WO2020066348A1 - 判定方法 - Google Patents

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WO2020066348A1
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sphere
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aggregate
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崇市郎 中村
祥 小野澤
龍介 大▲崎▼
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富士フイルム株式会社
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Definitions

  • the disclosed technology relates to a determination method for determining a state of an aggregate of a plurality of cells.
  • Patent Literature 1 discloses a method for determining the degree of differentiation of pluripotent stem cells using the flatness of the surface of one cell or the flatness of the surface of a cell population as an index of the degree of differentiation.
  • Patent Literature 2 discloses a multi-layer colony containing a multipotent stem cell in which a differentiated colony containing a differentiated pluripotent stem cell, an undifferentiated colony containing only an undifferentiated pluripotent stem cell, and a multi-layered pluripotent stem cell are stacked based on the luminance in a captured image. Is described. In this method, a colony having a region with a luminance higher than the first luminance threshold is determined to be a differentiated colony. In addition, a colony having only a region with a luminance equal to or lower than the first threshold is determined to be an undifferentiated colony.
  • a colony having only a region having a luminance equal to or lower than the first threshold and having a luminance equal to or higher than the second threshold is determined to be an undifferentiated colony.
  • a colony having an area with a luminance lower than the second threshold is determined to be a multilayer colony.
  • Patent Document 3 discloses an image input step of inputting a captured image obtained by capturing cells in a neural differentiation process, a neurite extraction step of extracting neurites appearing in cells in a neural differentiation process from an original image based on the captured image, A neurite correspondence determination step of determining a state of the extracted neurite is described.
  • Patent Document 4 discloses a method for presenting a cell state, wherein a time-lapse profile of the cell is obtained by monitoring a time-lapse of a gene state associated with at least one gene selected from genes derived from the cell. A method is described that includes the steps of presenting the temporal profile.
  • a culture method capable of mass-producing cells there is known a three-dimensional culture method in which spheres, which are aggregates of cells, are cultured in a state of being suspended in a medium.
  • a technique for non-destructively and simply evaluating the quality of cells in a sphere state is required from the viewpoint of easy process control.
  • no method has been established for evaluating spheres of various sizes randomly present in the three-dimensional space, and it is difficult to directly observe the cell density and survival status, especially inside the sphere. is there. For this reason, as described in Patent Literatures 1-3, evaluation using a conventional two-dimensional culture technique has been performed.
  • the disclosed technique aims to non-destructively and easily determine the state of aggregates of a plurality of cells formed by three-dimensional culture.
  • the determination method generates a phase difference image of an aggregate from a hologram obtained by imaging an aggregate of a plurality of cells, and indicates the randomness of the array of the amount of phase difference in a plurality of pixels forming the phase difference image. Deriving a first index value and determining a state of a cell constituting the aggregate based on the first index value. According to the determination method according to the disclosed technology, the state of the aggregate of a plurality of cells formed by three-dimensional culture can be determined nondestructively and easily.
  • the first index value may be a value determined according to a degree of deviation from a circle of a shape of a region surrounded by equiphase lines connecting pixels having the same phase difference amount in the phase difference image.
  • the minimum value of the phase difference amount in a predetermined range in a plurality of pixels constituting the phase difference image is ⁇ 0
  • the maximum value is ⁇ N
  • the circumference of the isophase line at an arbitrary phase ⁇ in the predetermined range is set.
  • the average phase fluctuation ⁇ defined by the following equation (3) is It can be used as an index value of 1.
  • the first index value may be derived based on a shape component removal image that has been subjected to a process of removing a component depending on the shape of the aggregate from the phase difference image.
  • a shape component removal image that has been subjected to a process of removing a component depending on the shape of the aggregate from the phase difference image.
  • an autocorrelation function or a two-dimensional power spectrum derived based on the shape component removed image may be derived as the first index value.
  • the determination method according to the disclosed technology may include performing a determination regarding the survival rate of the cells constituting the aggregate based on the first index value. Further, when the cells constituting the aggregate are stem cells, the determination method according to the disclosed technology may include performing a determination regarding the undifferentiation rate of the stem cells constituting the aggregate based on the first index value. . By making a determination on the cell survival rate or undifferentiation rate based on the first index value, the determination can be made nondestructively and easily.
  • the determination method derives a second index value indicating a correlation between the first index value and the particle size of the aggregate for a plurality of aggregates included in the determination target lot, The determination may be performed on the determination target lot based on the index value. This makes it possible to perform a non-destructive and simple determination on the determination target lot.
  • the determination method according to the disclosed technology may include performing a determination regarding the survival rate of the cells included in the determination target lot based on the second index value. Further, when the cells constituting the aggregate are stem cells, the determination method according to the disclosed technique includes performing a determination regarding the undifferentiation rate of the stem cells included in the determination target lot based on the second index value. obtain. By performing the determination regarding the survival rate or the undifferentiation rate of the cells included in the determination target lot based on the second index value, the determination can be performed nondestructively and easily.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an example of a configuration of an imaging system used for performing a determination method according to an embodiment of the disclosed technology.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating an example of a hologram used for performing a determination method according to an embodiment of the disclosed technology. It is a figure showing an example of a Fourier transform picture of a sphere. It is a figure showing an example of a phase contrast picture before unwrapping of a sphere. It is a figure showing an example of a phase contrast picture after unwrapping of a sphere.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a concept of a phase difference image according to an embodiment of the disclosed technology.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram related to focusing of a phase difference image according to an embodiment of the disclosed technology.
  • 11 is an example of a hardware configuration of a computer that performs an autofocus process according to an embodiment of the disclosed technology.
  • 11 is a flowchart illustrating an example of a flow of an autofocus process according to an embodiment of the disclosed technology.
  • 9 is a graph illustrating an example of a relationship between a focus position and a variation in a phase difference amount in a phase difference image of a sphere according to the embodiment of the disclosed technology. It is a figure showing a phase difference picture of a sphere.
  • FIG. 8B is a contour diagram illustrating a distribution of a phase difference amount in the phase difference image illustrated in FIG. 8A. It is a figure showing a phase difference picture of a sphere.
  • FIG. 9B is a contour diagram illustrating a distribution of a phase difference amount in the phase difference image illustrated in FIG. 9A. It is a figure showing a phase difference picture of a sphere.
  • FIG. 10B is a contour diagram illustrating a distribution of a phase difference amount in the phase difference image illustrated in FIG. 10A. It is a figure showing a phase difference picture of a sphere.
  • FIG. 11B is a contour diagram illustrating a distribution of a phase difference amount in the phase difference image illustrated in FIG. 11A.
  • 5 is a graph showing an example of a correlation between a sphere particle size and an average phase fluctuation. It is a graph which shows an example of the correlation between the constant A and the undifferentiation rate.
  • FIG. 5 is a graph showing an example of a correlation between a sphere particle size and an average phase fluctuation. It is a graph which shows the correlation between the constant A and the cell survival rate. It is a figure which shows an example of the image (right figure) which extracted the randomness (spatial variation) of the phase difference amount from the phase difference image of the sphere.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a two-dimensional power spectrum derived for an image that has been subjected to a process of removing a component depending on the shape of a sphere from a phase difference image of the sphere.
  • the determination method generates a phase difference image of an aggregate (sphere) from a hologram obtained by imaging an aggregate (sphere) of a plurality of cells, and calculates a position in a plurality of pixels constituting the phase difference image. This is a value that derives a first index value indicating the randomness of the sequence of the amount of phase difference, and determines the state of the cells constituting the aggregate (sphere) based on the first index value. According to this determination method, the state of the aggregate (sphere) can be determined nondestructively and easily.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an example of a configuration of an imaging system 1 used for performing a determination method according to an embodiment of the disclosed technology.
  • the imaging system 1 includes a hologram optical system 10 for acquiring a sphere hologram using a known digital holography technique.
  • Digital holography technology uses an image sensor to capture an image generated by interference between object light transmitted or reflected by an object and reference light that is coherent to the object light, and the image obtained by the imaging is based on light propagation. This is a technique for restoring the wavefront of light waves from an object by performing numerical calculations. According to the digital holography technique, the phase distribution of an object can be quantified, and three-dimensional information of the object can be obtained without mechanically moving a focal position.
  • the hologram optical system 10 includes a laser light source 11, beam splitters 12, 18, collimating lenses 13, 21, an objective lens 15, a dichroic mirror 34, an imaging lens 17, and a CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera 19. I have.
  • the sphere as the sample 14 set on the sample stage is arranged between the collimator lens 13 and the objective lens 15.
  • the laser light source 11 for example, a HeNe laser having a wavelength of 632.8 nm can be used.
  • the laser light emitted from the laser light source 11 is split into two laser lights by the beam splitter 12.
  • One of the two laser beams is used as an object beam, and the other is used as a reference beam.
  • the object light is collimated by a collimating lens 13 and then applied to a sphere which is a sample 14 set on a sample stage.
  • the image of the object light transmitted through the sphere is enlarged by the objective lens 15.
