WO2020066306A1 - 細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路 - Google Patents

細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路 Download PDF

Info

Publication number
WO2020066306A1
WO2020066306A1 PCT/JP2019/030861 JP2019030861W WO2020066306A1 WO 2020066306 A1 WO2020066306 A1 WO 2020066306A1 JP 2019030861 W JP2019030861 W JP 2019030861W WO 2020066306 A1 WO2020066306 A1 WO 2020066306A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell structure
cell
flow path
gel
cell suspension
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/030861
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
智瑛 倉員
亮 松野
一憲 高橋
Original Assignee
富士フイルム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士フイルム株式会社 filed Critical 富士フイルム株式会社
Priority to JP2020548095A priority Critical patent/JP7159334B2/ja
Publication of WO2020066306A1 publication Critical patent/WO2020066306A1/ja
Priority to US17/205,432 priority patent/US20210207120A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/06—Tubular
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0012—Cell encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/74—Alginate

Definitions

  • the disclosed technology relates to a cell structure, a method for producing the cell structure, a cell culture method, and a microchannel.
  • Japanese Patent Application Publication No. 2016-53652 describes a capsule including a liquid core containing cells having hematopoietic activity and a gel-like shell surrounding the liquid core.
  • This capsule is formed through the following steps. a) separately moving a first liquid solution containing hematopoietic cells and a second liquid solution containing a gellable liquid polyelectrolyte in a jacket; b) at an outlet of the jacket. Forming a series of droplets, each droplet comprising a central core formed of a first solution, and a peripheral film formed of a second solution and completely covering the central core; c.
  • Each droplet is immersed in a gel solution containing a reagent capable of reacting with the polyelectrolyte of the film, and the droplet transitions from a liquid state to a gel state to form a gel-like shell. Forming; d) collecting the formed capsules.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2017-154070 discloses a capsule containing a biological substance, wherein the capsule is a polymer having a communicating porous structure, and a skin layer is present on an outer surface and an inner surface. Are listed.
  • Japanese Patent Application Laid-Open Publication No. 2017-154070 describes a culture method for culturing cells or microorganisms in a three-dimensional direction using this capsule.
  • Japanese Patent No. 563,077 describes a microfiber including a microgel fiber coated with a high-strength hydrogel, wherein the microgel fiber contains a cell or a cell culture.
  • Japanese Patent No. 5633077 discloses that a sodium alginate solution before crosslinking is divided into a core portion and a shell portion containing cells so as to be coaxial and injected to form a coaxial core-shell fluid, Is introduced into an aqueous solution containing calcium chloride to cause gelation, whereby a microfiber composed of two types of gels, an inner (core) and an outer (shell), is described.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • the cells fuse with each other to form a cell aggregate (sphere).
  • the size of the cell aggregate (sphere) is excessive, supply of oxygen and nutrients to the center of the cell aggregate becomes insufficient, and cells in the center of the aggregate may be necrotic.
  • a method of coating the periphery of a cell suspension containing a plurality of cells with a gel-like substance is considered.
  • a method for producing a cell structure in which the periphery of a cell suspension is covered with a gel-like substance for example, there is a method in which the cell structure is formed into a fiber shape as described in Japanese Patent No. 5633077.
  • fiber-like cell structures are difficult to handle. For example, when a plurality of fiber-like cell structures are dispersed in a culture medium and cultured, the fiber-like cell structures are entangled with each other, and a larger aggregate is generated. Supply may be insufficient.
  • the fiber-like cell structure may be divided into individual pieces.
  • a method of singulation a method of cutting a fiber-like cell structure with a cutting tool such as a cutter after gelation of a gel-like substance, a method of pulling a fiber-like cell structure by applying a pulling force, and the like Can be considered.
  • the cut surface exposed by the cutting is not covered with the gel-like substance, and the cell suspension may leak from the cut portion.
  • the tip of the tearing portion is stretched in the pulling direction, and the thickness of the gel-like substance in the portion is compared with other portions. It gets thicker. From the portion where the thickness of the gel-like substance becomes excessive, it may be difficult to take in oxygen and nutrients.
  • the fiber-like cell structure is singulated after the gel-like substance is gelled, it is difficult to form a structure suitable for culture.
  • a liquid droplet containing cells and a gel precursor is gelled.
  • a method of dropping the agent when a droplet containing cells and a gel precursor is dropped onto the gelling agent, the droplet is exposed to the atmosphere, and the cells are contaminated by a contamination source such as bacteria and viruses. There is a risk.
  • the shape of the cell structure produced by this method is spherical.
  • the ratio of the volume of the gel-like substance to the volume of the cell increases.
  • the gel-like substance covering the cells is removed in a subsequent step. It is assumed that the removal of the gel substance is performed by dissociating the gel substance using a chelating agent such as EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid). If the ratio of the volume of the gel-like substance to the volume of the cells is large, the treatment time with the chelating agent becomes long, and the damage to the cells becomes large.
  • the disclosed technique is a cell structure having a structure suitable for culture, a cell structure having a structure suitable for culture, a cell structure manufacturing method, a cell culture method, and a cell structure in which a cell suspension containing a plurality of cells is covered with a gel-like substance.
  • a microchannel is provided.
  • the method for producing a cell structure is a method for producing a cell structure in which a cell suspension containing a plurality of cells is coated with a gel-like substance around a cell suspension, and the cell suspension is suspended in a tubular flow path.
  • a cell suspension circulation step of flowing the liquid a coating step of injecting the gel precursor into the flow channel to coat the periphery of the cell suspension with the gel precursor, and injecting a gas into the flow path
  • a cell structure coated with a gel-like substance around a cell suspension containing a plurality of cells it is possible to form a structure suitable for culture, Individualization of the cell suspension coated with the gel precursor can be appropriately performed.
  • the amount of gas injected into the flow path per unit time may be constant. This makes it possible to stably form an alternating flow of the cell suspension and the gas covered with the gel precursor.
  • the aspect ratio of the cell structure may be controlled by the amount of gas injected into the flow channel per unit time in the alternate flow forming step.
  • the aspect ratio of the cell structure can be easily controlled.
  • gas may be intermittently injected into the flow path.
  • shape of the cross section orthogonal to the liquid passing direction of the flow path may be circular or polygonal.
  • the contact angle of the gel precursor to the inner wall surface of the flow channel is 50 ° or more. Further, it is preferable that the inner wall surface of the channel is subjected to a water-repellent treatment. Thereby, the alternating flow of the cell suspension and the gas coated with the gel precursor can be stably formed, and the cell suspension coated with the gel precursor is appropriately separated. Becomes possible.
  • a cell culture method is a cell culture method for culturing cells contained in the cell structure manufactured by the above manufacturing method, and includes a culturing step of culturing the cell structure in a medium. According to the cell culture method according to the disclosed technology, it is possible to avoid agglomeration of cell structures in cell culture while reducing damage in a gel-like substance removing step of cells.
  • the cell culture method according to the disclosed technology may further include a removing step of removing a gel substance after the culturing step.
  • the cell structure according to the disclosed technology includes a cell suspension including a plurality of cells, and a gel-like substance that covers the entire periphery of the cell suspension, and the thickness of the gel-like substance extends over the entire area.
  • the thickness is 0.1 to 3 times the average thickness of the gel material, the outer shape is non-spherical, and the aspect ratio is 100 or less.
  • a cell structure suitable for culture is provided.
  • the aspect ratio is preferably 20 or less. Thereby, the handling property of the cell structure can be further improved.
  • the length in the lateral direction is 10 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less.
  • the length of the cell structure in the lateral direction is 10 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less.
  • the microchannel according to the disclosed technology communicates with a tubular main channel through which a cell suspension flows and a first inlet into which a gel precursor is injected, and is connected to the main channel at a first junction.
  • a second junction that communicates with the first branch channel that merges and the second inlet into which gas is injected and that is disposed downstream of the first junction in the liquid flow direction with respect to the first junction.
  • a second branch flow path that merges with the main flow path in the section, and a third injection port into which a gelling agent for gelling the gel precursor is injected, and a second flow path from the second merge section of the main flow path
  • a third branch flow path that merges with the main flow path at a third merging portion disposed downstream in the liquid flow direction.
  • a structure suitable for culture in a cell structure in which the periphery of a cell suspension containing a plurality of cells is covered with a gel-like substance.
  • FIG. 9 is a diagram schematically illustrating a structure of a cell structure according to Comparative Example 3. It is a figure for explaining the measuring method of the average thickness of the shell part in the cell structure concerning an embodiment of the art of an indication.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view illustrating an example of a configuration of a microchannel used for manufacturing a cell structure according to an embodiment of the disclosed technology. It is a process flow figure showing an example of a manufacturing method of a cell structure concerning an embodiment of an art of an indication. It is a figure showing a situation in a microchannel at the time of manufacturing a cell structure concerning an embodiment of art of an indication.
  • FIG. 9 is a diagram schematically illustrating a structure of a cell structure according to Comparative Example 3. It is a figure for explaining the measuring method of the average thickness of the shell part in the cell structure concerning an embodiment of the art of an indication.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view illustrating an example of a configuration of a microchannel used for manufacturing a cell structure according
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a structure of a cell structure 1 according to an embodiment of the disclosed technology.
  • the cell structure 1 includes a core part 10 made of a cell suspension containing a plurality of cells 2, and a shell part 11 made of a gel-like substance that covers the entire circumference of the core part 10.
  • the type of the cells 2 constituting the core portion 10 is not particularly limited, and for example, stem cells such as iPS cells and ES cells can be used.
  • the cell suspension constituting the core section 10 contains a medium for providing the cells 2 with a growth environment.
  • the gel-like substance constituting the shell part 11 is a hydrogel having dissociation properties.
  • Having dissociation means having the property of dissolving by treatment with a chelating agent such as EDTA.
  • a chelating agent such as EDTA.
  • the hydrogel having dissociation properties for example, gelled sodium alginate can be used.
  • the outer shape of the cell structure 1 may be non-spherical, and may be, for example, a column, a square, or a hexagon. Further, the aspect ratio of the cell structure 1 is preferably larger than 1 and 100 or less, more preferably 1.1 or more and 20 or less. The aspect ratio is a ratio (L1 / L2) between the length L1 at the longest part and the length L2 at the shortest part of the outer length of the cell structure 1.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the structure of the cell structure 1X according to Comparative Example 3.
  • the shape of the cell structure 1X according to Comparative Example 3 is spherical. That is, the aspect ratio of the cell structure 1X according to Comparative Example 3 is 1.
  • the ratio of the volume of the shell portion 11 (gel-like substance) to the volume of the core portion 10 (cell suspension) (hereinafter, referred to as gel volume ratio) is smaller than that of the cell structure 1X according to Comparative Example 3 having a spherical outer shape. However, it is larger than the cell structure 1 according to the present embodiment having a non-spherical outer shape (see FIG. 1). That is, as the aspect ratio of the cell structure approaches 1, the gel volume ratio increases.
  • the diameter of the cell structure 1X according to Comparative Example 3 is, for example, 200 ⁇ m and the thickness of the gel-like substance forming the shell portion 11 is, for example, 50 ⁇ m.
  • the gel volume ratio is about 8.
  • the outer shape of the cell structure 1 according to the present embodiment is, for example, a columnar shape, the length L1 in the longitudinal direction is, for example, 2 mm, the length L2 in the lateral direction is, for example, 200 ⁇ m, and the shell portion 11 is formed.
  • the thickness of the constituent gel material is, for example, 50 ⁇ m.
  • the gel volume ratio is about 4.2.
  • the gel-like substance constituting the shell part 11 is removed in a subsequent step.
  • the removal of the gel substance is performed by dissociating the gel substance using a chelating agent such as EDTA.
  • a chelating agent such as EDTA.
  • the outer shape of the cell structure 1 according to the present embodiment is non-spherical and has an aspect ratio larger than 1, so that the gel volume is higher than that of the cell structure 1X according to Comparative Example 3 having a spherical outer shape. The rate can be reduced, and the processing time with the chelating agent when removing the gel-like substance constituting the shell portion 11 can be shortened.
  • the gel volume ratio can be reduced. Further, by making the outer shape of the cell structure 1 into a square pillar or a hexagonal pillar, the gel volume ratio is increased as compared with the case of having the same size of a column, but the surface area of the cell structure 1 is increased. This is advantageous in terms of uptake of oxygen and nutrients in the core portion 10.
