WO2023233827A1 - 位相画像取得方法及び定量データ取得方法 - Google Patents

Abstract

底面が曲面である凹部を有する容器の前記凹部に対象物を収容した状態で、対象物のホログラム画像を取得する。ホログラム画像から位相画像を生成する。凹部の底面の形状を示す多項式から導出される位相成分を位相画像から減算する処理を行って、処理済み位相画像を取得する。

Description

位相画像取得方法及び定量データ取得方法

　開示の技術は、位相画像取得方法及び定量データ取得方法に関する。

　ホログラフィー技術を利用して細胞を監視する技術として以下の技術が知られている。例えば、特表２０１８－５１６５９１号公報には、細胞培養容器内における細胞のインキュベーションのための内部チャンバを含むインキュベータキャビネットと、内部チャンバ内の細胞を撮像するように構成されたホログラフィックイメージャと、を含む、細胞培養インキュベータが記載されている。

　細胞を透過した物体光と、物体光に対してコヒーレントな参照光との干渉によって形成されるホログラム画像（干渉像）に基づいて生成される位相画像は、細胞を透過した物体光の位相分布を示す画像であり、細胞の状態が反映される。従って、位相画像に基づいて細胞の品質評価を行うことが可能である。例えば、位相画像の画素毎の位相量を積算して得られる総位相量を、当該細胞の評価するための定量データとして用いることが可能である。

　細胞の位相画像は、底面が傾斜した凹部（ウェル）を有するディッシュ（容器）の上記凹部に細胞を収容した状態で取得され得る。この状態で取得される細胞の位相画像には、凹部底面の傾斜に由来する位相成分が重畳される。凹部底面に由来する位相成分は、いわばノイズであり、位相画像から得られる定量データの精度を低下させる原因となる。

　開示の技術は、上記の点に鑑みてなされたものであり、対象物の位相画像から不要な位相成分を適切に除去することを目的とする。

　開示の技術に係る位相画像取得方法は、底面が曲面である凹部を有する容器の凹部に対象物を収容した状態で、対象物のホログラム画像を取得し、ホログラム画像から位相画像を生成し、凹部の底面の形状を示す多項式から導出される位相成分を位相画像から減算する処理を行って、処理済み位相画像を取得することを含む。

　多項式の次数は、２以上７以下であることが好ましい。位相画像内における凹部の底面の高さの変化量が１０μｍ以上であることが好ましい。

　対象物は、例えば細胞又は細胞集合体であってもよい。細胞又は細胞集合体は、動物の受精卵であってもよい。

　開示の技術の実施形態に係る位相画像取得方法において、凹部に収容した状態で培養された細胞又は細胞集合体の位相画像を取得してもよい。

　開示の技術に係る定量データの取得方法は、上記の位相画像取得方法を用いた定量デー
タの取得方法であって、処理済みの位相画像に基づいて細胞又は細胞集合体の状態を示す定量データを導出することを含む。

　開示の技術によれば、対象物の位相画像から不要な位相成分を適切に除去することが可能となる。

開示の技術の実施形態に係る受精卵の培養状態の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係るホログラフィー装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る受精卵のアンラッピング前の位相画像の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る位相画像の概念を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る凹部の底面の形状について行った関数フィッティングの一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る処理済み位相画像の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る処理済み位相画像の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る処理済み位相画像の一例を示す図である。 比較例に係る容器の構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る凹部の底面の高さの変化量を示す図である。

　以下、開示の技術の実施形態の一例を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素及び部分には同一の参照符号を付与し、重複する説明は省略する。

　開示の技術の実施形態に係る位相画像取得方法は、底面が曲面である凹部を有する容器の凹部に対象物を収容した状態で、対象物のホログラム画像を取得する第１のステップと、ホログラム画像から位相画像を生成する第２のステップと、凹部の底面の形状に応じた多項式から導出される位相成分を、位相画像から減算する処理（バックグラウンド除去処理）を行って、処理済み位相画像を取得する第３のステップを含む。

