KR101950339B1

KR101950339B1 - 살아있는 세포의 간섭법을 통한 신속한, 대용량 병렬 단일-세포 약물 반응 측정방법

Info

Publication number: KR101950339B1
Application number: KR1020147005381A
Authority: KR
Inventors: 제이슨 씨. 리드; 마이클 에이. 테이텔
Original assignee: 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2011-08-02
Filing date: 2012-08-02
Publication date: 2019-02-20
Also published as: CA2843445A1; AU2018232924B2; AU2016200629B2; KR20140058589A; EP2739937A1; EP2739937B1; AU2018232924A1; JP2017198680A; AU2016200629A1; CN103842769B; AU2012290024A1; CN103842769A; AU2012290024B2; US20140178865A1; EP2739937A4; CA2843445C; WO2013019984A1; JP6348635B2; JP6144679B2; JP2014527168A

Abstract

암 치료법에서 중심 질문은 종양 세포의 성장이 정지되도록 설계된 약물에 대한 종양 세포 집단 내 개별 세포의 반응 양상이다. 그러나, 세포의 절대적 성장, 물리적 질량에서의 변화는, 암성의(cancerous) 또는 생리적이든, 종래 기술에 의해 직접 측정하는 것은 어렵다. 본 발명의 구체예는, 변화하는 환경에 노출된 세포에서 세포 질량의 신속한, 실시간 정량을 위한, 살아있는 세포의 간섭법 (LCI)을 제공한다. 전체적으로, LCI는, 치료용 약물과 같은 단일 세포 반응을 확인, 모니터링, 및 측정하기 위하여 세포 집단을 평가하는데 개념상 진보를 제공한다.

Description

살아있는 세포의 간섭법을 통한 신속한, 대용량 병렬 단일-세포 약물 반응 측정방법{Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry}

본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여된 보조금 제CA090571호, 제CA107300호, 및 제GM074509호의 정부 지원에 의해 수행되었다. 미국 정부는 본 발명에서 특정한 권리를 갖는다.

본 출원은 2011년 8월 2일에 제출된, 명칭 "살아있는 세포의 간섭을 통한 신속한, 대용량 병렬 단일 세포 약물 반응 측정방법"으로 공동-계류 중인 미국 가출원 일련번호 제61/514,353호에 대한 35 U.S.C. Section 119(e)하의 이익을 주장하고, 그 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 출원은, 2009년 5월 6일 제출된 미국 특허 출원 제12/436,702호에 관한 것이고, 그 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 하나 이상의 세포를 검사하는데 이용될 수 있는 간섭 시스템(interferometric system), 물질, 및 기법에 관한 것이다.

간섭 현미경(interference microscopy)은 세포 및 기타 투명체(transparent object) 내부에 있는 물질의 공간적 분포를 측정하기 위한 흥미로운 생물물리학적 접근법을 제공한다. 이전에, 이 기술의 개작물(adaptation)인 살아있는 세포의 간섭법(Live Cell Interferometry; LCI)이, 동시에 수백 개의 세포의 나노기계적 특성(nanomechanical property)을 민감하게 검출 및 추적할 수 있다는 것이 확인되었다 (1). 또한, LCI는, 고자장 탐침(highly magnetic probe)에 의해 작은 인덴션(small indention)이 세포 표면상에 형성될 경우, 단일 세포 내부에서 세포질의 동적 흐름을 모니터링하는데 이용될 수 있다 (2). 여러 연구는, 세포 물질의 즉각적인 재분포 대부분이 세포 표면의 인덴테이션(indentation)의 결과이고, 이는 종래 광학 현미경의 검출 한계를 뛰어넘는다는 것을 보여주었다.

개별 세포가 그의 크기를 조절하는 방법은, 세포 질량과 잘 규명된 생화학 경로 간의 관계이기는 하지만, 충분히 이해되지 않는다. 살아있는 단일 세포에 대한 정량적인 질량 측정은 1950년대에 시작되었으나, (3, 4) 최근에서야 세포 질량 측정의 속도, 정확성, 및 실시가능성을 증가시키는 보다 새로운 접근법이 이용가능해졌다. 단독의 또는 대규모 세포 집단 내에 집합된 하나 이상의 세포의 질량을 신속하고 동시에 측정할 수 있는 신규한 방법에 대한 요구가 존재한다 (7, 8). 본 명세서에 개시된 본 발명의 구체예는 이와 같은 요구 및 기타의 요구를 충족시킨다.

발명의 요약

본 발명의 구체예는, 예를 들면, 하나 이상의 세포에 대한 하나 이상의 특징 또는 특성을 결정하는데 이용될 수 있는 간섭계, 방법 및 물질을 포함한다. 그와 같은 특성은, 예를 들면, 세포 질량, 세포 부피, 광학적 세포 두께 (세포 밀도) 등을 포함한다. 본 발명의 구체예는 간섭 시스템에 의해 세포의 하나 이상의 특징 또는 특성을 관찰하고, 그 후 이 관찰 결과를 이용하여 세포 생리를 특징짓는 것을 포함한다.

본 발명의 예시적인 구체예는 살아있는 세포의 간섭법을 이용하는 세포의 질량을 관찰하는 방법이다. 일반적으로, 그와 같은 간섭법 방법은: 광의 시험용 빔(test beam)과 광의 기준 빔(reference beam) 간 프랙셔널 위상 전이(fractional phase shift)를 측정하도록 된 간섭 현미경의 관찰 챔버(observation chamber)에 상기 세포를 배치하는 단계; 조명 파장(illumination wavelength)에서 상기 세포를 광의 시험용 빔에 노출시키는 단계; 및 그 후 상기 세포를 통해 전파하는 광의 시험용 빔과 광의 기준/대조 빔 간 프랙셔널 위상 전이를 측정하는 단계를 포함한다. 그 후 그와 같은 측정 결과는 상기 세포의 질량을 도출하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 통상적인 구체예에서, 상기 세포의 질량은 하기 식을 이용하여 관찰되고:

식 중에서 m은 상기 세포의 질량이고, α는 위상 전이와 세포 질량 간의 관계를 기술하는 상수이며, Ψ는 측정된 프랙셔널 위상 전이이고, λ는 조명 파장이며, 적분(integration)은 전체 세포 영역인 A에 대해 수행된다. 본 발명의 특정 구체예에서, α는 1.8 × 10^-3 m³kg^-1이다. 선택적으로, 상기 세포의 질량은 복수 회 관찰되어 일정 시간 동안 상기 세포의 질량 특성에서의 변화 양상이 관찰된다. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 세포의 질량은 실시간으로 정량된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 방법은 복수 개의 세포의 질량을 정량하는데 이용된다.

본 발명의 일반적인 구체예에서, 상기 방법은 현미경과 작동가능하게 결합되어 있는 검출기; 세포를 포함하도록 된 관찰 챔버를 포함하는 시료 어셈블리; 기준 세포를 포함하도록 된 기준 챔버를 포함하는 기준 어셈블리; 및 광 빔(light beam)을 광원으로부터 시험용 빔과 기준 빔으로 분리(split)하기 위한 빔 스플리터(beam splitter)를 포함하는, 살아있는 세포의 간섭 시스템을 이용하여 수행된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 관찰 챔버는 상기 챔버 내로 세포 배지를 순환시키도록 된 하나 이상의 관류 도관(perfusion conduit)을 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 살아있는 세포(들)의 간섭 시스템은 상기 세포의 하나 이상의 영상을 처리 및 저장하도록 된 처리 요소 및 기억 저장 요소를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 세포의 질량 특성은 치료제에 대한 상기 세포의 반응을 정량하기 위하여 관찰된다. 선택적으로, 상기 하나 이상의 세포는 암을 앓는 개체로부터 수득되고 상기 치료제는 상기 암을 치료하는데 일반적으로 이용되는 것이다 (예를 들면, 치료제에 대한 암 세포의 민감도를 평가하기 위해 고안된 방법에서).

또한, 본 발명의 다른 구체예는 특정 환경 또는 환경 조건의 집합, 예를 들면, 시험용 조성물, 예를 들면, 헤르셉틴(HERCEPTIN)과 같은 치료제를 포함하는 세포 배양액에 대한 세포의 반응을 관찰하는 방법이다. 본 발명의 그와 같은 방법에서, 상기 세포는 제1 환경 (예를 들면, 제1 관찰 챔버)에 배치되고, 그 후 상기 제1 환경 내 세포의 질량 특성이, 살아있는 세포의 간섭법을 포함하는 방법을 이용하여 관찰된다. 본 발명의 방법에서, 상기 제1 환경에서 관찰된 질량 특성은 살아있는 세포의 간섭법을 포함하는 방법을 이용하여 제2 환경에서 관찰된 상기 세포의 질량 특성과 비교된다. 이러한 방식으로, 제1 환경에 대한 세포의 반응이 관찰될 수 있다. 일반적인 방법에서, 제1 환경은 시험용 조성물(test composition)을 포함하고 제2 환경은 상기 시험용 조성물을 포함하지 않는다. 이 방법에서, 세포가 제1 환경에서 시험용 조성물에 노출될 경우, 세포의 생리는 이 시험용 조성물에 의해 변형되고(transformed) 그 후 이 변형은 본 발명의 방법에 의해 관찰된다 (그리고 일반적으로 시험용 조성물에 노출되지 않고 따라서 이 조성물에 의해 변형되지 않은 대조군 세포와 비교된다). 선택적으로, 시험용 조성물은 항생제, 항체, 알킬화제, 항대사물질(antimetabolite), 세포 주기 억제제, 토포아이소머라제 억제제, 또는 세포를 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 시험용 조성물은 세포 내에서(intracellularly) 기능하고, 예를 들면, siRNA와 같은 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에서, 질량 특성이 관찰되는 세포는 제1 환경에 단리된 단일 세포로 존재한다. 대안적으로, 질량 특성이 관찰될 수 있는 세포는 제1 환경에 세포 집합(cluster) 또는 세포 집괴(clump)로 존재한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 제1 환경에 존재하는 복수 개의 세포의 질량 특성이 관찰된다. 본 발명의 구체예에서, 제1 환경 내 하나 이상의 세포의 질량 특성은 복수 회 관찰되어 일정 시간 동안 상기 하나 이상의 세포의 질량 특성에서의 변화 양상이 관찰될 수 있다. 선택적으로, 예를 들면, 세포의 질량 특성에서의 변화는 시간적 질량 프로파일(temporal mass profile)을 관찰하기 위한 시간 동안 관찰된다. 본 발명의 특정 구체예는 관찰된 시간적 질량 프로파일을 시간적 질량 프로파일의 데이터베이스와 비교하는 단계를 포함하고, 상기 시간적 질량 프로파일의 데이터베이스는 상기 시험용 조성물에 대한 세포 민감도의 특징을 나타내는 시간적 질량 프로파일 (예를 들면, 세포의 성장이 시험용 조성물의 존재하에 억제되는 환경에서) 및 상기 시험용 조성물에 대한 세포 내성의 특징을 나타내는 시간적 질량 프로파일 (예를 들면, 세포의 성장이 시험용 조성물의 존재하에 억제되지 않는 환경에서)을 포함하도록 선택된다.