  • the object light that has passed through the objective lens 15 passes through the dichroic mirror 34, is converted into parallel light again by the imaging lens 17, and is then imaged on the imaging surface of the CMOS camera 19 via the beam splitter 18.
  • the reference light is guided by the optical fiber 20 to a position before the collimator lens 21.
  • the reference light emitted from the optical fiber 20 is converted into parallel light by the collimator lens 21, and enters the imaging surface of the CMOS camera 19 via the beam splitter 18.
  • a hologram generated by interference between the object light and the reference light is recorded by the CMOS camera 19. Note that an off-axial optical system in which the optical axes of the object light and the reference light incident on the imaging surface of the CMOS camera 19 are different from each other may be configured.
  • a phase difference image of a sphere can be obtained without destroying the sphere and without damaging cells constituting the sphere.
  • the configuration of the imaging system 1 described above is merely an example, and is not limited to the above configuration.
  • any imaging system that can acquire a hologram using a digital hologram technology can be used.
  • FIG. 2A the hologram illustrated in FIG. 2A acquired by the CMOS camera 19 is subjected to two-dimensional Fourier transform to extract a complex amplitude component of only the object light.
  • FIG. 2B is an example of a Fourier transform image of the sphere obtained by this processing.
  • FIG. 2C is an example of a phase difference image before unwrapping of the sphere obtained by this processing.
  • the sphere phase at this point has been convolved to a value between 0 and 2 ⁇ . Therefore, for example, by applying a phase connection (unwrapping) method such as Unweighted Least Squares (unweighted least squares method) or Flynn's Algorithm (Flinn's algorithm), a portion of 2 ⁇ or more is joined, and FIG.
  • a phase difference image of the final sphere as illustrated can be obtained.
  • Many unwrapping methods have been proposed, and an appropriate method that does not cause phase mismatch may be appropriately selected.
  • Figure 3 is a diagram showing the concept of a phase difference image I P.
  • the lower part of FIG. 3 is an image obtained by three-dimensionally displaying the amount of phase difference at each pixel k of the phase difference image I P.
  • the upper part of FIG. 3 is a diagram showing an amount of phase difference at each pixel k of the phase difference image I P in grayscale on a plane.
  • phase difference image I P the amount of phase difference theta in the phase difference image I P, the phase of the background (non-existing regions of the spheres) existing in the same focal plane of the phase contrast image I P and theta B, a region in the presence of Spheres
  • phase is represented by the following equation (1).
  • phase in this specification is a phase of an electric field amplitude when light is regarded as an electromagnetic wave, and is used in a more general sense.
  • phase difference amount theta k in each pixel k of the phase difference image I P can be represented by the following equation (2).
  • n k is the index of refraction of the spheres in the region corresponding to each image k of the phase difference image I P
  • d k is the thickness of the spheres at the site corresponding to each pixel k of the phase difference image I P
  • ⁇ is the wavelength of the object light in the hologram optical system 10.
  • the phase difference image of the sphere is an image showing the optical path length distribution of the object light transmitted through the sphere. Since the optical path length in the sphere corresponds to the product of the refractive index of the sphere and the thickness of the sphere, the phase difference image of the sphere has the refractive index and the thickness of the sphere as shown in equation (2). It contains information on the size (shape).
  • phase difference image From the phase difference image out of focus on the sphere, accurate information matching the actual state of the sphere cannot be obtained due to the influence of the spread due to diffraction. Therefore, when acquiring a phase difference image from the hologram acquired by the CMOS camera 19, it is preferable to focus on the sphere.
  • focus on the sphere means to obtain a phase difference image sliced near the center of the spherical sphere.
  • the focusing of the phase difference image be automated without manual operation.
  • automating focusing it is possible to eliminate arbitrariness by an operator and further reduce processing time.
  • the present inventors have found an automatable focusing technique described below.
  • the left graph in FIG. 4 is a graph showing an example of the relationship between the position of the sphere in the plane direction and the amount of phase difference in the phase difference image, and the solid line corresponds to the state where the sphere is in focus, and the dotted line is the sphere. Corresponds to the state of being out of focus. When the sphere is in focus, a steep peak appears at a specific position in the phase difference image. On the other hand, when the sphere is out of focus, the peak is lower and gentler than when the sphere is in focus.
  • the right graph of FIG. 4 is an example of the histogram of the phase difference amount in the phase difference image of the sphere, and the solid line corresponds to the state where the sphere is in focus, and the dotted line corresponds to the state where the sphere is not in focus. I do.
  • the half width w of the curve (variation in phase difference amount) becomes relatively large
  • the half width w of the curve (variation in phase difference amount) Is relatively small.
  • a phase difference image of a sphere is acquired for each different focus position (slice position), and a half width w (variation of the phase difference amount) of the curve in the histogram of the phase difference amount is obtained for each of the acquired phase difference images.
  • the focusing can be realized by extracting the phase difference image having the maximum half value width w among the obtained half value widths w as the phase difference image focused on the sphere.
  • FIG. 5 is an example of a hardware configuration of a computer 500 that performs an autofocus process for automatically performing the above-described focusing.
  • the computer 500 includes a CPU (Central Processing Unit) 501, a main storage device 502 as a temporary storage area, a nonvolatile auxiliary storage device 503, and a communication I / F (InterFace) 504 for performing communication with the CMOS camera 19. , And a display unit 505 such as a liquid crystal display.
  • the CPU 501, the main storage device 502, the auxiliary storage device 503, the communication I / F 504, and the display unit 505 are connected to a bus 507, respectively.
  • the auxiliary storage device 503 stores an autofocus program 506 describing the procedure of the above autofocus processing.
  • the computer 500 performs an autofocus process when the CPU 501 executes the autofocus program 506.
  • FIG. 6 is a flowchart illustrating an example of the flow of the autofocus process performed by the computer 500.
  • step S1 the CPU 501 obtains a sphere hologram from the CMOS camera 19.
  • step S2 the CPU 501 generates a plurality of phase difference images having different focal positions (slice positions) from the obtained hologram.
  • step S3 the CPU 501 derives a variation in the amount of phase difference for each of the phase difference images for each focal position (slice position). For example, the CPU 501 may derive the difference between the maximum value and the minimum value of the phase difference amount in the phase difference image as the variation of the phase difference amount in the phase difference image.
  • step S4 the CPU 501 converts the phase difference image in which the variation of the phase difference amount derived in step S3 is maximum among the phase difference images having different focal positions (slice positions) from each other into the focused phase difference image. Extract as an image.
  • FIG. 7 is a graph showing an example of the relationship between the focus position (slice position) and the variation in the amount of phase difference in the phase difference image of the sphere.
  • FIG. 7 exemplifies, with a graph, phase difference images of spheres corresponding to focal positions of ⁇ 400 ⁇ m, ⁇ 200 ⁇ m, 0 ⁇ m, +200 ⁇ m, and +400 ⁇ m.
  • the focal position at which the variation in the amount of phase difference is maximum is 0 ⁇ m.
  • a phase difference image corresponding to a focus position of 0 ⁇ m at which the variation of the phase difference amount becomes maximum is extracted as a focused phase difference image.
  • the outline of the sphere is the sharpest.
  • the first index value indicating the randomness of the arrangement of the phase difference amounts in the plurality of pixels forming the phase difference image of the sphere is derived.
  • the method includes determining a state of a cell constituting the sphere based on the first index value.
  • FIG. 8A shows a phase difference of a sphere which is an aggregate of iPS cells extracted from a culture lot in which the ratio of iPS cells maintaining an undifferentiated state in the lot (hereinafter referred to as undifferentiation rate) is 99%. It is a figure showing the example of a typical image.
  • FIG. 8B is a contour diagram showing a distribution of a phase difference amount in the phase difference image shown in FIG. 8A.
  • FIG. 9A is a diagram illustrating a representative example of a phase contrast image of a sphere that is an aggregate of iPS cells extracted from a culture lot with an undifferentiation rate of 87%.
  • FIG. 9B is a contour diagram showing a distribution of a phase difference amount in the phase difference image shown in FIG. 9A.
  • Spheres in lots with a higher undifferentiation rate have higher internal homogeneity compared to spheres in lots with a lower undifferentiation rate (ie, germ layer differentiation is progressing) it is conceivable that. Therefore, in the phase difference image of the sphere in the lot having a relatively high undifferentiation rate, as shown in FIG. 8B, the shape of the region surrounded by the equiphase lines connecting the pixels having the same phase difference amount is circular. The shapes are close, and the equiphase lines are distributed concentrically. On the other hand, in the phase difference image of the sphere in the lot having a relatively low undifferentiation rate, as shown in FIG.
  • the arrangement of the phase difference amounts in a plurality of pixels constituting the phase difference image becomes random, The shape of the area surrounded by is broken. That is, the progress of differentiation of the cells constituting the sphere is reflected in the randomness of the arrangement of the phase difference amounts in the plurality of pixels constituting the phase difference image of the sphere. Therefore, it is possible to quantify the progress of differentiation of the cells constituting the sphere by using the index value indicating the randomness of the arrangement of the phase difference amounts in the plurality of pixels constituting the phase difference image of the sphere.
  • the index value is surrounded by equal phase lines connecting the pixels having the same phase difference amount in the phase difference image of the sphere.
  • An index value determined according to the degree of deviation of the shape of the region from the circle can be used.
  • the average phase fluctuation ⁇ defined by the following equation (3) can be used as an index value indicating the randomness of the arrangement of the phase difference amounts in a plurality of pixels forming the phase difference image of the sphere.
  • ⁇ 0 is the minimum value of the phase difference amount in a predetermined range in a plurality of pixels forming the phase difference image
  • ⁇ N is the maximum value of the phase difference amount in the predetermined range.
  • L ( ⁇ ) is the perimeter of the isophase line at an arbitrary phase ⁇ within the above-mentioned predetermined range
  • a ( ⁇ ) is the area of a region surrounded by the isophase line of the perimeter L ( ⁇ ).
  • the average phase fluctuation ⁇ is minimum when the shape of the region surrounded by the isophase line is a perfect circle, and increases as the shape of the region surrounded by the isophase line increases as the shape departs from the circle. That is, the higher the randomness of the shape of the region surrounded by the equal phase lines, the larger the average phase fluctuation ⁇ .
