WO2019176427A1 - 判定方法 - Google Patents

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WO2019176427A1
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sphere
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determination
index value
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崇市郎 中村
龍介 大▲崎▼
祥 小野澤
彰洋 朝倉
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富士フイルム株式会社
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    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro

Definitions

  • the disclosed technology relates to a determination method for determining the state of a sphere that is an aggregate of a plurality of cells.
  • Patent Document 1 discloses that a cell group is irradiated with illumination light, transmitted light transmitted through the cell group by illumination light irradiation is detected to detect an image of the cell group, and scattered light in the cell group is detected.
  • a cell evaluation method is described in which a group of cells is irradiated with the detected light and the group of cells is evaluated based on the spatial spread or temporal fluctuation of the intensity of the detected scattered light.
  • an image input unit that inputs a first captured image obtained by imaging cells in a neuron differentiation process, and an omnifocal image in a focused state at a position in the thickness direction of the cell are at least first.
  • An omnifocal image generation unit that generates a first original image based on the captured image, an area having a luminance distribution below a certain level in the first original image, and an area having a density difference below a certain level in the first original image Describes a cell evaluation apparatus including a rosette extraction unit that extracts a common area as rosettes that appear in the differentiation process, and a rosette correspondence determination unit that determines the state of the extracted rosetta.
  • Patent Document 3 describes a cell determination method including a determination step of determining the degree of cell differentiation based on the cell thickness.
  • a three-dimensional culture method in which spheres, which are cell aggregates, are cultured in a suspended state in a medium.
  • a technique for nondestructively and simply evaluating the quality of cells in a sphere state is required.
  • no method has been established to evaluate spheres of various sizes that exist randomly in a three-dimensional space.
  • it is difficult to directly observe the density and viability of cells inside the sphere. is there. For this reason, evaluation using a conventional two-dimensional culture technique has been performed.
  • the disclosed technique is intended to easily and nondestructively determine the state of a sphere that is an aggregate of a plurality of cells.
  • the determination method generates a phase difference image of a sphere from a hologram obtained by imaging a sphere that is an aggregate of a plurality of cells, and based on the phase difference image and a shape index value corresponding to the shape of the sphere, Including determining the state of the sphere.
  • the state of the sphere can be determined nondestructively and easily.
  • the determination method based on the phase difference image and the shape index value, at least one of the survival rate, density, homogeneity, undifferentiated state deviation, and outer shape of the sphere included in the sphere You may make the determination regarding one.
  • a phase difference amount sum that is a value obtained by integrating the phase difference amounts of a plurality of pixels constituting the phase difference image is derived, and the correlation between the phase difference amount sum and the shape index value is derived. May be used to determine the state of the sphere.
  • a reference correlation trend line indicating a correlation standard between the phase difference total and the shape index value, and a correlation between the phase difference total and the shape index value for the sphere to be determined
  • the state of the sphere to be determined may be determined according to the degree of deviation from the reference correlation trend line of the correlation between the sum of the phase difference and the shape index value for the sphere to be determined. For example, when the width of deviation from the reference correlation trend line of the correlation between the total amount of phase difference and the shape index value for the determination target sphere exceeds the threshold, the survival rate and density of the cells included in the determination target sphere In addition, it may be determined that there is an abnormality in at least one of the homogeneity and the outer shape of the sphere.
  • a reference correlation trend line indicating a correlation reference between the total amount of phase difference and the shape index value, and the total amount of phase difference for each of a plurality of spheres belonging to the culture lot to be determined
  • the correlation between the sum of phase difference and the shape index value for the culture lot to be judged is at least one of the state of deviation from the reference correlation trend line and the degree of deviation Accordingly, the quality of the determination target culture lot may be determined.
  • the shape index value may be any one of a sphere volume, a cross-sectional area, a particle diameter, and a circumference length.
  • the phase difference amount density is derived by dividing the sum of the phase difference amounts, which is a value obtained by integrating the phase difference amounts of the plurality of pixels constituting the phase difference image, by the volume of the sphere.
  • the sphere state may be determined based on the phase difference density.
  • the phase difference image used to determine the state of the sphere is a variation in the amount of phase difference between a plurality of pixels constituting the phase difference image among a plurality of phase difference images that can be generated from a hologram. It is preferable that the phase difference image has a maximum.
  • the state of a sphere that is an aggregate of a plurality of cells can be determined nondestructively and easily.
  • 3 is an example of a hardware configuration of a computer that performs autofocus processing according to an embodiment of the disclosed technology.
  • 14 is a flowchart illustrating an example of a flow of autofocus processing according to an embodiment of the disclosed technology. It is a graph which shows an example of the relationship between the focus position in the phase difference image of a sphere, and the dispersion
  • H 2 O 2 After the addition of H 2 O 2, it is a fluorescence microscopic image of colonies at the time of the lapse of 37 minutes. After the addition of H 2 O 2, a phase contrast image of the colony at the time of the lapse of 0 minutes. It is a phase-contrast image of the colony at the time of passing 15 minutes after adding H 2 O 2 . It is a phase-contrast image of a colony when 37 minutes have elapsed after adding H 2 O 2 . It is a graph which shows the relative value of each phase difference amount total of the colony induced
  • a determination method generates a phase difference image of a sphere from a hologram obtained by imaging a sphere that is an aggregate of a plurality of cells, and generates a phase difference image and a shape index value corresponding to the shape of the sphere. Based on this, the state of the sphere is determined.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an example of a configuration of an imaging system 1 used for performing a determination method according to an embodiment of the disclosed technology.
  • the imaging system 1 includes a hologram optical system 10 for acquiring a hologram of a sphere using a known digital holography technique, and a fluorescence microscope optical system 30 for performing observation of the sphere with a fluorescence microscope. .
  • Digital holography technology uses an image sensor to capture an image generated by interference between object light that is transmitted or reflected through an object and reference light that is coherent with the object light. This is a technique for restoring the wavefront of a light wave from an object by performing a numerical calculation based on. According to the digital holography technology, it is possible to quantify the phase distribution of the object and acquire the three-dimensional information of the object without mechanically moving the focal position.
  • the hologram optical system 10 includes a laser light source 11, beam splitters 12 and 18, collimating lenses 13 and 21, an objective lens 15, an imaging lens 17, and a CMOS (Complementary Metal Metal Oxide Semiconductor) camera 19.
  • the sphere as the sample 14 set on the sample stage is disposed between the collimating lens 13 and the objective lens 15.
  • the laser light source 11 for example, a HeNe laser with a wavelength of 632.8 nm can be used.
  • the laser light emitted from the laser light source 11 is split into two laser lights by the beam splitter 12.
  • One of the two laser beams is an object beam, and the other is a reference beam.
  • the object light is collimated by the collimating lens 13 and then irradiated on the sphere that is the sample 14 set on the sample stage.
  • An image of the object light transmitted through the sphere is magnified by the objective lens 15.
  • the object light transmitted through the objective lens 15 is converted into parallel light again by the imaging lens 17 and then imaged on the imaging surface of the CMOS camera 19 via the beam splitter 18.
  • the reference light is guided to the front of the collimating lens 21 by the optical fiber 20.
  • the reference light emitted from the optical fiber 20 is converted into parallel light by the collimator lens 21 and enters the imaging surface of the CMOS camera 19 via the beam splitter 18.
  • a hologram generated by the interference between the object beam and the reference beam is recorded by the CMOS camera 19. Note that an off-axial optical system in which the optical axis directions of the object light and the reference light incident on the imaging surface of the CMOS camera 19 are different from each other may be configured.
  • the fluorescence microscope optical system 30 includes an excitation light source 31, an excitation filter 32, an ON / OFF switching mirror 33, a dichroic mirror 34, an objective lens 15, a spectral filter 35, and a CMOS camera 36.
  • a mercury lamp can be used as the excitation light source 31.
  • the excitation filter 32 transmits light in the wavelength region of, for example, 450 nm to 490 nm among the excitation light emitted from the excitation light source 31.
  • Excitation light that has passed through the excitation filter 32 is applied to the sphere, which is the sample 14 set on the sample stage, via the ON / OFF switching mirror 33, the dichroic mirror 34, and the objective lens 15.
  • the fluorescent dye added to the sphere By irradiating the fluorescent dye added to the sphere with excitation light, the fluorescence emitted from the fluorescent dye passes through the objective lens 15, the dichroic mirror 34, the ON / OFF switching mirror 33, and the spectral filter 35.
  • the spectral filter 35 transmits light having a wavelength region of, for example, 515 nm or more out of the fluorescence emitted from the fluorescent dye.
  • hologram observation by the hologram optical system 10 and fluorescence microscope observation by the fluorescence microscope optical system 30 can be performed in parallel.
  • the configuration of the imaging system 1 described above is merely an example, and is not limited to the above configuration.
  • any imaging system capable of acquiring a hologram using a digital hologram technique can be used.
  • FIG. 2A is an example of a Fourier transform image of the sphere obtained by this processing.
  • FIG. 2C is an example of the phase difference image before unwrapping of the sphere obtained by this processing.
  • the phase of the sphere at this point is folded to a value of 0 to 2 ⁇ . Therefore, for example, by applying a phase connection (unwrapping) method such as Unweighted Least Squares (weightless least squares) or Flynn's Algorithm (Flynn's algorithm), 2 ⁇ or more portions are joined to each other in FIG. 2D.
  • a phase difference image of the final sphere as illustrated can be obtained.
  • Many unwrapping techniques have been proposed, and an appropriate technique that does not cause phase mismatch may be selected as appropriate.
  • Figure 3 is a diagram showing the concept of a phase difference image I P.
  • phase difference image I P the amount of phase difference theta in the phase difference image I P, the phase of the background (non-existing regions of the spheres) existing in the same focal plane of the phase contrast image I P and theta B, a region in the presence of Spheres
  • phase ⁇ S
  • phase it is expressed by the following equation (1).
  • phase in the present specification is a phase of electric field amplitude when light is regarded as an electromagnetic wave, and is used in a more general sense.
  • phase difference amount theta k in each pixel k of the phase difference image I P can be represented by the following equation (2).
  • n k is the index of refraction of the spheres at the site corresponding to each pixel k of the phase difference image I P
  • d k is the thickness of the spheres at the site corresponding to each pixel k of the phase difference image I P
  • ⁇ is the wavelength of the object light in the hologram optical system 10.
  • the sphere phase difference image is an image showing the optical path length distribution of the object light transmitted through the sphere. Since the optical path length in the sphere corresponds to the product of the refractive index of the sphere and the thickness of the sphere, the phase difference image of the sphere has a refractive index and a thickness of the sphere as shown in equation (2). Contains information on the shape.
  • the left graph in FIG. 4 is a graph showing an example of the relationship between the position in the plane direction and the amount of phase difference in the phase image of the sphere.
  • the solid line corresponds to the state where the sphere is in focus
  • the dotted line is the sphere.
  • a sharp peak appears at a specific position in the phase difference image.
  • the peak is low and gentle compared to when the sphere is in focus.
  • the right graph in FIG. 4 is an example of a phase difference amount histogram in a sphere phase difference image, in which a solid line corresponds to a state where the sphere is in focus and a dotted line corresponds to a state where the sphere is not in focus. To do. When the sphere is in focus, the curve width w (variation in phase difference) is relatively large, and when the sphere is not in focus, the curve width w (variation in phase difference) is Relatively small.
  • the phase difference image of the sphere is acquired for each different focal position (slice position), and for each of the acquired phase difference images, the curve width w (variation of the phase difference amount) in the phase difference amount histogram is obtained, Focusing can be realized by extracting a phase difference image having the maximum width w among the obtained widths w as a phase difference image focused on the sphere.
  • FIG. 5 is an example of a hardware configuration of a computer 500 that performs autofocus processing for automatically performing the above focusing.