본 발명의 다른 예시적인 구체예는, 예를 들면, 세포의 질량을 정량하고 및/또는 환경적 자극에 반응하여 하나 이상의 세포의 질량의 변화 양상을 관찰하기 위한 시스템 및 방법을 포함할 수 있다. 일부 구체예는, 시험용 빔과 광의 기준 빔 간 프랙셔널 위상 전이를 생성시키고 측정할 수 있는 간섭 현미경의 관찰 챔버에 하나 이상의 세포를 배치하는 단계; 조명 파장에서 상기 세포를 시험용 빔에 노출시키는 단계; 상기 세포를 통해 전파하는 시험용 빔과 기준 세포를 통해 전파하는 기준 빔 간 프랙셔널 위상 전이를 측정하는 단계; 및 하나 이상의 세포의 질량을 하기 식에 의해 결정하고,

식 중에서 m은 상기 세포의 질량이고, α는 위상 전이와 세포 질량 간의 관계를 기술하는 상수이며, Ψ는 측정된 프랙셔널 위상 전이이고, λ는 조명 파장이며, 적분은 전체 세포 영역인 A에 대해 수행되는 것인 단계를 포함하는 방법을 포함한다.

또한, 기타 세포의 특성을 관찰하기 위한 방법론적 구체예가 고려된다. 예를 들면, 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 방법은 수성 매질에서 살아있는 세포의 광학적 두께를 관찰하는데 이용될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 살아있는 세포의 집단을 동시에 관찰, 예를 들면, 살아있는 세포의 집단에서 자극에 대한 휴지기(resting) 세포 반응 및 동적 세포 반응을 확인, 모니터링, 및 측정하는데 이용될 수 있다. 일반적으로 이 방법에서, 이 특성은 치료용 약물과 같은 자극에 대한 세포의 노출에 반응하여 관찰된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 내부 또는 외부 자극에 대한 집단 내 세포의 차별적 반응(differential response)을 프로파일링하기 위하여 고도의 병렬 방식으로(in a highly parallel fashion) 수행될 수 있다. 선택적으로, 상기 방법은 세포를 관찰 챔버로부터 제거하는 단계 및 추가 분석을 위하여 세포를 조작하는 단계를 더 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 방법은 수성 매질에서 살아있는 세포에 대한 세포 특이적 프로파일을 포함하는 정보를 수득하고 그 후 이 정보를 기억 저장 요소에 저장하는데 이용된다.

본 발명의 방법론적 구체예의 변이가 고려된다. 예를 들면, 본 발명의 특정 방법론적 구체예는: 마이켈슨 간섭 대물렌즈(Michelson interference objective)를 갖는 현미경; 상기 현미경에 작동가능하게 결합되어 있는 카메라 (예를 들면, 스틸 카메라, 비디오 카메라, 전하 결합 소자(charge coupled device; CCD) 등)와 같은 검출기; 세포를 포함하도록 된 관찰 챔버를 포함하는 시료 어셈블리; 및 기준 챔버를 포함하는 기준 어셈블리를 포함하는 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 그와 같은 시스템은 세포의 하나 이상의 영상을 저장하도록 된 기억 저장 요소 및 세포의 하나 이상의 영상을 처리하도록 된 처리 요소를 추가로 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 현미경은 유체 매질을 통해 간섭 무늬(interference fringe)를 관찰할 수 있는 간섭 현미경이다. 대안적으로, 상기 시스템은 다중 위상 전이에서 간섭 패턴을 관찰하고 그 후 관찰된 간섭 패턴을 세포의 광학적 두께 프로파일과 연관시킬 수 있다. 본 명세서에 개시된 시스템은 구조의 변이를 채택할 수 있으므로, 그와 같은 통상의 구체예는 비제한적이다. 본 발명의 다른 구체예는 세포 휘트니스(cellular fitness)에 대한 실시간 및 비침습적 마커 및 세포 휘트니스를 관찰하는 방법을 포함한다. 그와 같은 시스템 및 기법은 세포 질량 변화의 관찰에 의존할 수 있다.

본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 부록을 포함한 하기 상세한 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는, 본 발명의 일부 구체예가 제한이 아닌 설명의 방식으로 주어진다는 것을 나타낸다는 것이 이해되어질 것이다. 본 발명의 범위 내의 여러 변화 및 변형은 그의 사상으로부터 벗어나지 않고 제조될 수 있고, 본 발명은 그와 같은 모든 변형을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술(art) 용어, 표기법 및 기타 과학 용어 또는 전문용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 통상 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부의 경우, 통상 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 즉각적인 참조(ready reference)를 위해 본 명세서에 정의될 수 있고, 본 명세서 내에 그와 같은 정의의 포함은 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 항상 이해되어서는 안된다. 본 명세서에 기술되거나 참조되는 여러 기법 및 방법은 통상의 기술자에 의해 잘 이해되고 종래의 방법론을 이용하여 통상적으로 이용된다. 적절하게는, 상업적으로 이용가능한 키트 및 시약의 사용은 달리 언급되지 않는 한 일반적으로 제조사에 의해 정의된 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 수행된다. 여러 용어가 하기에 정의되어 있다.

본 발명이 더 기술되기 전에, 본 발명은 그 자체가, 물론, 변할 수 있는, 기술된 특정 구체예에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 범위가 단지 첨부된 청구항에 의해 한정될 것이므로, 본 명세서에서 사용된 전문 용어는 단지 특정 구체예를 기술하는 목적을 위한 것이고 한정하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서와 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "a", "및", 및 "the"는, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다는 것에 주의해야 한다. 따라서, 예를 들면, "시험용 조성물(a test composition)"의 언급은 복수 개의 그와 같은 시험용 조성물 등을 포함한다. 절대치로 정수 이외의 값을 특징으로 할 수 있는 값을 언급하는, 명세서 및 관련 청구항에 기재된 모든 숫자 (예를 들면, 용액 중 화합물의 농도)는 용어 "약"에 의해 변형된다는 것이 이해된다. 일정 범위의 값이 주어질 경우, 각 사이에 있는 값(intervening value)은, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 하한 단위의 10분의 1까지, 그 범위 및 그 명시된 범위에서 기타 명시된 또는 그 사이에 있는 값의 상한 및 하한 사이에서, 본 발명 내에 포함된다. 보다 더 좁은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 보다 더 좁은 범위에 포함될 수 있고, 또한 본 발명 내에 포함되며, 명시된 범위에서 특별히 배제된 한계의 대상이 될 수 있다. 명시된 범위가 상한과 하한 중 하나 또는 모두를 포함할 경우, 그 상한 및 하한 중 하나 또는 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.

본 명세서에 언급된 모든 문헌은 그 문헌이 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시 및 기술하기 위하여 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 인용된 문헌은 본 발명의 출원일에 앞선 그의 개시에 대하여 인용된다. 본명세서에서 어느 것도, 본 발명자가 발명의 최우선일 또는 우선일 덕분에 문헌에 선행하는 것으로 자격을 주지 않는 허가로 해석되지 않는다. 또한, 실제 공개일은 나타난 것과 상이할 수 있고 독립적인 확인을 요구한다.

본 명세서에 개시된 발명은 다수의 구체예를 갖는다. 본 발명의 구체예는 세포의 하나 이상의 특성, 예를 들면, 그의 질량 및/또는 여러 환경 조건에 반응하는 세포의 질량에서의 변화 양상을 관찰 및/또는 특징짓기 위한 방법, 물질 및 시스템을 제공한다. 본 발명의 예시적인 구체예는 세포의 질량에 대한 정보를 얻기 위하여 및/또는 세포의 질량에 관련된 하나 이상의 세포의 특성을 특징짓기 위하여 간섭법을 이용하는 것을 포함한다. 본 발명의 구체예에 의해 관찰될 수 있는, 예시적인 세포의 특성은, 자극, 예를 들면, 약물 또는 기타 생물학적으로 활성인 제제 및 다양한 기타 요인들에의 노출을 포함한 자극에 반응하는, 예를 들면, 세포 골격 리모델링 행동(cytoskeletal remodeling behavior)을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 관찰되는 현상은 전암(precancerous) 세포 및 암 세포에서 발생하는 것과 같은, 비정상적인(aberrant) 세포 분열과 같은 병리 상태에 해당하는, 또는 그 상태와 관련된 것이다. 본 발명의 일부 구체예에서, 움직임이 관찰되는 세포막은 단일 세포의 막이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 복수 개의 세포의 막 특성이 관찰된다. 특정 구체예에서, 막은 조직 내에 있는 세포의 막이다. 다른 구체예에서, 막은 세포의 콜로니 (예를 들면, 환자 또는 확립된 세포주로부터 취해진 원시 세포(primary cell)의 인 비트로 세포 배양물) 내에 있는 세포의 막이다. 본 발명의 일반적인 구체예에서, 세포는 진핵 (예를 들면, 포유동물) 세포이다.

본 발명의 일반적인 간섭(interferometric) 구체예에서, 간섭 시스템는, 예를 들면, 마이켈슨 구조를 이용한다. 또한, 분산 간섭법(spectrally resolved interferometry), 파장 주사 간섭법(wavelength scanning interferometry), 디지털 홀로그래피 등을 포함한 간섭 기법과 관련된 방법 및 요소가 본 발명의 구체예에서 이용될 수 있다. 여러 간섭 현미경 시스템과 방법이 본 발명의 구체예에 의한 이용에 적합할 수 있는 반면, 본 발명의 다른 구체예는 주사 광학 현미경, 공초점 현미경 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 구체예에 의한 이용에 적합할 수 있는 광학 프로파일링(optical profiling) 방법 및 물질을 기술하는 예시적인, 비제한적인 문헌의 목록은, 예를 들면, 미국 특허 출원 제20100284016호; 제20050248770호; 제20050225769호; 제20050200856호; 20050195405호; 제20050122527호; 제20050088663호; 제20040252310호; 제20050117165호; 제20030234936호; 제20040066520호; 제20080018966호 및 제20050167578호에 개시되어 있고, 그 내용이 참조에 의해 포함된다.