　上記第１乃至第３のステップの各々について、以下に詳細に説明する。なお、本実施形態においては、位相画像を取得する対象となる対象物が、動物の受精卵である場合を例に説明する。受精卵は胚の状態にまで発育したものであってもよい。開示の技術に係る位相画像取得方法は、例えば、受精卵の品質管理、品質評価、品質検査又は品質予測等の目的で使用することが可能である。

＜第１のステップ：ホログラム画像の取得＞
　図１は、受精卵２００の培養状態の一例を示す図である。受精卵２００は、凹部１１０を有する容器１００の凹部１１０に収容した状態で培養される。容器１００は、複数の凹部１１０を含んでいてもよく、複数の凹部１１０の各々に、受精卵２００が収容されていてもよい。容器１００は、例えば市販のディッシュ又はシャーレであってもよい。凹部１１０は、ディッシュ又はシャーレに設けられたウェルであってもよい。容器１００として、例えば、CooperSurgical社製の38Special GPS（登録商標）を好適に用いることが可能
である。

　凹部１１０には、受精卵２００とともに培地２１０が収容されており、受精卵２００は、凹部１１０内において培地２１０に浸漬された状態で培養される。凹部１１０の底面１
２０は、曲面とされており、中心部１２１の高さが最も低く、中心部１２１から外側に向けて緩やかに上昇する方向に傾斜している。凹部１１０の底面１２０の形状は球面状であってもよい。

　受精卵２００のホログラム画像を取得する際には、受精卵２００を顕微鏡で捉える必要がある。顕微鏡の視野内に受精卵２００を収めた状態を維持するために、受精卵２００の移動量を抑制することが好ましい。仮に、受精卵２００を平坦面上に配置した場合には、培地の加温に伴う対流等によって受精卵２００が揺動し、受精卵２００を顕微鏡の視野内に収めた状態を維持することが困難となる。凹部１１０の底面１２０が、中心部１２１の高さが最も低くなるような傾斜を有することで、中心部１２１の近傍に受精卵２００を配置することができ、更に、受精卵２００の移動量を抑制することが可能となる。

　第１のステップでは、受精卵２００のホログラム画像が取得される。受精卵２００のホログラム画像は、凹部１１０に受精卵２００を収容した状態で取得される。図２は、ホログラム画像の取得に用いられるホログラフィー装置１０の構成の一例を示す図である。

　ホログラフィー装置１０は、分波器２１、反射ミラー２２、２４、対物レンズ２３、結像レンズ２５、合波器２６及び撮像装置３０を含んで構成されている。撮像対象の受精卵２００は、容器１００の凹部１１０内に培地とともに収容された状態で反射ミラー２２と対物レンズ２３との間に配置される。

　レーザ光源２０には、例えば波長６３２．８ｎｍのＨｅＮｅレーザを用いることが可能である。レーザ光源２０から出射された直線偏光であるレーザ光Ｌ０は、分波器２１によって２つのレーザ光に分割される。２つのレーザ光の一方は物体光Ｌ１とされ、他方は参照光Ｌ２とされる。分波器２１としてビームスプリッタを用いることができる。物体光Ｌ１は、反射ミラー２２に入射する。反射ミラー２２によって進行方向が曲げられた物体光Ｌ１は、受精卵２００に照射される。物体光Ｌ１は、凹部１１０の底面１２０を貫く方向に照射される。

　受精卵２００を透過した物体光Ｌ１による像は、対物レンズ２３によって拡大される。対物レンズ２３を透過した物体光Ｌ１は、反射ミラー２４によって進行方向が曲げられて、結像レンズ２５を介して合波器２６に入射する。一方、参照光Ｌ２も合波器２６に入射する。物体光Ｌ１及び参照光Ｌ２は合波器２６によって合波され、撮像装置３０の撮像面に結像される。合波器２６としてビームスプリッタを用いることができる。