  • the computer 500 includes a CPU (Central Processing Unit) 501, a main storage device 502 as a temporary storage area, a nonvolatile auxiliary storage device 503, and a communication I / F (InterFace) 504 for performing communication with the CMOS camera 19. And a display unit 505 such as a liquid crystal display.
  • the CPU 501, main storage device 502, auxiliary storage device 503, communication I / F 504, and display unit 505 are each connected to a bus 507.
  • the auxiliary storage device 503 stores an autofocus program 506 describing the procedure of the autofocus process.
  • the computer 500 performs autofocus processing when the CPU 501 executes the autofocus program 506.
  • FIG. 6 is a flowchart illustrating an example of the flow of autofocus processing performed in the computer 500.
  • step S1 the CPU 501 acquires a sphere hologram from the CMOS camera 19.
  • step S2 the CPU 501 generates a plurality of phase difference images having different focal positions (slice positions) from the acquired hologram.
  • step S3 the CPU 501 derives the variation in the phase difference amount for each phase difference image for each focal position (slice position). For example, the CPU 501 may derive the difference between the maximum value and the minimum value of the phase difference amount in the phase difference image as a variation in the phase difference amount in the phase difference image.
  • step S4 the CPU 501 selects a phase difference image in which the variation in the phase difference amount derived in step S3 is the largest among the plurality of phase difference images having different focal positions (slice positions). Extract as an image.
  • FIG. 7 is a graph showing an example of the relationship between the focal position (slice position) and the phase difference variation in the sphere phase difference image.
  • FIG. 7 illustrates a phase difference image of a sphere corresponding to focal positions of ⁇ 400 ⁇ m, ⁇ 200 ⁇ m, 0 ⁇ m, +200 ⁇ m, and +400 ⁇ m, and a graph.
  • the focal position at which the variation in the phase difference amount is maximum is 0 ⁇ m.
  • the phase difference image corresponding to the focal position of 0 ⁇ m at which the variation in the phase difference amount is maximum is extracted as the focused phase difference image.
  • the phase difference image corresponding to the focal position of 0 ⁇ m where the variation of the phase difference amount is maximum the sphere outline is the clearest.
  • the determination method includes determining a sphere state based on a sphere phase difference image and a sphere shape index value. That is, the state of the sphere is determined by analyzing the phase difference image of the sphere in association with the shape index value of the sphere.
  • the state of the sphere to be determined includes, for example, the survival rate, density, homogeneity, deviation from an undifferentiated state, the outer shape of the sphere, and the like of a plurality of cells included in the sphere.
  • the sphere shape index value for example, sphere volume, cross-sectional area, particle size, circumference length, and the like can be used.
  • the particle diameter and circumference length of the sphere can be directly obtained from the image of the sphere in the phase difference image focused on the sphere (that is, the phase difference image sliced near the center of the sphere).
  • the cross-sectional area of the sphere can be derived, for example, as a cross-sectional area of a circle whose diameter is the particle diameter of the sphere.
  • the volume of the sphere can be derived, for example, as the volume of a sphere whose diameter is the particle diameter of the sphere.
  • Determination method is to derive a value obtained by integrating the phase difference of each of the plurality of pixels constituting a phase difference image phase difference amount sum theta A, and the phase difference amount sum theta A Determining the state of the sphere using the correlation with the shape index value may be included.
  • the phase difference total sum ⁇ A is expressed by the following equation (3).
  • s is the area of each pixel k of the phase difference image
  • v k is the volume of the sphere at the part corresponding to each pixel k of the phase difference image.
  • the total phase difference amount ⁇ A corresponds to a value obtained by integrating the phase difference amount ⁇ k for each pixel of the phase difference image of the sphere for all the pixels k.
  • d k represents the thickness of the sphere portion projected onto the pixel k
  • nk represents the refractive index difference between the background culture medium and the inside of the sphere.
  • v k d k ⁇ s is used.
  • the unit of the phase difference sum ⁇ A is an area scale, for example, [ ⁇ m 2 ]. However, when the comparison is not performed between the image sensors, it is simply per pixel.
  • the determination method includes a reference correlation trend line indicating a correlation reference between the phase difference total ⁇ A and the shape index value of the sphere, and a phase difference total ⁇ A for the sphere to be determined. And the correlation between the shape index value and determining the state of the determination target sphere according to the degree of deviation of the correlation of the determination target sphere from the reference correlation trend line.
  • the width of the correlation of the determination target sphere from the reference correlation trend line exceeds a threshold, the survival rate, density, homogeneity of the cells included in the determination target sphere, and the sphere It may be determined that at least one of the outer shapes is abnormal.
  • the state of the determination target sphere may be determined.
  • the width of deviation from the reference correlation trend line in the plot exceeds a threshold, at least one of the survival rate, density, homogeneity, and outer shape of the sphere included in the determination target sphere It may be determined that there is an abnormality.
  • the determination method compares the correlation between the reference correlation trend line and the phase difference amount total ⁇ A and the shape index value for each of the plurality of spheres belonging to the determination-target culture lot.
  • the determination of the quality of the determination-target culture lot may be performed in accordance with at least one of the state of deviation from the reference correlation trend line and the degree of deviation of the correlation of the determination-target culture lot.
  • the quality determination of the culture lot may be performed according to at least one of the state of deviation from the correlation trend line and the degree of deviation.
  • a correlation line between the phase difference amount total ⁇ A and the sphere shape index value acquired in advance for a sound sphere (standard sample) can be used as the reference correlation trend line.
  • a regression line derived from each plot of the determination target sphere using the least square method may be used as the reference correlation trend line.
  • Determination method is to derive a phase difference amount density D P a retardation amount sum theta A is divided by the volume of the spheres, based on the derived amount of phase difference density D P, the Determining the state of the sphere may include.
  • Retardation amount density D P is represented by the following formula (4).
  • V is the volume of the sphere.
  • the phase difference amount density D P corresponding to the phase difference amount sum theta A to a value obtained by dividing the volume V of the spheres. It is considered that healthy cells maintain a constant value of the internal refractive index different from the refractive index of the medium because of its homeostasis. On the other hand, dead cells lose homeostasis and the internal refractive index is considered to be substantially the same as the refractive index of the medium. Accordingly, the phase difference amount density D P, it may be possible to use as an index indicating the state of the cell.
  • the phase difference amount density D P obtained for spheres to be determined is, the state of the spheres can be be determined to be good if it is above the threshold, the phase difference amount density D P is less than the threshold value In this case, it can be determined that the state of the sphere is abnormal.
  • the 2 [pi / lambda it is possible to treat as a constant, upon derivation of the phase difference amount density D P, it may be omitted multiplication 2 [pi / lambda.
  • the phase difference density is a value obtained by normalizing the refractive index difference of the volume averaged sphere by the length of the wavelength.
  • V is obtained by calculating the equivalent sphere diameter from the cross-sectional image of the phase image of the sphere. It is also possible to make an elliptical sphere more accurately.
  • Example 1 The spheres of iPS cells (induced pluripotent stem cells) cultured by the three-dimensional culture method were set on the sample stage of the imaging system 1 shown in FIG. A phase difference image sliced in the vicinity of the center of the sphere was obtained by performing a numerical calculation by a computer on the obtained hologram of each sphere.
  • FIG. 8 is a graph showing the correlation characteristics between the volume of the sphere and the total phase difference amount ⁇ A. As shown in FIG. 8, it was confirmed that the total amount of phase difference ⁇ A and the volume of the sphere are in a proportional relationship.
  • FIG. 8 shows a reference correlation trend line L S and a plot showing a reference for the correlation between the sphere volume and the sum of phase difference amounts ⁇ A. From each plot shown in FIG. 8, the derived regression line was used as a reference correlation trendline L S.
  • FIG. 8 is corresponding to the plot a3, a4, a5 present in a position divergence phase contrast image of spheres corresponding to the plot a1 and a2 exists in the reference correlation trend on line L S, and from the reference correlation trendline L S A phase contrast image of the sphere is shown.
  • the spheres corresponding to the plot a1 and a2 exists in the reference correlation trend on line L S, brightness uniform phase difference image obtained over the whole sphere. This indicates that the plurality of cells constituting the sphere are homogeneous, the density of the cells in the sphere is uniform, and the like.
  • the spheres corresponding to the plot a3 and a4 are present in a position deviated from the reference correlation trendline L S, a phase difference image in which the luminance of the central portion is reduced compared with the other sites were obtained.
  • the plurality of cells constituting the sphere are heterogeneous, the density of the cells in the sphere is nonuniform, and the like.
  • the spheres corresponding to the plot a5 present in a position deviated from the reference correlation trendline L S, irregularities of the outline of the sphere is obtained remarkable phase-contrast image. This indicates that an abnormality has occurred in the cells constituting the sphere.
  • the state of the sphere can be determined using the correlation between the phase difference amount total ⁇ A and the volume which is an example of the shape index value of the sphere. Further, the reference correlation trend line L S indicating the correlation between the phase difference total ⁇ A and the sphere volume is compared with the correlation between the phase difference total ⁇ A and the shape index value for the sphere to be determined. , the correlation of the spheres to be determined, it can be said that it is possible to determine the state of the spheres according to the degree of deviation from the reference correlation trendline L S.
  • the plot of the sphere to be determined is plotted on a graph in which the volume of the sphere is taken on one axis and the phase difference amount ⁇ A is taken on the other axis. It can be said that the state of each sphere can be determined according to the degree of deviation.
  • theta A is greater than or equal to the threshold, the density of the plurality of cells included in the sphere, homogeneity, and the outer shape of spheres It can be determined that at least one of them is abnormal.
  • the volume of the sphere is used as the sphere shape index value, but it is also possible to use the cross-sectional area, particle size, or circumference length of the sphere instead. Even when any of these shape index values is used, it is possible to determine the state of the sphere using the correlation with the phase difference amount total ⁇ A.
  • Example 2 a culture lot containing a plurality of spheres was determined.
  • the culture lots to be judged are good lots and bad lots shown in Table 1 below.
  • a sphere belonging to a good lot and a sphere belonging to a bad lot are spheres of iPS cells cultured by a three-dimensional culture method, respectively.
  • the proliferation rate of the cells from the first day to the fifth day of the culture period was 20 times in the sphere belonging to the good lot and 3.7 times in the sphere belonging to the defective lot.
  • the cell viability on the fifth day of culture was 90.2% for spheres belonging to good lots and 64.1% for spheres belonging to bad lots.
  • the sphere as the sample 14 was set on the sample stage of the imaging system 1 shown in FIG. 1, and a hologram of a plurality of spheres was photographed by the CMOS camera 19.
  • a phase difference image sliced in the vicinity of the center of the sphere was obtained by performing a numerical calculation by a computer on the obtained hologram of each sphere.
  • FIG. 9A is a histogram of the sphere particle size derived for each of the good lot and the bad lot. As shown in FIG. 9A, there was no significant difference in the histogram between the good lot and the bad lot. This indicates that the state of the sphere is hardly reflected in the particle size of the sphere, and it is difficult to determine the state of the sphere based only on the particle size of the sphere.
  • the volume is derived as the shape index value of each sphere from the phase difference image of each sphere obtained for each of the good lot and the defective lot. Further, the phase difference image of each sphere is expressed by equation (3).
  • the total phase difference amount ⁇ A is derived.
  • a plot of each sphere of each culture lot is formed on a graph with the horizontal axis representing the sphere volume and the vertical axis representing the total phase difference amount ⁇ A , whereby the sphere volume and the total phase difference amount ⁇ A The correlation characteristics of were obtained.
  • FIG. 9B is a graph showing the correlation characteristics between the sphere volume and the total phase difference amount ⁇ A acquired for each of the good lot and the bad lot. In FIG. 9B, a reference correlation trend line L S and a plot are shown.
  • the phase difference amount ⁇ A has a small number of spheres below the reference correlation trend line L S , whereas in the defective lot, the phase difference amount total ⁇ A is the reference correlation. spheres below the trend line L S is, in comparison with the good lot, and there are many.