본 발명의 구체예는 광학 프로파일측정 기법(optical profilometry technique)을 이용하여, 예를 들면, 높이 측정, 형태 측정, 및 세포막의 형태 및 세포의 질량에 관련될 수 있는 기타 특성에서 기타 변조(modulation)의 측정 방법을 제공한다. 이 기법은 일반적으로, 시험용 세포 또는 집단 이탈 세포(population off cell)의 형태, 크기 등에 따라, 구조형 광(structured light), 눈의 초점 특성(focusing properties of optic), 광 간섭 등을 이용하여, 경제적이고 실제적인 방식으로 결과를 최적화한다. Moire' 기법, ESPI (전자처리 스페클 패턴 간섭법, electronic speckle-pattern interferometry), 레이저 주사, 사진 측량(photogrammetry), 및 간섭법은 3차원 형태 측정을 수행하기 위하여 개발된 예시적인 기법이다. 또한, 통상적으로 백색광 간섭법(white-light interferometry) 또는 간섭 레이더(coherence radar)로 지칭되는, 백색광 수직 주사 간섭(white-light vertical scanning interferometry; VSI) 기법은, 작은 물체, 일반적으로 수 마이크로미터를 초과하지 않는 거칠기(roughness)를 갖는 물체를 영상화하는데 이용된다. VSI 방법론은 두 개의 간섭하는, 다색의(polychromatic) 파면(wavefront)에 의해 생성된 간섭 피크(coherence peak)의 검출에 기반한다. 그것은 절대적 깊이 구별(absolute depth discrimination), 신속한 측정 사이클, 및 높은 수직 해상도와 같은 이점을 갖는다. VSI의 한 가지 이점은 정확도에서 우수하지만 VSI의 주사 깊이를 결여할 수 있는, 위상-이동 간섭법(phase-shifting interferometry; PSI)과 같은, 기타 측정 기법과 조합될 수 있다는 편이성이다. 일반적으로 PSI는 프로파일에서 작은 변화를 갖는 평활 표면의 측정에 이용될 수 있다 (K. Creath, "Temporal Phase Measurement Methods," Interferogram Analysis, Institute of Physics Publishing Ltd., Bristol, 1993, pp. 94-140을 참조한다). 일반적으로, VSI는 대형 인터픽셀 높이 범위(large interpixel height range)를 갖는 평활 표면 및/또는 거친 표면을 측정하는데 이용된다 (K. G. Larkin, "Efficient Nonlinear Algorithm for Envelope Detection in White Light Interferometry," J. Opt. Soc. Am., A/Vol. 13, 832-843 (1996). VSI와 PSI의 조합은, 예를 들면, PSI 정확성을 갖는 대형 단계(large step)를 측정하는데 이용되었다 (C. Ai, U.S. Pat. No. 5,471,303). VSI와 PSI 조합의 특정한 경우인 PSIOTF 기법은, 보다 넓은 높이 범위에서 평활 표면의 측정을 개선시킨다 (예를 들면, Harasaki et al., "Improved Vertical Scanning Interferometry," Appl. Opt. 39, 2107-2115, 2000을 참조한다). 일반적인 VSI와 PSI 시스템 및 방법은, 예를 들면, 미국 특허 제5,133,601호, 제5,471,303호 및 미국 특허 제6,449,048호, 및 미국 특허 출원 제20020196450호에 개시되어 있고, 그 내용은 참조에 의해 포함된다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 구체예는 본 명세서에 개시된 시스템을 이용하여 세포의 질량 특성을 관찰하는 방법을 포함한다. 구체예는 예를 들면, 막의 움직임이, 광학적 세포 두께 (세포 밀도), 세포 부피 등과 같은 인자의 실시간 위상 측정에 의해 관찰되는 막의 관찰을 포함한다. 그와 같은 한 가지 방법은 세포 (및/또는 세포 집단)의 특성을 관찰하는 방법으로서, 상기 방법은 마이켈슨 간섭 대물렌즈를 갖는 광학 현미경의 세포 관찰 챔버에 상기 세포를 배치하는 단계; 및 이 마이켈슨 간섭 대물렌즈를 이용하여 상기 세포를 관찰하는 단계를 포함한다. 일반적으로 그와 같은 구체예에서, 질량 특성은 세포 밀도 및/또는 세포 부피 등과 같은 세포의 관찰 가능한 특성과 연관될 수 있고, 이러한 방식으로 상기 방법은 세포의 질량 특성이 관찰되게 한다.

본 발명의 예시적인 한 가지 구체예는 살아있는 세포의 간섭법을 이용하는, 세포의 질량을 측정하는 방법이다. 일반적으로, 그와 같은 방법은, 광의 시험용 빔과 광의 기준 빔 간 프랙셔널 위상 전이를 측정하도록 된 간섭 현미경의 관찰 챔버에 상기 세포를 배치하는 단계; 조명 파장에서 상기 세포를 광의 시험용 빔에 노출시키는 단계; 및 그 후 상기 세포를 통해 전파하는 광의 시험용 빔과 광의 기준 빔 (예를 들면, 대조 세포 또는 기준 세포를 통해 전파하는 것) 간 프랙셔널 위상 전이를 측정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 통상의 기술자는 상기 세포를 통해 전파하는 시험용 빔과 기준 세포를 통해 전파하는 기준 빔 간 프랙셔널 위상 전이로서, 상기 프랙셔널 위상 전이는 상기 세포의 특성과 연관되는 것인 프랙셔널 위상 전이를 측정하기 위하여 현미경을 이용할 수 있다. 그 후 그와 같은 측정 결과는 상기 세포의 질량을 도출하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 통상적인 구체예에서, 세포의 질량은 하기 식을 이용하여 관찰/도출되고:

식 중에서 m은 상기 세포의 질량이고, α는 위상 전이와 세포 질량 간의 관계를 기술하는 상수이며, Ψ는 측정된 프랙셔널 위상 전이이고, λ는 조명 파장이며, 적분은 전체 세포 영역인 A에 대해 수행된다. 본 발명의 특정 구체예에서, α = 1.8 x 10^-3 m³kg^-1이다. 선택적으로, 세포의 질량은 복수 회 관찰되어 일정 시간 동안 세포의 질량에서의 변화 양상이 관찰된다. 본 발명의 일부 구체예에서, 세포의 질량은 실시간으로 정량된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 방법은 복수 개의 세포의 질량을 정량하는데 이용된다.

본 발명의 일반적인 구체예에서, 상기 방법은 현미경과 작동가능하게 결합되어 있는 검출기; 세포를 포함하도록 된 관찰 챔버를 포함하는 시료 어셈블리; 기준 세포를 포함하도록 된 기준 챔버를 포함하는 기준 어셈블리; 및 광 빔을 광원으로부터 시험용 빔과 기준 빔으로 분리하기 위한 빔 스플리터를 포함하는, 살아있는 세포의 간섭 시스템을 이용하여 수행된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 관찰 챔버는 상기 챔버 내로 세포 배지를 순환시키도록 된 하나 이상의 관류 도관을 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 살아있는 세포의 간섭 시스템은 상기 세포의 하나 이상의 영상을 처리 및 저장하도록 된 처리 요소 및 기억 저장 요소를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 세포 특성의 mass (예를 들면, 세포의 질량, 세포의 중량, 세포의 부피 등)은 치료제에 대한 상기 세포의 반응을 정량하기 위하여 관찰된다. 선택적으로, 예를 들면, 상기 세포는 암을 앓는 개체로부터 수득되고 상기 치료제는 상기 암을 치료하는데 이용된다.

또한, 본 발명의 다른 구체예는, 특정 환경, 예를 들면, 헤르셉틴과 같은 치료제를 포함하는 특정 환경에 대한 세포의 반응을 관찰하는 방법이다. 본 발명의 그와 같은 방법에서, 세포는 제1 환경에 배치되고, 그 후 제1 환경 내 세포의 질량 특성이, 살아있는 세포의 간섭법을 포함하는 방법을 이용하여 관찰된다. 일반적으로, 이러한 비교는, 제1 환경 및 제2 환경에서 환자로부터 유래된 동일 계통의 세포 (예를 들면, 암 계통)를 관찰하는 것을 포함한다. 이러한 방식으로, 제1 환경 및/또는 제2 환경에 대한 세포의 반응이 관찰될 수 있다. 일반적으로 이 방법에서, 제1 환경은 시험용 조성물을 포함하고 제2 환경은 시험용 조성물을 포함하지 않는다. 선택적으로, 시험용 조성물은 항생제, 항체, 알킬화제, 항대사물질, 세포 주기 억제제, 토포아이소머라제 억제제, siRNA 또는 세포 (예를 들면, 항원 제시 세포와 같은 인간 면역 세포)를 포함한다. 이 방법에서, 제1 환경에서 관찰된 질량 특성은 살아있는 세포의 간섭법을 포함하는 방법을 이용하여 제2 환경에서 관찰된 세포의 질량 특성과 비교된다.

본 발명의 특정 구체예에서, 질량 특성이 관찰되는 세포는 제1 환경에 단리된 세포로 존재한다. 대안적으로, 질량 특성이 관찰되는 세포는 제1 환경에 세포 집합 또는 세포 집괴 (예를 들면, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 세포의 응집)로 존재한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 제1 환경에 존재하는 복수 개의 세포의 질량 특성이 관찰된다. 본 발명의 구체예에서, 제1 환경에서 하나 이상의 세포의 질량 특성은 복수 회 관찰되어 일정 시간 동안 하나 이상의 세포의 질량에서의 변화 양상이 관찰될 수 있다. 선택적으로, 예를 들면, 세포의 질량 특성에서의 변화는 시간적 질량 프로파일을 관찰하기 위한 시간 동안 관찰된다 (예를 들면, 일정 시간 동안 세포의 질량이 변화하는 특정한 방식). 본 발명의 일부 구체예는 관찰된 시간적 질량 프로파일을 시간적 질량 프로파일의 데이터베이스와 비교하는 단계를 포함하고, 상기 시간적 질량 프로파일의 데이터베이스는 시험용 조성물에 대한 세포 민감도의 특징을 나타내는 시간적 질량 프로파일 및 상기 시험용 조성물에 대한 세포 내성의 특징을 나타내는 시간적 질량 프로파일을 포함한다.

본 발명의 다른 예시적인 구체예는, 예를 들면, 세포의 질량을 정량하고 및/또는 환경적 자극에 반응하는 하나 이상의 세포의 질량에서의 변화 양상을 관찰하기 위한 시스템 및 방법을 포함할 수 있다. 일부 구체예는, 시험용 빔과 광의 기준 빔 간 프랙셔널 위상 전이를 생성시키고 측정할 수 있는 간섭 현미경의 관찰 챔버에 하나 이상의 세포를 배치하는 단계; 조명 파장에서 시험용 빔에 상기 세포를 노출시키는 단계; 상기 세포를 통해 전파하는 시험용 빔과 기준 세포를 통해 전파하는 기준 빔 간 프랙셔널 위상 전이를 측정하는 단계; 및 하나 이상의 세포의 질량을 하기 식에 의해 결정하는 단계를 포함하는 방법을 포함하고,

(1)

식 중에서 m은 상기 세포의 질량이고, α는 위상 전이와 세포 질량 간의 관계를 기술하는 상수이며, Ψ는 측정된 프랙셔널 위상 전이이고, λ는 조명 파장이며, 적분은 전체 세포 영역인 A에 대해 수행된다.

질량 및/또는 기타 세포의 특성을 관찰하기 위한 방법론적 구체예가 고려된다. 예를 들면, 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 방법은 수성 매질에서 살아있는 세포의 광학적 두께를 관찰하는데 이용될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 살아있는 세포의 집단을 동시에 관찰, 예를 들면, 살아있는 세포의 집단에서 자극에 대한 휴지기 세포 반응 및 동적 세포 반응을 확인, 모니터링, 및 측정하는데 이용될 수 있다. 일반적으로 이 방법에서, 이 특성은 치료용 약물과 같은 자극에 대한 세포의 노출에 반응하여 관찰된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 내부 또는 외부 자극에 대한 집단 내 세포의 차별적 반응을 프로파일링하기 위하여 고도의 병렬 방식으로 수행될 수 있다. 선택적으로, 상기 방법은 세포를 관찰 챔버로부터 제거하는 단계 및 추가 분석을 위하여 세포를 조작하는 단계를 더 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 방법은 수성 매질에서 살아있는 세포의 세포 특이적 프로파일을 포함하는 정보를 수득하고 그 후 이 정보를 기억 저장 요소에 저장하는데 이용된다.