　物体光Ｌ１と参照光Ｌ２との干渉によって生じる干渉像であるホログラム画像が撮像装置３０によって撮像される。撮像装置３０は、ＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide-Semiconductor）イメージセンサ等の撮像素子を備え、ホログラム画像の画像データを生成
する。

＜第２のステップ：位相画像の取得＞
　ホログラム画像から位相画像を取得する方法の一例について以下に説明する。はじめに、撮像装置３０によって取得された受精卵２００のホログラム画像を、例えば、２０４８×２０４８のサイズとなるようにトリミングを行った後、二次元フーリエ変換する。この処理によって得られるフーリエ変換画像は、直接光、物体光、共役光に基づく像を含み得る。

　次に、フーリエ変換画像における直接光に対する物体光のずれ量を特定することで物体光の位置を特定し、例えば、半径２５０ｐｉｘｅｌの円形開口のマスクを用いた周波数フィルタリング処理により、物体光のみの複素振幅成分を抜き出す。

　次に、例えば、角スペクトル法を適用して任意の空間位置の受精卵２００の位相を示す画像を復元する。具体的には、撮像装置３０の撮像面で捉えた波面ｕ（ｘ，ｙ；０）のフーリエ変換画像の角スペクトルＵ（ｆ_ｘ，ｆ_ｙ；０）を求める。次に、下記の（１）式に示すように、角スペクトルＵ（ｆ_ｘ，ｆ_ｙ；０）に伝達関数Ｈ（ｆ_ｘ，ｆ_ｙ；ｚ）を乗算することで、光軸方向（ｚ方向）の任意の位置ｚにおける波面を再生する。ここで、伝達関数Ｈ（ｆ_ｘ，ｆ_ｙ；ｚ）は、周波数応答関数（インパルス応答関数(グリーン関数)のフーリエ変換）である。

　次に、下記の（２）式に示すように、光軸方向（ｚ方向）の位置ｚにおける波面Ｕ（ｆ_ｘ，ｆ_ｙ；ｚ）について逆フーリエ変換を実施することで、位置ｚにおける解ｕ（ｘ，ｙ；ｚ）を導出する。

　次に、下記の（３）式に示すように、ｕ（ｘ，ｙ；ｚ）についての位相φを導出することで位相画像を生成する。

　上記の処理によって得られるアンラッピング前の位相画像における位相は、０～２πの値に畳みこまれている。そこで、例えば、Unweighted Least Squares（重みなし最小２乗法）またはFlynn's Algorithm（フリンのアルゴリズム）などの位相接続（アンラッピン
グ）手法を適用して２π以上の部分を接続する。なお、アンラッピングの手法は数多く提案されており、位相不整合を生じない適切なものを適宜選択すればよい。

　図３は、受精卵２００のアンラッピング前の位相画像の一例を示す図である。位相画像には、凹部１１０の底面１２０の傾斜に由来する位相成分が重畳される。凹部１１０の底面１２０に由来する位相成分は、いわばノイズであり、位相画像から得られる定量データの精度を低下させる原因となる。凹部１１０の底面１２０に由来する位相成分は、以下に説明するバックグラウンド除去処理によって除去される。

＜第３のステップ：バックグラウンドの除去＞
　図４は、位相画像Ｉ_Ｐの概念を示す図である。図４下段は、位相画像Ｉ_Ｐの各画素ｋにおける位相量を三次元表示したものである。図４上段は、位相画像Ｉ_Ｐの各画素ｊにおける位相量を平面上にグレースケールで示したものである。

　ここで、位相画像Ｉ_Ｐの各画素ｊにおける位相量をＰ_Ｓとし、同一焦点面内に存在するバックグラウンド（受精卵２００の存在しない領域）の位相をＰ_Ｂとした場合、バックグ
ラウンド除去処理は、下記（４）式によって表すことができる。なお、本明細書中における「位相」という用語は、光を電磁波とみなした場合の電場振幅の位相であり、より一般的な意味で使用される。