  • the cell structure 1 according to the present embodiment has an aspect ratio of 100 or less, for example, the handling of the cell structure 1 in a culture step of culturing the cell structure 1 can be improved. That is, when a plurality of cell structures 1 are dispersed in a medium and cultured, the risk that the cell structures are entangled with each other can be reduced. By setting the aspect ratio to 20 or less, the handling of the cell structure 1 can be further improved.
  • the length L2 in the lateral direction of the cell structure 1 is preferably 10 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less.
  • the length L2 in the lateral direction of the cell structure 1 is preferably 10 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less.
  • the gel-like substance constituting the shell 11 covers the entire periphery of the cell suspension constituting the core 10 without defects. That is, even at the longitudinal end of the cell structure 1, the shell 11 covers the core 10 with a sufficient thickness. Further, the thickness of the shell portion 11 is set to be 0.1 to 3 times the average thickness of the shell portion 11 over the entire area of the shell portion 11. The average thickness of the shell part 11 is obtained as follows.
  • each of the extracted cell structures 1 is observed with a phase contrast microscope.
  • the thickest portion A1, the thinnest portion A2, and the thickest portion A1 of the gel material constituting the core portion 10 are formed.
  • a total of nine portions A1 to A9 including portions A3 to A9 that divide the shell portion 11 into eight parts are extracted, and an average value Xi obtained by averaging the thicknesses of these nine portions A1 to A9 is obtained.
  • the average value X of the average values Xi obtained for each of the ten cell structures 1 is defined as the average thickness of the shell portion 11.
  • each part A1 to A9 of the shell part 11 is such that a point a corresponding to the part on the inner wall of the shell part 11 and a line extending at a right angle from the point a to the inner wall correspond to the outer wall of the shell part 11. It means the length of the line segment ab connecting the intersecting point b.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view illustrating an example of the configuration of the micro flow channel 20 used for manufacturing the cell structure 1.
  • the micro flow path 20 is a device having a flow path formed by using a fine processing technique such as a MEMS (Micro Electro Mechanical Systems) technique.
  • the material of the microchannel 20 is not particularly limited, but glass, PDMS (Polydimethylsiloxane), quartz, resin, or the like can be used.
  • the micro flow path 20 includes a main flow path 21, a first branch flow path 22, a second branch flow path 23, and a third branch flow path 24.
  • the main flow path 21 is a tubular flow path through which the cell suspension constituting the core 10 of the cell structure 1 flows.
  • the main flow path 21 extends straight, and the flow direction of the cell suspension in the micro flow path 20 is linear.
  • the shape of the cross section of the main flow path 21 perpendicular to the flow direction (flow direction of the cell suspension) is not particularly limited, and may be, for example, a circle or an ellipse, or a square, a hexagon, or the like. May be a polygon.
  • the tube diameter of the main flow path 21 corresponds to the length L2 in the short direction of the cell structure 1 to be manufactured. Therefore, the diameter of the main flow path 21 is set according to the target size of the cell structure 1 to be manufactured.
  • the first branch channel 22 communicates with a first inlet 25 into which a gel precursor that is a material of a gel-like substance constituting the shell 11 of the cell structure 1 is injected.
  • the first branch flow path 22 joins the main flow path 21 at a first junction 26 on the main flow path 21.
  • the second branch channel 23 communicates with a second inlet 27 into which gas is injected.
  • the second branch flow path 23 is provided at a second junction 28 located downstream of the main flow path 21 in the liquid flow direction (flow direction of the cell suspension) from the first junction 26. It joins the flow channel 21.
  • the third branch channel 24 communicates with a third inlet 29 into which a gelling agent for gelling the gel precursor is injected.
  • the third branch flow path 24 is provided at a third merging portion 30 located downstream of the second merging portion 28 in the liquid flow direction (flow direction of the cell suspension) with respect to the second merging portion 28. It joins the flow channel 21.
  • FIG. 5 is a process flow chart showing an example of a method for producing the cell structure 1.
  • the method for producing the cell structure 1 includes a cell suspension distribution step P1, a coating step P2, an alternating flow forming step P3, and a gelation step P4.
  • FIG. 6 is a diagram showing a state inside the microchannel 20 when the cell structure 1 is being manufactured.
  • the cell suspension 3 containing a plurality of cells is injected into the main flow path 21, and the cell suspension 3 is distributed in the main flow path 21.
  • the cell suspension 3 is injected using, for example, a syringe. It is preferable to suppress the sedimentation of the cells by, for example, stirring the cell suspension 3 in the syringe so that the density of the cells contained in the cell suspension 3 becomes uniform in the microchannel 20.
  • the flow rate of the cell suspension 3 flowing through the main flow path 21 be kept constant by making the amount of the cell suspension 3 injected into the main flow path 21 per unit time constant. .
  • the injected cell suspension 3 flows downstream along the main channel 21.
  • the gel precursor 4 is injected from the first injection port 25, and the cell suspension 3 flowing through the main flow path 21 is coated with the gel precursor 4.
  • the gel precursor 4 injected from the first injection port 25 merges with the cell suspension 3 flowing through the main flow path 21 at the first junction 26 via the first branch flow path 22. Then, the periphery of the cell suspension 3 is coated.
  • the gel precursor 4 is a material of a gel-like substance constituting the shell part 11 of the cell structure 1.
  • an aqueous solution of sodium alginate can be used. It is preferable that the amount of the gel precursor 4 injected into the first branch channel 22 per unit time is constant, and the flow rate of the gel precursor 4 flowing through the first branch channel 22 is constant.
  • the cell suspension 3 covered with the gel precursor 4 flows further downstream along the main channel 21.
  • the gas 5 is injected from the second inlet 27, and an alternating flow of the cell suspension 3 and the gas 5 covered with the gel precursor 4 is formed in the main flow path 21. .
  • the gas 5 injected from the second inlet 27 passes through the second branch channel 23 and is suspended in the second junction 28 by the cell suspension coated with the gel precursor 4 flowing through the main channel 21. Merges with liquid 3.
  • the gas 5 comes into contact with the cell suspension 3 covered with the gel precursor 4
  • the cell suspension 3 covered with the gel precursor 4 and the gas 5 flow while being alternately arranged.
  • An alternating flow is formed in the main channel 21. That is, the cell suspension 3 covered with the gel precursor 4 is divided by the gas 5 and singulated.
  • the gel precursor 4 wraps around the surface of the singulated cell suspension on the side in contact with the gas 5. Thereby, the entire circumference of the singulated cell suspension is covered with the gel precursor 4.
  • the amount of the gas 5 injected from the second inlet 27 per unit time is constant.
  • the length of the cell suspension 3 covered with the gel precursor 4 in the flowing direction and the length of the gas 5 in the flowing direction in the above-mentioned alternate flow are set.
  • the longitudinal length L1 of the cell structure 1 manufactured by the present manufacturing method is allowed depending on the purpose of using the cell structure 1. It is not limited in a strict sense as long as it is within the range of variation.
  • the injection of the gas 5 into the microchannel 20 may be continuous or intermittent.
  • a commercially available dispenser may be used, or the opening of the mass flow controller may be adjusted to an intermittent pattern.
  • the pressure at the time of injecting the gas 5 is preferably 0.1 MPa or more.
  • the pipe diameter of the second branch flow path 23 through which the gas 5 passes is preferably 0.1 mm or more and 0.5 mm or less, and is preferably as thin as possible within the above range.
  • non-cytotoxic gas such as air, oxygen, nitrogen and carbon dioxide
  • the gas 5 is preferably adjusted to a composition and temperature suitable for culturing cells contained in the cell suspension 3.
  • a gas containing 5% of carbon dioxide, 20% of oxygen, and 75% of nitrogen can be suitably used, and the temperature of the gas is more preferably adjusted to 37 ° C.
  • the inner wall of the main flow path 21 is relatively formed with respect to the gel precursor 4. It preferably has high water repellency. If the water repellency of the inner wall of the main flow path 21 to the gel precursor 4 is insufficient, the gel precursor 4 goes around between the gas 5 and the inner wall of the main flow path 21, and the periphery of the gas 5 becomes gel precursor. There is a risk of being covered by the body 4.
  • the gas 5 becomes bubbles in the main flow path 21 and the cell suspension 3 covered with the gel precursor 4 and the gas 5 This may make it difficult to stably form the alternating flow due to the above. In this case, it is difficult to appropriately separate the cell suspension 3 coated with the gel precursor 4 into individual pieces.
  • a method of increasing the water repellency of the inner wall of the main flow path 21 to the gel precursor 4 for example, a method of impregnating the inner wall of the main flow path 21 with a silane coupling agent having a hydrophobic group such as a perfluoroalkyl chain may be mentioned.
  • a silane coupling agent having a hydrophobic group such as a perfluoroalkyl chain
  • a method of irradiating CF-based plasma from the end of the main flow path 21 there is a method of irradiating CF-based plasma from the end of the main flow path 21.
  • a desired water repellency can be obtained by adjusting the hydrophobicity of the material of the inner wall of the main flow path 21 and the processing conditions.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating a method of measuring the contact angle ⁇ . As shown in FIG. 7, a predetermined amount of the gel precursor 40 is injected into the main channel 21. The angle between the interface S2 between the gas 50 and the gel precursor 40 formed in the main flow path 21 and the inner wall surface S1 of the main flow path 21 is defined as a contact angle ⁇ .
  • the contact angle ⁇ of the gel precursor 4 to the inner wall of the main flow path 21 is preferably 50 ° or more.
  • an alternating flow of the cell suspension 3 and the gas 5 covered with the gel precursor 4 can be stably formed in the alternating flow forming step P3, The individualization of the cell suspension 3 covered with the precursor 4 can be performed appropriately.
  • the gelling agent 6 is injected from the third inlet 29, and the gelling agent 6 is merged with the cell suspension 3 covered with the gel precursor 4 and the gas 5 in an alternating flow. Then, the gel precursor 4 is gelled.
  • the gelling agent 6 injected from the third inlet 29 merges with the alternate flow flowing through the main flow path 21 at the third junction 30 via the third branch flow path 24.
  • a crosslinking reaction occurs in the gel precursor 4, and the gel precursor 4 is gelled. Thereby, the shell part 11 made of the gel-like substance is formed.
  • the gel precursor 4 is gelled while maintaining the state of covering the entire periphery of the cell suspension 3, the entire periphery of the cell suspension 3 is covered with the gel-like substance without any defect.
  • the gelling agent 6 for example, an aqueous solution of calcium chloride can be used. Individual pieces of the cell structure 1 in which the periphery of the cell suspension 3 is covered with a gel-like substance are continuously discharged from the downstream end of the microchannel 20.
  • the cell suspension 3 covered with the gel precursor 4 and the gas 5 alternately.
  • the cell suspension 3 covered with the gel precursor 4 is divided and singulated.
  • the gel precursor 4 is gelled while maintaining a state of covering the entire periphery of the cell suspension 3. That is, according to the manufacturing method according to the present embodiment, since the individualization of the cell structure 1 is substantially completed in the alternating flow forming step P3, the cell structure 1 is cut after gelation. You don't need to tear off.
  • FIG. 8A is a phase contrast microscope image of the cell structure 1 manufactured by the manufacturing method according to the embodiment of the disclosed technology
  • FIG. 8B is a schematic diagram of the cell structure 1 corresponding to FIG. 8A
  • 9A is a phase-contrast microscope image of the cell structure 1Y according to Comparative Example 1 obtained by cutting the fiber-shaped cell structure after gelling the shell portion
  • FIG. 9B corresponds to FIG. 9A
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a cell structure 1Y to be formed.
  • FIG. 10A is a phase-contrast microscope image of the cell structure 1Z according to Comparative Example 2 in which the fiber-shaped cell structure is separated into pieces by gelling the shell portion
  • FIG. 10B corresponds to FIG. 10A. It is a schematic diagram of cell structure 1Z.
  • the cell structure 1Y according to Comparative Example 1 since the cut surface is not covered by the shell portion 11 and the core portion 10 is exposed from the cut surface, the cells of the core portion 10 are exposed from the cut surface. Suspension leaks.
  • the method of manufacturing the cell structure 1 according to the embodiment of the disclosed technology it is not necessary to cut the cell structure after the shell portion 11 is gelated, and thus the cell suspension accompanying the fragmentation is not required. Leakage can be avoided.
  • the tip of the tearing portion 12 is stretched in the pulling direction, and the thickness of the shell portion 11 in the portion is compared with that of the other portions. Thicker. From the portion where the thickness of the shell portion 11 is excessive, it may be difficult to take in oxygen and nutrients.
  • the manufacturing method of the cell structure 1 according to the embodiment of the disclosed technology it is not necessary to tear off the cell structure after the gelation of the shell portion 11, so that the thickness variation of the shell portion 11 can be suppressed. Becomes possible.
  • the gel precursor 4 wraps around the surface of the cell suspension 3 singulated in the alternating flow forming step P3 on the side in contact with the gas 5, The entire circumference of the singulated cell suspension 3 is covered with the gel precursor 4. Thereafter, in the gelling step P4, the gel precursor 4 is gelled while maintaining a state of covering the entire periphery of the cell suspension 3. Therefore, the occurrence of defects in the shell 11 can be suppressed, and the thickness variation in each part of the shell 11 can be suppressed.