방법론적 구체예의 변이가 고려된다. 예를 들면, 본 발명의 특정 방법론적 구체예는: 마이켈슨 간섭 대물렌즈를 갖는 현미경; 상기 현미경에 작동가능하게 결합되어 있는 카메라 (예를 들면, 스틸 카메라, 비디오 카메라, 전하 결합 소자(CCD) 등)와 같은 검출기; 세포를 함유하도록 된 관찰 챔버를 포함하는 시료 어셈블리; 및 기준 챔버를 포함하는 기준 어셈블리를 포함하는 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 그와 같은 시스템은 세포의 하나 이상의 영상을 저장하도록 된 기억 저장 요소 및 세포의 하나 이상의 영상을 처리하도록 된 처리 요소를 추가로 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 현미경은 유체 매질을 통해 간섭 무늬를 관찰할 수 있는 간섭 현미경이다. 대안적으로, 상기 시스템은 다중 위상 전이에서 간섭 패턴을 관찰하고 그 후 관찰된 간섭 패턴을 세포의 광학적 두께 프로파일과 연관시킬 수 있다. 그와 같은 일반적인 구체예는, 본 명세서에 개시된 시스템이 구조적 변이를 채택할 수 있으므로, 비-제한적이다. 본 발명의 다른 구체예는 세포 휘트니스의 실시간 및 비침습적 마커 및 세포 휘트니스를 관찰하는 방법을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예는, 현미경; 상기 현미경에 작동가능하게 결합되어 있는 포인트 검출기(point detector), 선 검출기(line detector), 마이크로볼로미터(microbolometer) 또는 카메라 (예를 들면, 스틸 카메라, 비디오 카메라, 전하 결합 소자(CCD) 기타 영상 캡처 장치를 이용하는 현미경)와 같은 검출기; 세포를 함유하도록 된 관찰 챔버를 포함하는 시료 어셈블리; 및 기준 챔버를 포함하는 기준 어셈블리를 포함하는, 세포의 질량 특성을 관찰하기 위한 시스템이다. 그와 같은 시스템 및 기법은 세포 질량에서의 변화의 관찰에 의존한다.

본 발명의 다른 구체예는, 간섭 무늬로부터 정보를 추출할 수 있는 간섭 현미경; 상기 간섭 현미경에 작동가능하게 결합되어 있는 검출기; 세포를 함유하도록 된 관찰 챔버를 포함하는 시료 어셈블리, 및 상기 시료 어셈블리의 광로 길이(optical path length)에 실질적으로 맞도록 된 기준 어셈블리를 포함하는, 세포의 하나 이상의 영상을 수득하기 위한 시스템을 포함한다. 본 발명의 일반적인 일 구체예는, 마이켈슨 간섭 대물렌즈를 갖는 현미경; 상기 현미경에 작동가능하게 결합되어 있는 카메라; 세포를 함유하도록 된 관찰 챔버를 포함하는 시료 어셈블리, 및 유체 (예를 들면, 관찰 챔버 내에 배치된 매질, RPMI, PBS, 물 등)를 함유하도록 된 기준 챔버를 포함하는 기준 어셈블리를 포함하는, 세포의 영상을 수득하기 위한 시스템이다.

상기 시스템의 구체예는 기술분야에 알려져 있고 및/또는 본 명세에 기술된 변이 요소 및 방법을 이용하기에 적합하다. 예를 들면, 시료 챔버 및/또는 기준 챔버가 일반적으로 유체를 포함하는 반면, 또한, 유체 세포, 예를 들면, 전달가능 매질 (transmissive media: TTM) 대물렌즈 (예를 들면, 염을 이용함으로써)를 필요로하지 않는 기타 구체예가 본 발명의 구체예에서 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 특정 구체예에서, 세포를 유지하는 시료 챔버는 닫혀 있는 반면, 다른 구체예에서, 시료 챔버는 정상부(top)가 개방되어 있을 수 있다 (즉, 뚜껑을 필요로 하지 않음). 본 발명의 구체예는, 일반적으로 시료 어셈블리와 기준 어셈블리를 구성하는 요소의 크기와 구조(architecture)을 조절함으로써, 간섭계의 팔(arm) 간의 광로 차이를 맞추는 것(matching)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 기준 어셈블리는, 제1 광학창(optical window); 상기 제1 광학창을 유지하도록 된 제1 하우징 요소(housing element); 제2 광학창; 상기 제2 광학창을 유지하도록 된 제2 하우징 요소; 및 상기 제1 광학창과 상기 제2 광학창 사이에서 이용가능하고 상기 제1 및 제2 광학창을 정의된 거리까지 분리시키도록 된, 복수 개의 구형 스페이서(spherical spacer) 요소를 더 포함한다. 이것은 단지 이 목적을 달성하는 한 가지 방법의 실례가 되고 비-제한적인 예이고, 팔 사이 등의 광로 차이를 맞추는 기타 방법의 변이가 존재한다 (예를 들면, 세포 챔버에 맞는 단 하나의 플레이트, 두 개의 웨지(wedge)가 서로에 대하여 이동되어 광로가 변할 수 있는 구체예에서, 상이한 유형의 스페이스가 구형 스페이서 요소 등에 대신하여 이용될 수 있다.).

본 발명의 다른 구체예는, 빔 스플리터, 기준 거울을 포함하는 간섭계를 제공하는 단계 및 유체 세포를 보충하는 단계를 포함하고, 상기 유체 세포는 검체(specimen) 주위의 유체에 의해 유도된 광로 차이를 조정하는데 이용된다. 그와 같은 방법은 압전 변환기(piezoelectric translator)를 이용하여, 광로를 소량 감소시켜 시험용 빔과 기준 빔 간의 위상 전이를 유발하는 것을 포함한다. 그와 같은 방법은 투명한 세포체를 통해 전파하는 빛에 가해진 위상에서의 변이를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 그와 같은 방법은 하기 식에 의해 측정된 위상 지연에 대하여 세포 질량을 결정하는 단계를 포함할 수 있다:

본 발명의 구체예는 이 시스템의 치환(permutation) 변이를 포함한다. 예를 들면, 특정 구체예에서, 관찰 챔버는 챔버 내로 세포 배지를 순환시키도록 된 하나 이상의 관류 도관을 포함한다. 본 발명의 일부 구체예는 세포의 하나 이상의 영상을 처리 및 저장하도록 된 처리 요소 및 기억 저장 요소를 더 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 세포는 형광 마커 (예를 들면, 녹색 형광 단백질)과 같이 기술분야에 알려져 있는 다른 마커/프로브에 의해 표지되고 이 시스템은 이들 표지된 세포를 영상화하도록 된 광학 요소를 포함한다. 본 발명의 일부 구체예는 FT 적외선 분광법, 라만(Raman) 분광법 등에서 이용되는 장치 및 방법 (예를 들면, 소프트웨어 기반 방법)과 같은, 세포 특성을 관찰하는데 이용되는 추가의 요소를 포함한다.

본 발명의 방법은 하나 이상의 세포 특성에 관한 광범위하고 다양한 정보를 수득하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 방법은, 예를 들면, 수성 매질에서 살아있는 세포의 광학적 두께를 관찰하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 구체예는 1 nm의 수직 해상도까지, (변형에 의해 1초의 1/1000 중 1회까지 증가될 수 있는) 11초마다 1회의 영상 캡처 비율로, 관측 시야에 있는 모든 세포에 대해 액체 (즉, 배양 배지)에서 살아있는 세포의 광학적 두께를 측정하는데 이용될 수 있다. 이 관찰은 유용한 정보를 제공하고, 예를 들면, CCD 검출기 카메라로 돌아가는 간섭계 광의 회귀를 지연시키는 세포에서, 픽셀-by-픽셀 기반으로 관측 시야 내 세포체의 수평축을 가로질러, 단백질, 핵산 및 기타 분자의 측정을 포함한다.

대안적으로, 상기 방법은 수성 매질에서 살아있는 세포의 세포 질량 특성을 관찰하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 액체에서 세포 질량은 본 명세서에 개시된 시스템의 구체예로부터 수득된 관찰 결과로부터 각 세포에 대해 계산될 수 있다. 일정 시간 동안 그와 같은 계산결과를 수집합으로써, 세포의 광학적 두께 (질량)에서의 적응성(adaptive) 및/또는 부적응성(maladaptive) 변화가 환경 (즉, 항원 제시 세포와 같은 기타 세포와의 상호작용, 헤르셉틴 등과 같은 제제와의 상호작용)에 반응하여 평가될 수 있다. 이 정보로부터, 그 후, 예를 들면, (일반적으로 기술분야에 알려져 있는 계산결과를 이용하여) 점탄성과 같은, 시야 내 각 세포에 대한 생물물리학적 변수를 도출할 수 있다. 이와 같은 방식으로, 통상의 기술자는 시간에 따라 변화하는 조건하에서 세포의 질량 특성을 관찰할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 세포의 질량 "시그니쳐(signature)"는 휴지 상태에 있는 또는 일부 환경 조건에 반응하는 집단 내 각 개별 세포로부터 도출될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 고유의 특성을 갖는 살아있는 개별 세포는, 그의 위치(들)가 관측 간섭계 시야에서 확인될 수 있으므로, 관측 시야로부터 단리되고 회수될 수 있다. 또한, 추가의 분석에 대하여 관찰된 세포를 회수하는 것과 같은 조작이 고려된다. 회수는 흡입 피펫(suction pipette)에 의해, 예를 들면, 추가 연구 (즉, 단일 세포 마이크로어레이 유전자 발현 프로파일링 등과 같은, 다양한 설정에서 추가 시험되는, 소동물내로의 양자 도입(adoptive transfer))를 가능하게 하는 것일 수 있다.

전술된 바와 같이, 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 방법은 수성 매질에서 살아있는 세포의 질량 특성을 관찰하는데 이용된다. 선택적으로, 상기 방법은 살아있는 세포의 집단을 관찰하는데, 예를 들면, 살아있는 세포의 집단에서 자극에 대한 휴지기 반응 및 동적 반응을 관찰하는데 이용된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 살아있는 세포의 집단에서 복수 개의 세포의 휴지기 반응 및/또는 동적 반응은 동시에 측정될 수 있다. 일반적으로 이 방법에서, 이 특성은 세포의 배지 내로 도입되는 조성물과 같은 자극에 대한 세포의 노출에 반응하여 관찰된다. 선택적으로, 상기 방법은 관찰 챔버로부터 세포를 제거하는 단계 및 추가의 분석을 위하여 세포를 조작하는 단계를 더 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 방법은 수성 매질에서 살아있는 세포의 세포 특이적 프로파일을 포함하는 정보를 수득하고, 그 후 이 정보를 기억 저장 요소에 저장하는데 이용된다. 본 발명의 일부 구체예에서, 세포는 보다 균일하고, 보다 큰 밀도, 및 보다 고용량의 분석을 위하여 (예를 들면, 기술분야에 알려져 있는 포토레지스트 도포에 의해), 적절한 크기의 "구멍(hole)" (예를 들면, 나노웰 또는 마이크로웰)에 의해 배열될 수 있다.