  • the average phase fluctuation ⁇ in the phase difference image of the sphere corresponding to the undifferentiation rate of 99% shown in FIGS. 8A and 8B is 13.6, which corresponds to the undifferentiation rate of 87% shown in FIGS. 9A and 9B.
  • the average phase fluctuation ⁇ in the phase difference image of the sphere was 18.9.
  • the sphere in a lot with a relatively low undifferentiation rate contains a plurality of cells that have deviated from the undifferentiated state, thereby reducing the homogeneity inside the sphere. As a result, the randomness of the arrangement of the phase difference amounts in the plurality of pixels constituting the phase difference image of the sphere increases, and the average phase fluctuation ⁇ increases.
  • the average phase fluctuation ⁇ as an index value indicating the randomness of the arrangement of the phase difference amounts in a plurality of pixels constituting the phase difference image of the sphere, the progress of differentiation of the cells constituting the sphere can be determined. It is possible to estimate without destroying the cells.
  • FIG. 10A is a diagram illustrating a representative example of a phase contrast image of a sphere that is an aggregate of iPS cells extracted from a lot having a cell viability of 87.3% in the lot.
  • FIG. 10B is a contour diagram showing a distribution of the amount of phase difference in the phase difference image shown in FIG. 10A.
  • FIG. 11A is a diagram illustrating a representative example of a phase contrast image of a sphere that is an aggregate of iPS cells extracted from a culture lot in which the cell survival rate in the lot is 59.2%.
  • FIG. 11B is a contour diagram showing a distribution of a phase difference amount in the phase difference image shown in FIG. 11A.
  • a healthy cell maintains a constant internal refractive index different from the refractive index of a medium due to its homeostasis.
  • dead cells lose homeostasis and the internal refractive index becomes substantially the same as the refractive index of the medium. Therefore, spheres in a culture lot with a relatively high cell viability are considered to have higher internal homogeneity than spheres in a culture lot with a relatively low cell viability. Therefore, in the phase contrast image of the sphere in the culture lot in which the cell viability is relatively high, as shown in FIG.
  • the shape of the region surrounded by the equiphase lines connecting the pixels having the same phase difference amount Has a shape close to a circle, and the equiphase lines are distributed concentrically.
  • the arrangement of the phase difference amounts in a plurality of pixels constituting the phase difference image becomes random, The shape of the region surrounded by the equal phase lines is lost. That is, the survival rate of the cells constituting the sphere is reflected in the randomness of the arrangement of the phase difference amounts in the plurality of pixels constituting the phase difference image of the sphere. Therefore, the average phase fluctuation ⁇ can be used for determining the survival rate of the cells in the sphere.
  • the average phase fluctuation ⁇ in the phase difference image of the sphere corresponding to the cell viability of 87.3% shown in FIGS. 10A and 10B is 5.77, and the cell viability shown in FIGS. 11A and 11B.
  • the average phase fluctuation ⁇ in the phase difference image of the sphere corresponding to 59.2% was 11.08.
  • Spheres in lots with relatively low cell viability have reduced homogeneity inside the sphere due to the inclusion of many dead cells inside. As a result, the randomness of the arrangement of the phase difference amounts in the plurality of pixels constituting the phase difference image of the sphere increases, and the average phase fluctuation ⁇ increases.
  • the survival rate of the cells constituting the sphere can be determined by the cell Can be estimated without destroying.
  • the determination method includes, for a plurality of spheres included in a determination target lot, the above-described index value indicating the randomness of an array of phase difference amounts in a plurality of pixels included in a sphere phase difference image ( (Hereinafter referred to as a first index value) and deriving a second index value indicating a correlation between the sphere particle size and performing a determination on the determination target lot based on the second index value.
  • a first index value average phase fluctuation ⁇ can be used.
  • FIG. 12 is a graph showing the correlation between the sphere particle size and the average phase fluctuation ⁇ obtained for a plurality of spheres included in each of two lots whose undifferentiation rates are 87% and 99%, respectively. As shown in FIG. 12, it was found that the average phase fluctuation ⁇ tends to increase as the sphere particle size increases.
  • the sphere particle size dependence of the average phase fluctuation ⁇ can be considered to be characteristic of a cell line, a three-dimensional culture process, and a differentiation induction process.
  • spheres having a small particle size tend to have uniform progression of differentiation, whereas spheres having a large particle size tend to have uneven progression of differentiation, and
  • the fact that the size dependence of the cell density in the sphere differs depending on the culture and / or differentiation induction process is considered to be a factor that the average phase fluctuation ⁇ has the sphere particle size dependence.
  • the correlation between the sphere particle size and the average phase fluctuation ⁇ illustrated in FIG. 12 can be fitted by, for example, a function represented by the following equation (4). That is, the correlation between the sphere particle size and the average phase fluctuation ⁇ can be represented by an approximate expression using the function of Expression (4).
  • X is a sphere particle size
  • Y is an average phase fluctuation ⁇
  • A is a constant.
  • the constant A in the equation (4) can be used as an index value (a second index value) that indicates (correlates) the correlation between the sphere particle size and the average phase fluctuation ⁇ .
  • FIG. 13 is a graph showing the correlation between the constant A of Expression (4) and the undifferentiation rate in the two lots having different undifferentiation rates shown in FIG.
  • the undifferentiation rate of the cells in the determination target lot is estimated based on the constant A, for example. It is possible.
  • the undifferentiation rate of the determination target lot is determined based on the constant A (the second index value) which is an index value indicating the correlation between the average phase fluctuation ⁇ (the first index value) and the sphere particle size. It is possible to make an estimation, and it is possible to make, for example, a pass / fail judgment on the determination target lot based on the estimated undifferentiation rate.
  • FIG. 14 shows the results obtained for a plurality of spheres included in each of the four lots in which the viability of cells in the lot is 59.2%, 69.8%, 81.5%, and 87.3%, respectively.
  • 5 is a graph showing a correlation between a sphere particle size and an average phase fluctuation ⁇ .
  • the point that the average phase fluctuation ⁇ has a sphere particle size dependency is as described above.
  • FIG. 14 it was found that there was a difference in the correlation between the sphere particle size and the average phase fluctuation ⁇ between lots having different survival rates. That is, the difference in the cell survival rate between lots is reflected in the correlation between the sphere particle size and the average phase fluctuation ⁇ .
  • the correlation between the sphere particle size and the average phase fluctuation ⁇ shown in FIG. 14 can be fitted by, for example, the function shown in equation (4). That is, the correlation between the sphere particle size and the average phase fluctuation ⁇ can be represented by an approximate expression using the function of Expression (4).
  • the constant A which is an index value (second index value) characterizing the correlation between the sphere particle size and the average phase fluctuation ⁇ in the lot having the survival rate of 69.8%
  • FIG. 15 is a graph showing the correlation between the constant A of Expression (4) and the cell viability in the four lots having different cell viabilities shown in FIG.
  • the constant A the second index value
  • the constant A the second index value
  • the index value indicating the correlation between the average phase fluctuation ⁇ the first index value
  • the sphere particle size the cells in the lot for the determination target lot are determined. It is possible to estimate the survival rate of the determination target lot based on the estimated survival rate of the cells.
  • the randomness of the arrangement of the phase difference amount in a plurality of pixels constituting the phase difference image of the sphere May be derived.
  • the component that depends on the shape of the sphere is a surface that is gentle with respect to the pixel size and forms a basic shape of the sphere surface in the phase difference image of the sphere, and is a polynomial surface such as a quadratic function and a cubic function.
  • FIG. 16 shows a shape component-removed image (right diagram) in which randomness (spatial variation) of the phase difference amount is extracted by performing a process of removing a component depending on the shape of the sphere from the phase difference image of the sphere (left diagram).
  • the autocorrelation function derived for the shape component-removed image (the right diagram in FIG. 16) can be used as an index value indicating the randomness of the arrangement of the phase difference amounts in a plurality of pixels constituting the sphere phase difference image. is there. That is, the randomness (spatial variation) of the phase difference amount in the phase difference image of the sphere can be quantified by the autocorrelation function. Accordingly, it is possible to estimate the undifferentiation rate and the survival rate of the cells for the sphere or the lot to be determined including the sphere based on the autocorrelation function derived for the shape component-removed image (the right diagram in FIG. 16). .
  • the autocorrelation function obtained as described above is compared with, for example, a reference sample whose cell viability and undifferentiation rate are known, to determine whether the sphere or a lot to be determined including the sphere is good or bad. It is possible to make a decision.
  • the two-dimensional power spectrum derived for the shape component-removed image (the right diagram in FIG. 16) can be used as an index value indicating the randomness of the arrangement of the phase difference amounts in a plurality of pixels constituting the phase difference image of the sphere. It is.
  • the two-dimensional power spectrum P in the two-dimensional Fourier transform spectrum ⁇ (kx, ky) of the phase difference image ⁇ (x, y) is represented by the following equation (5).
  • kx and ky are spatial frequencies.
  • the randomness (spatial variation) of the phase difference amount in the phase difference image of the sphere can be quantified by the slope of the power spectrum illustrated in FIG. 17 and the function fitting. Then, based on the quantified numerical values, it is possible to estimate the undifferentiation rate and the survival rate of the cells for the sphere or the lot to be determined including the sphere.
  • the two-dimensional power spectrum obtained as described above for example, by comparing the survival rate and undifferentiation rate of the cell with a standard sample known, for the sphere or a lot to be determined containing the sphere, for example, Pass / fail judgment can be made.
  • the same can be applied to the autocorrelation function, which is the inverse Fourier transform of the power spectrum, according to the Wiener-Khintchine theorem.
  • Imaging system 10 Hologram optical system 11
  • Laser light source 12 Beam splitter 13
  • Collimating lens 14 samples 15
  • Objective lens 17 Imaging lens 18
  • CMOS camera 20 Optical fiber 21
  • Collimating lens 34 dichroic mirror 500 computers 502
  • Main storage device 503 Auxiliary storage device 504
  • Communication interface 505 display 506
  • Auto Focus Program 507 bus IP phase difference image ⁇ phase difference ⁇ B Background phase Phase Phase of the area where ⁇ S sphere exists ⁇ k Phase difference of one pixel k pixels w curve half width ⁇ Average phase fluctuation