  • the injection amount of the cell suspension 3 into the microchannel 20 per unit time and the injection of the gas 5 into the microchannel 20 per unit time are described.
  • the ratio to the amount it is possible to adjust the length of the individual pieces of the cell suspension 3 coated with the gel precursor in the flow direction (flow direction of the cell suspension).
  • the aspect ratio of the manufactured cell structure 1 can be adjusted. For example, by increasing the injection ratio of the gas 5 to the cell suspension 3, the length L in the longitudinal direction of the cell structure 1 can be shortened, and the aspect ratio can be reduced.
  • the aspect ratio of the cell structure 1 to be manufactured can also be adjusted by setting the diameter of the main channel 21.
  • the gas 5 is transferred to the micro flow path 20.
  • the aspect ratio of the manufactured cell structure 1 can be adjusted.
  • FIG. 11 is a process flowchart illustrating an example of a cell culture method according to an embodiment of the disclosed technology.
  • the cell culture method according to the embodiment of the disclosed technology includes a culture step P11 of culturing the cell structure 1 produced by the above production method in a medium.
  • a plurality of cell structures 1 may be housed together with a culture medium 110 in a closed bag-shaped culture container 100 and cultured.
  • the cell structure 1 may be maintained in a floating state in the medium 110 by adjusting the viscosity of the medium 110.
  • the cell suspension containing the cell structure 1 and the medium 110 may be cultured with stirring.
  • Oxygen and nutrients contained in the culture medium 110 can reach the core part (cells) through the shell part (gel-like substance) of the cell structure 1.
  • the length L2 in the lateral direction of the cell structure 1 to 500 ⁇ m or less
  • oxygen and nutrients contained in the medium 110 can reach the center of the core.
  • the aspect ratio of the cell structure 1 to 100 or less, the risk that the cell structures 1 are entangled during the culture period can be suppressed, and handling of the cell structure 1 during the culture period becomes easy. .
  • the cells in the core proliferate, and the size of the cell aggregate formed in the core increases. Since the entire circumference of the core is covered with the gel-like substance constituting the shell, the proliferation of cells in the core does not occur indefinitely, and the size of the cell aggregate formed in the core is increased. It stops when the cell density in the core reaches a certain level. That is, expansion of the size of the cell aggregate formed in the core is limited by the core being covered by the shell.
  • the size of the cell aggregate does not increase beyond the size of the cell structure 1, so that the size of the cell aggregate Can be prevented from becoming excessive. Therefore, the risk of occurrence of cell death due to insufficient supply of oxygen and nutrients to the central part of the cell aggregate can be suppressed. That is, according to the cell culture method according to the present embodiment, the survival rate of the cells can be increased, and the culture efficiency can be improved.
  • the cell culture method according to the embodiment of the disclosed technology may further include, after the above-described culture step P11, a removal step P12 of removing a gel-like substance constituting the shell portion 11.
  • the gel-like substance may be removed, for example, after a lapse of a predetermined period (for example, several days) after the start of the culturing step P11.
  • a predetermined period for example, several days
  • the removal of the gel substance is performed, for example, by dissociating the gel substance using a chelating agent such as EDTA.
  • the outer shape of the cell structure 1 according to the present embodiment is non-spherical and has an aspect ratio larger than 1, the cell structure 1X according to Comparative Example 3 having a spherical outer shape (FIG. 2), it is possible to reduce the gel volume ratio, and it is possible to shorten the processing time of the chelating agent when removing the gel-like substance constituting the shell portion.
  • the cell culture method divides a cell aggregate in a core portion exposed by removing a gel-like substance constituting a shell portion into a smaller size cell aggregate or a single cell. May be included in the dividing step P13.
  • the division of the cell aggregate may be performed, for example, by passing the cell aggregate through a mesh.
  • the cell aggregate may be divided by treatment with a drug solution that exerts a cell dissociation effect.
  • the divided cell aggregate can be reused for manufacturing the cell structure 1. This enables mass production of cells.
  • Table 1 shows the evaluation results of the cell structures manufactured using the manufacturing method according to the embodiment of the disclosed technology and the manufacturing method according to the comparative example. Production method, shape, aspect ratio, contact angle of the gel precursor to the inner wall of the microchannel, type of open system / closed system in the production method, thickness of shell part in each of Examples and Comparative Examples Is as shown in Table 1.
  • microchannels having the following channel configuration were used. Specifically, a microchannel was prepared by combining a cylindrical glass capillary having an inner diameter of 0.6 mm and an outer diameter of 1.0 mm and a prism having an inner diameter of 1 mm and an outer diameter of 1.5 mm. One side of the cylindrical glass capillary was processed with a glass puller (PC-100 manufactured by Narishige) so that the inner diameter was 0.25 mm.
  • a glass puller PC-100 manufactured by Narishige
  • the liquid to be used was prepared as follows.
  • Cell suspension Human iPS cells were transformed to 2.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 in Essential-8 medium (Lifetechnologies) in a T-flask (Corning) coated with 0.5 ⁇ g / cm 2 of Vitronectin (Lifetechnologies). And cultivated for 4 days.
  • the cultured human iPS cells are washed with DPBS (Lifetechnologies), collected with TryPLE Select (Lifetechnologies), centrifuged at 300 G for 4 minutes with a centrifuge (Thermo Fisher), and 1.3 centrifuged to Essential-8.
  • the cell suspension was adjusted to be ⁇ 10 7 cells / mL.
  • Gel precursor 1.50 parts by mass of sodium alginate (Wako Pure Chemicals), 0.85 parts by mass of sodium chloride (Wako Pure Chemicals), and 97.65 parts by mass of distilled water are stirred until completely dissolved. Sterilization was performed at 120 ° C. for 60 minutes.
  • Gelling agent 3 parts by mass of sucrose (Wako Pure Chemical), 1.11 parts by mass of calcium chloride, and 95.89 parts by mass of distilled water are stirred until completely dissolved, and sterilized in an autoclave at 120 ° C. for 60 minutes. went.
  • the prepared liquids were respectively sent at the following flow rates by a syringe pump (PD4000 manufactured by Harvard).
  • Example 1 the aspect ratio of the cell structure was set to be the same as that of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 in consideration of the comparison with Comparative Example 1 and Comparative Example 2, and the gas flow rate was set to 120 ⁇ L / min.
  • the aspect ratio of the cell structure is set to 50.
  • the length L1 in the longitudinal direction of the cell structure according to Example 1 was 11.5 mm, and the length L2 in the lateral direction was 0.23 mm.
  • Example 2 is a typical example of the cell structure according to the embodiment of the disclosed technology, in which the gas flow rate is adjusted to 450 ⁇ L / min and air is supplied to set the aspect ratio of the cell structure to 10. It is.
  • the length L1 in the longitudinal direction of the cell structure according to Example 2 was 2.3 mm, and the length L2 in the lateral direction was 0.23 mm.
  • Examples 3 and 4 are different from the typical example (Example 2) in that the shape of the cell structure was changed, and they were quadrangular prisms and hexagonal prisms, respectively.
  • the shape of the cell structures according to Examples 1, 2, 5-9 and Comparative Examples 1 and 2 is cylindrical, and the shape of the cell structure according to Comparative Example 3 is spherical.
  • the shape of the cell structure was changed by changing the shape of the cross section of the microchannel used for manufacturing the cell structure.
  • Example 5 is different from the typical example (Example 2) in that the contact angle ⁇ of the gel precursor with respect to the inner wall of the microchannel is reduced.
  • Examples 1-4 and 6-8 and Comparative Examples 1 and 2 were manufactured using the microchannels subjected to the water-repellent treatment on the inner wall surface, and Example 5 was manufactured using the water-repellent. It is manufactured using a microchannel (glass capillary) that is not subjected to a treatment.
  • the water-repellent treatment in Examples 1-4 and 6-8 and Comparative Examples 1 and 2 was performed in the following procedure.
  • a liquid having a 1% by mass acetic acid / ethanol ratio of 20:80 was prepared, and a silane coupling agent KBE-3083 made by Shin-Etsu Silicone was added to this solution so as to have a concentration of 1% by mass. Decomposed.
  • the glass microchannel was immersed in this liquid for 6 hours, dried at room temperature, and then heated on a hot plate whose surface temperature was set to 100 ° C. for 10 minutes.
  • Comparative Example 4 was manufactured using a microchannel composed of a glass capillary that had been processed at 15 Pa for 1 minute with an oxygen plasma processing machine (PR-500 manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.).
  • the contact angle of the gel precursor to the inner wall of the microchannel was obtained by the following procedure. Using a micropipette, 100 ⁇ l of a dissociable hydrogel precursor solution was injected into the main channel of the microchannel, observed with an inverted microscope (AXIO@Obeserver.Z1 manufactured by Zeiss), and a transmission image of a gas-liquid interface was taken. From this image, as shown in FIG. 7, the angle between the interface between the dissociable hydrogel precursor liquid and air and the inner wall surface of the main flow path was obtained as the contact angle ⁇ .
  • the contact angles ⁇ were 100 °, respectively.
  • the contact angle ⁇ of Example 5 not subjected to the water-repellent treatment was 60 °.
  • the contact angle ⁇ of Comparative Example 4 using the glass capillary subjected to the oxygen plasma treatment was 30 °.
  • Embodiments 6, 7, and 8 each have a different aspect ratio of the cell structure from the typical example (Example 2).
  • the aspect ratio of the cell structure was set to 100 by adjusting the gas flow rate to 70 ⁇ L / min and sending the gas.
  • the length L1 in the longitudinal direction of the cell structure according to Example 6 was 23.0 mm, and the length L2 in the lateral direction was 0.23 mm.
  • the aspect ratio of the cell structure was set to 3 by adjusting the gas flow rate to 3.1 mL / min and sending the gas.
  • the length L1 in the longitudinal direction of the cell structure according to Example 7 was 0.69 mm, and the length L2 in the lateral direction was 0.23 mm.
  • Example 8 the aspect ratio of the cell structure was set to 1.5 by adjusting the gas flow rate to 5.2 mL / min and sending the gas.
  • the length L1 in the longitudinal direction of the cell structure according to Example 8 was 0.35 mm, and the length L2 in the lateral direction was 0.23 mm.
  • Comparative Example 1 a fibrous cell structure was formed using a microchannel, and then cut into individual pieces by using a cutter.
  • Comparative Example 2 after a fibrous cell structure was formed using a microchannel, it was cut into pieces to separate the cell structure.
  • Comparative Example 3 was prepared by dropping a droplet containing cells and a gel precursor onto a gelling agent. That is, Comparative Example 3 was manufactured without using the microchannel, and the manufacturing environment of the cell structure was an open system.
  • the shape of the cell structure according to Comparative Example 3 is spherical due to the manufacturing method, and therefore, the aspect ratio of the cell structure is 1.
  • the contact angle ⁇ was set to 30 ° by using the glass capillary subjected to the oxygen plasma treatment as described above.
  • Each of the cell structures according to Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 4 includes a core portion made of a cell suspension containing iPS cells and a shell portion made of a gel-like material that covers the periphery of the core portion. It is a core-shell type cell structure.
  • the shells of the cell structures according to Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 4 were checked for defects.
  • the core portion was exposed on the cut surface cut by the cutter, and the cell suspension in the core portion leaked from the cut surface. That is, the cell structure according to Comparative Example 1 had a structure in which the shell portion had a defect.
  • no defect was confirmed in the shell portion.
  • cell structure dispersion liquids prepared so that the cell density was 1.3 ⁇ 10 5 cells / mL were prepared.
  • Preparation of the cell structure dispersion liquid was performed by sedimentation and discarding of the supernatant, and dilution operation with Essential 8 medium (manufactured by Life technologies).
  • the cell density in the cell structure dispersion liquid was calculated from the cell density in the cell suspension in the core part and the amount of each liquid sent during the preparation of the cell structure.
  • the cell structures according to Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 4 were cultured for 4 days, washed with PBS (Phosphate Buffered Saline), and then immersed in 0.5 mol / l-EDTA (Nacalai Tesque).
  • the cell structure during the EDTA treatment was observed with a phase contrast microscope, and the time required for the gel-like substance in the shell to completely decompose was evaluated according to the following criteria. It was confirmed that the smaller the aspect ratio of the cell structure, the longer the EDTA treatment time. 1: 3 minutes or more 2: 1 minute or more and less than 3 minutes 3: 30 seconds or more and less than 1 minute 4: 5 seconds or more and less than 30 seconds 5: less than 5 seconds
  • Example 2 A sample of the cell structure corresponding to Example 2 prepared so that the cell density of the hiPS cells in the core becomes 1.3 ⁇ 10 7 cells / mL was placed in Essential8 medium (manufactured by Life technologies) for 24 hours. Culture was performed for 4 days while changing the medium every time. The sample on day 4 of the culture was observed with a phase contrast microscope. It was confirmed by trypan blue staining that the hiPS cells in the core proliferated while surviving.
  • Essential8 medium manufactured by Life technologies
  • the sample was immersed in 0.5 mol / l-EDTA (manufactured by Nacalai Tesque) for 1 minute.
  • the sample during the EDTA treatment was observed with a phase contrast microscope. It was confirmed that the aggregate of the hiPS cells in the core portion dissolved the gel-like substance forming the shell portion while maintaining the shape of the core portion.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体の製造方法は、管状の流路内に細胞懸濁液を流通させる細胞懸濁液流通工程と、流路内にゲル前駆体を注入して細胞懸濁液の周囲をゲル前駆体によって被覆する被覆工程と、流路内に気体を注入して、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液と気体とによる交互流を流路内に形成する交互流形成工程と、流路内にゲル化剤を注入して、交互流にゲル化剤を合流させることで、ゲル前駆体をゲル化させるゲル化工程と、を含む。