시험용 세포의 특징을 확인하는데 유용한 본 발명의 구체예는 컴퓨터 시스템 및 데이터베이스와 결합될 수 있다. 시험용 세포의 특징을 확인하는 방법은 일반적으로 시험용 세포의 세포 특징적 프로파일을 결정하여 시험용 프로파일을 생성하는 단계, 및 이 시험용 프로파일을 서브젝트 데이터베이스(subject database) 중 기준 프로파일과 비교하는 단계를 포함한다. 그와 같은 방법은 프로파일 라이브러리 (예를 들면, 치료제에 대한 세포 민감도 또는 내성과 같은 여러 프로파일과 연관된 특이적 생리 조건에 따라 집단화된 것)의 생성 및 시험용 프로파일의 프로파일 라이브러리 중 프로파일에 대한 비교를 더 포함한다. 그와 같은 비교는, 기술분야에 알려져 있는 소프트웨어 방법을 이용하여, 예를 들면, 시험용 프로파일과 실질적으로 동일한 기준 프로파일을 확인하는 최적의 맞춤을 제공할 수 있다. 그 후 기준 프로파일은 시험용 세포의 하나 이상의 특징을 연관시키는데 이용될 수 있다.

세포의 특징적 프로파일은, 전술된 바와 같이, 데이터베이스에서 편집될 수 있고, 데이터베이스 내의 정보는 시험용 세포의 프로파일을 데이터베이스에 있는 기준 프로파일과 비교하는데 이용된다. 이 비교는 훈련된 개인 (예를 들면, 임상가, 기술자 등)에 의해 만들어질 수 있고, 또는 컴퓨터 또는 기타 기계에 의해 만들어질 수 있다. 개체 진단 분석(subject diagnostic assay)은 임의의 유형의 비정상 세포를 확인하는데 유용하고, 예를 들면, 본 발명의 진단 분석은 생물학적 시료에 있는, 예를 들면, 생검, 및 인 비보로 개체에서 암 세포를 확인하는데 유용하다.

여러 생리적 조건하 및 여러 생리적 상태에 있는 여러 세포 유형의 분석으로부터 수득된 데이터는, 예를 들면, 세포 타입 및 세포의 생리적 상태의 독립적인 검출을 위한 신경망(neural network)을 훈련시키기 위하여 데이터베이스에서 편집될 수 있다. 세포의 특징적 프로파일은 전술된 바와 같이 수득되고, 신경망은 여러 세포 타입의 세포, 여러 생리적 상태에 있는 세포, 및 여러 자극에 반응하는 세포를 인식하도록 훈련된다. 신경망은 암 세포, 전암 세포, 및 기타 생리적 조건에 있는 세포를 확인하는데 유용하다.

본 발명의 구체예에 의한 이용에 적합할 수 있는 일반적인 방법 및 물질은 미국 특허 출원 제20100284016호에 개시되어 있고, 그 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 구체예와 연관된 추가의 양태, 요소, 및 방법이 하기 개시된다.

전술된 바와 같이, 본 발명의 구체예는 살아있는 세포의 간섭 기법(Live Cell Interferometry technique)에 관한 것이다. 그와 같은 기법은 기술분야에 알려져 있다. 살아있는 세포의 간섭 (LCI) 시스템, 방법, 및 물질을 기술하는, 실례가 되고 비-제한적인 문헌의 목록은 예를 들면, Teitell 등에 의한 미국 특허 출원 공개공보 제2010/0284016호; Popescu 등에 의한, 미국 특허 출원 공개공보 제2009/0290156호; Reed, J. et al., ACS Nano. 2008, 2, 841-6; Reed, J. et al. Nanotechnology 2008, 19, 235101; Reed, J. et al. Biophys J. 2011, 101, 1025-31에 개시되어 있고, 그 내용은 참조에 의해 포함된다.

LCI 기저의 물리적인 원리는 다음과 같다: 투명한 세포체를 통해 전파하는 간섭광 또는 반-간섭 광(semi-coherent light)에 가해지는 위상에서의 변이는 세포의 물질 밀도에 대하여 선형으로 비례한다 (9-11). 간섭 현미경은, 마이크론-크기의 물체에 대하여, 파장의 1/1000을 초과하는 정확도까지, 또는 가시광선에 있어서 0.5 nm보다 더 나은, 위상에서의 변이를 측정할 수 있다. 그 후 세포 질량은 다음과 같이 각 세포에 대해 측정된 위상 지연과 관련될 수 있다: (9)

식 중에서 m은 상기 세포의 질량이고, α는 위상 전이와 세포 질량 간의 관계를 기술하는 상수이며, Ψ는 측정된 프랙셔널 위상 전이이고, λ는 조명 파장이며, 적분은 전체 세포 영역인 A에 대해 수행된다. 여기에서, α = 1.8x10^-3 m³kg^-1로, 세포의 통상적인 내용물을 고려한 평균값으로서 Ross (9)과 일치한다. α의 정확한 값은 알려져 있지 않지만, 이전의, 독립적인 측정에 기초하여: (1) α는 광범위한 농도에 걸쳐 일정하게 유지되고 (2) α는 세포 내용물의 변화로 인해 약 5%를 초과하여 변할 것 같지는 않다고 가정된다. (11-13) 그럼에도 불구하고, α의 특정 값은 세포 분열 후 상대적인 성장 속도 (c.f. 도 2, 3) 및 상대적인 딸세포 질량 (c.f. 도 5)의 측정에 대한 정확도에 영향을 미치지 않을 것이다. 도 1은 LCI, 및 부착성 세포 및 비-부착성 세포의 일반적인 광학적 두께 영상의 도식을 나타낸다.

이것은 광범위한(wide-field) 영상 기법이므로, LCI는 수백개의 세포에 대한 동시적인 질량 측정결과를 제공한다 (도 2). 데이터 수집 전반에서, 세포는 6시간 또는 그 이상의 주기적인, 종적 측정(longitudinal measurement)을 가능하게 하는 생리적 조건에서 (예를 들면, pH 7.4, 37℃, 5% CO₂) 표준 배양 접시에서 유지될 수 있다 (도 2a). 자동화된 영상 처리 알고리즘에 의하여, 연속적인(in rapid succession) 각 영상에서 수백 개의 세포가 확인되고 질량-프로파일링 될 수 있다 (도 2b). 이 조건에서, 단일-세포 질량 측정은 반복가능성이 높다 (<3% CV; 방법: 측정 오차를 참조한다). 그러므로, 각 시점에서, 세포 질량의 전-집단(population-wide) 분포가 결정될 수 있다 (도 2c). 또한, 도 2d에서와 같이, 개별 세포는 성장 속도 곡선을 산출하기 위하여 장시간 동안 추적될 수 있다 (비-수성 세포 질량 변화)

하기 실시예는 본 발명이 보다 완전하게 이해될 수 있게 하기 위하여 제공된다. 이들 실시예는 단지 예시적인 것이고 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