Abstract

三次元培養により形成される複数の細胞の凝集体の状態を非破壊且つ簡便に判定することができる判定方法を提供する。開示の技術に係る判定方法は、複数の細胞の凝集体を撮像したホログラムから凝集体の位相差画像を生成し、位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す第１の指標値を導出し、第１の指標値に基づいて、凝集体を構成する細胞の状態を判定することを含む。

Description

判定方法

　開示の技術は、複数の細胞の凝集体の状態を判定する判定方法に関する。

　細胞の状態を評価または判定する技術として、例えば、以下の技術が知られている。特許文献１には、一細胞の表面の平坦度又は細胞集団の表面の平坦度を分化の度合いの指標として用いた多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法が記載されている。

　特許文献２には、撮像画像における輝度に基づいて、分化した多能性幹細胞を含む分化コロニーと未分化多能性幹細胞のみを含む未分化コロニーと多層に重なった多能性幹細胞を含む多層コロニーとを識別する方法が記載されている。この方法では、輝度の第１の閾値より明るい輝度の領域を有するコロニーを分化コロニーであると判断する。また、第１の閾値に等しいかこれより暗い輝度の領域のみを有するコロニーを未分化コロニーであると判断する。また、第１の閾値に等しいかこれより暗く第２の閾値に等しいかこれより明るい輝度の領域のみを有するコロニーを未分化コロニーであると判断する。また、第２の閾値より暗い輝度の領域を有するコロニーを多層コロニーであると判断する。

　特許文献３には、神経分化過程の細胞を撮像した撮像画像を入力する画像入力ステップと、神経分化過程の細胞に出現する神経突起を撮像画像に基づく原画像から抽出する神経突起抽出ステップと、抽出された神経突起の状態を判定する神経突起対応判定ステップと、を備えることを特徴とする細胞評価方法が記載されている。

　特許文献４には、細胞状態を提示する方法であって、該細胞に由来する遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子に関連する遺伝子状態を経時的にモニタすることより該細胞の経時プロファイルを得る工程と該経時プロファイルを提示する工程とを含む方法が記載されている。

ＷＯ２０１４／０４１９３５号公報 特開２０１６－０２８６０７号公報 特開２０１３-２３６５６４号公報 特表２００６-５２２６０５号公報

　細胞の大量生産が可能な培養手法として、細胞の凝集体であるスフェアを培地中に浮遊させた状態で培養する三次元培養法が知られている。三次元培養による細胞の製造工程においては、工程管理の容易性の観点から、細胞の品質をスフェアの状態のまま非破壊且つ簡便に評価する技術が求められる。しかしながら、現時点においては、三次元空間中にランダムに存在する様々なサイズのスフェアを評価する手法が確立されておらず、特にスフェアの内部における細胞の密度及び生存状況について直接観察することは困難である。このため、特許文献１－３にも記載されているように、従来の二次元培養の手法を適用した評価がなされているが、培養する細胞の数の増加に伴って、評価工数が増えるため、多くの人手及び多くの時間が必要となる。従来の二次元培養の手法を適用した評価では、スフェアを単一細胞に分解したり、特許文献４に記載されているように、蛍光色素を添加したりするといった細胞の破壊を伴う処理が必要とされる。

　開示の技術は、三次元培養により形成される複数の細胞の凝集体の状態を非破壊且つ簡便に判定することを目的とする。

　開示の技術に係る判定方法は、複数の細胞の凝集体を撮像したホログラムから凝集体の位相差画像を生成し、位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す第１の指標値を導出し、第１の指標値に基づいて、凝集体を構成する細胞の状態を判定することを含む。開示の技術に係る判定方法によれば、三次元培養により形成される複数の細胞の凝集体の状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。

　第１の指標値は、位相差画像における同一の位相差量の画素を結んだ等位相線によって囲まれた領域の形状の、円形からの乖離の程度に応じて定まる値であってもよい。具体的には、位相差画像を構成する複数の画素における所定範囲の位相差量の最小値をΦ０、最大値をΦＮとし、上記所定範囲内における任意の位相Φにおける等位相線の周長をＬ（Φ）とし、周長Ｌ（Φ）の等位相線によって囲まれる領域の面積をＡ（Φ）とした場合、下記の（３）式によって定義される平均位相ゆらぎλを、第１の指標値として用いることができる。第１の指標値として平均位相ゆらぎλを用いることによって、位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を定量化することができ、従って、凝集体を構成する細胞の状態を適確に判定することが可能となる。

　また、位相差画像から凝集体の形状に依存する成分を除去する処理を施した形状成分除去画像に基づいて第１の指標値を導出してもよい。例えば、形状成分除去画像に基づいて導出された自己相関関数または二次元パワースペクトルを、第１の指標値として導出してもよい。