  • the quality determination of the culture lot can be performed using the correlation between the phase difference amount total ⁇ A and the volume which is an example of the sphere shape index value.
  • the reference correlation trend line L S indicating the correlation between the phase difference total ⁇ A and the volume of the sphere is compared with the correlation for the sphere belonging to the culture lot to be determined, correlation, it can be said that it is possible to quality determination of the culture lot depending on the degree of deviation from the reference correlation trendline L S.
  • the reference correlation trend of the plot for each sphere belonging to the culture lot to be judged plotted on the graph with the sphere volume on one axis and the total phase difference amount ⁇ A on the other axis it can be said that it is possible to determine the state of the culture lot based on and at least one of the degree of divergence (whether below the reference correlation trendline L S) state of deviation from the line L S.
  • the phase difference amount sum theta A sphere content minus the width is equal to or greater than the first threshold value from a reference correlation trendline L S of, when the second threshold or more, said culture lot bad lot
  • the content rate is less than the second threshold value
  • Figure 9C was obtained for each of the good lot and bad lot, a histogram of the amount of phase difference density D P. As shown in FIG. 9C, a significant difference was observed in the histogram between the good lot and the bad lot. Specifically, in the good lot, there is a peak of distribution of a relatively high position the phase difference amount density D P, in bad lot, the phase difference amount density D P is distributed in a relatively low position There was a peak.
  • p value is an index showing the reliability of a significant difference between the good lot and a defective lot in the histogram of the amount of phase difference density D P (significance probability) was less than 0.05.
  • the average value of the phase difference amount density D P when the average value is equal to or greater than the threshold, is possible to determine the culture lot as good Lot
  • the culture lot can be determined as a defective lot.
  • phase difference amount density D P to quality determination of culture lot
  • the phase difference amount density D P obtained for spheres to be determined is equal to or greater than the threshold, it is possible to state of the spheres is determined to be good, when the phase difference amount density D P is less than the threshold value Furthermore, it can be determined that the state of the sphere is abnormal.
  • Example 3 In this example, a plurality of spheres belonging to a plurality of different culture lots were determined.
  • the spheres to be determined are all iPS cell spheres cultured by a three-dimensional culture method.
  • the sphere as the sample 14 was set on the sample stage of the imaging system 1 shown in FIG. 1, and a hologram of the plurality of spheres was photographed by the CMOS camera 19.
  • a phase difference image sliced in the vicinity of the center of the sphere was obtained by performing a numerical calculation by a computer on the obtained hologram of each sphere.
  • the amount of phase difference density D P represented derived for each culture batch by formula.
  • the procedure for measuring the survival rate is as follows.
  • the spheres contained in the centrifuge tube were centrifuged at 400 G (G: gravitational acceleration) for 3 minutes.
  • the spheres precipitated at the bottom of the centrifuge tube were collected and decomposed into single cells using TrypLE (registered trademark) Select, which is a cell dissociation enzyme.
  • TrypLE registered trademark
  • Select which is a cell dissociation enzyme.
  • the dead cells are stained with Trypan Blue on the degraded cells, the cells are counted using a general cell counter (Countess (registered trademark)) available on the market. The number of The cell viability was derived for each culture lot from the count of dead cells.
  • FIG. 10 is a graph showing the correlation characteristics between the cell viability and the phase difference density D P (lot average value). As shown in FIG. 10, and cell survival, it was confirmed from the amount of phase difference density D P is a proportional relationship.
  • the amount of phase difference density D P can be estimated cell viability.
  • the survival rate of the cells can be estimated from the amount of phase difference density D P, without performing a process involving the destruction of cells such as centrifugation and dyeing treatment (i.e. nondestructively), knowing the cell viability Can do.
  • the average value of the phase difference amount density D P to keep the correlation line indicating the correlation is previously obtained, and obtains the spheres belonging to the culture lot to be determined between survival and amount of phase difference density D P cells, It is possible to estimate the cell viability in the culture lot from the above correlation line.
  • Example 4 The effect of cell viability on the phase contrast image was confirmed.
  • 3 wt% H 2 O 2 hydroogen peroxide
  • SYTOX registered trademark
  • the colony subjected to the above processing was set on the sample stage of the imaging system 1 shown in FIG. 1, and the colony hologram was photographed by the CMOS camera 19.
  • a phase difference image of the colony was acquired by performing numerical calculation with a computer on the acquired hologram.
  • a fluorescence microscope image was photographed by the CMOS camera 36.
  • FIG. 11A, FIG. 11B, and FIG. 11C are fluorescence microscope images of colonies at the time when 0 minutes have passed, 15 minutes have passed, and 37 have passed since H 2 O 2 was added, respectively.
  • FIG. 12A, FIG. 12B, and FIG. 12C are phase difference images of colonies when 0 minute has passed, 15 minutes have passed, and 37 minutes have passed since H 2 O 2 was added, respectively.
  • the number of light emission points increased with the passage of time from the time when H 2 O 2 was added. This means that the number of dead cells increased (in other words, the cell viability decreased) with the lapse of time from the time when H 2 O 2 was added.
  • the area of the low luminance region in the phase difference image increased with the passage of time from the time when H 2 O 2 was added. This means that the phase difference amount total ⁇ A in the phase difference image decreases as the cell survival rate decreases. Thus, it was confirmed that the cell viability has an influence on the total phase difference amount ⁇ A.
  • Necrosis was induced by adding H 2 O 2 to colonies of iPS cells cultured by a two-dimensional culture method (adhesion culture method).
  • another iPS cell colony was induced to undergo apoptosis using the Apoptosis Inducer Set of PromoKine.
  • Apoptosis is active cell death managed and regulated as a growth control mechanism in cells of multicellular organisms.
  • necrosis is passive cell death caused by external environmental factors such as nutritional deficiencies, poisons, and trauma, and the process leading to cell death is different from apoptosis.
  • the colonies subjected to the above processing and healthy colonies were set on the sample stage of the imaging system 1 shown in FIG. 1, and a hologram of each colony was photographed by the CMOS camera 19.
  • the phase difference image of each colony was acquired by performing numerical calculation with a computer with respect to the acquired hologram. With respect to the phase difference image of each colony, the phase difference amount total ⁇ A represented by the equation (3) was derived.
  • FIG. 13 is a graph showing the relative value of the phase difference amount total ⁇ A of colonies induced by necrosis (dead cells), colonies induced by apoptosis (dead cells), and healthy colonies (live cells).
  • the total phase difference amount ⁇ A of healthy colonies (live cells) was set to 1.
  • the p value (significance probability), which is an index indicating the reliability of the significant difference, was less than 0.05.
  • the total phase difference amount ⁇ A can be used for discrimination of cell life and death regardless of whether the process leading to cell death is necrosis or apoptosis. For example, if the total phase difference amount ⁇ A acquired for the determination target sphere is equal to or greater than the threshold value, the sphere can be determined to contain more living cells, and the phase difference amount acquired for the determination target sphere. When the total ⁇ A is less than the threshold value, it can be determined that the sphere includes more dead cells. Incidentally, the phase difference amount sum ⁇ phase difference amount density in place of the A D P, it is possible to use the determination of cell viability.
  • Example 6 The spheres of the iPS cells that maintained the undifferentiated state and the spheres of the iPS cells that deviated from the undifferentiated state were set on the sample stage of the imaging system 1 shown in FIG. A phase difference image sliced in the vicinity of the center of the sphere was obtained by performing a numerical calculation by a computer on the obtained hologram of each sphere. For the phase difference image of each sphere, a total phase difference amount ⁇ A represented by the equation (3) was derived. In addition, about the sphere which deviated from the undifferentiated state, it induced
  • FIG. 14 is a graph showing the average value of the total phase difference amount ⁇ A of the spheres that have maintained the undifferentiated state and the spheres that have deviated from the undifferentiated state. As shown in FIG. 14, a significant difference was found in the total phase difference amount ⁇ A between the sphere that maintained the undifferentiated state and the sphere that deviated from the undifferentiated state.
  • the total phase difference amount ⁇ A can be used to determine whether the undifferentiated state in the stem cells is maintained or deviated from the undifferentiated state. For example, when the total phase difference amount ⁇ A acquired for the determination target sphere is equal to or greater than a threshold, it can be determined that the sphere maintains an undifferentiated state, and the phase difference acquired for the determination target sphere When the total amount ⁇ A is less than the threshold, it can be determined that the sphere has deviated from the undifferentiated state.
  • the phase difference amount density D P in place of the phase difference amount sum theta A, or maintains the undifferentiated state it is possible to use in determining whether to deviate from the undifferentiated state.
  • the sphere is based on the phase difference image generated from the sphere hologram and the shape index value corresponding to the shape of the sphere. Therefore, it is possible to determine the sphere state in a non-destructive and simple manner.
  • the determination method it is also possible to determine the cell density and the survival rate inside the sphere that cannot be grasped by a conventional optical microscope.
  • the hologram imaging, image analysis, statistical processing, and the like performed in this determination method can be easily automated by a computer, and can reduce manpower and processing time compared to conventional methods.
  • a stable determination result can be obtained without being affected by variations in procedures by the operator.
  • Hologram photography can also be easily performed on spheres that exist randomly in a three-dimensional space, and it is also possible to determine the state of spheres during culture by a three-dimensional culture method on the spot. .
  • a more accurate determination result can be obtained by using a phase difference image sliced near the center of the spherical sphere.
  • the processing required for determination can be simplified as compared with the case where a plurality of phase difference images having different slice positions are used. .
  • the determination method generates a phase difference image of a sphere from a hologram obtained by imaging a sphere that is an aggregate of a plurality of cells, and based on the phase difference image and a shape index value corresponding to the shape of the sphere, Including determining the state of the sphere.
  • the state of the sphere can be determined nondestructively and easily.
  • the determination method based on the phase difference image and the shape index value, at least one of the survival rate, density, homogeneity, undifferentiated state deviation, and outer shape of the sphere included in the sphere You may make the determination regarding one.
  • a phase difference amount sum that is a value obtained by integrating the phase difference amounts of a plurality of pixels constituting the phase difference image is derived, and the correlation between the phase difference amount sum and the shape index value is derived. May be used to determine the state of the sphere.
  • a reference correlation trend line indicating a correlation standard between the phase difference total and the shape index value, and a correlation between the phase difference total and the shape index value for the sphere to be determined
  • the state of the sphere to be determined may be determined according to the degree of deviation from the reference correlation trend line of the correlation between the sum of the phase difference and the shape index value for the sphere to be determined. For example, when the width of deviation from the reference correlation trend line of the correlation between the total amount of phase difference and the shape index value for the determination target sphere exceeds the threshold, the survival rate and density of the cells included in the determination target sphere In addition, it may be determined that there is an abnormality in at least one of the homogeneity and the outer shape of the sphere.
  • a reference correlation trend line indicating a correlation reference between the total amount of phase difference and the shape index value, and the total amount of phase difference for each of a plurality of spheres belonging to the culture lot to be determined
  • the correlation between the sum of phase difference and the shape index value for the culture lot to be judged is at least one of the state of deviation from the reference correlation trend line and the degree of deviation Accordingly, the quality of the determination target culture lot may be determined.
  • the shape index value may be any one of a sphere volume, a cross-sectional area, a particle diameter, and a circumference length.
  • the phase difference amount density is derived by dividing the sum of the phase difference amounts, which is a value obtained by integrating the phase difference amounts of the plurality of pixels constituting the phase difference image, by the volume of the sphere.
  • the sphere state may be determined based on the phase difference density.
  • phase difference density for determining the sphere state
  • the phase difference image used to determine the state of the sphere is a variation in the amount of phase difference between a plurality of pixels constituting the phase difference image among a plurality of phase difference images that can be generated from a hologram. It is preferable that the phase difference image has a maximum.