도 1은 살아있는 세포의 간섭계 (LCI)에 대한 구체예의 도식을 도시한다. LCI (a)는 기준 세포의 광학적 두께를 관찰 챔버에 배치된 시료의 광학적 두께와 비교하는 마이켈슨-타입 간섭 현미경이다. 관찰 챔버 내에 거울같은 기판(mirrored substrate)이 매달려 있어, LCI가 투명한 세포에 대한 광학적 두께를 측정하는 것을 가능하게 한다. 현미경의 대물렌즈와 관찰 챔버의 상대적인 위치는 컴퓨터에 의해 조절되고 3차원으로 변환 가능하여(translatable), 신속하고, 자동화된 영상 획득을 가능하게 한다. 데이터 수집 전반에서, 관찰 챔버에 있는 세포는 표준 세포 배양 조건에서 유지된다 (예를 들면, pH 7.4, 37℃, 5% CO₂). 살아있는 세포의 간섭계는 부착성 세포 및 비-부착성 세포의 질량을 측정할 수 있다. 프레임 (b)는 폴리-L-라이신 용액에 의해 기판을 코팅한 후 관찰 챔버 기판에 부착된 여러 개의 비-부착성 H929 세포를 나타내는 반면, 프레임 (c)는 기판상에서 직접 배양되는 부착성 암컷 Indian Muntjac (9) 세포를 나타낸다. 색상 지도(color map)는, 푸른색은 배경에 비해 낮은 광학적 두께이고 붉은색은 높은 광학적 두께인, 광학적 두께 측정을 나타낸다.
도 2는 LCI에 의한 세포 질량의 고용량 및 종적 측정을 나타낸다. LCI로부터의, H929 다발성 골수종 세포에 대한 4개의 시료 영상 (a)은 6시간의 모니터링 동안 광학적 두께의 프로파일을 나타낸다. 색상은, 어두운 푸른색은 낮은 두께를 나타내고 백색/붉은색은 높은 두께를 나타내는, nm의 위상 전이를 나타낸다. 이 시료 영상은 매 7분마다 촬영된 25개의 연속적인 CCD 캡처로 구성된다. 삽도(inset)는 단일 세포를 가로지르는 위상 전이의 측정 결과를 나타낸다. 세포를 가로지르는 통합된 위상 전이는 세포의 건조 질량에 직접적으로 비례한다. (b) 수백 개의 개별 세포 (붉은색 윤곽의)가 각 프레임 내 고유의 위치에서 확인되고 (c) 각 개별 세포의 질량이 결정되어, 시간에 따른, 고용량, 집단-수준의 질량 프로파일링을 가능하게 한다. (d) 개별 세포의 질량을 시간에 따라 종적으로(longitudinally) 추적하여, 단일 세포의 성장 동역학을 검사한다. 측정 결과는 선형 최소 제곱 최량 적합선(linear least squares best fit line)을 갖는 속이 빈 부호로 표시된다. 이 경우 측정된 성장 속도는 6.5 (se +/- 0.72) pg/hr이다. 잔여 오차의 표준 편차로 취해진, 선형 추세 부근의 변이는 5.0 pg 또는 세포 질량 중앙값의 1.17%이다. 최대 피크-대-피크의 잔여 오차는 102분에서 11 pg 또는 이 시점에서 질량 중앙값의 2.61%이다.
도 3은 단일-세포 질량 축적에 의해 프로파일링 된 H929 다발성 골수종 세포의 약물 반응을 도시한다. DMSO-처리된 대조군 및 투니카마이신(Tunicamycin)-처리된 (10 g/ml) 세포의 질량 축적과 비교한, H929 다발성 골수종 세포 집단에 대한 LCI 종적 질량 측정 결과. 데이터는 5시간 동안 수집된다. 처리된 세포는 대조군에 비해 보다 서서히 성장한다. 실험 #1에 대한 37℃에 비하여, 실험 #2와 #3은 32℃에서 수행되었고, 이는 관찰된 경미하게 더 낮은 전반적인 성장 속도를 설명한다. 산점도(scatter plot) (a-b)는 그의 최초 질량 대비 5시간에서 개별 세포의 성장을 묘사한다 (최초 질량에 의해 정규화). 오차 선(error bar)은, 측정 오차의 추정치인 +/- 2% CV를 나타낸다. 오차 선은 모든 데이터에 적용되지만, 명료성을 위하여 그래프 중 대다수의 지점에서 생략된다. 시간 대비 정규화된 질량의 상자 그림(box plot) (c-d)에서, 원은 시료의 중앙값을 나타내고, 삼각형은 중앙값에 대한 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 솔리드 박스(solid box)는 25 및 75 백분위 한계를 나타내고, 위스커(whisker)는 평균으로부터의 두 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 투니카마이신에 대한 H929 반응의 분자 프로파일을 도시한다. 처리 집단과 미처리 집단 간 성장 속도에서의 차이는 전사 인자 CHOP의 상향-조절 (a) 및 전사 인자 XBP1의 대체 스플라이싱 (b)에 의해 처리 집단에서 동시에 발생한다. CHOP 및 XBP1-s는, 소포체에서 단백질 잘못-접힘(mis-folding)의 영향을 완화시키는 역할을 하는 호스트 유전자(host of gene)를 활성화시킨다. 이것은 단백질 당화의 억제자인 TM 작용의 알려진 기작과 일치한다. (c) 세포 주기 데이터는, 세포 주기 정지와 일치하는, G2/M 기 집단에서의 신속한 감소 및 G1/G0 집단에서의 상응하는 증가를 나타낸다. 이와 같은 이동은 TM 노출 3시간 후에 표명되어, G1/G0의 세포의 50%를 처리 5시간 종결시까지 남겨둔다.
도 5는 세포 분열의 질량 동역학을 도시한다. (총 ~600개의 세포로부터) 모든 실험의 처리 및 미처리 집단으로부터 28회의 분열이 기록되었다. (a) 분열하는 세포의 질량 범위를, 개별 분열을 관찰하고 모세포 및 딸세포의 질량을 직접 측정함으로써 결정하였다. 패널 (a)는 측정된 모든 세포 (처리 및 미처리; 파선)의 질량 분포를 실험 중 분열된 세포의 질량과 비교한다 (분열 전 붉은색, 분열 후 푸른색). (b) 놀랍게도, 많은 세포 분열이, 두 개의 딸세포 중 더 작은 것에서, 총 모세포 질량의 ~55% 이상을 유지하며, 매우 비대칭적이었다. (c) 5시간 경과 후 매우 비대칭적인 분열의 두 가지 예가 나타난다. 이 분열에서 딸세포 중 더 작은 것 (별표로 표시됨)은, 모세포 질량의 각각 35% 및 40%를 포함하였다. 이 분열은 (b)에서 붉게-채워진 원에 의해 나타난다. 오차 선은, 측정 오차의 추정치인 +/- 2% CV를 나타낸다 (방법을 참조한다).
도 6은 부착성 세포의 질량에 대한 살아있는 세포의 간섭계 측정 결과를 도시한다. 프레임은 연마된(polished) 실리콘 기판상에서 직접 배양된 몇 개의 쥐의 섬유아세포를 나타낸다. 색상 지도는, 푸른색은 배경에 비해 낮은 광학적 두께이고 붉은색은 높은 광학적 두께인, 광학적 두께 측정을 나타낸다. 좌측으로는(to the left), 표시된 바와 같이, 200분 동안 2초마다 취해진, 4개의 세포에 대한 질량 측정 결과이다. 부착성 세포 대 비-부착성 세포 중 더 작은 광학적 두께가 LCI에 의해 용이하게 측정된다.
도 7은 처리 및 미처리 데이터 세트의 산점도를 도시한다. 붉은 추세선은 데이터에 대한 선형 최소-제곱 피트(linear least-squares fit to the data)를 나타낸다. 성장 속도와 세포 질량 간 상관관계가 존재하지 않을 확률을 나타내는 p 값이 각 피트에 대해 주어진다. 95% 신뢰에 대하여 통계적으로 유의하지 않음에도 불구하고, 미처리 대조군에서 세포 질량이 증가함에 따라 성장이 더 둔화되는 추세가 존재한다. 처리된 세트 Tm2 및 Tm3는 성장 속도와 질량 간 상관관계를 나타내지 않는 반면, 음의 기울기는 Tm1에 대하여 유의하다 (p=0.02). 각 선형 피트에 대한 잔차의 놈(norm of the residual)은 각 질량 세그먼트 내에서 성장 변이의 추정치를 제공한다. 오차 선은 측정 오차의 추정치인 +/- 2% CV를 나타낸다.
도 8은 LCI의 광로 및 질량 측정 안정성을 도시한다. 실리콘 상에 ~35 nm 높이로 증착된 금 섬 증기(Gold islands vapor)를 (a, 하부 패널), 140분 동안 반복적으로 측정하여, 간섭계의 안정성을 시험하였다. 상부 패널에서 나타나듯이, 3개의 대표적인 섬의 평균 높이는 이 기간 동안 의미 있는 드리프트(drift)를 나타내지 않고, 높이에 대한 표준 편차로 주어진, 측정 반복성은 ~1.2 옹스트롬(angstrom) 또는 총 높이의 0.35%이다. 유사하게, 투명한 물체에 대한 질량 측정의 안정성은 80+ 분 동안, 부분-용융된 10 um 직경의 폴리스티렌 구체를 반복적으로 측정함으로써 (b) 추정된다. 상부 패널에서, 자취 #1은 집합 내로 용융되는(melted into a cluster) 세 개의 구체를 나타내고, 자취 #2는 집합 내로 용융되는 두 개의 구체를 나타낸다. 다른 세 개의 자취는 단일 구체로부터 유래한다. 폴리스티렌 구체에 대한 질량 측정의 변이 계수는, 측정기간 동안 무시할 만한 드리프트를 가져, 금 섬의 평균 높이에 대해 얻어진 것인, <0.4%와 유사하다. 데이터는, 물이 배양 배지를 대체한 것을 제외하고는, 살아있는 세포를 측정하는데 이용된 것과 동일한 조건하에서 LCI 관찰 챔버에서 수집되었다.
도 9는 LCI에 의한 높은 정확도의 질량 측정 결과를 도시한다. 4개의 개별 세포 (a 내지 d)를 선택하고 대략 12초 간격으로 행해진 98회의 연속 측정을 통해 추적하였다. 이 기간 동안(총 20분) 관찰된 세포는 질량에서 작은 변화를 나타내어 (질량 대 시간의 삽도 그래프를 참조한다), 측정 반복성의 평가를 가능하게 하였다. c 및 d의 세포는 이 기간 동안 >1 피코그램의 평균 질량 변화를 나타내어, c 및 d의 히스토그램은 성장으로 인한 추가의 변이를 제거하기 위하여 측정된 질량 -(마이너스) 최소-제곱 피트 선의 선형 요소(linear component of the least-squares fit line)를 나타낸다 (삽도에서 붉게 나타남). 각 세포에 대한 측정 결과의 히스토그램은 Matlab의 비선형 최소-제곱 피팅(nonlinear least-squares fitting)에 의해 가우스 분포에 맞았다. 평균 (μ) 및 표준 편차 (σ)가 각 분포에 대해 기록된다. 모든 표준 편차는 <1%의 분포 평균으로, LCI에 의한 질량 측정이 반복가능성이 높다는 것을 나타낸다.
도 10은 물에서 LCI에 의해 측정된, 부분적으로 용융된 6 μm 직경의 폴리스티렌 구체 집단 (Flow Check, Polysciences Inc.)의 질량을 도시한다 (a). 제조 중에, 이 구체들은 드물게 응집하고 가열에 의해 이량체 및 삼량체가 단일의, 원추형 집합으로 합쳐진다. 단량체 (110.7 pg), 이량체 (213.7 pg) 및 삼량체 (308.1 pg)의 집단에 대한 피크는 히스토그램에서 구별될 수 있다. LCI-측정된, 단량체 집단 질량의 표준 편차는 7.5 pg, 또는 평균의 6.8%로, 제조자가 명시한 사양인 15%를 초과한다. 4개의 상이한 포유동물 세포 타입 집단의 질량 분포 및 6 um 폴리스티렌 구체가 비교를 위해 히스토그램으로 함께 도시된다 (b). LCI에 의해 결정된, 쥐의 적혈구 (RBC) 집단의 평균 질량은 기타 기법에 의해 결정된 발표된 값 (예를 들면, Nie, Z., et al. Analytical Chemistry, 2007. 79: p. 7401-7407; Vaysse, J., et al. Mechanisms of Ageing and Development, 1988. 44(3): p. 265-276; Wirth-Dzieciolowska, E., et al. Animal Science Papers and Reports, 2009. 27(1): p. 69-77; Magnani, M., et al. Mechanisms of Ageing and Development, 1988. 42(1): p. 37-47을 참조한다), 및 마이크로간섭법(microinterferometry)을 이용하는 다른 그룹에 의해 결정된 발표된 값 (예를 들면, Mysliwski, A., et al. Mechanisms of Ageing and Development, 1985. 29(2): p. 107-110을 참조한다)과 비교될 수 있다 (c). Nie 등은 신규한 질량 분석법(mass spectrometric method)을 이용하여 쥐의 RBC의 세포 질량, 및 또한, 종래 광화학 기법(photochemical technique)에 의해 평균 혈구 혈색소 (mean corpuscular hemoglobin: MCH) 질량을 측정하였다 (예를 들면, Nie, Z., et al. Analytical Chemistry, 2007. 79: p. 7401-7407을 참조한다). MCH는 일반적으로 포유동물의 적혈구의 총 세포 질량의 높은 분율(fraction)을 나타낸다. 여러 쥐 종(mouse strain)에 대한 MCH 값의 범위는 잘 확립되어 있다 (예를 들면, Magnani, M., et al. Mechanisms of Ageing and Development, 1988. 42(1): p. 37-47; Mysliwski, A. et al. Mechanisms of Ageing and Development, 1985. 29(2): p. 107-110; Wirth-Dzieciolowska, E., et al. Animal Science Papers and Reports, 2009. 27(1): p. 69-77을 참조한다). 추정치로서 Nie 등에 의해 주어진 MCH 대 총 질량의 비율을 이용하여, 쥐의 RBC MCH에 대한 확립된 값이 측정된 쥐의 평균 RBC 질량과 비교될 수 있다. 추정된 값은 붉은 색으로 나타난다.
도 11은 4개의 상이한 살아있는 또는 신선하게 제조된 세포 타입의 집단의 질량 분포가 LCI에 의해 측정된 것을 도시한다: (a) 쥐의 WEHI-231 B 림프종 세포 (b) 15주령 암컷 C57BL/6 쥐로부터 얻은 적혈구 (RBC), (c) 인간 H929 다발성 골수종 세포, 및 (d) 표준 기법을 이용한 레트로바이러스에 의한 도입(retroviral transduction) 및 입양 세포 전달(adoptive cell transfer)에 의해 C57BL/6 쥐에서 확립된, 1차 골수와 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia: AML) 세포의 혼합물.
도 12는 도 9a에서 주어진 데이터로부터 대표적인 세포에 대한 질량 대 시간 그래프 (a)를 도시한다. 파선은 이 데이터에 맞는 지수적 성장을 나타낸다. 살아있는 세포의 실험에서 측정 변이의 규모를 추정하기 위하여, (각각, D1-D3 및 Tm1-Tm3으로 표시된) 세 개의 모든 Tm-처리된 실행(run) 및 DMSO 대조군 실행으로부터의, 모든 단일-세포 질량 대 시간 데이터를 단순 지수 성장 모델 (mass(t)=m₀*C^t , 상수 C는 1(unity)에 근접)에 맞추고, 잔여 오차를 각 시점에서의 추세와 실제 데이터 간 퍼센트 차이로 계산하였다. 상자 그림에서, 중앙선은 시료의 중앙값을 나타내고, 삼각형은 이 중앙값에 대한 95% 신뢰구간을 나타낸다. 솔리드 박스는 25 및 75 백분위 한계를 나타내고, 위스커는 평균으로부터의 두 표준 편차를 나타낸다. 잔차는 0(zero) 부근에 대칭적으로 분포하고, 25% 내지 75% 사분위수 범위 (IQR)는 0.0126 (D2) 내지 0.027 (D3)로 변화한다. 평균 IQR은 0.02이다.
도 13은 aLCI에 의해 영상화되고 질량이 정량된 여러 단일 세포, 세포 집합, 및 조밀한 콜로니를 도시한다. (a) MDA-MB-231, MCF-7, SK-BR-3, 및 BT-474 유방암 세포주의 공초점 영상. SK-BR-3 및 MDA-MB-231 세포주는 단일 세포 또는 느슨한 집합(loose cluster)으로 성장하는 반면, BT-474 및 MCF-7 세포주는 조밀한 다세포 콜로니로 성장한다. 붉은색은 Alexa 568 Phalloidin 액틴 염색이고 푸른색은 DAPI 핵 염색이다. (b) 각 세포주에 대한 질량 분포의 위상 영상. 단일 세포, 느슨한 집합, 및 조밀한 콜로니가 aLCI에 의해 실시간으로, 재생적으로(reproducibly) 정량화된다. 색상 스케일은 질량 밀도를 pg/um²으로 나타낸다. 스케일 바는 50um이다.
도 14는 aLCI에 의한 단일 세포와 대형 콜로니의 동시 영상화(simultaneous imaging)를 도시한다. (a) 위상 전이는 약 52개의 세포로 구성된 다세포 MCF-7 콜로니와 함께 단일 MCF-7 세포 (555 pg)를 나타낸다. 색상 스케일은 질량 밀도를 pg/um²으로 나타낸다. (b) 모든 세포주에 대한 성장 속도 대 최초 질량의 복합 산포도(composite scatter plot). 상이한 세포주의 세포 및 콜로니 크기의 범위와 성장 속도를 나타내기 위하여 MDA-MB-231 (붉은색), MCF-7 (푸른색), SK-BR-3 (청록색), 및 BT-474 (흑색)이 더해져있다. 콜로니 형성 세포주 (MCF-7 및 BT-474)는 단일 세포에서부터 대형, 다세포 콜로니까지의 범위를 포괄한다.
도 15는 3 내지 5시간 내에서 aLCI에 의해 재생적으로 정량된 트라스트주맙으로 인한 유방암 세포 성장 억제를 도시한다. (a) 집단은 20 ug/ml 트라스트주맙 처리에 의한 각 세포주의 정규화된 질량 대 시간 그래프를 의미한다 (오차 선은 표준 오차를 나타낸다). (b) 7시간까지 SKBR-3 및 BT-474 세포주에 대하여 트라스트주맙 처리로 인한 성장 억제는 매우 유의하게 된다 (p < 0.001). 매시간 성장 속도가 선형 피트로부터 질량 축적 데이터로 계산된다.
도 16은 6시간 차에 수집된 aLCI 질량 축적 프로파일링 데이터와 함께 (컬럼 4) 나타나는 7-일 증식 분석법(7-day proliferation assay) (컬럼 3)에 의해 결정된 트라스트주맙 (헤르셉틴) 민감도를 도시하는 표를 제공한다. HER2 상태는 O’Brien 등에 의해 결정되었다 (예를 들면, Molecular Cancer Therapeutics. 2010, 9, 1489-502을 참조한다).