　開示の技術に係る判定方法は、第１の指標値に基づいて、凝集体を構成する細胞の生存率に関する判定を行うことを含み得る。また、凝集体を構成する細胞が幹細胞である場合、開示の技術に係る判定方法は、第１の指標値に基づいて、凝集体を構成する幹細胞の未分化率に関する判定を行うことを含み得る。細胞の生存率または未分化率に関する判定を、第１の指標値に基づいて行うことによって、当該判定を非破壊且つ簡便に行うことが可能となる。

　開示の技術に係る判定方法は、判定対象ロットに含まれる複数の凝集体について、第１の指標値と凝集体の粒径との相関性を示す第２の指標値を導出し、第２の指標値に基づいて、判定対象ロットについて判定を行うことを含み得る。これにより、判定対象ロットについての判定を、非破壊且つ簡便に行うことが可能となる。

　開示の技術に係る判定方法は、第２の指標値に基づいて、判定対象ロットに含まれる細胞の生存率に関する判定を行うことを含み得る。また、凝集体を構成する細胞が幹細胞である場合、開示の技術に係る判定方法は、第２の指標値に基づいて、判定対象ロットに含まれる幹細胞の未分化率に関する判定を行うことを含み得る。判定対象ロットに含まれる細胞の生存率または未分化率に関する判定を、第２の指標値に基づいて行うことによって、当該判定を非破壊且つ簡便に行うことが可能となる。

　開示の技術によれば、三次元培養により形成される複数の細胞の凝集体の状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。

開示の技術の実施形態に係る判定方法の実施に用いる撮像システムの構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る判定方法の実施に用いるホログラムの一例を示す図である。 スフェアのフーリエ変換画像の一例を示す図である。 スフェアのアンラッピング前の位相差画像の一例を示す図である。 スフェアのアンラッピング後の位相差画像の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る位相差画像の概念を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る位相差画像の焦点合わせに関する説明図である。 開示の技術の実施形態に係るオートフォーカス処理を行うコンピュータのハードウェア構成の一例である。 開示の技術の実施形態に係るオートフォーカス処理の流れの一例を示すフローチャートである。 開示の技術の実施形態に係るスフェアの位相差画像における焦点位置と位相差量のばらつきとの関係の一例を示すグラフである。 スフェアの位相差画像を示す図である。 図８Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。 スフェアの位相差画像を示す図である。 図９Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。 スフェアの位相差画像を示す図である。 図１０Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。 スフェアの位相差画像を示す図である。 図１１Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。 スフェア粒径と平均位相ゆらぎとの相関性の一例を示すグラフである。 定数Ａと未分化率との相関性の一例を示すグラフである。 スフェア粒径と平均位相ゆらぎとの相関性の一例を示すグラフである。 定数Ａと細胞の生存率との相関性を示すグラフである。 スフェアの位相差画像から位相差量のランダム性（空間ばらつき）を抽出した画像（右図）の一例を示す図である。 スフェアの位相差画像からスフェアの形状に依存する成分を除去する処理を施した画像について導出した二次元パワースペクトルを示す図である。

　以下、本発明の実施形態について図面を参照しつつ説明する。尚、各図面において、実質的に同一又は等価な構成要素又は部分には同一の参照符号を付している。

　開示の技術の実施形態に係る判定方法は、複数の細胞の凝集体（スフェア）を撮像したホログラムから凝集体（スフェア）の位相差画像を生成し、位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す第１の指標値を導出し、この第１の指標値に基づいて、凝集体（スフェア）を構成する細胞の状態を判定するという値である。この判定方法によれば、凝集体（スフェア）の状態の判定を非破壊的且つ簡便に行うことが可能である。

　図１は、開示の技術の実施形態に係る判定方法の実施に用いる撮像システム１の構成の一例を示す図である。撮像システム１は、公知のデジタルホログラフィ技術を用いてスフェアのホログラムを取得するためのホログラム光学系１０を含んで構成されている。

　デジタルホログラフィ技術は、物体を透過または反射した物体光と、物体光に対してコヒーレントである参照光との干渉によって生じる像をイメージセンサで撮像し、撮像によって得られた画像について、光伝搬に基づく数値計算を実施することによって、物体からの光波の波面を復元する技術である。デジタルホログラフィ技術によれば、物体の位相分布を定量化し、また、焦点位置を機械的に移動させることなく、物体の三次元情報を取得することができる。

　ホログラム光学系１０は、レーザ光源１１、ビームスプリッタ１２、１８、コリメートレンズ１３、２１、対物レンズ１５、ダイクロイックミラー３４、結像レンズ１７及びＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）カメラ１９を含んで構成されている。サンプルステージにセットされる試料１４としてのスフェアは、コリメートレンズ１３と対物レンズ１５との間に配置される。

　レーザ光源１１には、例えば波長６３２．８ｎｍのＨｅＮｅレーザを用いることが可能である。レーザ光源１１から出射されたレーザ光は、ビームスプリッタ１２により、２つのレーザ光に分割される。２つのレーザ光の一方は物体光とされ、他方は参照光とされる。物体光は、コリメートレンズ１３によって平行光とされた後、サンプルステージにセットされた試料１４であるスフェアに照射される。スフェアを透過した物体光による像は、対物レンズ１５によって拡大される。対物レンズ１５を透過した物体光は、ダイクロイックミラー３４を透過して、結像レンズ１７によって再び平行光とされた後、ビームスプリッタ１８を介してＣＭＯＳカメラ１９の撮像面に結像される。一方、参照光は、光ファイバ２０によってコリメートレンズ２１の手前まで導かれる。光ファイバ２０から出射した参照光は、コリメートレンズ２１によって平行光とされ、ビームスプリッタ１８を介してＣＭＯＳカメラ１９の撮像面に入射する。物体光と参照光との干渉によって生じるホログラムが、ＣＭＯＳカメラ１９によって記録される。なお、ＣＭＯＳカメラ１９の撮像面に入射する物体光と参照光の光軸方向が互いに異なったオフアキシャル光学系が構成されていてもよい。

　本実施形態に係る撮像システム１によれば、スフェアを破壊することなく、またスフェアを構成する細胞にダメージを与えることなくスフェアの位相差画像を取得することができる。なお、上記した撮像システム１の構成は、一例に過ぎず、上記の構成に限定されるものではない。開示の技術に係る判定方法の実施には、デジタルホログラム技術を用いてホログラムを取得することができる、あらゆる撮像システムを利用することが可能である。

　以下に、撮像システム１を用いて取得したスフェアのホログラムから、スフェアの位相差画像を取得する方法の一例について説明する。

　はじめに、ＣＭＯＳカメラ１９によって取得した図２Ａに例示するホログラムを、二次元フーリエ変換することにより、物体光のみの複素振幅成分を抜き出す。図２Ｂは、この処理によって得られるスフェアのフーリエ変換画像の一例である。

　次に、例えば角スペクトル法を適用して任意の空間位置のスフェアの位相を示す画像を復元する。図２Ｃは、この処理によって得られるスフェアのアンラッピング前の位相差画像の一例である。この時点におけるスフェアの位相は、０～２πの値に畳みこまれている。そこで、例えば、Unweighted Least Squares（重みなし最小２乗法）またはFlynn's Algorithm（フリンのアルゴリズム）などの位相接続（アンラッピング）手法を適用して２π以上の部分も接合していくことで、図２Ｄに例示するような最終的なスフェアの位相差画像を得ることができる。なお、アンラッピングの手法は数多く提案されており、位相不整合を生じない適切な手法を適宜選択すればよい。

　図３は、位相差画像ＩＰの概念を示す図である。図３の下段は、位相差画像ＩＰの各画素ｋにおける位相差量を３次元表示した画像である。図３の上段は、位相差画像ＩＰの各画素ｋにおける位相差量を平面上にグレースケールで示した図である。

　ここで、位相差画像ＩＰにおける位相差量θは、位相差画像ＩＰの同一焦点面内に存在するバックグラウンド（スフェアの存在しない領域）の位相をθＢとし、スフェアの存在する領域の位相をθＳとした場合、下記の（１）式によって表わされる。また、本明細書中における「位相」という用語は、光を電磁波とみなした場合の電場振幅の位相であり、より一般的な意味で使用される。

Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002

　また、位相差画像ＩＰの各画素ｋにおける位相差量θｋは、下記（２）式によって表わすことができる。但し、ｎｋは位相差画像ＩＰの各画像ｋに対応する部位におけるスフェアの屈折率であり、ｄｋは位相差画像ＩＰの各画素ｋに対応する部位におけるスフェアの厚さであり、λはホログラム光学系１０における物体光の波長である。

Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003

　スフェアの位相差画像は、スフェアを透過した物体光の光路長分布を示した画像である。スフェア内における光路長は、スフェアの屈折率とスフェアの厚さの積に相当することから、スフェアの位相差画像は、（２）式にも示されているように、スフェアの屈折率及び厚さ（形状）の情報を含んでいる。

　スフェアに対して焦点が合っていない位相差画像からは、回折による広がりの影響によりスフェアの実態に合致した正確な情報が得られない。従って、ＣＭＯＳカメラ１９によって取得したホログラムから位相差画像を取得する際に、スフェアに焦点を合わせることが好ましい。ここで、「スフェアに焦点を合わせる」とは、球形状のスフェアの中央付近でスライスした位相差画像を得ることを意味する。スフェアに焦点が合った位相差画像を用いてスフェアの状態を判定することによって、より正確な判定結果を得ることができる。

　位相差画像の焦点合わせは、人手によらず、自動化することが好ましい。焦点合わせを自動化することによって、作業者による任意性を排除し、更に、処理時間の短縮を図ることができる。本発明者らは、以下に説明する自動化可能な焦点合わせの手法を見出した。

　図４の左のグラフは、スフェアの位相差画像における平面方向の位置と位相差量との関係の一例を示すグラフであり、実線がスフェアに焦点が合っている状態に対応し、点線がスフェアに焦点が合っていない状態に対応する。スフェアに焦点が合っている場合、位相差画像における特定の位置に急峻なピークが現れる。一方、スフェアに焦点が合っていない場合、焦点が合っている場合と比較してピークが低く且つなだらかになる。

　図４の右のグラフは、スフェアの位相差画像における位相差量のヒストグラムの一例であり、実線がスフェアに焦点が合っている状態に対応し、点線がスフェアに焦点が合っていない状態に対応する。スフェアに焦点が合っている場合、カーブの半値幅ｗ（位相差量のばらつき）は、相対的に大きくなり、スフェアに焦点が合っていない場合、カーブの半値幅ｗ（位相差量のばらつき）は、相対的に小さくなる。

　従って、互いに異なる焦点位置（スライス位置）毎にスフェアの位相差画像を取得し、取得した位相差画像の各々について、位相差量のヒストグラムにおけるカーブの半値幅ｗ（位相差量のばらつき）を求め、求めた半値幅ｗのうち、最大の半値幅ｗを有する位相差画像を、スフェアに焦点が合った位相差画像として抽出することで焦点合わせを実現できる。

　上記の焦点合わせは、コンピュータを用いて自動化することが可能である。図５は、上記の焦点合わせを自動で行うオートフォーカス処理を行うコンピュータ５００のハードウェア構成の一例である。

　コンピュータ５００は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）５０１、一時記憶領域としての主記憶装置５０２、不揮発性の補助記憶装置５０３、ＣＭＯＳカメラ１９との間において通信を行うための通信Ｉ／Ｆ（InterFace）５０４、及び液晶ディスプレイ等の表示部５０５を含んで構成されている。ＣＰＵ５０１、主記憶装置５０２、補助記憶装置５０３、通信Ｉ／Ｆ５０４、及び表示部５０５は、それぞれ、バス５０７に接続されている。補助記憶装置５０３には、上記のオートフォーカス処理の手順を記述したオートフォーカスプログラム５０６が格納されている。コンピュータ５００は、ＣＰＵ５０１がオートフォーカスプログラム５０６を実行することによって、オートフォーカス処理を行う。

　図６は、コンピュータ５００において実施されるオートフォーカス処理の流れの一例を示すフローチャートである。

　ステップＳ１において、ＣＰＵ５０１は、ＣＭＯＳカメラ１９からスフェアのホログラムを取得する。

　ステップＳ２において、ＣＰＵ５０１は、取得したホログラムから、焦点位置（スライス位置）が互いに異なる複数の位相差画像を生成する。

　ステップＳ３において、ＣＰＵ５０１は、焦点位置（スライス位置）毎の位相差画像の各々について、位相差量のばらつきを導出する。ＣＰＵ５０１は、例えば、位相差画像における位相差量の最大値と最小値との差分を、当該位相差画像における位相差量のばらつきとして導出してもよい。

　ステップＳ４において、ＣＰＵ５０１は、焦点位置（スライス位置）が互いに異なる複数の位相差画像のうち、ステップＳ３にて導出した位相差量のばらつきが最大となる位相差画像を、焦点が合った位相差画像として抽出する。

　図７は、スフェアの位相差画像における焦点位置（スライス位置）と位相差量のばらつきとの関係の一例を示したグラフである。図７には、焦点位置が、－４００μｍ、－２００μｍ、０μｍ、＋２００μｍ、及び＋４００μｍに対応するスフェアの位相差画像が、グラフとともに例示されている。なお、図７では、位相差量のばらつきが最大となる焦点位置を０μｍとしている。上記のオートフォーカス処理によれば、位相差量のばらつきが最大となる焦点位置０μｍに対応する位相差画像が、焦点が合った位相差画像として抽出される。位相差量のばらつきが最大となる焦点位置０μｍに対応する位相差画像において、スフェアの輪郭が最も鮮明となる。

　上記のように、開示の技術の実施形態に係る判定方法においては、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す第１の指標値を導出し、この第１の指標値に基づいて、スフェアを構成する細胞の状態を判定することを含む。

　図８Ａは、未分化状態を維持しているｉＰＳ細胞の、ロット内における割合（以下、未分化率という）が９９％である培養ロットから抽出されたｉＰＳ細胞の凝集体であるスフェアの位相差画像の代表例を示す図である。図８Ｂは、図８Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。図９Ａは、未分化率が８７％である培養ロットから抽出されたｉＰＳ細胞の凝集体であるスフェアの位相差画像の代表例を示す図である。図９Ｂは、図９Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。

　未分化率が相対的に高いロット内のスフェアは、未分化率が相対的に低い（すなわち、胚葉への分化が進行している）ロット内のスフェアと比較して、内部の均質性が高いと考えられる。従って、未分化率が相対的に高いロット内のスフェアの位相差画像においては、図８Ｂに示すように、同一の位相差量の画素を結んだ等位相線によって囲また領域の形状が円形に近い形状となり、等位相線が同心円状に分布する。一方、未分化率が相対的に低いロット内のスフェアの位相差画像においては、図９Ｂに示すように、位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列がランダムとなり、等位相線によって囲まれた領域の形状がくずれる。すなわち、スフェアを構成する細胞の分化の進行状態は、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性に反映される。従って、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値によって、スフェアを構成する細胞の分化の進行状態を定量化することが可能である。

　スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として、例えば、スフェアの位相差画像における同一の位相差量の画素を結んだ等位相線によって囲まれた領域の形状の、円形からの乖離の程度に応じて定まる指標値を用いることができる。

　具体的には、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として、下記の（３）式によって定義される平均位相ゆらぎλを用いることができる。（３）式において、Φ０は、位相差画像を構成する複数の画素における所定範囲の位相差量の最小値であり、ΦＮは、上記所定範囲の位相差量の最大値である。Ｌ（Φ）は、上記所定範囲内における任意の位相Φにおける等位相線の周長であり、Ａ（Φ）は、周長Ｌ（Φ）の等位相線によって囲まれる領域の面積である。

Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004

　平均位相ゆらぎλは、等位相線によって囲まれる領域の形状が真円である場合に最小となり、等位相線によって囲まれる領域の形状が円形から離れる程大きくなる程大きくなる。すなわち、等位相線によって囲まれる領域の形状のランダム性が高くなる程、平均位相ゆらぎλは大きくなる。

　図８Ａ及び図８Ｂに示される、未分化率９９％に対応するスフェアの位相差画像における平均位相ゆらぎλは１３．６であり、図９Ａ及び図９Ｂに示される、未分化率８７％に対応するスフェアの位相差画像における平均位相ゆらぎλは１８．９であった。未分化率が相対的に低いロット内のスフェアは、未分化状態を逸脱した複数の細胞を内部に含むことにより、スフェア内部の均質性が低下する。その結果、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性が増大し、平均位相ゆらぎλが大きくなる。

　このように、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として、平均位相ゆらぎλを用いることによって、スフェアを構成する細胞の分化の進行状態を、細胞を破壊することなく推定することが可能である。