  • phase difference image used for determining the state of the sphere
  • more accurate information that matches the actual state of the sphere can be obtained from the phase difference image, and the accuracy of the state determination of the sphere can be improved. Further increase is possible.

Abstract

複数の細胞の凝集体であるスフェアの状態を非破壊且つ簡便に判定することができる判定方法を提供する。複数の細胞の凝集体であるスフェアを撮像したホログラムからスフェアの位相差画像を生成し、位相差画像と前記スフェアの形状に応じた形状指標値とに基づいて、スフェアの状態を判定する。

Description

判定方法
　開示の技術は、複数の細胞の凝集体であるスフェアの状態を判定する判定方法に関する。
　細胞の状態を評価または判定する技術として、例えば、以下の技術が知られている。特許文献１には、細胞群に対して照明光を照射し、照明光の照射によって細胞群を透過した透過光を検出して細胞群の画像を検出し、細胞群における散乱光を検出するための検出光を細胞群に対して照射し、検出した散乱光の強度の空間的な広がりまたは時間的な揺らぎに基づいて細胞群を評価する細胞評価方法が記載されている。
　特許文献２には、神経細胞分化過程の細胞を撮像した第１の撮像画像を入力する画像入力部と、細胞の厚さ方向の位置において焦点の合った状態の全焦点画像を、少なくとも第１の撮像画像に基づく第１の原画像として生成する全焦点画像生成部と、第１の原画像において一定以下の輝度分布を有する領域と、第１の原画像において濃度差が一定以下の領域とで共通する領域を、分化過程に出現するロゼッタとして抽出するロゼッタ抽出部と、抽出されたロゼッタの状態を判定するロゼッタ対応判定部と、を備える細胞評価装置が記載されている。
　特許文献３には、細胞厚さに基づいて、細胞の分化度を判定する判定ステップを備えることを特徴とする細胞判定方法が記載されている。
特開２０１６－００５４３７号公報 特開２０１７－０００１６３号公報 特開２０１５－１４６７４７号公報
　細胞の大量生産が可能な培養手法として、細胞の凝集体であるスフェアを培地中に浮遊させた状態で培養する三次元培養法が知られている。三次元培養による細胞の製造工程においては、工程管理の容易性の観点から、細胞の品質をスフェアの状態のまま非破壊且つ簡便に評価する技術が求められる。しかしながら、現時点においては、三次元空間中にランダムに存在する様々なサイズのスフェアを評価する手法が確立されておらず、特にスフェアの内部における細胞の密度及び生存状況について直接観察することは困難である。このため、従来の二次元培養の手法を適用した評価がなされているが、培養する細胞の数の増加に伴って、評価工数が増えるため、多くの人手及び多くの時間が必要となる。従来の二次元培養の手法を適用した評価では、スフェアを単一細胞に分解したり、蛍光色素を添加したりするといった細胞の破壊を伴う処理が必要とされる。
　開示の技術は、複数の細胞の凝集体であるスフェアの状態を非破壊且つ簡便に判定することを目的とする。
　開示の技術に係る判定方法は、複数の細胞の凝集体であるスフェアを撮像したホログラムからスフェアの位相差画像を生成し、位相差画像とスフェアの形状に応じた形状指標値とに基づいて、スフェアの状態を判定することを含む。
　開示の技術に係る判定方法によれば、スフェアの状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。
　開示の技術に係る判定方法において、位相差画像と形状指標値とに基づいて、スフェアに含まれる複数の細胞の生存率、密度、均質性、未分化状態逸脱、及びスフェアの外形形状の少なくとも１つに関する判定を行ってもよい。
　開示の技術に係る判定方法において、位相差画像を構成する複数の画素の各々の位相差量を積算した値である位相差量総和を導出し、位相差量総和と形状指標値との相関性を用いてスフェアの状態を判定してもよい。
　開示の技術に係る判定方法において、位相差量総和と形状指標値との相関性の基準を示す基準相関トレンドラインと、判定対象のスフェアについての位相差量総和と形状指標値との相関性とを比較し、判定対象のスフェアについての位相差量総和と形状指標値との相関性の、基準相関トレンドラインからの乖離の程度に応じて判定対象のスフェアの状態を判定してもよい。例えば、判定対象のスフェアについての位相差量総和と形状指標値との相関性の、基準相関トレンドラインからの乖離の幅が閾値を超える場合、判定対象のスフェアに含まれる細胞の生存率、密度、均質性及びスフェアの外形形状の少なくとも１つについて異常ありと判定してもよい。
　開示の技術に係る判定方法において、位相差量総和と形状指標値との相関性の基準を示す基準相関トレンドラインと、判定対象の培養ロットに属する複数のスフェアの各々についての位相差量総和と形状指標値との相関性とを比較し、判定対象の培養ロットについての位相差量総和と形状指標値との相関性の、基準相関トレンドラインからの乖離の状態及び乖離の程度の少なくとも一方に応じて判定対象の培養ロットの良否判定を行ってもよい。
　開示の技術に係る判定方法において、形状指標値は、スフェアの体積、断面積、粒径及び周の長さのいずれかであってもよい。
　開示の技術に係る判定方法において、位相差画像を構成する複数の画素の各々の位相差量を積算した値である位相差量総和を、スフェアの体積で除算して位相差量密度を導出し、位相差量密度に基づいて、スフェアの状態を判定してもよい。
　開示の技術に係る判定方法において、スフェアの状態の判定に用いる位相差画像は、ホログラムから生成可能な複数の位相差画像のうち、位相差画像を構成する複数の画素間の位相差量のばらつきが最大となる位相差画像であることが好ましい。
　開示の技術によれば、複数の細胞の凝集体であるスフェアの状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。
開示の技術の実施形態に係る判定方法の実施に用いる撮像システムの構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る判定方法の実施に用いるホログラムの一例を示す図である。 スフェアのフーリエ変換画像の一例を示す図である。 スフェアのアンラッピング前の位相差画像の一例を示す図である。 スフェアのアンラッピング後の位相差画像の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る位相差画像の概念を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る位相差画像の焦点合わせに関する説明図である。 開示の技術の実施形態に係るオートフォーカス処理を行うコンピュータのハードウェア構成の一例である。 開示の技術の実施形態に係るオートフォーカス処理の流れの一例を示すフローチャートである。 開示の技術の実施形態に係る、スフェアの位相差画像における焦点位置と位相差量のばらつきとの関係の一例を示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係る、スフェアの体積と位相差量総和との相関特性の一例を示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係る、良ロット及び不良ロットの各々について導出したスフェアの粒径のヒストグラムである。 開示の技術の実施形態に係る、良ロット及び不良ロットの各々について取得した、スフェアの体積と位相差量総和との相関特性の一例を示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係る、良ロット及び不良ロットの各々について取得した、位相差量密度のヒストグラムである。 開示の技術の実施形態に係る、細胞の生存率と位相差量密度との相関特性の一例を示すグラフである。 Ｈ２Ｏ２を添加した後、０分経過した時点におけるコロニーの蛍光顕微鏡画像である。 Ｈ２Ｏ２を添加した後、１５分経過した時点におけるコロニーの蛍光顕微鏡画像である。 Ｈ２Ｏ２を添加した後、３７分経過した時点におけるコロニーの蛍光顕微鏡画像である。 Ｈ２Ｏ２を添加した後、０分経過した時点におけるコロニーの位相差画像である。 Ｈ２Ｏ２を添加した後、１５分経過した時点におけるコロニーの位相差画像である。 Ｈ２Ｏ２を添加した後、３７分経過した時点におけるコロニーの位相差画像である。 開示の技術の実施形態に係る、ネクローシスに誘導したコロニー、アポトーシスに誘導したコロニー及び健全なコロニーのそれぞれの位相差量総和の相対値を示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係る、未分化状態を維持したスフェア及び未分化状態を逸脱したスフェアのそれぞれの位相差量総和の平均値を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について図面を参照しつつ説明する。尚、各図面において、実質的に同一又は等価な構成要素又は部分には同一の参照符号を付している。
　開示の技術の実施形態に係る判定方法は、複数の細胞の凝集体であるスフェアを撮像したホログラムからスフェアの位相差画像を生成し、位相差画像とスフェアの形状に応じた形状指標値とに基づいて、スフェアの状態を判定する、というものである。
　図１は、開示の技術の実施形態に係る判定方法の実施に用いる撮像システム１の構成の一例を示す図である。撮像システム１は、公知のデジタルホログラフィ技術を用いてスフェアのホログラムを取得するためのホログラム光学系１０と、スフェアの蛍光顕微鏡観察を行うための蛍光顕微鏡光学系３０と、を含んで構成されている。
　デジタルホログラフィ技術は、物体を透過または反射した物体光と、物体光に対してコヒーレントである参照光との干渉によって生じる像をイメージセンサーを用いて撮像し、撮像によって得られた画像について、光伝搬に基づく数値計算を実施することにより、物体からの光波の波面を復元する技術である。デジタルホログラフィ技術によれば、物体の位相分布を定量化し、また、焦点位置を機械的に移動させることなく、物体の三次元情報を取得することができる。
　ホログラム光学系１０は、レーザ光源１１、ビームスプリッタ１２及び１８、コリメートレンズ１３及び２１、対物レンズ１５、結像レンズ１７並びにＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）カメラ１９を含んで構成されている。サンプルステージにセットされる試料１４としてのスフェアは、コリメートレンズ１３と対物レンズ１５との間に配置される。
　レーザ光源１１には、例えば波長６３２．８ｎｍのＨｅＮｅレーザを用いることが可能である。レーザ光源１１から出射されたレーザ光は、ビームスプリッタ１２により、２つのレーザ光に分割される。２つのレーザ光の一方は物体光とされ、他方は参照光とされる。物体光は、コリメートレンズ１３によって平行光とされた後、サンプルステージにセットされた試料１４であるスフェアに照射される。スフェアを透過した物体光による像は、対物レンズ１５によって拡大される。対物レンズ１５を透過した物体光は、結像レンズ１７によって再び平行光とされた後、ビームスプリッタ１８を介してＣＭＯＳカメラ１９の撮像面に結像される。一方、参照光は、光ファイバ２０によってコリメートレンズ２１の手前まで導かれる。光ファイバ２０から出射した参照光は、コリメートレンズ２１によって平行光とされ、ビームスプリッタ１８を介してＣＭＯＳカメラ１９の撮像面に入射する。物体光と参照光との干渉によって生じるホログラムが、ＣＭＯＳカメラ１９によって記録される。なお、ＣＭＯＳカメラ１９の撮像面に入射する物体光と参照光の光軸方向が互いに異なったオフアキシャル光学系が構成されていてもよい。
　一方、蛍光顕微鏡光学系３０は、励起光源３１、励起用フィルタ３２、ＯＮ／ＯＦＦ切り替えミラー３３、ダイクロイックミラー３４、対物レンズ１５、分光フィルタ３５及びＣＭＯＳカメラ３６を含んで構成されている。
　励起光源３１には、例えば水銀ランプを用いることが可能である。励起用フィルタ３２は、励起光源３１から出射された励起光のうち、例えば４５０ｎｍ～４９０ｎｍの波長域の光を透過させる。励起用フィルタ３２を透過した励起光は、ＯＮ／ＯＦＦ切り替えミラー３３、ダイクロイックミラー３４及び対物レンズ１５を介してサンプルステージにセットされた試料１４であるスフェアに照射される。スフェアに添加された蛍光色素に励起光が照射されることにより、蛍光色素から発せられる蛍光は、対物レンズ１５、ダイクロイックミラー３４、ＯＮ／ＯＦＦ切り替えミラー３３及び分光フィルタ３５を介してＣＭＯＳカメラ３６の撮像面に入射する。分光フィルタ３５は、蛍光色素から発せられた蛍光のうち、例えば５１５ｎｍ以上の波長域の光を透過させる。