실시예 1: 본 발명의 구체예에 유용한 예시적인 방법 및 물질

간섭계

살아있는 세포의 간섭계는 이전에 상세하게 기술되었다 (1). 요약하면, 이 시스템은, 일반적인 광학 해상도 (20x 대물렌즈에 있어서 1.16 μm)를 갖는 부수적인 특징뿐 아니라 1 나노미터 눈금 미만인 반사체(reflective object)의 높이 치수(height dimension)의 관찰을 가능하게 하는 20X 0.28NA 마이켈슨 간섭 대물렌즈를 구비한, 변형된 Veeco NT9300 광학 프로파일러(optical profiler) 기반의, 광학 현미경이다. 마이켈슨 간섭계는 빔 스플리터, 간섭 거울로 구성되고 검체 주위의 유체에 의해 유도된 광로 차이를 조정하기 위하여 유체 세포(fluid cell)를 보완한다. 위상 전이 간섭 (phase shifting interferometry: PSI) (14) 방법은 인 시투에서 세포체의 위상 영상(phase image)을 캡처하는데 이용되었다. 측정 중에, 압전 변환기는 광로를 소량 감소시켜 시험용 빔과 기준 빔 간 위상 전이를 유발한다. 이 시스템은 다수의 상이한 위상 전이에서 결과로 얻은 간섭 패턴의 조도(irradiance)를 기록하고 그 후 PSI 알고리즘을 이용하여 이 조도 데이터를 통합함으로써 조도를 위상 파면(phase wavefront) 데이터로 전환한다. 현재 시행된 바와 같이, 자동초점 및 PSI 측정 사이클은 12초가 소요된다. PSI 측정 자체는 1 내지 2초가 소요되고 카메라 프레임 속도 (60 fps)에 의해 제한된다. 이 실험에서, 400 내지 1,000 개의 세포를 포함한 25개 영상의 한 세트가 매 7분마다 캡처되었다. 25개 영상의 각 세트는 본 명세서에 나타낸 최초 5개의 영상으로부터 얻은 데이터에 의해, 수백개의 세포를 포함하고, 따라서 각 실행(run)은 ~80개의 세포를 포함한다. 선택된 각 영상 내의 모든 세포가 측정되었다.

데이터 분석

Veeco NT9300에 고유한 소프트웨어는 위상 영상으로부터 수동으로 선택된 세포의 자동화된 광학적 두께 측정을 가능하게 한다. 광학적 두께는, 본문 내용에 기술된 바와 같이, Ross.와 일치하는 전환 상수(conversion constant)인, α = 1.8x10^-3m³kg^-1를 이용하여 질량으로 전환된다 (9). 각 세포의 경계(boundary)는 픽셀 높이의 히스토그램으로부터 결정된 역치를 이용하여 물체를 배경으로부터 분할하는 알고리즘에 의해 자동적으로 선택되었다 (15). 미가공된 위상 영상의 광학적 두께로의 전환은 일련의 잘 확립된 '위상 펼침(phase unwrapping)' 루틴(routine)을 이용한다 (16). 때때로, 위상으로부터 광학적 두께로의 전환은 음수 한 파장(negative one wavelength)(530 nm)만큼 부정확하고, 이는 세포와 인접한 영역이 실제 값보다 한 파장 미만인 겉보기 광학적 두께를 갖도록 한다. 이 오차는 광학적 두께에서 비-물리적 불연속성으로 용이하게 검출되고, 영향받은 픽셀에 광학적 두께의 한 파장을 다시 더함으로써 교정된다. 이 방법은 현재 완전히 자동화되어 있지는 않다.

측정 오차의 정량

세포 질량 측정을 위한 간섭 현미경의 정확도는 전자기 이론에서 (17, 18), 및 초원심분리 (3, 4, 10-12, 19-21), 단백질 용액, 하이드로겔 및 투명 필름의 굴절계 (22-24), x-선 덴시토미트리(densitometry) (25), 및 전자 현미경 (26-30)을 포함한 다양한 기준 기법에 의해 견고하게 확립되어 있다. LCI 시스템의 정확도 및 안정성을 특징짓기 위하여, 여러 기준(benchmark) 실험을 수행하였고, 이에 대한 상세한 내용은 도 8 내지 11에서 제공된다. 간섭 측정 광로(interferometric optical path) (1.2 옹스트롬; 도 8a)의 시간적 안정성(temporal stability)에 대한 함수인, LCI 질량 측정을 위한 변동 계수(coefficient of variation: CV)의 하한은, ~0.35%인 것으로 결정되었다. 세포를 흉내낸(simulate), 부분적으로 용융된 폴리스티렌 비드의 연속 측정에 있어서 (CV < 0.4%; 도 8b), 및 실제 살아있는 세포의 짧은 반복 측정에 있어서 (CV < 1%; 도 9), 유사한 CV가 결정되었다. 본 발명자는, 유세포 분석기 (Flow Check, Polysciences Inc)에서 보정 표준으로 통상적으로 이용되는 6 μm 직경의 폴리스티렌 구체의 집단을 측정하였고 (도 10a), 이에 대해 집단의 평균 부피와 표준 편차가 제조자에 의해 제공된다; LCI에 의해 결정된 집단 질량 CV는 (6.8%) 제조자에 의해 결정된 것보다 (15%) 상당히 작았다. 또한, 본 발명자는 15주령의 암컷 C57BL/6 쥐로부터 신선하게 수득한 적혈구 (RBC) 집단을 측정하였다 (도 10b-c). 쥐의 RBC는, (광화학적 방법 및 기타 방법에 의해 결정된) 평균 세포 질량 값의 확립된 범위가 존재하기 때문에, 정보를 제공하는 독립적인 표준물질(informative independent standard)로 기능한다. 본 발명자가 얻은, 평균 RBC 세포 질량의 LCI-결정된 값인, 19.4 pg는, 15-21 pg에서 문헌에 나타난 값의 범위와 훌륭하게 일치한다 (9-12, 31). 마지막으로, 비교를 위하여 본 발명자는 다양한 포유동물 세포 타입 집단의 질량을 측정하였다 (도 10b, 11). 이것을 쥐의 RBC 및 폴리스티렌 구의 데이터와 함께 도 9b에 그래프로 나타내었다. 멀티-아워 살아있는 세포 실험(multi-hour live cell experiment)에서 측정 변이의 규모를 추정하기 위하여, (~480개의 세포를 나타내는) 모든 단일-세포 질량 대 시간 데이터를 단순 지수함수 성장 모델(simple exponential growth model)에 맞추었고 (mass(t)=m₀*C^t, 상수 C는 1(unity)에 근접) 각 시점에서 추세와 실제 데이터 간 퍼센트 차이로 잔여 오차를 계산하였다 (도 12a). 잔차는 0 근처에서 대칭적으로 분포되어 있고 (도 12b) 25% 내지 75% 사분위수 범위 (IQR)는 0.0126 (c2) 내지 0.027 (c3)까지 변한다. 평균 IQR은 0.02였다. 종합하면, 이 결과는 0.5-1.0%의 차수상 측정 반복성(measurement repeatability on the order)의 하위 경계(lower bound)와 2.0-3.0%의 외부 경계(outer bound)를 나타낸다. 살아있는 세포의 단기 및 종적 측정 간의 주요 차이는 시간 규모(scale of hour)에서 발생하는 형태 변화이다. 이는, 이전의 연구가 이 오차가 상대적으로 작을 것이라고 제시했음에도 불구하고 (3), (1) 세포 경계를 분할하는데 있어서 작은 오차, (2) '둥근(rounded)' 세포의 가장자리에 존재하는 인접 배치 주변부(closely spaced fringe)의 광학적 '평균화(averaging)', 및 (3) 질량-대-광학적 두께 상수인 α 값에서의 잠재 변화(potential change)로부터, 통합된 광학적 두께에서의 추가적인 변이를 초래할 수 있다. (1) α는, 심지어 결정화 단백질 용액의 한계까지도, 농도에서의 변화에 의해 영향받지 않고 (9), (2) α는 특정 위치에서 빛과 상호작용하는 질량을 반영하며 (9-12, 31), 따라서, 세포가 성장함에 따라 관측 시야 내에 세포가 차지하는 영역의 크기에 영향받지 않고, (3) α 값은 세포에서 발견되는 광범위한 물질을 통해 0.0018에 근접하게 유지된다 (32).