Description

細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路
　本願は２０１８年９月２８日出願の日本出願第２０１８－１８５５８１号の優先権を主張すると共に、その全文を参照により本明細書に援用する。
　開示の技術は、細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路に関する。
　細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体に関する技術として、例えば、以下のものが知られている。
　例えば、特表２０１６-５３９６５２号公報には、造血能がある細胞を含む液体コアと、液体コアの周囲を被包するゲル状殻とを含むカプセルが記載されている。このカプセルは、以下の工程を経ることにより形成される。ａ）造血能がある細胞を含有する第１の液体溶液と、ゲル化し得る液体多価電解質を含有する第２の液体溶液とをジャケット内で別々に移動させる工程、ｂ）ジャケットの流出口において一連の小滴を形成する工程であって、それぞれの小滴が第１の溶液で形成される中心コアと、第２の溶液で形成され中心コアを完全に覆う周縁フィルムとを含む工程、ｃ）フィルムの多価電解質と反応可能な試薬を含有するゲル溶液中にそれぞれの小滴を浸して、小滴を液体状態からゲル状態に移行させゲル状殻を形成させ、中心コアが液体コアを形成する工程、ｄ）形成されたカプセルを回収する工程。
　また、特開２０１７-１５４０７０号公報には、生体物質を内包するカプセルであって、皮膜が連通多孔構造のポリマーであり、外表面と内表面にスキン層が存在することを特徴とするカプセルが記載されている。また、特開２０１７-１５４０７０号公報には、このカプセルを用い、三次元方向に細胞または微生物を培養する培養方法が記載されている。
　また、特許５６３３０７７号公報には、高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロゲルファイバを含み、マイクロゲルファイバ中に細胞又は細胞培養物を含んだマイクロファイバが記載されている。また、特許５６３３０７７号公報には、架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を、同軸となるように細胞を含むコア部及びシェル部に分けて射出し、同軸のコア・シェル状態の流体を形成させ、その流体を塩化カルシウムを含む水溶液中に導入してゲル化させることにより、内側（コア部）及び外側（シェル部）の２種類のゲルからなるマイクロファイバを構築することが記載されている。
　ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）及びＥＳ細胞（embryonic stem cells）等の幹細胞を培地中に浮遊させた状態で培養すると、細胞同士が融合し、細胞凝集体（スフェア）が形成される。しかしながら、細胞凝集体（スフェア）のサイズが過大となると、細胞凝集体の中心部への酸素及び栄養分の供給が不十分となり、凝集体の中心部の細胞が壊死する場合がある。
　細胞凝集体の成長を規制する方法として、複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆する方法が考えられる。細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体の製造方法としては、例えば、特許５６３３０７７号公報に記載のように、細胞構造体をファイバ状に成形する方法がある。しかしながら、ファイバ状の細胞構造体は、ハンドリングが困難である。例えば、複数のファイバ状の細胞構造体を培地中に分散させて培養を行った場合、ファイバ状の細胞構造体同士が絡み合い、より大きな凝集体を生じさせてしまい、細胞への酸素及び栄養分の供給が不十分となるおそれがある。
　そこで、細胞構造体のハンドリング性を高めるためには、ファイバ状の細胞構造体を個片化すればよいと考えられる。個片化の方法としては、ファイバ状の細胞構造体を、ゲル状物質のゲル化後に、カッター等の切断具により切断する方法、ファイバ状の細胞構造体に引っ張り力を作用させて引きちぎる方法などが考えられる。
　しかしながら、ファイバ状の細胞構造体を切断具により切断した場合には、切断により露出する切断面はゲル状物質によって被覆されておらず、切断部から細胞懸濁液が漏出するおそれがある。また、ファイバ状の細胞構造体を引きちぎることにより個片化した場合には、引きちぎり部分の先端が、引っ張り方向に引き伸ばされ、当該部分におけるゲル状物質の厚さが他の部分と比較して厚くなる。ゲル状物質の厚さが過大となる部分からは、酸素及び栄養分の取り込みが困難となるおそれがある。このように、ファイバ状の細胞構造体の個片化を、ゲル状物質のゲル化後に行う方法によれば、培養に適した構造を形成することが困難である。
　細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体の他の製造方法としては、例えば、特表２０１６-５３９６５２号公報に記載のように、細胞及びゲル前駆体を含む液滴をゲル化剤に滴下する方法がある。しかしながら、この方法によれば、細胞及びゲル前駆体を含む液滴をゲル化剤に滴下する際に、該液滴が大気に晒されることとなり、細胞が細菌及びウィルス等の汚染源に汚染されるリスクがある。
　また、この方法により製造される細胞構造体の形状は球形となる。細胞構造体の形状が球形となると、細胞の体積に対するゲル状物質の体積の比率が大きくなる。ここで、細胞を被覆するゲル状物質は、その後の工程において除去されることが想定される。ゲル状物質の除去は、例えばＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）等のキレート剤を用いてゲル状物質を解離させることにより行うことが想定される。細胞の体積に対するゲル状物質の体積の比率が大きいと、キレート剤による処理時間が長くなり、細胞へのダメージが大きくなる。
　開示の技術は、複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体において、培養に適した構造を有する細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路を提供とする。
　開示の技術に係る細胞構造体の製造方法は、複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体の製造方法であって、管状の流路内に細胞懸濁液を流通させる細胞懸濁液流通工程と、流路内にゲル前駆体を注入して細胞懸濁液の周囲をゲル前駆体によって被覆する被覆工程と、流路内に気体を注入して、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液と気体とによる交互流を流路内に形成する交互流形成工程と、流路内にゲル化剤を注入して、交互流にゲル化剤を合流させることで、ゲル前駆体をゲル化させるゲル化工程と、を含む。開示の技術に係る細胞構造体の製造方法によれば、複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体において、培養に適した構造を形成することができ、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液の個片化を適切に行うことが可能となる。
　交互流形成工程において流路内に注入される気体の単位時間当たりの注入量が一定であってもよい。これにより、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液と気体とによる交互流を安定的に形成することが可能となる。
　交互流形成工程において流路内に注入される気体の単位時間当たりの注入量により、細胞構造体のアスペクト比を制御してもよい。これにより、細胞構造体のアスペクト比の制御を容易に行うことができる。
　また、交互流形成工程において流路内に気体を間欠的に注入してもよい。また、流路の通液方向に直交する断面の形状は、円形または多角形であってもよい。
　流路の内壁面に対するゲル前駆体の接触角が５０°以上であることが好ましい。また流路の内壁面が撥水処理されていることが好ましい。これにより、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液と気体とによる交互流を安定的に形成することができ、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液の個片化を適切に行うことが可能となる。
　開示の技術に係る細胞培養方法は、上記の製造方法によって製造された細胞構造体に含まれる細胞を培養する細胞培養方法であって、細胞構造体を培地中で培養する培養工程を含む。開示の技術に係る細胞培養方法によれば、細胞のゲル状物質除去工程におけるダメージを低減しつつ細胞培養における細胞構造体同士の凝集を回避することができる。
　開示の技術に係る細胞培養方法は、培養工程の後にゲル状物質を除去する除去工程を更に含んでいてもよい。
　開示の技術に係る細胞構造体は、複数の細胞を含む細胞懸濁液と、細胞懸濁液の全周を覆うゲル状物質と、を含み、ゲル状物質の厚さが、全域に亘り、ゲル状物質の平均厚さの０．１倍以上３倍以下であり、外形が非球状且つアスペクト比が１００以下である。開示の技術に係る細胞構造体によれば、培養に適した細胞構造体が提供される。
　開示の技術に係る細胞構造体において、アスペクト比は２０以下であることが好ましい。これにより、細胞構造体のハンドリング性をより高めることができる。
　開示の技術に係る細胞構造体において、短手方向の長さが１０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましい。細胞構造体の短手方向の長さを１０μｍ以上とすることで、マイクロ流路への細胞懸濁液の注入を適切に行うことが可能となる。また、細胞構造体の短手方向の長さを５００μｍ以下とすることで、細胞構造体を培地中に分散させて培養を行う場合に、コア部の中心部にも、十分な量の酸素及び栄養分を供給することが可能となる。
　開示の技術に係るマイクロ流路は、細胞懸濁液が流通する管状のメイン流路と、ゲル前駆体が注入される第１の注入口に連通し、第１の合流部においてメイン流路に合流する第１の分岐流路と、気体が注入される第２の注入口に連通し、メイン流路の、第１の合流部よりも通液方向の下流側に配置された第２の合流部においてメイン流路に合流する第２の分岐流路と、ゲル前駆体をゲル化させるゲル化剤が注入される第３の注入口に連通し、メイン流路の、第２の合流部よりも通液方向の下流側に配置された第３の合流部においてメイン流路に合流する第３の分岐流路と、を含む。開示の技術に係るマイクロ流路によれば、培養に適した細胞構造体を容易に形成することが可能となる。
　開示の技術によれば、１つの側面として、複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体において、培養に適した構造を形成することが可能となる。
開示の技術の実施形態に係る細胞構造体の構造を模式的に示す図である。 比較例３に係る細胞構造体の構造を模式的に示す図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞構造体におけるシェル部の平均厚さの測定方法を説明するための図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞構造体の製造に用いられるマイクロ流路の構成の一例を示す断面図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞構造体の製造方法の一例を示す工程フロー図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞構造体を製造しているときのマイクロ流路内の様子を示す図である。 開示の技術の実施形態に係るマイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角の測定方法を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る製造方法によって製造された細胞構造体の位相差顕微鏡画像である。 図８Ａに対応する細胞構造体の模式図である。 比較例１に係る細胞構造体の位相差顕微鏡画像である。 図９Ａに対応する細胞構造体の模式図である。 比較例２に係る細胞構造体の位相差顕微鏡画像である。 図１０Ａに対応する細胞構造体の模式図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す工程フロー図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す図である。
