
9. 評価基準ロットに含まれる複数の前記凝集体の粒径の頻度分布の各階級における頻度を、前記判定対象ロットに含まれる複数の前記凝集体の粒径の頻度分布の、対応する階級における頻度で除算した値を、それぞれ補正係数として導出し、
   前記判定対象ロットに含まれる複数の前記凝集体の各々について取得した位相差量密度について、対応する前記補正係数を乗算することで、前記判定対象ロットに含まれる複数の前記凝集体の位相差量密度の補正値を導出し、
   前記補正値の平均値の時間推移に基づいて、前記判定対象ロットについて判定を行う
   請求項６から請求項８のいずれか１項に記載の判定方法。
10. 前記判定対象ロットに含まれる複数の前記凝集体について、位相差量密度と前記凝集体の粒径との相関性を示す指標値を導出し、
    前記指標値の時間推移に基づいて、前記判定対象ロットについて判定を行う
    請求項６または請求項７に記載の判定方法。
    

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