　本実施形態に係る撮像システム１によれば、ホログラム光学系１０によるホログラム観察と、蛍光顕微鏡光学系３０による蛍光顕微観察とを並行して行うことが可能である。なお、上記した撮像システム１の構成は、一例にすぎず、上記の構成に限定されない。開示の技術に係る判定方法の実施には、デジタルホログラム技術を用いてホログラムを取得することができる、あらゆる撮像システムを利用することが可能である。
　以下に、撮像システム１を用いて取得したスフェアのホログラムから、スフェアの位相差画像を取得する方法の一例について説明する。
　はじめに、ＣＭＯＳカメラ１９によって取得した図２Ａに例示するホログラムを、二次元フーリエ変換することにより、物体光のみの複素振幅成分を抜き出す。図２Ｂは、この処理によって得られるスフェアのフーリエ変換画像の一例である。
　次に、例えば角スペクトル法を適用して任意の空間位置のスフェアの位相を示す画像を復元する。図２Ｃは、この処理によって得られるスフェアのアンラッピング前の位相差画像の一例である。この時点におけるスフェアの位相は、０～２πの値に畳みこまれている。そこで、例えば、Unweighted Least Squares（重みなし最小２乗法）またはFlynn's Algorithm（フリンのアルゴリズム）などの位相接続（アンラッピング）手法を適用して２π以上の部分も接合していくことにより、図２Ｄに例示するような最終的なスフェアの位相差画像を得ることができる。なお、アンラッピングの手法は数多く提案されており、位相不整合を生じない適切な手法を適宜選択すればよい。
　図３は、位相差画像ＩＰの概念を示す図である。図３の下段には、位相差画像ＩＰの各画素ｋにおける位相差量を３次元表示する。図３の上段には、位相差画像ＩＰの各画素ｋにおける位相差量を平面上にグレースケールで示す。
　ここで、位相差画像ＩＰにおける位相差量θは、位相差画像ＩＰの同一焦点面内に存在するバックグラウンド（スフェアの存在しない領域）の位相をθＢとし、スフェアの存在する領域の位相をθＳとしたとき、下記の（１）式によって表わされる。また、本明細書中における「位相」という用語は、光を電磁波とみなした場合の電場振幅の位相であり、より一般的な意味で使用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　また、位相差画像ＩＰの各画素ｋにおける位相差量θｋは、下記（２）式によって表わすことができる。但し、ｎｋは位相差画像ＩＰの各画素ｋに対応する部位におけるスフェアの屈折率であり、ｄｋは位相差画像ＩＰの各画素ｋに対応する部位におけるスフェアの厚さであり、λはホログラム光学系１０における物体光の波長である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　スフェアの位相差画像は、スフェアを透過した物体光の光路長分布を示した画像である。スフェア内における光路長は、スフェアの屈折率とスフェアの厚さの積に相当することから、スフェアの位相差画像は、（２）式にも示されているように、スフェアの屈折率及び厚さ（形状）の情報を含んでいる。
　スフェアに対して焦点が合っていない位相差画像からは、回折による広がりの影響によりスフェアの実態に合致した正確な情報が得られない。従って、ＣＭＯＳカメラ１９によって取得したホログラムから位相差画像を取得する際に、スフェアに焦点を合わせることが好ましい。ここで、「スフェアに焦点を合わせる」とは、球形状のスフェアの中央付近においてスライスした位相差画像を得ることを意味する。スフェアに焦点が合った位相差画像を用いてスフェアの状態を判定することにより、より正確な判定結果を得ることができる。なお、ユーザが、取得したスフェアの位相差画像に基づいて、スフェアの状態を判定してもよい。または、判定条件を学習したコンピュータが、取得したスフェアの位相差画像に基づいて、スフェアの状態を判定してもよい。
　位相差画像の焦点合わせは、人手によらず、自動化することが好ましい。焦点合わせを自動化することにより、作業者による任意性を排除し、更に、処理時間の短縮を図ることができる。本発明者らは、以下に説明する自動化可能な焦点合わせの手法を見出した。
　図４の左のグラフは、スフェアの位相差画像における平面方向の位置と位相差量との関係の一例を示すグラフであり、実線がスフェアに焦点が合っている状態に対応し、点線がスフェアに焦点が合っていない状態に対応する。スフェアに焦点が合っている場合、位相差画像における特定の位置に急峻なピークが現れる。一方、スフェアに焦点が合っていない場合、焦点が合っている場合と比較してピークが低く且つなだらかになる。
　図４の右のグラフは、スフェアの位相差画像における位相差量のヒストグラムの一例であり、実線がスフェアに焦点が合っている状態に対応し、点線がスフェアに焦点が合っていない状態に対応する。スフェアに焦点が合っている場合、カーブの幅ｗ（位相差量のばらつき）は、相対的に大きくなり、スフェアに焦点が合っていない場合、カーブの幅ｗ（位相差量のばらつき）は、相対的に小さくなる。
　従って、互いに異なる焦点位置（スライス位置）毎にスフェアの位相差画像を取得し、取得した位相差画像の各々について、位相差量のヒストグラムにおけるカーブの幅ｗ（位相差量のばらつき）を求め、求めた幅ｗのうち、最大の幅ｗを有する位相差画像を、スフェアに焦点が合った位相差画像として抽出することにより焦点合わせを実現できる。
　上記の焦点合わせは、コンピュータを用いて自動化することが可能である。図５は、上記の焦点合わせを自動で行うオートフォーカス処理を行うコンピュータ５００のハードウェア構成の一例である。
　コンピュータ５００は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）５０１、一時記憶領域としての主記憶装置５０２、不揮発性の補助記憶装置５０３、ＣＭＯＳカメラ１９との間で通信を行うための通信Ｉ／Ｆ（InterFace）５０４、及び液晶ディスプレイ等の表示部５０５を含んで構成されている。ＣＰＵ５０１、主記憶装置５０２、補助記憶装置５０３、通信Ｉ／Ｆ５０４、及び表示部５０５は、それぞれ、バス５０７に接続されている。補助記憶装置５０３には、上記のオートフォーカス処理の手順を記述したオートフォーカスプログラム５０６が格納されている。コンピュータ５００は、ＣＰＵ５０１がオートフォーカスプログラム５０６を実行することにより、オートフォーカス処理を行う。
　図６は、コンピュータ５００において実施されるオートフォーカス処理の流れの一例を示すフローチャートである。
　ステップＳ１において、ＣＰＵ５０１は、ＣＭＯＳカメラ１９からスフェアのホログラムを取得する。
　ステップＳ２において、ＣＰＵ５０１は、取得したホログラムから、焦点位置（スライス位置）が互いに異なる複数の位相差画像を生成する。
　ステップＳ３において、ＣＰＵ５０１は、焦点位置（スライス位置）毎の位相差画像の各々について、位相差量のばらつきを導出する。ＣＰＵ５０１は、例えば、位相差画像における位相差量の最大値と最小値との差分を、当該位相差画像における位相差量のばらつきとして導出してもよい。
　ステップＳ４において、ＣＰＵ５０１は、焦点位置（スライス位置）が互いに異なる複数の位相差画像のうち、ステップＳ３にて導出した位相差量のばらつきが最大となる位相差画像を、焦点が合った位相差画像として抽出する。
　図７は、スフェアの位相差画像における焦点位置（スライス位置）と位相差量のばらつきとの関係の一例を示したグラフである。図７には、焦点位置が、－４００μｍ、－２００μｍ、０μｍ、＋２００μｍ、及び＋４００μｍに対応するスフェアの位相差画像、並びにグラフが例示されている。なお、図７では、位相差量のばらつきが最大となる焦点位置を０μｍとしている。上記のオートフォーカス処理によれば、位相差量のばらつきが最大となる焦点位置０μｍに対応する位相差画像が、焦点が合った位相差画像として抽出される。位相差量のばらつきが最大となる焦点位置０μｍに対応する位相差画像において、スフェアの輪郭が最も鮮明となる。
　開示の技術の実施形態に係る判定方法は、スフェアの位相差画像と、スフェアの形状指標値とに基づいてスフェアの状態を判定することを含む。すなわち、スフェアの位相差画像を、スフェアの形状指標値と関連付けて分析することにより、スフェアの状態が判定される。判定されるスフェアの状態には、例えば、スフェアに含まれる複数の細胞の生存率、密度、均質性、未分化状態逸脱、及びスフェアの外形形状などが含まれる。
　スフェアの形状指標値として、例えば、スフェアの体積、断面積、粒径及び周の長さなどを用いることができる。スフェアの粒径及び周の長さは、スフェアに焦点を合わせた位相差画像（すなわち、スフェアの中央付近においてスライスした位相差画像）におけるスフェアの像から直接的に求めることが可能である。スフェアの断面積は、例えば、スフェアの粒径を直径とする円の断面積として導出することが可能である。スフェアの体積は、例えばスフェアの粒径を直径とする球の体積として導出することが可能である。
　開示の技術の実施形態に係る判定方法は、位相差画像を構成する複数の画素の各々の位相差量を積算した値である位相差量総和θＡを導出し、位相差量総和θＡと形状指標値との相関性を用いてスフェアの状態を判定することを含み得る。
　位相差量総和θＡは、下記の（３）式によって表わされる。但し、ｓは位相差画像の各画素ｋの面積であり、ｖｋは位相差画像の各画素ｋに対応する部位におけるスフェアの体積である。（３）式に示されるように、位相差量総和θＡは、スフェアの位相差画像の画素毎の位相差量θｋを、全ての画素ｋについて積算した値に相当する。なお、（３）式におけるｄｋは画素ｋに投影されたスフェア部分の厚みを示し、ｎｋはバックグラウンドである培養液とスフェア内部との屈折率差を表す。（３）式では、ｖｋ＝ｄｋ・sを用いた。ここで、（３）式により、位相差量総和θＡの単位は面積のスケールとなって、例えば[μｍ２]であるが、イメージセンサー間で比較を行わない場合には単に１ピクセルあたりの画素毎の位相差量θｋの和として位相差量総和θＡの単位を[pixel]とし、つまりs ＝ 1 [pixel]として扱ってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　開示の技術の実施形態に係る判定方法は、位相差量総和θＡとスフェアの形状指標値との相関性の基準を示す基準相関トレンドラインと、判定対象のスフェアについての位相差量総和θＡと形状指標値との相関性とを比較し、判定対象のスフェアについての相関性の、基準相関トレンドラインからの乖離の程度に応じて当該判定対象のスフェアの状態を判定することを含み得る。この場合において、判定対象のスフェアについての相関性の、基準相関トレンドラインからの乖離の幅が閾値を超える場合、当該判定対象のスフェアに含まれる細胞の生存率、密度、均質性及び前記スフェアの外形形状の少なくとも１つについて異常ありと判定してもよい。
　例えば、一方の軸に位相差量総和θＡをとり、他方の軸に形状指標値をとったグラフ上にプロットされた、判定対象のスフェアについてのプロットの、基準相関トレンドラインからの乖離の程度に応じて、当該判定対象のスフェアの状態を判定してもよい。この場合において、上記プロットの、基準相関トレンドラインからの乖離の幅が閾値を超える場合、当該判定対象のスフェアに含まれる細胞の生存率、密度、均質性及びスフェアの外形形状の少なくとも１つについて異常ありと判定してもよい。
　開示の技術の実施形態に係る判定方法は、基準相関トレンドラインと、判定対象の培養ロットに属する複数のスフェアの各々についての位相差量総和θＡと形状指標値との相関性とを比較し、判定対象の培養ロットについての相関性の、基準相関トレンドラインからの乖離の状態及び乖離の程度の少なくとも一方に応じて当該判定対象の培養ロットの良否判定を行うことを含み得る。
　例えば、一方の軸に位相差量総和θＡをとり、他方の軸に形状指標値をとったグラフ上にプロットされた、判定対象の培養ロットに属する複数のスフェアの各々についてのプロットの、基準相関トレンドラインからの乖離の状態及び乖離の程度の少なくとも一方に応じて当該培養ロットの良否判定を行ってもよい。
　例えば、健全なスフェア（標準サンプル）について予め取得した、位相差量総和θＡとスフェアの形状指標値との相関ラインを、基準相関トレンドラインとして用いることが可能である。また、判定対象のスフェアについての各プロットから、例えば最小二乗法を用いて導出される回帰線を、基準相関トレンドラインとして用いてもよい。
　開示の技術の実施形態に係る判定方法は、位相差量総和θＡを当該スフェアの体積で除算して位相差量密度ＤＰを導出し、導出した位相差量密度ＤＰに基づいて、当該スフェアの状態を判定することを含み得る。