　平均位相ゆらぎλは、細胞の分化の進行状態の判定のみならず、スフェア内における細胞の生存率の判定に用いることもできる。図１０Ａは、ロット内における細胞の生存率が８７．３％であるロットから抽出されたｉＰＳ細胞の凝集体であるスフェアの位相差画像の代表例を示す図である。図１０Ｂは、図１０Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。図１１Ａは、ロット内における細胞の生存率が５９．２％である培養ロットから抽出されたｉＰＳ細胞の凝集体であるスフェアの位相差画像の代表例を示す図である。図１１Ｂは、図１１Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。

　健全な細胞は、その恒常性から内部の屈折率は、媒質の屈折率とは異なる一定の値を維持するものと考えられる。一方、死細胞は、恒常性を喪失し、内部の屈折率が媒質の屈折率と略同じになるものと考えられる。従って、細胞の生存率が相対的に高い培養ロット内のスフェアは、細胞の生存率が相対的に低い培養ロット内のスフェアと比較して、内部の均質性が高いと考えられる。従って、細胞の生存率が相対的に高い培養ロット内のスフェアの位相差画像においては、図１０Ｂに示すように、同一の位相差量の画素を結んだ等位相線によって囲まれた領域の形状が円形に近い形状となり、等位相線が同心円状に分布する。一方、細胞の生存率が相対的に低い培養ロット内のスフェアの位相差画像においては、図１１Ｂに示すように、当該位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列がランダムとなり、等位相線によって囲まれた領域の形状がくずれる。すなわち、スフェアを構成する細胞の生存率は、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性に反映される。従って、平均位相ゆらぎλを、スフェア内の細胞の生存率の判定に用いることが可能である。

　図１０Ａ及び図１０Ｂに示される、細胞の生存率８７．３％に対応するスフェアの位相差画像における平均位相ゆらぎλは５．７７であり、図１１Ａ及び図１１Ｂに示される、細胞の生存率５９．２％に対応するスフェアの位相差画像における平均位相ゆらぎλは１１．０８であった。細胞の生存率が相対的に低いロット内のスフェアは、多くの死細胞を内部に含むことによりスフェア内部の均質性が低下する。その結果、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性が増大し、平均位相ゆらぎλが大きくなる。

　このように、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として、平均位相ゆらぎλを用いることによって、スフェアを構成する細胞の生存率を、細胞を破壊することなく推定することが可能である。

　開示の技術の実施形態に係る判定方法は、判定対象ロットに含まれる複数のスフェアについて、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す上記の指標値（以下、第１の指標値という）とスフェアの粒径との相関性を示す第２の指標値を導出し、この第２の指標値に基づいて、判定対象ロットについて判定を行うことを含み得る。第１の指標値としては、平均位相ゆらぎλを用いることができる。

　図１２は、未分化率がそれぞれ、８７％及び９９％である２つのロットのそれぞれに含まれる複数のスフェアについて取得した、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を示すグラフである。図１２に示すように、スフェア粒径が大きくなる程、平均位相ゆらぎλが大きくなる傾向があることが判明した。平均位相ゆらぎλのスフェア粒径依存性は、細胞株、三次元培養プロセス及び分化誘導プロセスの特徴を表わしていると考えることができる。具体的には、ガス濃度及び誘導因子の透過性に起因して、粒径が小さいスフェアは分化の進行が均一となりやすい一方、粒径が大きいスフェアは分化の進行が不均一となりやすいこと、及び培養及びまたは分化誘導プロセスに応じてスフェア内の細胞密度のサイズ依存性が異なるといったことが、平均位相ゆらぎλがスフェア粒径依存性を持つ要因となると考えられる。

　また、図１２に示すように、未分化率８７％のロットと、未分化率９９％のロットとでは、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性に差異があることが判明した。すなわち、ロット間における未分化率の違いは、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性に反映される。図１２に例示されるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、例えば、下記の（４）式に示される関数によってフィッティングすることが可能である。すなわち、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数による近似式によって表わすことができる。（４）式においてＸはスフェア粒径であり、Ｙは平均位相ゆらぎλであり、Ａは定数である。（４）式における定数Ａは、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を示す（相関性を特徴付ける）指標値（第２の指標値）として用いることができる。

Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005

　図１２に示される未分化率８７％のロットにおける スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝ｅ０．０１２２Ｘと表わすことができる。すなわち、未分化率８７％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を特徴付ける指標値（第２の指標値）である定数Ａは、０．０１２２である。また、図１２に示される未分化率９９％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝ｅ０．０１０７Ｘと表わすことができる。すなわち、未分化率９９％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を特徴付ける指標値（第２の指標値）である定数Ａは、０．０１０７である。

　図１３は、図１２に示す、未分化率が互いに異なる２つのロットにおける、（４）式の定数Ａと、未分化率との相関性を示すグラフである。図１３に示すように、定数Ａと未分化率との間には、一定の相関性がみられることから、例えば、定数Ａに基づいて、判定対象ロット内における細胞の未分化率を推定することが可能である。このように、平均位相ゆらぎλ（第１の指標値）とスフェア粒径との相関性を示す指標値である定数Ａ（第２の指標値）に基づいて、判定対象ロットについて未分化率を推定することが可能であり、また、推定された未分化率に基づいて、判定対象ロットについて、例えば良否判定を行うことが可能である。

　図１４は、ロット内における細胞の生存率がそれぞれ、５９．２％、６９．８％、８１．５％、８７．３％である４つのロットのそれぞれに含まれる複数のスフェアについて取得した、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を示すグラフである。平均位相ゆらぎλが、スフェア粒径依存性を有する点は、上記したとおりである。図１４に示すように、生存率が互いに異なるロット間において、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性に差異があることが判明した。すなわち、ロット間における細胞の生存率の違いは、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性に反映される。図１４に示されるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、例えば、（４）式に示される関数によってフィッティングすることが可能である。すなわち、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数による近似式によって表わすことができる。

　図１４に示される生存率５９．２％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝ｅ０．０１８３Ｘと表わすことができる。すなわち、生存率５９．２％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を特徴付ける指標値（第２の指標値）である定数Ａは、０．０１８３である。また、図１４に示される生存率６９．８％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝ｅ０．０１６２Ｘと表わすことができる。すなわち、生存率６９．８％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を特徴付ける指標値（第２の指標値）である定数Ａは、０．０１６２である。図１４に示される生存率８１．５％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝ｅ０．０１３２Ｘと表わすことができる。すなわち、生存率８１．５％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を特徴付ける指標値（第２の指標値）である定数Ａは、０．０１３２である。また、図１４に示される生存率８７．３％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝ｅ０．０１２６Ｘと表わすことができる。すなわち、生存率８７．３％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を特徴付ける指標値（第２の指標値）である定数Ａは、０．０１２６である。

　図１５は、図１４に示す、細胞の生存率が互いに異なる４つのロットにおける、（４）式の定数Ａと、細胞の生存率との相関性を示すグラフである。図１５に示すように、定数Ａと細胞の生存率との間には、一定の相関性がみられることから、定数Ａに基づいて、判定ロット内における細胞の生存率を推定することが可能である。このように、平均位相ゆらぎλ（第１の指標値）とスフェア粒径との相関性を示す指標値である定数Ａ（第２の指標値）に基づいて、判定対象ロットについてロット内における細胞の生存率を推定することが可能であり、また、推定された細胞の生存率に基づいて、判定対象ロットについて、例えば良否判定を行うことが可能である。

　以上の説明では、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として、（３）式によって定義される平均位相ゆらぎλを用いる場合を例示したが、この態様に限定されない。

　例えば、スフェアの位相差画像からスフェアの形状に依存する成分を除去する処理を施した形状成分除去画像に基づいて、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値を導出してもよい。ここで、スフェアの形状に依存する成分とは、スフェアの位相差画像において、スフェア表面の基本形状を構成する、画素サイズに対して緩やかな曲面であり、二次関数及び三次関数等の多項式曲面による近似によって導出される曲面成分である。この成分を、スフェアの位相差画像から除去することによって、スフェアの位相差画像における、位相差量のランダム性（空間ばらつき）のみを抽出した形状成分除去を得ることができる。図１６は、スフェアの位相差画像（左図）からスフェアの形状に依存する成分を除去する処理を施すことにより、位相差量のランダム性（空間ばらつき）を抽出した形状成分除去画像（右図）の一例を示す図である。

　例えば、形状成分除去画像（図１６右図）について導出した自己相関関数を、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として用いることが可能である。すなわち、自己相関関数によって、スフェアの位相差画像における位相差量のランダム性（空間ばらつき）を定量化することができる。従って、形状成分除去画像（図１６右図）について導出した自己相関関数に基づいて、当該スフェアまたは当該スフェアを含む判定対象ロットについて、細胞の未分化率及び生存率を推定することが可能である。また、上記のようにして得られる自己相関関数を、例えば、細胞の生存率及び未分化率が既知である基準サンプルと比較することによって、当該スフェアまたは当該スフェアを含む判定対象ロットについて、例えば良否判定を行うことが可能である。