　バックグラウンドの位相Ｐ_Ｂは、凹部１１０の底面１２０に由来する位相成分である。したがって、凹部１１０の底面１２０の形状を特定することで、バックグラウンドの位相Ｐ_Ｂを算出することが可能である。凹部１１０の底面１２０は、曲面とされていることから、凹部１１０の底面１２０の形状について、次数が２以上である多項式による関数フィッティングを行うことが可能である。関数フィッティングは、例えば、凹部１１０の底面１２０の形状のプロファイルを実測によって取得し、取得したプロファイルに近似する多項式を探索することにより行うことができる。

　図５は、凹部１１０の底面１２０の形状について行った関数フィッティングの一例を示す図である。図５において、横軸は、凹部１１０の平面方向における位置を示し、縦軸は凹部１１０の高さ方向における位置を示す。図５において、点線は凹部１１０の底面１２０の形状を示す２次多項式によって規定される曲線であり、実線は凹部１１０の底面１２０の形状の実測によるプロファイルである。実線と点線は、略一致しているのがわかる。このように、凹部１１０の底面１２０の形状は、次数が２以上の多項式によって記述することが可能である。

　バックグラウンドの位相Ｐ_Ｂ、すなわち、凹部１１０の底面１２０に由来する位相成分は、凹部１１０の底面１２０の形状を示す多項式から導出することが可能である。バックグラウンドの位相Ｐ_Ｂは、下記の（５）式によって表される。（５）式において、ｘは凹部１１０の中心部１２１からの距離である。ｍは多項式の次数である。ａ_ｋは各項の係数であり、凹部１１０の底面１２０の形状を示す多項式から求めることが可能である。

　なお、底面１２０の形状を示す多項式をＣ（ｘ）としたとき、下記の（６）式によって示される換算処理を行うことによってバックグラウンドの位相Ｐ_Ｂに換算することが可能である。（６）式において、ｎ_ｓは容器１００の屈折率であり、ｎ_ｍは培地の屈折率であり、λはホログラム光学系における物体光の波長である。

　バックグラウンド除去処理においては、（４）式に示すように、凹部１１０の底面１２０の形状を示す多項式から導出される位相成分が、第２のステップにおいて得られた位相画像における各画素の位相量から減算される。これにより、凹部１１０の底面１２０に由来する位相成分が除去された位相画像が取得される。バックグラウンドの位相Ｐ_Ｂ、すなわち、凹部１１０の底面１２０に由来する位相成分が除去された位相画像を以下において「処理済み位相画像」と呼ぶこととする。

　図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃは、それぞれ、処理済み位相画像の一例を示す図である。図６Ａは、凹部１１０の底面１２０の形状を示す多項式の次数を３として関数フィッティングを行った場合の処理済み位相画像である。図６Ｂは、凹部１１０の底面１２０の形状を示す多項式の次数を５として関数フィッティングを行った場合の処理済み位相画像である。図６Ｃは、凹部１１０の底面１２０の形状を示す多項式の次数を７として関数フィッティングを行った場合の処理済み位相画像である。図６Ａ～図６Ｃに示すように、バックグラウンド除去処理を行うことで、凹部１１０の底面１２０に由来する位相成分が除去されて、受精卵２００のみが抽出された処理済み位相画像を取得することができる。

　図７は、比較例に係る容器１００Ｘの一例を示す図である。容器１００Ｘは、凹部１１０Ｘの底面１２０が非曲面である点が、上記した開示の技術の実施形態に係る容器１００（図１参照）と異なる。すなわち、比較例に係る凹部１１０Ｘの底面１２０Ｘの傾斜は直線的である。