　以下、開示の技術の実施形態の一例を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。
[第１の実施形態]
　図１は、開示の技術の実施形態に係る細胞構造体１の構造を模式的に示す図である。細胞構造体１は、複数の細胞２を含む細胞懸濁液からなるコア部１０と、コア部１０の全周を覆うゲル状物質からなるシェル部１１とを含む。
　コア部１０を構成する細胞２の種類は、特に限定されないが、例えば、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞等の幹細胞を用いることができる。コア部１０を構成する細胞懸濁液には、細胞２に生育環境を提供する培地が含まれる。
　シェル部１１を構成するゲル状物質は、解離性を有するハイドロゲルであることが望ましい。解離性を有するとは、ＥＤＴＡ等のキレート剤による処理によって溶解する性質を持つことを意味する。解離性を有するハイドロゲルとして、例えば、ゲル化したアルギン酸ナトリウムを用いることができる。
　細胞構造体１の外形形状は、非球状であればよく、例えば円柱状、四角柱状または六角柱状であってもよい。また、細胞構造体１のアスペクト比は、１よりも大きく１００以下であることが好ましく、１．１以上２０以下であることが更に好ましい。アスペクト比とは、細胞構造体１の外形長さのうち、最も長い部位における長さＬ１と、最も短い部位における長さＬ２との比（Ｌ１／Ｌ２）である。
　図２は、比較例３に係る細胞構造体１Ｘの構造を模式的に示す図である。比較例３に係る細胞構造体１Ｘの形状は球状とされている。すなわち、比較例３に係る細胞構造体１Ｘのアスペクト比は１である。コア部１０（細胞懸濁液）の体積に対するシェル部１１（ゲル状物質）の体積の比率（以下、ゲル体積率という）は、球状の外形を有する比較例３に係る細胞構造体１Ｘの方が、非球状の外形を有する本実施形態に係る細胞構造体１（図１参照）よりも大きくなる。すなわち、細胞構造体のアスペクト比が１に近くなる程、ゲル体積率が大きくなる。
　ここで、比較例３に係る細胞構造体１Ｘの直径が、例えば２００μｍであり、シェル部１１を構成するゲル状物質の厚さが例えば５０μｍである場合を想定する。この場合、ゲル体積率は約８である。また、本実施形態に係る細胞構造体１の外形が、例えば円柱形であり、長手方向における長さＬ１が例えば２ｍｍであり、短手方向における長さＬ２が例えば２００μｍであり、シェル部１１を構成するゲル状物質の厚さが例えば５０μｍである場合を想定する。この場合、ゲル体積率は約４．２である。
　シェル部１１を構成するゲル状物質は、その後の工程において除去されることが想定される。ゲル状物質の除去は、例えばＥＤＴＡ等のキレート剤を用いてゲル状物質を解離させることにより行われる。ゲル体積率が大きいと、キレート剤による処理時間が長くなり、細胞２へのダメージが大きくなる。本実施形態に係る細胞構造体１の外形は、非球状とされており、アスペクト比が１よりも大きいので、球状の外形を有する比較例３に係る細胞構造体１Ｘと比較して、ゲル体積率を小さくすることができ、シェル部１１を構成するゲル状物質を除去する際のキレート剤による処理時間を短くすることができる。特に、細胞構造体１の外形形状を円柱状とすることで、ゲル体積率を小さくすることができる。また、細胞構造体１の外形形状を四角柱状または六角柱状とすることで、同一サイズの円柱状とする場合と比較して、ゲル体積率は大きくなるが、細胞構造体１の表面積を大きくすることができ、コア部１０における酸素及び栄養分の取り込みの点において有利となる。
　また、本実施形態に係る細胞構造体１は、アスペクト比が１００以下とされているので、例えば、細胞構造体１を培養する培養工程における細胞構造体１のハンドリング性を高めることができる。すなわち、複数の細胞構造体１を培地中に分散させて培養を行った場合、細胞構造体同士が絡み合うリスクを低減することができる。アスペクト比を２０以下とすることで、細胞構造体１のハンドリング性を更に高めることが可能となる。
　また、本実施形態に係る細胞構造体１の短手方向における長さＬ２は、１０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましい。細胞構造体１の短手方向における長さＬ２を、１０μｍ以上とすることで、細胞構造体１の製造に用いられる後述するマイクロ流路への細胞懸濁液の注入を適切に行うことが可能となる。また、細胞構造体１の短手方向における長さＬ２を、５００μｍ以下とすることで、細胞構造体１を培地中に分散させて培養を行う場合に、コア部１０の中心部にも、十分な量の酸素及び栄養分を供給することが可能となる。
　本実施形態に係る細胞構造体１において、シェル部１１を構成するゲル状物質は、コア部１０を構成する細胞懸濁液の全周を欠陥なく覆っている。すなわち、細胞構造体１の長手方向の端部においてもシェル部１１がコア部１０を十分な厚さで覆っている。また、シェル部１１の厚さは、シェル部１１の全域に亘り、シェル部１１の平均厚さの０．１倍以上３倍以下とされている。シェル部１１の平均厚さは、以下のようにして求められる。
　すなわち、１０個の細胞構造体１を無作為に抽出し、抽出した細胞構造体１の各々について位相差顕微鏡にて観察を行う。細胞構造体１の各々について、図３に示すように、コア部１０を構成するゲル状物質の厚さが最も厚い部位Ａ１、厚さが最も薄い部位Ａ２、および、厚さが最も厚い部位Ａ１を起点に、シェル部１１を８等分する部位Ａ３～Ａ９を含む合計９つの部位Ａ１～Ａ９を抽出し、これら９つの部位Ａ１～Ａ９の厚さを平均した平均値Ｘｉを求める。１０個の細胞構造体１の各々について求めた平均値Ｘｉの平均値Ｘを、シェル部１１の平均厚さとする。なお、シェル部１１の各部位Ａ１～Ａ９における厚さは、シェル部１１の内壁の、当該部位に対応する点ａと、点ａから内壁に対し直角に伸ばした線がシェル部１１の外壁と交わる点ｂと、を結ぶ線分ａｂの長さを意味する。
　以下に、細胞構造体１の製造方法について説明する。図４は、細胞構造体１の製造に用いられるマイクロ流路２０の構成の一例を示す断面図である。マイクロ流路２０は、ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）技術などの微細加工技術を利用して形成される流路を有するデバイスである。マイクロ流路２０の材料としては、特に限定されないが、ガラス、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）、石英、樹脂などを用いることができる。マイクロ流路２０は、メイン流路２１、第１の分岐流路２２、第２の分岐流路２３、第３の分岐流路２４を含んで構成されている。
　メイン流路２１は、細胞構造体１のコア部１０を構成する細胞懸濁液が流通する管状の流路である。本実施形態において、メイン流路２１は、一直線に伸びており、マイクロ流路２０内において細胞懸濁液の流れ方向は直線的となる。メイン流路２１の、通液方向（細胞懸濁液の流れ方向）に直交する断面の形状は、特に限定されないが、例えば、円形、楕円形であってもよく、また、四角形、六角形等の多角形であってもよい。メイン流路２１の管径は、製造される細胞構造体１の短手方向における長さＬ２に対応する。従って、メイン流路２１の管径は、製造される細胞構造体１の目標サイズに応じて設定される。
　第１の分岐流路２２は、細胞構造体１のシェル部１１を構成するゲル状物質の材料となるゲル前駆体が注入される第１の注入口２５に連通している。第１の分岐流路２２は、メイン流路２１上の第１の合流部２６においてメイン流路２１に合流する。
　第２の分岐流路２３は、気体が注入される第２の注入口２７に連通している。第２の分岐流路２３は、メイン流路２１の、第１の合流部２６よりも通液方向（細胞懸濁液の流れ方向）の下流側に配置された第２の合流部２８においてメイン流路２１に合流する。
　第３の分岐流路２４は、ゲル前駆体をゲル化させるゲル化剤が注入される第３の注入口２９に連通している。第３の分岐流路２４は、メイン流路２１の、第２の合流部２８よりも通液方向（細胞懸濁液の流れ方向）の下流側に配置された第３の合流部３０においてメイン流路２１に合流する。
　図５は、細胞構造体１の製造方法の一例を示す工程フロー図である。細胞構造体１の製造方法は、細胞懸濁液流通工程Ｐ１、被覆工程Ｐ２、交互流形成工程Ｐ３及びゲル化工程Ｐ４を含む。図６は、細胞構造体１を製造しているときのマイクロ流路２０内の様子を示す図である。
　細胞懸濁液流通工程Ｐ１において、複数の細胞を含む細胞懸濁液３をメイン流路２１内に注入し、メイン流路２１内に細胞懸濁液３を流通させる。細胞懸濁液３の注入は、例えばシリンジを用いて行われる。細胞懸濁液３に含まれる細胞の密度がマイクロ流路２０内において均一となるように、シリンジ内の細胞懸濁液３を撹拌するなどして、細胞の沈降を抑制することが好ましい。また、メイン流路２１内への細胞懸濁液３の単位時間当たりの注入量を一定とすることで、メイン流路２１内を流通する細胞懸濁液３の流量を一定とすることが好ましい。注入された細胞懸濁液３は、メイン流路２１に沿って下流側に向けて流れる。
　被覆工程Ｐ２において、第１の注入口２５からゲル前駆体４を注入して、メイン流路２１を流通する細胞懸濁液３の周囲をゲル前駆体４によって被覆する。第１の注入口２５から注入されたゲル前駆体４は、第１の分岐流路２２を経由して、第１の合流部２６において、メイン流路２１を流通する細胞懸濁液３と合流し、細胞懸濁液３の周囲を被覆する。ゲル前駆体４は、細胞構造体１のシェル部１１を構成するゲル状物質の材料である。ゲル前駆体４として例えばアルギン酸ナトリウムの水溶液を用いることができる。第１の分岐流路２２へのゲル前駆体４の単位時間当たりの注入量を一定とし、第１の分岐流路２２内を流通するゲル前駆体４の流量を一定とすることが好ましい。ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３は、メイン流路２１に沿って更に下流側に向けて流れる。
　交互流形成工程Ｐ３において、第２の注入口２７から気体５を注入して、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とによる交互流をメイン流路２１内に形成する。第２の注入口２７から注入された気体５は、第２の分岐流路２３を経由して第２の合流部２８においてメイン流路２１を流通するゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と合流する。気体５が、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と接触することで、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とが交互に配置された状態で流動する交互流がメイン流路２１内に形成される。すなわち、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３は、気体５によって分断され、個片化される。個片化された細胞懸濁液の気体５と接する側の表面には、ゲル前駆体４が周り込む。これにより、個片化された細胞懸濁液の全周は、ゲル前駆体４によって覆われる。
　交互流形成工程Ｐ３において、第２の注入口２７から注入される気体５の単位時間当たりの注入量は一定であることが好ましい。気体５の単位時間当たりの注入量を一定とすることで、上記交互流における、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３の通液方向における長さと、気体５の通液方向における長さをそれぞれ一定とすることができる。すなわち、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３の個片の長さを一定とすることができ、これにより、本製造方法によって製造される細胞構造体１の長手方向の長さＬ１を一定とすることができる。なお、気体５の単位時間当たりの注入量を一定にするとは、本製造方法により製造される細胞構造体１の長手方向の長さＬ１が、細胞構造体１を利用する目的に応じて許容されるばらつきに収まる程度であればよく厳密な意味での一定ではない。