　位相差量密度ＤＰは、下記の（４）式によって表わされる。但し、Ｖはスフェアの体積である。（４）式に示されるように、位相差量密度ＤＰは、位相差量総和θＡを当該スフェアの体積Ｖで除算した値に相当する。健全な細胞は、その恒常性から内部の屈折率は、媒質の屈折率とは異なる一定の値を維持すると考えられる。一方、死細胞は、恒常性を喪失し、内部の屈折率が媒質の屈折率と略同じになると考えられる。従って、位相差量密度ＤＰを、細胞の状態を示す指標として用いることが可能であると考えられる。例えば、判定対象のスフェアについて取得した位相差量密度ＤＰが、閾値以上である場合に当該スフェアの状態が良好であると判定することができ、位相差量密度ＤＰが、閾値未満である場合に当該スフェアの状態が異常であると判定することができる。なお、２π／λは、定数として扱うことができるので、位相差量密度ＤＰの導出に際し、２π／λの乗算を省略してもよい。ここで、スフェアの体積平均屈折率差ＮａｖｅをＮａｖｅ=Σｎｋ ・ （ｖｋ／Ｖ）とすると、（４）式は、ＤＰ = ( ２π／ λ) ×Ｎａｖｅとなることから、位相差密度は体積平均したスフェアの屈折率差を波長の長さで規格化した値である。本明細書において、Ｖはスフェアの位相像の断面画像から球相当径を算出して求めた。より正確に楕円球とすることも可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　開示の技術に係る判定方法の実施例を以下に示す。
［実施例１］
　三次元培養法により培養したｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）のスフェアを、図１に示す撮像システム１のサンプルステージにセットし、複数のスフェアのホログラムをＣＭＯＳカメラ１９によって撮影した。取得した各スフェアのホログラムに対してコンピュータによる数値計算を実施することにより、スフェアの中央付近においてスライスした位相差画像を取得した。
　得られた各スフェアの位相差画像から、各スフェアの形状指標値として体積を導出した。更に、各スフェアの位相差画像について、（３）式によって示される位相差量総和θＡを導出した。横軸にスフェアの体積をとり、縦軸に位相差量総和θＡをとったグラフ上に、各スフェアについてプロットを形成することにより、スフェアの体積と位相差量総和θＡの相関特性を取得した。図８は、スフェアの体積と位相差量総和θＡとの相関特性を示すグラフである。図８に示すように、位相差量総和θＡとスフェアの体積とは、比例関係であることが確認された。図８には、スフェアの体積と位相差量総和θＡとの間の相関性の基準を示す基準相関トレンドラインＬＳ及びプロットが示されている。図８に示す各プロットから、導出した回帰線を、基準相関トレンドラインＬＳとして適用した。
　図８には、基準相関トレンドラインＬＳ上に存在するプロットａ１及びａ２に対応するスフェアの位相差画像、及び基準相関トレンドラインＬＳから乖離した位置に存在するプロットａ３、ａ４、ａ５に対応するスフェアの位相差画像が示されている。基準相関トレンドラインＬＳ上に存在するプロットａ１及びａ２に対応するスフェアについては、スフェアの全体に亘って輝度が均一な位相差画像が得られた。このことは、スフェアを構成する複数の細胞が均質であること、及びスフェア内における細胞の密度が均一であること等を示している。一方、基準相関トレンドラインＬＳから乖離した位置に存在するプロットａ３及びａ４に対応するスフェアについては、中心部の輝度が他の部位と比較して低下している位相差画像が得られた。このことは、スフェアを構成する複数の細胞が不均質であること、及びスフェア内における細胞の密度が不均一であること等を示している。また、基準相関トレンドラインＬＳから乖離した位置に存在するプロットａ５に対応するスフェアについては、スフェアの輪郭線の凹凸が顕著な位相差画像が得られた。このことは、スフェアを構成する細胞に異常が生じていること等を示している。
　以上の結果から、位相差量総和θＡと、スフェアの形状指標値の一例である体積との相関性を用いてスフェアの状態を判定することが可能であるといえる。また、位相差量総和θＡとスフェアの体積との相関性を示す基準相関トレンドラインＬＳと、判定対象のスフェアについての位相差量総和θＡと形状指標値との相関性とを比較し、判定対象のスフェアについての相関性の、基準相関トレンドラインＬＳからの乖離の程度に応じて当該スフェアの状態を判定することが可能であるといえる。具体的には、一方の軸にスフェアの体積をとり、他方の軸に位相差量総和θＡをとったグラフ上にプロットした、判定対象のスフェアについてのプロットの、基準相関トレンドラインＬＳからの乖離の程度に応じて、各スフェアの状態を判定することが可能であるといえる。従って、例えば、位相差量総和θＡの基準相関トレンドラインＬＳからのマイナス幅が閾値以上であるスフェアについては、当該スフェアに含まれる複数の細胞の密度、均質性、及びスフェアの外形形状のうちの少なくとも１つに異常があると判定することができる。
　なお、本実施例では、スフェアの形状指標値としてスフェアの体積を用いたが、これに代えて、スフェアの断面積、粒径または周の長さを用いることも可能である。これらいずれの形状指標値を用いる場合でも、位相差量総和θＡとの相関性を用いてスフェアの状態を判定することが可能である。
［実施例２］
　本実施例では、複数のスフェアを含む培養ロットを判定対象とした。判定対象の培養ロットは、下記の表１に示す良ロット及び不良ロットである。良ロットに属するスフェア及び不良ロットに属するスフェアは、それぞれ、三次元培養法により培養したｉＰＳ細胞のスフェアである。培養期間の初日から５日目までの細胞の増殖率は、良ロットに属するスフェアおいては２０倍であり、不良ロットに属するスフェアにおいては３．７倍であった。培養５日目における細胞の生存率は、良ロットに属するスフェアおいては９０．２％であり、不良ロットに属するスフェアにおいては６４．１％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　良ロット及び不良ロットの各々について、試料１４であるスフェアを図１に示す撮像システム１のサンプルステージにセットし、複数のスフェアのホログラムをＣＭＯＳカメラ１９によって撮影した。取得した各スフェアのホログラムに対してコンピュータによる数値計算を実施することにより、スフェアの中央付近においてスライスした位相差画像を取得した。
　得られた各スフェアの位相差画像から、各スフェアの粒径を導出し、スフェアの粒径のヒストグラムを取得した。図９Ａは、良ロット及び不良ロットの各々について導出したスフェアの粒径のヒストグラムである。図９Ａに示すように、良ロットと不良ロットとの間でヒストグラムに有意な差はみられなかった。このことは、スフェアの状態は、当該スフェアの粒径に反映されにくく、スフェアの粒径のみに基づいてスフェアの状態を判定することは困難であることを示している。
　次に、良ロット及び不良ロットの各々について得られた各スフェアの位相差画像から、各スフェアの形状指標値として体積を導出し、更に、各スフェアの位相差画像について、（３）式によって示される位相差量総和θＡを導出した。横軸に、スフェアの体積をとり、縦軸に位相差量総和θＡをとったグラフ上に、各培養ロットの各スフェアについてプロットを形成することにより、スフェアの体積と位相差量総和θＡの相関特性を取得した。図９Ｂは、良ロット及び不良ロットの各々について取得した、スフェアの体積と位相差量総和θＡの相関特性を示すグラフである。図９Ｂには、基準相関トレンドラインＬＳ及びプロットが示されている。図９Ｂに示すように、良ロットにおいては、位相差量総和θＡが基準相関トレンドラインＬＳを下回るスフェアが少数であるのに対し、不良ロットにおいては、位相差量総和θＡが基準相関トレンドラインＬＳを下回るスフェアが、良ロットと比べて、多数存在した。
　以上の結果から、位相差量総和θＡと、スフェアの形状指標値の一例である体積との相関性を用いて培養ロットの良否判定を行うことが可能であるといえる。また、位相差量総和θＡとスフェアの体積との相関性を示す基準相関トレンドラインＬＳと、判定対象の培養ロットに属するスフェアについての相関性とを比較し、判定対象の培養ロットについての相関性の、基準相関トレンドラインＬＳからの乖離の程度に応じて当該培養ロットの良否判定が可能であるといえる。具体的には、一方の軸にスフェアの体積をとり、他方の軸に位相差量総和θＡをとったグラフ上にプロットした判定対象の培養ロットに属する各スフェアについてのプロットの、基準相関トレンドラインＬＳからの乖離の状態（基準相関トレンドラインＬＳを下回っているか否か）及び乖離の程度の少なくとも一方に基づいて当該培養ロットの状態を判定することが可能であるといえる。従って、例えば、位相差量総和θＡの基準相関トレンドラインＬＳからのマイナス幅が第１の閾値以上であるスフェアの含有率が、第２の閾値以上である場合、当該培養ロットが不良ロットであると判定することができ、上記含有率が、第２の閾値未満である場合、当該培養ロットが良ロットであると判定することができる。
　次に、良ロット及び不良ロットの各々について得られた各スフェアの位相差画像から、（４）式によって示される位相差量密度ＤＰを導出した。図９Ｃは、良ロット及び不良ロットの各々について取得した、位相差量密度ＤＰのヒストグラムである。図９Ｃに示すように、良ロットと不良ロットとの間で、ヒストグラムに有意な差が見られた。具体的には、良ロットにおいては、位相差量密度ＤＰが相対的に高い位置に分布のピークが存在し、不良ロットにおいては、位相差量密度ＤＰが相対的に低い位置に分布のピークが存在した。なお、位相差量密度ＤＰのヒストグラムにおける良ロットと不良ロットとの間の有意差の信頼性を示す指標であるｐ値（有意確率）は、０．０５未満であった。
　以上の結果から、スフェアの位相差量密度ＤＰに基づいて、培養ロットの良否判定を行うことが可能であるといえる。従って、例えば、判定対象の培養ロットに属する複数のスフェアについて、位相差量密度ＤＰの平均値を求め、上記平均値が閾値以上である場合に、当該培養ロットを良ロットと判定することができ、上記平均値が閾値未満である場合に、当該培養ロットを不良ロットと判定することができる。
　なお、本実施例では、位相差量密度ＤＰを培養ロットの良否判定に用いる場合を例示したが、位相差量密度ＤＰをスフェア単体の良否判定に用いることも可能である。例えば、判定対象のスフェアについて取得した位相差量密度ＤＰが閾値以上である場合に、当該スフェアの状態が良好であると判定することができ、位相差量密度ＤＰが閾値未満である場合に、当該スフェアの状態が異常であると判定することができる。
［実施例３］
　本実施例では、互いに異なる複数の培養ロットに属する複数のスフェアを判定対象とした。判定対象のスフェアは、いずれも三次元培養法により培養したｉＰＳ細胞のスフェアである。
　複数の培養ロットの各々について、試料１４であるスフェアを図１に示す撮像システム１のサンプルステージにセットし、複数のスフェアのホログラムをＣＭＯＳカメラ１９によって撮影した。取得した各スフェアのホログラムに対してコンピュータによる数値計算を実施することにより、スフェアの中央付近においてスライスした位相差画像を取得した。得られた各スフェアの位相差画像について、（４）式によって示される位相差量密度ＤＰを培養ロット毎に導出した。
　次に、複数の培養ロットの各々について、細胞の生存率を取得した。生存率の測定手順は以下のとおりである。遠沈管に収容したスフェアを４００Ｇ（Ｇ：重力加速度）、３分間の遠心分離処理を実施した。遠沈管の底に沈殿したスフェアを回収し、細胞解離酵素であるTrypLE（登録商標） Selectを用いて単一細胞に分解した。分解した細胞に対してTrypan Blueによる死細胞染色処理を施した後、細胞を、市販されている一般的なセルカウンタ（Countess（登録商標）） を用いて計数することにより、染色された死細胞の個数をカウントした。死細胞のカウント数から細胞の生存率を培養ロット毎に導出した。
　横軸に細胞の生存率をとり、縦軸に位相差量密度ＤＰをとったグラフ上に、各培養ロットについてプロットを形成することにより、細胞の生存率と位相差量密度ＤＰ（ロット平均値）との相関特性を取得した。図１０は、細胞の生存率と位相差量密度ＤＰ（ロット平均値）との相関特性を示すグラフである。図１０に示すように、細胞の生存率と、位相差量密度ＤＰとは比例関係であることが確認された。
　以上の結果より、位相差量密度ＤＰから細胞の生存率を推定できるといえる。位相差量密度ＤＰから細胞の生存率を推定することにより、遠心分離処理及び染色処理等の細胞の破壊を伴う処理を行うことなく（すなわち非破壊で）、細胞の生存率を把握することができる。例えば、細胞の生存率と位相差量密度ＤＰとの相関性を示す相関ラインを予め取得しておき、判定対象の培養ロットに属するスフェアについて取得した位相差量密度ＤＰの平均値と、上記の相関ラインとから当該培養ロットにおける細胞の生存率を推定することが可能である。