　比較例に係る容器１００Ｘによれば、凹部１１０Ｘの底面１２０Ｘの中心部１２１Ｘにおける高さの変化が急激となるため、底面１２０Ｘの形状について関数フィッティングを行った場合、誤差が大きくなる。関数フィッティングにおける誤差は、当該多項式に基づいて導出されるバックグラウンドの位相Ｐ_Ｂの誤差となるので、比較例に係る容器１００Ｘを用いた場合、凹部１１０Ｘの底面１２０Ｘに由来する位相成分の除去を適切に行うことが困難となる。

　一方、開示の技術の実施形態に係る容器１００の凹部１１０の底面１２０は、中心部１２１における高さが最も低く、中心部１２１から外側に向けて緩やかに傾斜している曲面とされているので、凹部１１０の底面１２０の形状について高精度な関数フィッティングを行うことが可能である（図５参照）。すなわち、開示の技術の実施形態に係る位相画像取得方法によれば、対象物の位相画像から不要な位相成分を適切に除去することが可能となる。

　なお、凹部１１０の底面１２０の形状を示す多項式の次数は２以上７以下であることが好ましい。多項式の次数を２以上とすることで、多項式によって曲面を記述することが可能となる。多項式の次数を７以下とすることで、凹部１１０の底面１２０の形状について、高精度な関数フィッティングを行うことが可能となり、凹部１１０の底面１２０に由来する位相成分の除去を適切に行うことが可能となる。多項式の次数が８以上となると、関数フィッティングにおける誤差が生じやすくなる傾向がある。なお、８次以上でフィッティングを行った場合でも、その係数の寄与分 (ａ_ｋ×ｘ^ｋ) が、２次～７次の係数の寄与分の総和（Σｋ＝２～７ ａ_ｋ×ｘ^ｋ）の１０％よりも小さい場合、実質的に７次でフィ
ッティングしているものとする 。また、位相画像内（位相画像の描出範囲内）における
凹部１１０の底面１２０の高さの変化量Δｈ（図８参照）が１０μｍ以上であることが好ましい。変化量Δｈが１０μｍ以上となることで、凹部１１０の底面１２０の形状の関数フィッティングを精度よく行うことが可能となり、凹部１１０の底面１２０に由来する位相成分の除去を適切に行うことが可能となる。

＜定量データの取得＞
　開示の技術の実施形態に係る定量データの導出方法は、上記した位相画像取得方法を用いるものである。すなわち、定量データ導出方法は、上記した位相画像取得方法を実施することで取得される処理済み位相画像に基づいて、受精卵２００の状態を示す定量データを導出する、というものである。本実施形態に係る定量データ導出方法について、以下に詳細に説明する。

　処理済み位相画像の各画素ｊにおける位相量Ｐ_ｊは、下記（７）式によって表わすこと
ができる。但し、ｎ_ｊは処理済み位相画像の各画素ｊに対応する部位における受精卵２００の屈折率であり、ｄ_ｊは処理済み位相画像の各画素ｊに対応する部位における受精卵２００の厚さであり、λはホログラム光学系における物体光の波長である。

　受精卵２００の処理済み位相画像は、受精卵２００を透過した物体光Ｌ１の位相分布を示す画像であり、受精卵２００を透過した物体光の光路長分布を示した画像でもある。受精卵２００内における光路長は、受精卵２００の屈折率と受精卵２００の厚さの積に相当することから、受精卵２００の処理済み位相画像は、（７）式にも示されているように、受精卵２００の屈折率及び厚さ（形状）の情報を含んでいる。受精卵２００の処理済み位相画像には、受精卵２００の内部の状態が反映されるので、処理済み位相画像に基づいて受精卵２００の品質評価を行うことが可能である。具体的には、下記の（８）式によって表される総位相量Ｐ_Ａを受精卵２００の状態を示す定量データとして用いることが可能である。（８）式において、ｓは処理済み位相画像の各画素ｊの面積であり、ｖ_ｊは処理済み位相画像の各画素ｊに対応する部位における受精卵２００の体積である。（８）式に示されるように、総位相量Ｐ_Ａは、処理済み位相画像の画素毎の位相量Ｐ_ｊを、全ての画素ｊについて積算したものに相当する。処理済み位相画像の画素値は位相量Ｐ_ｊに対応している。