　気体５のマイクロ流路２０内への注入は、連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。気体５の注入を間欠的に行う場合、市販のディスペンサを用いてもよいし、マスフローコントローラの開度を間欠状のパターンに調整してもよい。また、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３の第２の分岐流路２３内への侵入を防止するために、気体５の注入時の圧力を０．１ＭＰａ以上とすることが好ましい。また、気体５が通過する第２の分岐流路２３の管径は、０．１ｍｍ以上０．５ｍｍ以下であることが好ましく、上記の範囲内において極力細い方が好ましい。
　気体５として、空気、酸素、窒素、二酸化炭素等の細胞毒性を有さないものを用いることができる。また、気体５は、細胞懸濁液３に含まれる細胞の培養に適した組成及び温度に調整されていることが好ましい。気体５として、例えば、二酸化炭素５％、酸素２０％及び窒素７５％を含むガスを好適に用いることができ、そのガスの温度が３７℃に調整されていることが更に好ましい。
　ここで、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とによる交互流を安定的に形成するためには、メイン流路２１の内壁が、ゲル前駆体４に対して比較的高い撥水性を有していることが好ましい。仮に、メイン流路２１の内壁のゲル前駆体４に対する撥水性が不足する場合、気体５とメイン流路２１の内壁との間に、ゲル前駆体４が周り込み、気体５の周囲がゲル前駆体４によって覆われてしまうおそれがある。すなわち、メイン流路２１の内壁のゲル前駆体４に対する撥水性が不足する場合、気体５は、メイン流路２１内において気泡となり、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とによる交互流を安定的に形成することが困難となるおそれがある。この場合、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３の個片化を適切に行うことが困難となる。
　メイン流路２１の内壁のゲル前駆体４に対する撥水性を高める方法として、メイン流路２１の内壁を、例えば、パーフルオロアルキル鎖などの疎水基を有するシランカップリング剤によって含浸処理する方法が挙げられる。その他の方法として、メイン流路２１の端部よりＣＦ系のプラズマを照射する方法が挙げられる。メイン流路２１の内壁の素材の疎水度や処理条件を調整することで、所望の撥水性を得ることができる。
　メイン流路２１の内壁のゲル前駆体４に対する撥水性は、メイン流路２１の内壁に対するゲル前駆体４の接触角θによって定量化することができる。本明細書において、接触角θは、下記の測定方法によって測定されるもの意味する。図７は、接触角θの測定方法を示す図である。図７に示すように、メイン流路２１内に、所定量のゲル前駆体４０を注入する。これによりメイン流路２１内に形成される、気体５０とゲル前駆体４０との界面Ｓ２と、メイン流路２１の内壁面Ｓ１とのなす角を接触角θとする。
　メイン流路２１の内壁に対するゲル前駆体４の接触角θは、５０°以上であることが好ましい。接触角θを５０°以上とすることで、交互流形成工程Ｐ３において、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とによる交互流を安定的に形成することができ、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３の個片化を適切に行うことが可能となる。
　ゲル化工程Ｐ４において、第３の注入口２９からゲル化剤６を注入し、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とによる交互流にゲル化剤６を合流させることで、ゲル前駆体４をゲル化させる。第３の注入口２９から注入されたゲル化剤６は、第３の分岐流路２４を経由して第３の合流部３０においてメイン流路２１を流通する交互流と合流する。ゲル化剤６が、細胞懸濁液３を被覆するゲル前駆体４に接触することで、ゲル前駆体４において架橋反応が生じ、ゲル前駆体４がゲル化される。これにより、ゲル状物質からなるシェル部１１が形成される。ゲル前駆体４は、細胞懸濁液３の全周を被覆した状態を維持したままゲル化されるので、細胞懸濁液３の全周が、欠陥なくゲル状物質によって覆われる。ゲル化剤６として例えば塩化カルシウムの水溶液を用いることができる。細胞懸濁液３の周囲をゲル状物質で被覆した細胞構造体１の個片が、マイクロ流路２０の下流側の端部から連続的に排出される。
　以上のように、開示の技術の実施形態に係る細胞構造体１の製造方法によれば、交互流形成工程Ｐ３において、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とによる交互流がメイン流路２１内において形成されることで、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３が分断され、個片化される。その後、ゲル化工程Ｐ４において、ゲル前駆体４は細胞懸濁液３の全周を被覆した状態を維持しつつゲル化される。すなわち、本実施形態に係る製造方法によれば、細胞構造体１の個片化は、交互流形成工程Ｐ３において実質的に完了しているので、ゲル化後に、細胞構造体１を切断すること、または引きちぎることを要しない。
　図８Ａは、開示の技術の実施形態に係る製造方法によって製造された細胞構造体１の位相差顕微鏡画像であり、図８Ｂは図８Ａに対応する細胞構造体１の模式図である。図９Ａは、ファイバ状の細胞構造体をシェル部のゲル化後に切断することにより個片化された比較例１に係る細胞構造体１Ｙの位相差顕微鏡画像であり、図９Ｂは図９Ａに対応する細胞構造体１Ｙの模式図である。図１０Ａは、ファイバ状の細胞構造体をシェル部のゲル化後に引きちぎることにより個片化された比較例２に係る細胞構造体１Ｚの位相差顕微鏡画像であり、図１０Ｂは図１０Ａに対応する細胞構造体１Ｚの模式図である。
　比較例１に係る細胞構造体１Ｙによれば、図９Ｂに示すように、切断面がシェル部１１によって覆われず、切断面からコア部１０が露出するので、切断面からコア部１０の細胞懸濁液が漏出する。一方、開示の技術の実施形態に係る細胞構造体１の製造方法によれば、シェル部１１のゲル化後に、細胞構造体を切断することを要しないので、個片化に伴う細胞懸濁液の漏出を回避することができる。
　比較例２に係る細胞構造体１Ｚによれば、図１０Ｂに示すように、引きちぎり部分１２の先端が、引っ張り方向に引き伸ばされ、当該部分におけるシェル部１１の厚さが他の部分と比較して厚くなる。シェル部１１の厚さが過大となる部分からは、酸素及び栄養分の取り込みが困難となるおそれがある。一方、開示の技術の実施形態に係る細胞構造体１の製造方法によれば、シェル部１１のゲル化後に細胞構造体を引きちぎることを要しないので、シェル部１１の厚さばらつきを抑制することが可能となる。
　また、開示の技術の実施形態に係る製造方法によれば、交互流形成工程Ｐ３において個片化された細胞懸濁液３の気体５と接する側の表面にはゲル前駆体４が周り込み、個片化された細胞懸濁液３の全周は、ゲル前駆体４によって覆われる。その後、ゲル化工程Ｐ４において、ゲル前駆体４は細胞懸濁液３の全周を被覆した状態を維持したままゲル化される。従って、シェル部１１における欠陥の発生を抑制することができ、また、シェル部１１の各部位における厚さばらつきを抑制することができる。
　また、開示の技術の実施形態に係る製造方法によれば、細胞懸濁液３のマイクロ流路２０への単位時間当たりの注入量と、気体５のマイクロ流路２０への単位時間当たりの注入量との比率を調整することにより、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液３の個片の通液方向（細胞懸濁液の流れ方向）における長さを調整することが可能となる。結果として、製造される細胞構造体１のアスペクト比を調整することが可能となる。例えば、細胞懸濁液３に対する気体５の注入比率を高めることで、細胞構造体１の長手方向における長さＬを短くすることができ、アスペクト比を小さくすることができる。また、メイン流路２１の管径の設定によっても、製造される細胞構造体１のアスペクト比を調整することが可能である。例えば、メイン流路２１の管径及び細胞懸濁液３のマイクロ流路２０への単位時間当たりの注入量が固定である場合、交互流形成工程Ｐ３において、気体５のマイクロ流路２０への単位時間当たりの注入量を調整することによって、製造される細胞構造体１のアスペクト比を調整することが可能である。
　このように、開示の技術の実施形態に係る細胞構造体の製造法によれば、培養に適した構造の細胞構造体を製造することが可能となる。
　図１１は、開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す工程フロー図である。開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法は、上記の製造方法によって製造された細胞構造体１を培地中で培養する培養工程Ｐ１１を含む。例えば、図１２に示されるように、密閉されたバッグ状の培養容器１００に、複数の細胞構造体１を培地１１０とともに収容して培養を行ってもよい。なお、培地１１０の粘度を調整することにより、細胞構造体１が培地１１０中において浮遊した状態を維持するようにしてもよい。また、必要に応じて細胞構造体１及び培地１１０を含む細胞懸濁液を、撹拌しながら培養を行ってもよい。
　培地１１０に含まれる酸素及び栄養分は、細胞構造体１のシェル部（ゲル状物質）を透過してコア部（細胞）に達することができる。細胞構造体１の短手方向における長さＬ２を５００μｍ以下とすることで、培地１１０中に含まれる酸素及び栄養分は、コア部の中心にまで達することができる。また、細胞構造体１のアスペクト比を１００以下とすることで、培養期間中に細胞構造体１同士が絡み合うリスクを抑制することができ、培養期間中における細胞構造体１のハンドリングが容易となる。
　細胞構造体１を培養することで、コア部の細胞は増殖し、コア部に形成される細胞凝集体のサイズが大きくなる。コア部の全周がシェル部を構成するゲル状物質によって被覆されているので、コア部において細胞の増殖が無制限に生じることはなく、コア部に形成される細胞凝集体のサイズの拡大は、コア部における細胞の密度が、あるレベルに達した段階で停止する。すなわち、コア部に形成される細胞凝集体のサイズの拡大は、コア部がシェル部に覆われることで制限される。
　このように、細胞構造体１を用いる本実施形態に係る細胞培養方法によれば、細胞凝集体のサイズが、細胞構造体１のサイズを超えて拡大することがないので、細胞凝集体のサイズが過大となることを回避することができる。従って、細胞凝集体の中心部への酸素及び栄養分の供給不足による細胞死の発生のリスクを抑制することができる。すなわち、本実施形態に係る細胞培養方法によれば、細胞の生存率を高めることができ、培養効率を向上させることができる。
　開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法は、上記の培養工程Ｐ１１の後に、シェル部１１を構成するゲル状物質を除去する除去工程Ｐ１２を更に含み得る。ゲル状物質の除去は、例えば、培養工程Ｐ１１を開始してから所定期間経過後（例えば数日後）に実施してもよい。上記所定期間として、例えば、コア部の細胞が、８０％程度のコンフルエンシーに達するまでの期間を適用してもよい。ゲル状物質の除去は、例えば、ＥＤＴＡ等のキレート剤を用いてゲル状物質を解離させることにより行われる。
　上記のように、本実施形態に係る細胞構造体１の外形は、非球状とされており、アスペクト比が１よりも大きいので、球状の外形を有する比較例３に係る細胞構造体１Ｘ（図２参照）と比較して、ゲル体積率を小さくすることができ、シェル部を構成するゲル状物質を除去する際のキレート剤による処理時間を短くすることができる。