　なお、本実施例では、位相差量密度ＤＰから培養ロット内における細胞の生存率を推定する場合を例示したが、位相差量密度ＤＰから単一のスフェア内における細胞の生存率を推定することも可能である。例えば、細胞の生存率と位相差量密度ＤＰとの相関性を示す相関ラインを予め取得しておき、判定対象のスフェアについて取得した位相差量密度ＤＰと、上記の相関ラインとから当該スフェア内における細胞の生存率を推定することが可能である。
［実施例４］
　細胞の生存率が、位相差画像に与える影響について確認した。二次元培養法（接着培養法）により培養したｉＰＳ細胞をネクローシスに誘導するべく、細胞のコロニーに３ｗｔ％のＨ２Ｏ２（過酸化水素）を添加した後、蛍光色素であるSYTOX（登録商標） Greenによる染色処理を施した。続いて、上記の処理を施したコロニーを図１に示す撮像システム１のサンプルステージにセットし、コロニーのホログラムをＣＭＯＳカメラ１９によって撮影した。取得したホログラムに対してコンピュータによる数値計算を実施することにより、コロニーの位相差画像を取得した。ホログラム撮影と並行して、蛍光顕微鏡画像をＣＭＯＳカメラ３６によって撮影した。
　図１１Ａ、図１１Ｂ、及び図１１Ｃは、それぞれ、Ｈ２Ｏ２を添加した後、０分経過した時点、１５分経過した時点、３７経過した時点におけるコロニーの蛍光顕微鏡画像である。図１２Ａ、図１２Ｂ、及び図１２Ｃは、それぞれ、Ｈ２Ｏ２を添加した後、０分経過した時点、１５分経過した時点、３７分経過した時点におけるコロニーの位相差画像である。
　図１１Ａ～図１１Ｃに示すように、Ｈ２Ｏ２を添加した時点からの時間経過に伴って、発光箇所が増加した。このことは、Ｈ２Ｏ２を添加した時点からの時間経過に伴って、死細胞が増加したこと（換言すれば、細胞の生存率が低下したこと）を意味する。また、図１２Ａ～図１２Ｃに示すように、Ｈ２Ｏ２を添加した時点からの時間経過に伴って、位相差画像における低輝度領域の面積が増加した。このことは、細胞の生存率の低下に伴って、位相差画像における位相差量総和θＡが低下することを意味する。このように、細胞の生存率が、位相差量総和θＡに影響を及ぼすことが確認できた。
［実施例５］
　二次元培養法（接着培養法）により培養したｉＰＳ細胞のコロニーにＨ２Ｏ２を添加することにより、ネクローシスに誘導した。また、別のｉＰＳ細胞のコロニーについて、PromoKine社のApoptosis Inducer Setを用いてアポトーシスに誘導した。なお、アポトーシスは、多細胞生物の細胞において増殖制御機構として管理・調節された能動的な細胞死である。一方、ネクローシスは、栄養不足、毒物、外傷などの外的環境要因により起こる受動的な細胞死であり、細胞死に至る過程がアポトーシスと異なる。
　上記の処理を施したコロニー及び健全なコロニーを図１に示す撮像システム１のサンプルステージにセットし、各コロニーのホログラムをＣＭＯＳカメラ１９によって撮影した。取得したホログラムに対してコンピュータによる数値計算を実施することにより、各コロニーの位相差画像を取得した。各コロニーの位相差画像について、（３）式によって示される位相差量総和θＡを導出した。
　図１３は、ネクローシスに誘導したコロニー（死細胞）、アポトーシスに誘導したコロニー（死細胞）及び健全なコロニー（生細胞）のそれぞれの位相差量総和θＡの相対値を示すグラフである。なお、健全なコロニー（生細胞）の位相差量総和θＡを１とした。図１３に示すように、健全なコロニー（生細胞）と、ネクローシスに誘導したコロニー（死細胞）及びアポトーシスに誘導したコロニー（死細胞）との間で、位相差量総和θＡに有意な差が見られた。有意差の信頼性を示す指標であるｐ値（有意確率）は、０．０５未満であった。
　以上の結果から細胞死に至る過程が、ネクローシスであるかアポトーシスであるかにかかわらず、位相差量総和θＡを、細胞の生死の判別に利用できるといえる。例えば、判定対象のスフェアについて取得した位相差量総和θＡが、閾値以上である場合、当該スフェアは、生細胞をより多く含むと判定することができ、判定対象のスフェアについて取得した位相差量総和θＡが、閾値未満である場合、当該スフェアは、死細胞をより多く含むと判定することができる。なお、位相差量総和θＡに代えて位相差量密度ＤＰを、細胞の生死の判別に利用することも可能である。
［実施例６］
　未分化状態を維持したｉＰＳ細胞のスフェア及び未分化状態を逸脱したｉＰＳ細胞のスフェアを、図１に示す撮像システム１のサンプルステージにセットし、各スフェアのホログラムをＣＭＯＳカメラ１９によって撮影した。取得した各スフェアのホログラムに対してコンピュータによる数値計算を実施することにより、スフェアの中央付近においてスライスした位相差画像を取得した。各スフェアの位相差画像について、（３）式によって示される位相差量総和θＡを導出した。なお、未分化状態を逸脱したスフェアについては、未分化状態の維持に必要な成分を添加しない基礎培地を用いることにより未分化逸脱状態に誘導した。
　図１４は、未分化状態を維持したスフェア及び未分化状態を逸脱したスフェアのそれぞれの位相差量総和θＡの平均値を示すグラフである。図１４に示すように、未分化状態を維持したスフェアと、未分化状態を逸脱したスフェアとの間で、位相差量総和θＡに有意な差が見られた。
　以上の結果から、位相差量総和θＡを、幹細胞における未分化状態を維持しているか、未分化状態を逸脱しているかの判定に利用できるといえる。例えば、判定対象のスフェアについて取得した位相差量総和θＡが、閾値以上である場合に当該スフェアが未分化状態を維持していると判定することができ、判定対象のスフェアについて取得した位相差量総和θＡが閾値未満である場合に当該スフェアが未分化状態を逸脱したと判定することができる。なお、位相差量総和θＡに代えて位相差量密度ＤＰを、未分化状態を維持しているか、未分化状態を逸脱しているかの判定に利用することも可能である。
　以上の説明から明らかなように、開示の技術の実施形態に係る判定方法によれば、スフェアのホログラムから生成された位相差画像と当該スフェアの形状に応じた形状指標値とに基づいて、スフェアの状態が判定されるので、スフェアの状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能である。
　すなわち、開示の技術の実施形態に係る判定方法によれば、従来の光学顕微鏡では把握し得ないスフェアの内部における細胞の密度及び生存率などについても判定することができる。また、本判定方法において実施されるホログラムの撮影、画像解析及び統計処理などについては、コンピュータによる自動化が容易であり、従来の手法と比較して、人手及び処理時間を削減することができる。また、作業者による手技のばらつきが影響することもなく、安定した判定結果を得ることができる。また、スフェアを単一細胞に分解したり、蛍光色素を添加したりするといった細胞の破壊を伴う処理を行うことなく、スフェアの状態を非破壊で判定することが可能である。また、ホログラム撮影は、三次元空間中にランダムに存在するスフェアについても容易に行うことが可能であり、三次元培養法による培養中のスフェアの状態を、その場で判定することも可能である。
　また、スフェアの状態の判定において、球形状のスフェアの中央付近においてスライスした位相差画像を用いることにより、より正確な判定結果を得ることができる。球形状のスフェアの中央付近においてスライスした１枚の位相差画像を用いることにより、スライス位置が互いに異なる複数の位相差画像を用いる場合と比較して、判定に要する処理を簡略化することができる。
　開示の技術に係る判定方法は、複数の細胞の凝集体であるスフェアを撮像したホログラムからスフェアの位相差画像を生成し、位相差画像とスフェアの形状に応じた形状指標値とに基づいて、スフェアの状態を判定することを含む。
　開示の技術に係る判定方法によれば、スフェアの状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。
　開示の技術に係る判定方法において、位相差画像と形状指標値とに基づいて、スフェアに含まれる複数の細胞の生存率、密度、均質性、未分化状態逸脱、及びスフェアの外形形状の少なくとも１つに関する判定を行ってもよい。
　開示の技術に係る判定方法において、位相差画像を構成する複数の画素の各々の位相差量を積算した値である位相差量総和を導出し、位相差量総和と形状指標値との相関性を用いてスフェアの状態を判定してもよい。
　スフェアの状態の判定に位相差量総和と形状指標値との相関性を用いることにより、スフェアの状態について適確な判定を行うことが可能となる。
　開示の技術に係る判定方法において、位相差量総和と形状指標値との相関性の基準を示す基準相関トレンドラインと、判定対象のスフェアについての位相差量総和と形状指標値との相関性とを比較し、判定対象のスフェアについての位相差量総和と形状指標値との相関性の、基準相関トレンドラインからの乖離の程度に応じて判定対象のスフェアの状態を判定してもよい。例えば、判定対象のスフェアについての位相差量総和と形状指標値との相関性の、基準相関トレンドラインからの乖離の幅が閾値を超える場合、判定対象のスフェアに含まれる細胞の生存率、密度、均質性及びスフェアの外形形状の少なくとも１つについて異常ありと判定してもよい。
　この態様によれば、スフェアの状態判定の適確性を更に高めることが可能となる。
　開示の技術に係る判定方法において、位相差量総和と形状指標値との相関性の基準を示す基準相関トレンドラインと、判定対象の培養ロットに属する複数のスフェアの各々についての位相差量総和と形状指標値との相関性とを比較し、判定対象の培養ロットについての位相差量総和と形状指標値との相関性の、基準相関トレンドラインからの乖離の状態及び乖離の程度の少なくとも一方に応じて判定対象の培養ロットの良否判定を行ってもよい。
　この態様によれば、複数のスフェアを含む培養ロットについての良否判定を適確に行うことが可能となる。
　開示の技術に係る判定方法において、形状指標値は、スフェアの体積、断面積、粒径及び周の長さのいずれかであってもよい。
　開示の技術に係る判定方法において、位相差画像を構成する複数の画素の各々の位相差量を積算した値である位相差量総和を、スフェアの体積で除算して位相差量密度を導出し、位相差量密度に基づいて、スフェアの状態を判定してもよい。
　スフェアの状態を判定に位相差量密度を用いることにより、スフェアの状態について適確な判定を行うことが可能となる。
　開示の技術に係る判定方法において、スフェアの状態の判定に用いる位相差画像は、ホログラムから生成可能な複数の位相差画像のうち、位相差画像を構成する複数の画素間の位相差量のばらつきが最大となる位相差画像であることが好ましい。
　スフェアの状態の判定に用いる位相差画像として、上記の画像を用いることで、当該位相差画像から、スフェアの実態に合致したより正確な情報を得ることができ、スフェアの状態判定の適確性を更に高めることが可能となる。
１　撮像システム
１０　ホログラム光学系
１１　レーザ光源
１２　ビームスプリッタ
１３　コリメートレンズ
１４　試料
１５　対物レンズ
１７　結像レンズ
１８　ビームスプリッタ
１９、３６　ＣＭＯＳカメラ
２０　光ファイバ
２１　コリメートレンズ
３０　蛍光顕微鏡光学系
３１　励起光源
３２　励起用フィルタ
３３　ＯＮ／ＯＦＦ切り替えミラー
３４　ダイクロイックミラー
３５　分光フィルタ
５００　コンピュータ
５０２　主記憶装置
５０３　補助記憶装置
５０４　通信インターフェース
５０５　表示部
５０６　オートフォーカスプログラム
５０７　バス
ＤＰ　位相差量密度
ＩＰ　位相差画像
ＬＳ　基準相関トレンドライン
θ　位相差量
θＢ　バックグランドの位相
θＳ　スフェアの存在する領域の位相
θＡ　位相差量総和
θｋ　１画素の位相差量
Ｖ　スフェアの体積
ｖｋ　位相差画像の各画素ｋに対応する部位におけるスフェアの体積
ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、ａ５　プロット
ｋ　画素
ｗ　カーブの幅

Claims (9)

  1. 　複数の細胞の凝集体であるスフェアを撮像したホログラムから前記スフェアの位相差画像を生成し、
    　前記位相差画像と前記スフェアの形状に応じた形状指標値とに基づいて、前記スフェアの状態を判定する
    　判定方法。
  2. 　前記位相差画像と前記形状指標値とに基づいて、前記スフェアに含まれる複数の細胞の生存率、密度、均質性、未分化状態逸脱、及び前記スフェアの外形形状の少なくとも１つに関する判定を行う
    　請求項１に記載の判定方法。
  3. 　前記位相差画像を構成する複数の画素の各々の位相差量を積算した値である位相差量総和を導出し、
    　前記位相差量総和と前記形状指標値との相関性を用いて前記スフェアの状態を判定する
    　請求項１または請求項２に記載の判定方法。
  4. 　前記位相差量総和と前記形状指標値との相関性の基準を示す基準相関トレンドラインと、判定対象のスフェアについての位相差量総和と形状指標値との相関性とを比較し、
    　前記判定対象のスフェアについての位相差量総和と形状指標値との相関性の、前記基準相関トレンドラインからの乖離の程度に応じて前記判定対象のスフェアの状態を判定する