　例えば、処理済み位相画像に基づいて導出した総位相量Ｐ_Ａについて閾値判定を行うことで、受精卵２００の良否判定を行うことが可能である。開示の技術の実施形態に係る位相画像取得方法を実施することで取得される処理済み位相画像に基づいて、受精卵２００の状態を示す定量データを導出することで、定量データの精度を高めることができ、受精卵２００の評価を適切に行うことが可能となる。

　なお、位相画像に基づいて導出される定量データは、総位相量Ｐ_Ａに限定されるものではない。例えば、処理済み位相画像の画素値（位相量Ｐ_ｊ）の最大値、最小値、中央値、平均値、分散及び標準偏差等の統計値を定量データとして用いることも可能である。また、総位相量Ｐ_Ａを当該受精卵２００の体積で割った値である位相密度を、定量データとして用いることも可能である。

　以上の説明では、位相画像を取得する対象物が、受精卵である場合を例示したが、この態様に限定されない。対象物は、受精卵以外の細胞又は細胞集合体であってもよい。例えば、ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cell）又はその集合体であるスフェロイド
の位相画像を取得する場合に開示の技術を適用することが可能である。また、位相画像を取得する対象物は、人工物であってもよい。

［実施例］
　下記の表１に示すディッシュを用いてマウス胚を５日間培養した。各ディッシュに設けられた凹部（ウェル）の底面の形状を表１に示す。実施例１及び実施例２に係るディッシュの凹部の底面は、図１に例示するような曲面である。比較例１に係るディッシュは、凹部を有さない底面が平坦なディッシュである。比較例２に係るディッシュの凹部の底面は、図７に例示するような傾斜が直線的である非曲面である。各ディッシュにマウス胚が収
容された状態で、マウス胚のホログラム画像を取得し、ホログラム画像から位相画像を取得した。

＜底面の高さの変化量Δｈの測定＞
　各ディッシュについて、断面の画像を撮影し、位相画像内における凹部（ウェル）の底面の高さの変化量Δｈ（図８参照）を測定した。変化量Δｈの測定値を表１に示す。

＜バックグラウンド除去処理＞
　各実施例及び各比較例について取得したマウス胚の位相画像について、バックグラウンド除去処理を行った。凹部（ウェル）の底面が曲面である実施例１及び実施例２については、凹部の底面の形状について、５次多項式による関数フィッティングを行った。凹部の底面が非曲面である比較例２については、凹部の底面の形状について１次多項式による関数フィッティングを行った。これらの多項式から導出される位相成分を、位相画像から除去することで、処理済み位相画像を取得した。なお、ディッシュの底面が平坦である比較例１については、バックグランド除去処理は未実施である。

＜移動量の測定＞
　各実施例及び各比較例について、培養期間中におけるマウス胚の移動量を測定した。培養開始時点におけるマウス胚の位置を初期位置とし、培養期間中においてマウス胚が初期位置から最も離れた位置に移動したときのマウス胚の位置の、初期位置からの距離を移動量とした。移動量の測定値を表１に示す。実施例１、実施例２及び比較例２に係るディッシュは、底面が傾斜している凹部を備えることから、マウス胚の移動量が抑制されている。一方、底面が平坦な比較例１に係るディッシュを用いた場合、マウス胚の移動量が最も大きくなった。