　開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法は、シェル部を構成するゲル状物質が除去されることにより露出したコア部の細胞凝集体を、サイズのより小さい細胞凝集体または単一細胞に分割する分割工程Ｐ１３を含み得る。細胞凝集体の分割は、例えば、細胞凝集体を、メッシュに通すことにより行ってもよい。また、細胞解離作用を発揮する薬液処理により細胞凝集体を分割してもよい。分割された細胞凝集体は、細胞構造体１の製造に再利用することが可能である。これにより、細胞の大量生産が可能となる。
　開示の技術の実施形態に係る製造方法及び比較例に係る製造方法を用いて製造した細胞構造体の評価結果を下記の表１に示す。各実施例及び各比較例における、細胞構造体の製造方法、形状、アスペクト比、マイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角、製造方法における開放系／閉鎖系の種別、シェル部の厚さは、表１に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 
　実施例１～８及び比較例１、２、４については、以下に示す流路構成のマイクロ流路を用いた。具体的には、内径０．６ｍｍ、外径１．０ｍｍの円柱ガラスキャピラリー、及び、内径１ｍｍ、外径１．５ｍｍの角柱を組み合わせ、マイクロ流路を作製した。なお、円柱ガラスキャピラリーの片側は内径０．２５ｍｍとなるように、ガラスプーラー（ナリシゲ製ＰＣ－１００）にて加工した。
　使用する液を以下のように準備した。
　細胞懸濁液：Vitronectin（Lifetechnologies）を０．５μｇ／ｃｍ２コートしたＴフラスコ（Corning）内で、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ－８培地（Lifetechnologies）中でヒトｉＰＳ細胞を２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように播種し、４日間培養した。培養したヒトｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳ（Lifetechnologies）で洗浄し、ＴｒｙＰＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ(Lifetechnologies)で回収し、遠心分離機（Thermo Fisher）にて３００Ｇ、４分間の遠心分離を行い、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ－８に１．３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞懸濁液を調整した。
　ゲル前駆体：アルギン酸ナトリウム（和光純薬）１.５０質量部、塩化ナトリウム（和光純薬）０．８５質量部、蒸留水９７．６５質量部を完全に溶解するまで撹拌し、オートクレーブにて、１２０℃、６０分間滅菌処理を行った。
　ゲル化剤：スクロース（和光純薬）３質量部、塩化カルシウム１．１１質量部、蒸留水９５．８９質量部を完全に溶解するまで撹拌し、オートクレーブにて、１２０℃、６０分間滅菌処理を行った。
　準備した液を、シリンジポンプ（ハーバード製ＰＤ４０００）にて、それぞれ以下の流量にて送液した。
　細胞懸濁液：５０μＬ／ｍｉｎ
　ゲル前駆体：１５０μＬ／ｍｉｎ
　ゲル化剤：４ｍＬ／ｍｉｎ
　また、気体は圧縮空気（元圧０．４ＭＰａ）を、マスフローメータ（フジキン製ＦＣＳＴ１００５ＦＣ－ＡＩＲ）を用いて流量を調整して送気した。いずれの液及び気体も２５℃の室内で温調し、同温度下で使用した。
　実施例１は、比較例１及び比較例２との対比を考慮し、細胞構造体のアスペクト比を、比較例１及び比較例２と同としたものであり、気体の流量を１２０μＬ／ｍｉｎに調整して送気することで、細胞構造体のアスペクト比を５０としたものである。実施例１に係る細胞構造体の長手方向における長さＬ１は１１．５ｍｍであり、短手方向における長さＬ２は０．２３ｍｍであった。実施例２は、開示の技術の実施形態に係る細胞構造体の典型例であり、気体の流量を４５０μＬ／ｍｉｎに調整して送気することで、細胞構造体のアスペクト比を１０としたものである。実施例２に係る細胞構造体の長手方向における長さＬ１は２．３ｍｍであり、短手方向における長さＬ２は０．２３ｍｍであった。
　実施例３及び４は、典型例（実施例２）に対して、細胞構造体の形状を変更したものであり、それぞれ、四角柱及び六角柱とした。実施例１、２、５－９及び比較例１、２に係る細胞構造体の形状は円柱状であり、比較例３に係る細胞構造体の形状は球状である。細胞構造体の形状の変更は、細胞構造体の製造に用いるマイクロ流路の流路断面の形状変更により行った。
　実施例５は、典型例（実施例２）に対して、マイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角θを小さくしたものである。換言すれば、実施例１－４、６－８、比較例１、２は、内壁面の撥水処理を施したマイクロ流路を用いて製造されたものであり、実施例５は、撥水処理を施さないマイクロ流路（ガラスキャピラリー）を用いて製造されたものである。実施例１－４、６－８、比較例１、２における撥水処理を、以下の手順で行った。１質量％酢酸とエタノールの比率を２０：８０とした液を用意し、この液に信越シリコーン製シランカップリング剤ＫＢＥ-３０８３を１質量％濃度となるよう添加し、１時間室温で撹拌し加水分解した。この液にガラス製のマイクロ流路を６時間浸漬し、室温で乾燥した後、表面温度を１００℃に設定したホットプレート上で１０分間加熱した。比較例４は、酸素プラズマ処理機（ヤマト科学製ＰＲ－５００）にて１５Ｐａで１分処理したガラスキャピラリーで構成されたマイクロ流路を用いて製造されたものである。
　マイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角を、以下の手順で取得した。マイクロ流路のメイン流路に、マイクロピペットを用いて解離性ハイドロゲル前駆体液を１００μｌ注入し、倒立顕微鏡（Zeiss製AXIO Obeserver.Z1）にて観察し、気液界面の透過像を撮影した。この画像から、図７に示すように、解離性ハイドロゲル前駆体液と空気の界面と、メイン流路の内壁面とのなす角を、接触角θとして取得した。撥水処理を施した場合（実施例１－４、６－８及び比較例１、２）の接触角θは、それぞれ１００°であった。一方、撥水処理を施さない実施例５の接触角θは、６０°であった。酸素プラズマ処理を施したガラスキャピラリーを用いた比較例４の接触角θは、３０°であった。
　実施例６、７、８は、それぞれ、典型例（実施例２）に対して細胞構造体のアスペクト比を変更したものである。実施例６は、気体の流量を７０μＬ／ｍｉｎに調整して送気することで、細胞構造体のアスペクト比を１００としたものである。実施例６に係る細胞構造体の長手方向における長さＬ１は２３．０ｍｍであり、短手方向における長さＬ２は０．２３ｍｍであった。実施例７は、気体の流量を３．１ｍＬ／ｍｉｎに調整して送気することで、細胞構造体のアスペクト比を３としたものである。実施例７に係る細胞構造体の長手方向における長さＬ１は０．６９ｍｍであり、短手方向における長さＬ２は０．２３ｍｍであった。実施例８は、気体の流量を５．２ｍＬ／ｍｉｎに調整して送気することで、細胞構造体のアスペクト比を１．５としたものである。実施例８に係る細胞構造体の長手方向における長さＬ１は０．３５ｍｍであり、短手方向における長さＬ２は０．２３ｍｍであった。
　比較例１は、マイクロ流路を用いてファイバ状の細胞構造体を形成した後、これをカッターで切断することにより個片化したものである。比較例２は、マイクロ流路を用いてファイバ状の細胞構造体を形成した後、これを引きちぎることにより個片化したものである。比較例３は、細胞及びゲル前駆体を含む液滴をゲル化剤に滴下することにより作製したものである。すなわち、比較例３は、マイクロ流路を用いることなく製造されたものであり、細胞構造体の製造環境が開放系となる。比較例３に係る細胞構造体の形状は、その製造方法に起因して球形となり、従って細胞構造体のアスペクト比は１となる。比較例４は、上記のように、酸素プラズマ処理を施したガラスキャピラリーを用いることにより接触角θを３０°としたものである。実施例１～８及び比較例１～４に係る細胞構造体は、全て、ｉＰＳ細胞を含む細胞懸濁液からなるコア部と、コア部の周囲を覆うゲル状物質からなるシェル部とを含むコア・シェル型の細胞構造体である。
　実施例１～８及び比較例１～４に係る細胞構造体について、シェル部における欠陥の有無を確認した。比較例１に係る細胞構造体については、カッターで切断した切断面においてコア部が露出し、切断面からコア部の細胞懸濁液が漏出した。すなわち、比較例１に係る細胞構造体は、シェル部に欠陥を含む構造であった。実施例１～８及び比較例２～４に係る細胞構造体については、シェル部に欠陥は確認されなかった。
　実施例１～８及び比較例１～４に係る細胞構造体を、それぞれ１００個ずつ倒立顕微鏡（Zeiss製AXIO Obeserver.Z1）にて観察し、各細胞構造体のシェル部が他の細胞構造体のシェル部と連結しているものの個数割合を示す連結度を、以下の基準で評価した。マイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角が小さい実施例５及び比較例４に係る細胞構造体において、連結度が高くなることが確認された。
　１：連結度が２５％以上
　２：連結度が１％以上２５％未満
　３：連結度が０％
　実施例１～８及び比較例１～４に係る細胞構造体について、それぞれ細胞密度が１．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した細胞構造体分散液を用意した。細胞構造体分散液の調製は、沈降・上澄み液廃却と、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Life technologies社製）による希釈操作により行った。細胞構造体分散液における細胞密度は、コア部の細胞懸濁液における細胞密度、細胞構造体作製時における各液の送液量から計算した。各実施例及び各比較例に係る細胞構造体分散液２０ｍＬを、スターラー（１ｍｍ長／ＰＴＦＥ製）にて１００ｒｐｍで５分間緩やかに撹拌した後１０分間静置した。この操作で沈降した各実施例及び各比較例に係る細胞構造体を、それぞれ１００個ずつ倒立顕微鏡（Zeiss製AXIO Obeserver.Z1）にて観察し、細胞構造体同士が絡み合っているものの個数割合を示す凝集度を、以下の基準で評価した。細胞構造体のアスペクト比が高い実施例１、６及び比較例１、２に係る細胞構造体において、凝集度が高くなることが確認された。
　１：凝集度が２５％以上
　２：凝集度が１％以上２５％未満
　３：凝集度が０％
　実施例１～８及び比較例１～４に係る細胞構造体を４日間培養し、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）で洗浄したのち、０．５ｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）に浸した。ＥＤＴＡ処理中の細胞構造体を位相差顕微鏡観察し、シェル部のゲル状物質が完全に分解した時間を、以下の基準で評価した。細胞構造体のアスペクト比が小さくなる程、ＥＤＴＡ処理時間が長くなることが確認された。
　１：３分以上
　２：１分以上３分未満
　３：３０秒以上１分未満
　４：５秒以上３０秒未満
　５：５秒未満
　コア部におけるｈｉＰＳ細胞の細胞密度が１．３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように作製した実施例２に相当する細胞構造体のサンプルを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Life technologies社製）中で、２４時間毎に培地交換を行いながら４日間培養した。培養４日目のサンプルを位相差顕微鏡で観察した。コア部のｈｉＰＳ細胞が生存したまま増殖することをトリパンブルー染色により確認した。
　４日間培養した上記サンプルをＰＢＳで洗浄したのち、０．５ｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）に１分間浸した。ＥＤＴＡ処理中のサンプルを位相差顕微鏡観察した。コア部のｈｉＰＳ細胞の凝集体が、コア部の形状を維持したまま、シェル部を形成するゲル状物質が溶解することを確認した。