    　請求項３に記載の判定方法。
  5. 　前記判定対象のスフェアについての位相差量総和と形状指標値との相関性の、前記基準相関トレンドラインからの乖離の幅が閾値を超える場合、前記判定対象のスフェアに含まれる細胞の生存率、密度、均質性及び前記スフェアの外形形状の少なくとも１つについて異常ありと判定する
    　請求項４に記載の判定方法。
  6. 　前記位相差量総和と前記形状指標値との相関性の基準を示す基準相関トレンドラインと、判定対象の培養ロットに属する複数のスフェアの各々についての位相差量総和と形状指標値との相関性とを比較し、
    　前記判定対象の培養ロットについての位相差量総和と形状指標値との相関性の、前記基準相関トレンドラインからの乖離の状態及び乖離の程度の少なくとも一方に応じて前記判定対象の培養ロットの良否判定を行う
    　請求項３に記載の判定方法。
  7. 　前記形状指標値は、前記スフェアの体積、断面積、粒径及び周の長さのいずれかである
    　請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の判定方法。
  8. 　前記位相差画像を構成する複数の画素の各々の位相差量を積算した値である位相差量総和を、前記スフェアの体積で除算して位相差量密度を導出し、
    　前記位相差量密度に基づいて、前記スフェアの状態を判定する
    　請求項１または請求項２に記載の判定方法。
  9. 　前記スフェアの状態の判定に用いる位相差画像は、前記ホログラムから生成可能な複数の位相差画像のうち、位相差画像を構成する複数の画素間の位相差量のばらつきが最大となる位相差画像である
    　請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の判定方法。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020066348A1 (ja) * 2018-09-28 2020-04-02 富士フイルム株式会社 判定方法
WO2020066344A1 (ja) * 2018-09-28 2020-04-02 富士フイルム株式会社 判定方法
WO2021085033A1 (ja) * 2019-10-28 2021-05-06 富士フイルム株式会社 多能性幹細胞の選別方法、分化誘導結果の予測方法及び細胞製品の製造方法
WO2021085034A1 (ja) * 2019-10-28 2021-05-06 富士フイルム株式会社 多能性幹細胞の選別方法、分化誘導結果の予測方法及び細胞製品の製造方法
CN112765624A (zh) * 2021-01-19 2021-05-07 浙江科技学院 基于相位优化和稀疏约束的可认证纯相位全息图生成方法
WO2022215499A1 (ja) 2021-04-09 2022-10-13 富士フイルム株式会社 ホログラフィー装置及び細胞の評価方法
WO2022224722A1 (ja) 2021-04-21 2022-10-27 富士フイルム株式会社 評価値の取得方法
WO2023233827A1 (ja) * 2022-06-03 2023-12-07 富士フイルム株式会社 位相画像取得方法及び定量データ取得方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220254490A1 (en) * 2021-02-05 2022-08-11 Anvitha Addanki Data processing system for estimating disease progression rates

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080309944A1 (en) * 2006-04-21 2008-12-18 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Quantitative phase-contrast digital holography method for the numerical reconstruction of images, and relevant apparatus
JP2009521216A (ja) * 2005-12-22 2009-06-04 フェイズ ホログラフィック イメージング ペーハーイー アーベー 細胞サンプル分析のための方法と装置
JP2015146747A (ja) 2014-02-05 2015-08-20 浜松ホトニクス株式会社 細胞判定方法
JP2015192644A (ja) * 2014-03-26 2015-11-05 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス スフェロイドの評価方法およびスフェロイド評価装置
JP2016005437A (ja) 2014-06-20 2016-01-14 富士フイルム株式会社 細胞評価装置および方法並びにプログラム
JP2017000163A (ja) 2016-09-29 2017-01-05 株式会社ニコン 細胞評価装置、細胞評価方法およびプログラム
US20170261930A1 (en) * 2011-07-19 2017-09-14 Ovizio Imaging Systems NV/SA Method and system for detecting and/or classifying cancerous cells in a cell sample

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8531747B2 (en) * 2009-06-24 2013-09-10 Canon Kabushiki Kaisha Hologram, hologram data generation method, and exposure apparatus
US9977859B2 (en) * 2010-06-17 2018-05-22 Purdue Reserach Foundation Digital holographic method of measuring cellular activity and of using results to screen compounds
WO2014132781A1 (ja) * 2013-03-01 2014-09-04 シチズンホールディングス株式会社 光束分割素子
JP6388036B2 (ja) 2014-11-27 2018-09-12 株式会社島津製作所 ディジタルホログラフィ装置及びディジタルホログラム生成方法
JP6256669B1 (ja) * 2016-03-18 2018-01-10 株式会社村田製作所 金属製多孔膜、それを用いた分級方法、および分級装置
US10846849B2 (en) * 2016-06-16 2020-11-24 Hitachi High-Tech Corporation Method for analyzing state of cells in spheroid
JP7053853B2 (ja) * 2018-08-20 2022-04-12 富士フイルム株式会社 細胞培養方法及び細胞培養装置
WO2020066306A1 (ja) * 2018-09-28 2020-04-02 富士フイルム株式会社 細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009521216A (ja) * 2005-12-22 2009-06-04 フェイズ ホログラフィック イメージング ペーハーイー アーベー 細胞サンプル分析のための方法と装置
US20080309944A1 (en) * 2006-04-21 2008-12-18 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Quantitative phase-contrast digital holography method for the numerical reconstruction of images, and relevant apparatus
US20170261930A1 (en) * 2011-07-19 2017-09-14 Ovizio Imaging Systems NV/SA Method and system for detecting and/or classifying cancerous cells in a cell sample
JP2015146747A (ja) 2014-02-05 2015-08-20 浜松ホトニクス株式会社 細胞判定方法
JP2015192644A (ja) * 2014-03-26 2015-11-05 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス スフェロイドの評価方法およびスフェロイド評価装置
JP2016005437A (ja) 2014-06-20 2016-01-14 富士フイルム株式会社 細胞評価装置および方法並びにプログラム
JP2017000163A (ja) 2016-09-29 2017-01-05 株式会社ニコン 細胞評価装置、細胞評価方法およびプログラム

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARQUET, P. ET AL.: "Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axaial accuracy", OPTICS LETTERS, vol. 30, no. 5, 2005, pages 468 - 470, XP007903217, ISSN: 0146-9592, doi:10.1364/OL.30.000468 *
MIHAILESCU, M. ET AL.: "Automated imaging, identification, and counting of similar cells from digital hologram reconstructions", APPLIED OPTICS, vol. 50, no. 20, 2011, pages 3589 - 3597, XP001564222, ISSN: 0003-6935, doi:10.1364/AO.50.003589 *
See also references of EP3766984A4

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7123155B2 (ja) 2018-09-28 2022-08-22 富士フイルム株式会社 判定方法
WO2020066348A1 (ja) * 2018-09-28 2020-04-02 富士フイルム株式会社 判定方法
JP7046211B2 (ja) 2018-09-28 2022-04-01 富士フイルム株式会社 判定方法
JPWO2020066344A1 (ja) * 2018-09-28 2021-05-20 富士フイルム株式会社 判定方法
WO2020066344A1 (ja) * 2018-09-28 2020-04-02 富士フイルム株式会社 判定方法
JPWO2020066348A1 (ja) * 2018-09-28 2021-09-16 富士フイルム株式会社 判定方法
US11869181B2 (en) 2018-09-28 2024-01-09 Fujifilm Corporation Determination method
WO2021085033A1 (ja) * 2019-10-28 2021-05-06 富士フイルム株式会社 多能性幹細胞の選別方法、分化誘導結果の予測方法及び細胞製品の製造方法
WO2021085034A1 (ja) * 2019-10-28 2021-05-06 富士フイルム株式会社 多能性幹細胞の選別方法、分化誘導結果の予測方法及び細胞製品の製造方法
CN112765624A (zh) * 2021-01-19 2021-05-07 浙江科技学院 基于相位优化和稀疏约束的可认证纯相位全息图生成方法
CN112765624B (zh) * 2021-01-19 2022-05-27 浙江科技学院 基于相位优化和稀疏约束的可认证纯相位全息图生成方法
WO2022215499A1 (ja) 2021-04-09 2022-10-13 富士フイルム株式会社 ホログラフィー装置及び細胞の評価方法
WO2022224722A1 (ja) 2021-04-21 2022-10-27 富士フイルム株式会社 評価値の取得方法
WO2023233827A1 (ja) * 2022-06-03 2023-12-07 富士フイルム株式会社 位相画像取得方法及び定量データ取得方法

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