＜位相測定誤差の測定＞
　各実施例及び各比較例について取得した処理済み位相画像について、位相測定誤差を取得した。同一のマウス胚に対し、培養開始直後に（８）式によって示される総位相量Ｐ_Ａの測定を１００回繰り返し行った。総位相量Ｐ_Ａのバラツキが±１σとなる位相量の幅を、総位相量Ｐ_Ａの平均値で割ったものを位相測定誤差とした。なおσは標準偏差である。位相測定誤差の測定値を表１に示す。

　凹部（ウェル）の底面が曲面である実施例１及び実施例２に係るディッシュにおいては、凹部の底面の形状について高精度な関数フィッティングを行うことができるので、バックグランド除去処理を適切に行うことができる。これにより、位相測定誤差を５％以下にすることができた。一方、凹部の底面の形状が非曲面である比較例２に係るディッシュにおいては、凹部の底面の形状について高精度な関数フィッティングを行うことが困難であり、バックグラウンド除去処理を適切に行うことが困難である。これにより、位相測定誤差は、実施例１及び実施例２と比較して顕著に大きくなった。

　以上のように、実施例１及び実施例２に係るディッシュを用いて、バックグラウンド除去処理を行うことで、マウス胚の移動量を抑制し、誤差の小さい定量データ（総位相量Ｐ_Ａ）を取得することができた。

　以上の実施形態に関し、更に以下の付記を開示する。
（付記１）
　底面が曲面である凹部を有する容器の前記凹部に対象物を収容した状態で、前記対象物のホログラム画像を取得し、
　前記ホログラム画像から位相画像を生成し、
　前記凹部の底面の形状を示す多項式から導出される位相成分を前記位相画像から減算する処理を行って、処理済み位相画像を取得する
　位相画像取得方法。

（付記２）
　前記多項式の次数が２以上７以下である
　付記１に記載の位相画像取得方法。

（付記３）
　前記位相画像内における前記凹部の底面の高さの変化量が１０μｍ以上である
　付記１又は付記２に記載の位相画像取得方法。

（付記４）
　前記対象物が細胞又は細胞集合体である
　付記１から付記３のいずれか１つに記載の位相画像取得方法。

（付記５）
　前記細胞又は前記細胞集合体は、動物の受精卵である
　付記４に記載の位相画像取得方法。

（付記６）
　前記凹部に収容した状態で培養された前記細胞又は前記細胞集合体の位相画像を取得する
　付記４又は付記５に記載の位相画像取得方法。

（付記７）
　付記４又は付記５に記載の位相画像取得方法を用いた定量データの取得方法であって、
　前記処理済みの位相画像に基づいて前記細胞又は細胞集合体の状態を示す定量データを導出する
　定量データ取得方法。

　なお、２０２２年６月３日に出願された日本国特許出願２０２２－０９１０５６の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。また、本明細書に記載された全ての文献、特許出願および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (7)

1. 　底面が曲面である凹部を有する容器の前記凹部に対象物を収容した状態で、前記対象物のホログラム画像を取得し、
   　前記ホログラム画像から位相画像を生成し、
   　前記凹部の底面の形状を示す多項式から導出される位相成分を前記位相画像から減算する処理を行って、処理済み位相画像を取得する
   　位相画像取得方法。
2. 　前記多項式の次数が２以上７以下である
   　請求項１に記載の位相画像取得方法。
3. 　前記位相画像内における前記凹部の底面の高さの変化量が１０μｍ以上である
   　請求項２に記載の位相画像取得方法。
4. 　前記対象物が細胞又は細胞集合体である　
   　請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の位相画像取得方法。
5. 　前記細胞又は前記細胞集合体は、動物の受精卵である
   　請求項４に記載の位相画像取得方法。
6. 　前記凹部に収容した状態で培養された前記細胞又は前記細胞集合体の位相画像を取得する
   　請求項４に記載の位相画像取得方法。
7. 　請求項４に記載の位相画像取得方法を用いた定量データの取得方法であって、
   　前記処理済みの位相画像に基づいて前記細胞又は前記細胞集合体の状態を示す定量データを導出する
   　定量データ取得方法。