　また、形状成分除去画像（図１６右図）について導出した二次元パワースペクトルを、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として用いることが可能である。位相差画像Φ（ｘ,ｙ）の二次元フーリエ変換スペクトルΦ（ｋｘ，ｋｙ）における二次元パワースペクトルＰは、下記の（５）式によって表わされる。ここで、ｋｘ及びｋｙは、空間周波数である。

Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006

　図１７は、形状成分除去画像（図１６右図）について導出した二次元パワースペクトル（ｋｙ＝０とした）を示す図である。例えば、図１７に例示されるパワースペクトルの傾き及び、関数フィテッィングにより、当該スフェアの位相差画像における位相差量のランダム性（空間ばらつき）を定量化することができる。そして、定量化された数値に基づいて、当該スフェアまたは当該スフェアを含む判定対象ロットについて、細胞の未分化率及び生存率を推定することが可能である。また、上記のようにして得られる二次元パワースペクトルを、例えば、細胞の生存率及び未分化率が既知である標準サンプルと比較することによって、当該スフェアまたは当該スフェアを含む判定対象ロットについて、例えば良否判定を行うことが可能である。なお、図１７に示す例では、ｋｙ＝０としたが、Ｒ＝（ｋｘ２＋ｋｙ２）１／２とし、Ｒについて図１７に示すようなパワースペクトルをとってもよい。また、Ｗｉｅｎｅｒ-Ｋｈｉｎｔｃｈｉｎｅの定理より、パワースペクトルの逆フーリエ変換である自己相関関数についても同様のことができる。

１　撮像システム

１０　ホログラム光学系

１１　レーザ光源

１２　ビームスプリッタ

１３　コリメートレンズ

１４　試料

１５　対物レンズ

１７　結像レンズ

１８　ビームスプリッタ

１９　ＣＭＯＳカメラ

２０　光ファイバ

２１　コリメートレンズ

３４　ダイクロイックミラー

５００　コンピュータ

５０２　主記憶装置

５０３　補助記憶装置

５０４　通信インターフェース

５０５　表示部

５０６　オートフォーカスプログラム

５０７　バス

ＩＰ　位相差画像

θ　位相差量

θＢ　バックグランドの位相

θＳ　スフェアの存在する領域の位相

θｋ　１画素の位相差量

ｋ　画素

ｗ　カーブの半値幅

λ　平均位相ゆらぎ

Claims (9)


  1. 　複数の細胞の凝集体を撮像したホログラムから前記凝集体の位相差画像を生成し、

    　前記位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す第１の指標値を導出し、

    　前記第１の指標値に基づいて、前記凝集体を構成する細胞の状態を判定する判定方法。

  2. 　前記第１の指標値は、前記位相差画像における同一の位相差量の画素を結んだ等位相線によって囲まれた領域の形状の、円形からの乖離の程度に応じて定まる

    　請求項１に記載の判定方法。

  3. 　前記位相差画像を構成する複数の画素における所定範囲の位相差量の最小値をΦ０、最大値をΦＮとし、前記所定範囲内における任意の位相Φにおける等位相線の周長をＬ（Φ）とし、周長Ｌ（Φ）の等位相線によって囲まれる領域の面積をＡ（Φ）とした場合、下記の（Ｉ）式によって定義される平均位相ゆらぎλを前記第１の指標値として用いる

    　請求項１または請求項２に記載の判定方法。

    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001

  4. 　前記位相差画像から前記凝集体の形状に依存する成分を除去する処理を施した形状成分除去画像に基づいて前記第１の指標値を導出する

    　請求項１に記載の判定方法。

  5. 　前記第１の指標値に基づいて、前記凝集体を構成する細胞の生存率に関する判定を行う

    　請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の判定方法。

  6. 　前記凝集体を構成する細胞は幹細胞であり、

    　前記第１の指標値に基づいて、前記凝集体を構成する幹細胞の未分化率に関する判定を行う

    　請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の判定方法。

  7. 　判定対象ロットに含まれる複数の前記凝集体について、前記第１の指標値と前記凝集体の粒径との相関性を示す第２の指標値を導出し、

    　前記第２の指標値に基づいて、前記判定対象ロットについて判定を行う

    　請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の判定方法。

  8. 　前記第２の指標値に基づいて、前記判定対象ロットに含まれる細胞の生存率に関する判定を行う

    　請求項７に記載の判定方法。

  9. 　前記凝集体を構成する細胞は幹細胞であり、

    　前記第２の指標値に基づいて、前記判定対象ロットに含まれる幹細胞の未分化率に関する判定を行う

    　請求項７または請求項８に記載の判定方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022224722A1 (ja) * 2021-04-21 2022-10-27 富士フイルム株式会社 評価値の取得方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006522605A (ja) 2003-03-04 2006-10-05 独立行政法人産業技術総合研究所 経時的細胞解析法
WO2007122655A2 (en) * 2006-04-21 2007-11-01 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Quantitative phase-contrast digital holography method for the numerical reconstruction of images, and relevant apparatus
JP2009521216A (ja) * 2005-12-22 2009-06-04 フェイズ ホログラフィック イメージング ペーハーイー アーベー 細胞サンプル分析のための方法と装置
JP2013236564A (ja) 2012-05-11 2013-11-28 Nikon Corp 細胞評価装置、細胞評価方法およびプログラム
WO2014041935A1 (ja) 2012-09-13 2014-03-20 浜松ホトニクス株式会社 多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法
JP2015192644A (ja) * 2014-03-26 2015-11-05 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス スフェロイドの評価方法およびスフェロイド評価装置
JP2016028607A (ja) 2009-10-09 2016-03-03 川崎重工業株式会社 未分化多能性幹細胞の識別方法及び装置並びに自動培養方法及び装置
US20170261930A1 (en) * 2011-07-19 2017-09-14 Ovizio Imaging Systems NV/SA Method and system for detecting and/or classifying cancerous cells in a cell sample
WO2019176427A1 (ja) * 2018-03-12 2019-09-19 富士フイルム株式会社 判定方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL155435A0 (en) 2003-04-14 2003-11-23 Bromine Compounds Ltd Solid biocide formulations
US9557549B2 (en) * 2011-12-09 2017-01-31 Massachusetts Institute Of Technology Systems and methods for self-referenced quantitative phase microscopy
US11016443B2 (en) * 2017-10-20 2021-05-25 Naeilhae, Co. Ltd. Holographic reconstruction apparatus and method
US11269294B2 (en) * 2018-02-15 2022-03-08 University Of Connecticut Portable common path shearing interferometry-based holographic microscopy system with augmented reality visualization

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006522605A (ja) 2003-03-04 2006-10-05 独立行政法人産業技術総合研究所 経時的細胞解析法
JP2009521216A (ja) * 2005-12-22 2009-06-04 フェイズ ホログラフィック イメージング ペーハーイー アーベー 細胞サンプル分析のための方法と装置
WO2007122655A2 (en) * 2006-04-21 2007-11-01 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Quantitative phase-contrast digital holography method for the numerical reconstruction of images, and relevant apparatus
JP2016028607A (ja) 2009-10-09 2016-03-03 川崎重工業株式会社 未分化多能性幹細胞の識別方法及び装置並びに自動培養方法及び装置
US20170261930A1 (en) * 2011-07-19 2017-09-14 Ovizio Imaging Systems NV/SA Method and system for detecting and/or classifying cancerous cells in a cell sample
JP2013236564A (ja) 2012-05-11 2013-11-28 Nikon Corp 細胞評価装置、細胞評価方法およびプログラム
WO2014041935A1 (ja) 2012-09-13 2014-03-20 浜松ホトニクス株式会社 多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法
JP2015192644A (ja) * 2014-03-26 2015-11-05 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス スフェロイドの評価方法およびスフェロイド評価装置
WO2019176427A1 (ja) * 2018-03-12 2019-09-19 富士フイルム株式会社 判定方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AWATSUJI, YASUHIRO: "Development of his 3D moving image measurement method of cells by parallel digital holographic microscopy and its device,", READOUT : HORIBA TECHNICAL REPORTS, vol. 35, December 2009 (2009-12-01), pages 10 - 15, XP009525355, ISSN: 0915-9916 *
See also references of EP3859006A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022224722A1 (ja) * 2021-04-21 2022-10-27 富士フイルム株式会社 評価値の取得方法

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