Claims (13)

  1. 　複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体の製造方法であって、
    　管状の流路内に細胞懸濁液を流通させる細胞懸濁液流通工程と、
    　前記流路内にゲル前駆体を注入して前記細胞懸濁液の周囲を前記ゲル前駆体によって被覆する被覆工程と、
    　前記流路内に気体を注入して、前記ゲル前駆体によって被覆された前記細胞懸濁液と前記気体とによる交互流を前記流路内に形成する交互流形成工程と、
    　前記流路内にゲル化剤を注入して、前記交互流に前記ゲル化剤を合流させることで、前記ゲル前駆体をゲル化させるゲル化工程と、
    　を含む細胞構造体の製造方法。
  2. 　前記交互流形成工程において前記流路内に注入される前記気体の単位時間当たりの注入量が一定である
    　請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記交互流形成工程において前記流路内に注入される前記気体の単位時間当たりの注入量により、前記細胞構造体のアスペクト比を制御する
    　請求項１または請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記交互流形成工程において前記流路内に前記気体を間欠的に注入する
    　請求項１に記載の製造方法。
  5. 　前記流路の通液方向に直交する断面の形状は、円形または多角形である
    　請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　前記流路の内壁面に対する前記ゲル前駆体の接触角が５０°以上である
    　請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　前記流路の内壁面が撥水処理されている
    　請求項６に記載の製造方法。
  8. 　請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の製造方法によって製造された細胞構造体に含まれる細胞を培養する細胞培養方法であって、
    　前記細胞構造体を培地中で培養する培養工程を含む
    　細胞培養方法。
  9. 　前記培養工程の後に前記ゲル状物質を除去する除去工程を更に含む
    　請求項８に記載の細胞培養方法。
  10. 　複数の細胞を含む細胞懸濁液と、
    　前記細胞懸濁液の全周を覆うゲル状物質と、
    　を含み、
    　前記ゲル状物質の厚さが、全域に亘り、前記ゲル状物質の平均厚さの０．１倍以上３倍以下であり、
    　外形が非球状且つアスペクト比が１００以下である
    　細胞構造体。
  11. 　前記アスペクト比が２０以下である
    　請求項１０に記載の細胞構造体。
  12. 　短手方向の長さが１０μｍ以上５００μｍ以下である
    　請求項１０または請求項１１に記載の細胞構造体。
  13. 　細胞懸濁液が流通する管状のメイン流路と、
    　ゲル前駆体が注入される第１の注入口に連通し、第１の合流部において前記メイン流路に合流する第１の分岐流路と、
    　気体が注入される第２の注入口に連通し、前記メイン流路の、前記第１の合流部よりも通液方向の下流側に配置された第２の合流部において前記メイン流路に合流する第２の分岐流路と、
    　前記ゲル前駆体をゲル化させるゲル化剤が注入される第３の注入口に連通し、前記メイン流路の、前記第２の合流部よりも前記通液方向の下流側に配置された第３の合流部において前記メイン流路に合流する第３の分岐流路と、
    　を含むマイクロ流路。
PCT/JP2019/030861 2018-09-28 2019-08-06 細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路 WO2020066306A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020548095A JP7159334B2 (ja) 2018-09-28 2019-08-06 細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路
US17/205,432 US20210207120A1 (en) 2018-09-28 2021-03-18 Cell structure body, producing method for cell structure body, cell culturing method, and micro flow path

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018185581 2018-09-28
JP2018-185581 2018-09-28

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US17/205,432 Continuation US20210207120A1 (en) 2018-09-28 2021-03-18 Cell structure body, producing method for cell structure body, cell culturing method, and micro flow path

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020066306A1 true WO2020066306A1 (ja) 2020-04-02

Family

ID=69952645

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/030861 WO2020066306A1 (ja) 2018-09-28 2019-08-06 細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20210207120A1 (ja)
JP (1) JP7159334B2 (ja)
WO (1) WO2020066306A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7395796B1 (ja) * 2022-06-29 2023-12-11 持田製薬株式会社 ゲルファイバ製造装置及び製造方法
WO2024005067A1 (ja) * 2022-06-29 2024-01-04 持田製薬株式会社 ゲルファイバ製造装置及び製造方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6995975B2 (ja) * 2018-03-12 2022-02-04 富士フイルム株式会社 判定方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57197031A (en) * 1981-03-13 1982-12-03 Damon Corp Reversible micro-encapsulation
WO1989010397A1 (en) * 1988-04-18 1989-11-02 Nitta Gelatin Inc. Process for culturing animal cells on a large scale and process for preparing supporting substrate for that process
JP2009273461A (ja) * 2008-05-13 2009-11-26 Commissariat A L'energie Atomique 細胞集団を選別するため、および選別後の細胞集団を連続的にカプセル化するためのマイクロ流体システムおよび方法
JP2010025911A (ja) * 2008-06-16 2010-02-04 Sony Corp マイクロチップ及びマイクロチップにおける送流方法
JP2010038866A (ja) * 2008-08-08 2010-02-18 Sony Corp マイクロチップ、微小粒子分取装置及び送流方法
WO2014126228A1 (ja) * 2013-02-16 2014-08-21 国立大学法人千葉大学 細胞評価用ハイドロゲル基材および細胞評価手法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57197031A (en) * 1981-03-13 1982-12-03 Damon Corp Reversible micro-encapsulation
WO1989010397A1 (en) * 1988-04-18 1989-11-02 Nitta Gelatin Inc. Process for culturing animal cells on a large scale and process for preparing supporting substrate for that process
JP2009273461A (ja) * 2008-05-13 2009-11-26 Commissariat A L'energie Atomique 細胞集団を選別するため、および選別後の細胞集団を連続的にカプセル化するためのマイクロ流体システムおよび方法
JP2010025911A (ja) * 2008-06-16 2010-02-04 Sony Corp マイクロチップ及びマイクロチップにおける送流方法
JP2010038866A (ja) * 2008-08-08 2010-02-18 Sony Corp マイクロチップ、微小粒子分取装置及び送流方法
WO2014126228A1 (ja) * 2013-02-16 2014-08-21 国立大学法人千葉大学 細胞評価用ハイドロゲル基材および細胞評価手法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7395796B1 (ja) * 2022-06-29 2023-12-11 持田製薬株式会社 ゲルファイバ製造装置及び製造方法
WO2024005067A1 (ja) * 2022-06-29 2024-01-04 持田製薬株式会社 ゲルファイバ製造装置及び製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20210207120A1 (en) 2021-07-08
JP7159334B2 (ja) 2022-10-24
JPWO2020066306A1 (ja) 2021-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020066306A1 (ja) 細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路
Nerger et al. Microextrusion printing cell-laden networks of type I collagen with patterned fiber alignment and geometry
JP6439918B2 (ja) ３次元細胞構造体の製造方法
US10221382B2 (en) Hollow microfiber
Hu et al. Hydrodynamic spinning of hydrogel fibers
Wang et al. One-step synthesis of composite hydrogel capsules to support liver organoid generation from hiPSCs
CN105624832B (zh) 基于微流控技术制备具球棒结构的海藻酸钙微纤维的方法
WO2016021498A1 (ja) 繊維状タンパク質材料の作製方法、および細胞培養方法
Wang et al. Geometrically controlled preparation of various cell aggregates by droplet-based microfluidics
KR20110025341A (ko) 다공성 표면을 갖는 야누스 형태의 조직공학용 고분자 마이크로 섬유의 제조방법
Jorgensen et al. Predictable fabrication of pre-made alginate hydrogel microtubes for stem cell aggregation using needle-in-needle devices
Jeong et al. Microfluidic spinning of grooved microfiber for guided neuronal cell culture using surface tension mediated grooved round channel
JP5939558B2 (ja) 非球形ハイドロゲル粒子の合成法及び非球形ハイドロゲル粒子
Yoo et al. Fabrication of alginate fibers using a microporous membrane based molding technique
Miyama et al. A droplet-based microfluidic process to produce yarn-ball-shaped hydrogel microbeads
CN211394494U (zh) 一种三维细胞培养装置
JP7306647B2 (ja) 移植片及びその使用
KR102360763B1 (ko) 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 및 이를 이용한 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조방법
Bertillot et al. Compressive stress triggers fibroblasts spreading over cancer cells to generate carcinoma in situ organization
CN117586943B (zh) 体外构建类器官的方法及类器官
JP7134464B2 (ja) コラーゲンチューブの作製方法
WO2020262656A1 (ja) マイクロ流体デバイス及びその製造方法、並びに立体組織の培養方法
WO2019012622A1 (ja) 任意形状の３次元細胞構造体の製造装置およびその製造方法
US20200376165A1 (en) System and method for fabricating a cornea
KR101846732B1 (ko) 신경세포 in vitro 배양방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19866827

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020548095

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19866827

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1