세포주 및 조직 배양

H929 인간 다발성 골수종 세포를 10% 정의된(defined) 우태아 혈청 (HyClone)과 항생제가 보충된 RPMI 1640 성장 배지에서 5% CO₂ 중에 37℃에서 유지시켰다. 관찰 챔버는 플라스틱 선반의 정상부에 배치된 2x2 cm 실리콘 기판에 의해 직경이 4.5 cm이고 1.5 cm 깊이를 가져, 실리콘은 유체의 표면의 정상부에 근접하게 존재하였다. 균일한 두께의 시료 챔버를 제작하기 위하여, 3개의 600 μm 스테인레스 스틸 비드 (Salem Specialty Ball Company, Canton, CT)의 정상부에 받쳐(rest)짐으로써, 실리콘 표면으로부터 분리된 한 조각의(a piece of) 광학 유리 (BK7 glass, Quartz Plus, Inc., Brookline, NH)에 의해 셀의 영상화를 완료하였다. 5% CO₂ 기체가 주입된(bubbled with) 배지를 0.5 mL/min의 속도로 연동식 관류 펌프(peristaltic perfusion pump)를 이용하여 인큐베이션 챔버를 통해 계속하여 흘려주었다. 시료 챔버 상에 입사된 530 nm 파장의 LED 조명 (Luxeon Star LED, Brantford, Ontario)은 1.2 mm 직경의 조명 스팟에 분산되어 있는 15 μW의 전력을 가졌다. 실험 기간의 상한이 결정되지 않았음에도 불구하고, 외부 자극에 대한 세포의 반응을 이 구조에서 7시간 동안 측정하고, 12시간까지 비동요 배양(unperturbed culture)을 관찰하였다.

약물 처리, 세포 주기 분석, 및 핵산 분리

H929를 6-well 배양 플레이트에 1x10⁶cells/well의 밀도로 파종(seed)하였다. 세포를 LCI의 관찰 챔버에 플레이팅하기 전, 1 μL의 DMSO 중 투니카마이신 (T7765; Sigma-Aldrich), 또는 단독의 DMSO를 10 mg/ml, DMSO/media (1:1000 희석)의 농도로 배지에 첨가하였다. 실험 시스템을 안정화시키기 위하여, 즉, 배지 순화(culture acclimation), 온도 안정화 등, 세포를 관찰 챔버에 플레이팅하고 1시간 후에 질량 측정을 시작하였다. 세포 주기 분석에 있어서, 각 시점으로부터 세포를 수집하고 프로피디움 아이오디드(propidium iodide)를 함유한 저장성(hypotonic) DNA-염색용 완충용액으로 인큐베이션하고, 후에 유세포 분석기에 의해 분석하였다. 각 시점에 대하여 트리졸(Trizol) 시약 (Invitrogen)을 이용하여 RNA를 추출하였다.

역전사 , RT - PCR , 및 정량적 RT - PCR

Superscript III first strand cDNA 합성 키트 (Invitrogen)를 이용하여 oligo(dT) 프라이머에 의해 3 μg의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. XBP1 절단된(spliced) 동형(isoform) 및 절단되지 않은(unspliced) 동형에 대한 RT-PCR을 Platinum Taq (Invitrogen)을 이용하여 어닐링 온도 58℃에서 25회 동안 수행하였다. CHOP (DDIT3) mRNA에 대한 정량적 RT-PCR을 기술된 바와 같이 SYBR green 실시간 PCR 키트 (Diagenode) 및 Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) 7700 서열 검출기를 이용하여 수행하였다 (33). 표준화 대조군으로 36b4 발현에 대하여 시료를 분석하였다. 프라이머 서열은 요청에 의해 이용가능하다.

결과 및 논의

이전에는 동시 측정된 ~100개 세포의 전체 집단에 대하여 장시간 규모 (수 시간)로 세포-대-세포 기반에서 질량 축적 동역학(mass accumulation dynamic)이 보고된 적은 없었다. LCI 질량 프로파일이, 약물 반응과 같은, 외부 세포 자극에 대한 반응을 신속하게 결정할 수 있다는 가설을 검증하기 위하여, H929 다발성 골수종 세포를, 단백질 당화 억제제인 약물 투니카마이신 (TM)에 노출시키고 (34), 5시간 동안 계속해서 질량을 측정함으로써 TM-처리된 세포의 성장 프로파일을 미처리 대조군 세포와 비교하였다.

H929 세포의 질량의 최초 분포는, 200 내지 700 pg 범위를 갖는, 대략 대수 정규 분포(log normal)라는 것이 결정되었다. 세포의 대다수는 >200 pg 및 <400 pg의 질량을 가진 반면, 적은 부분 (36%)은 500 pg를 초과하는 질량을 가져, 평균보다 훨씬 크다. 처리 집단 및 미처리 집단 모두 성장을 나타내었으나, 질량 축적 속도는 처리된 세포에서 훨씬 더 낮았다 (도 3). 두 집단의 성장 프로파일은 분명하게 이질적이고(heterogeneous) (도 3 a-b), 두 집단에서, 소수의 세포는 질량에서 강력한 증가 (+15% 성장)을 나타내거나, 질량 축적이 거의 없거나 내지는 전혀 없었다 (<5% 성장). 처리 집단의 성장 억제는 2시간 이내에 나타나고, 4번째 시간(fourth hour)까지 즉시 눈에 띈다 (도 3 c-d). 그러므로, 세포 약물 반응에 대한 전체 집단 검출 및 정량은 처리 후 수시간 내에 수득되었다. 5시간에 처리군 및 미처리군 내에서 성장 속도에서의 변이 (도 3 c-d)는 동일 시간대에 처리 배양물 및 미처리 배양물 간 변이의 규모에 근접하였다. 이 실험은, 마스터 스톡(master stock)으로부터 취해진 별개의 서브컬쳐에 의하여, 별도의 날짜에 수행되었다. 그러므로, 그들은 '기술적인(technical)' 복제물이 아닌 '생물학적(biological)' 복제물이고, 행동에서의 차이는 생물학적 변이를 반영할 가능성이 있다. 본 발명자는 제어된 시료(controlled sample)에 대한 기술적 복제물을 이용하여 측정 오차를 <3% CV인 것으로 추정하였다. 그럼에도 불구하고, 각 처리 시료와 각 미처리 시료 간 정규화된 최종 질량 (최종/최초)에서의 차이는 p < 0.05로 통계적으로 유의하다는 것에 주목한다 (도 3 c-d). 이것은 LCI가 세포의 처리 및 미처리 세포 집단 간 성장 속도에서의 차이를 검출할 수 있다는 증거를 제공한다.

단일 세포 수준에서, 개별 세포의 성장 속도는, 실험 오차 내에서, 처리 및 미처리 세포에 대하여, 세포 질량과는 크게 무관하다 (도 7). 예외는 처리 집단 Tm1으로, 세포 서브집단이 보다 클수록 성장이 느려지는 통계적으로 유의한 선형 추세를 나타내었다. 이 차이에 대한 원인은 불분명하다. 흥미롭게도, 특정 질량 분율(mass fraction) 내의 성장 속도의 분포(spread)는 측정 오차에 의해 완전히 설명될 수 없어서, 이 변이의 생물학적 기원을 또한 암시한다. 성장 대 질량 데이터에 대한 선형 최소 제곱 피트의 잔차의 놈(norm of the residuals of a linear least squares fit to the growth versus mass data)으로 취해진, 이 변이는 3.15.8%로부터의 범위인 반면 (도 12), 질량 측정 오차는 <3% CV로 추정된다 (방법에서 오차의 논의를 참조한다).

질량 축적의 동역학과 생화학적 신호를 연결시키기 위하여, 처리 집단에서 PCR에 의해 분자 마커를 프로파일링하고 세포 주기 분석을 수행하였다. 처리 및 미처리 집단 간 성장 속도의 차이는, 처리 집단에서, 전사인자 CHOP 및 XBP1의 절단 형태('XBP1-s')의 상향-조절과 동시에 일어난다 (도 4 a-b). CHOP 및 XBP1-s는, 단백질 접힘을 보조하는 분자 샤페론의 증가된 생산, 및 잘못-접힌 단백질의 가속화된 분해를 통해 (소위, 미접힘 단백질 반응(unfolded protein response), UPR, 및 ER-관련 단백질 분해, ERAD, 경로), 소포체에서 단백질 잘못-접힘(mis-folding)의 영향을 완화시키는 역할을 하는 호스트 유전자를 활성화시킨다 (35). 이것은 TM 작용의 알려진 기작과 일치한다 (34). UPR 및 ERAD 분자 경로는 다발성 골수종을 포함한, 광범위한 질환에서 치료적 개입(therapeutic intervention)을 위한 신흥 타깃이다.

XBP1은 다발성 골수종 세포에서 세포 성장과 분화의, 상황 의존성(context dependent) 양성 또는 음성 조절자이다 (34). 그의 양극성 전사 포텐셜의 분자 동역학은 잘 이해되어져 있지 않다. 본 실험의 상황에서, XBP1 mRNA 스플라이싱의 유도는 질량 축적을 늦추는 것과 관련되나, 세포 수축(cell shrinkage) 또는 아폽토시스와 관련되어 있지 않다. 이러한 세포 질량의 시간 분해(time-resolved), 비-파괴 측정은, 면역조직화학법 또는 qPCR을 포함한 종래 기법을 통해 분석되는, 상충하는(conflicting) 증식 촉진 및 항-증식 분자 신호의 해석에 큰 도움이 된다. 세포 주기 데이터는, 세포 주기 정지와 일치하는, G2/M 기 집단에서의 신속한 감소 및 G1/G0 집단에서의 상응하는 증가를 나타낸다 (도 4c). 이와 같은 이동은 TM 노출 3시간 후에 표명되어, 세포의 50%를 G1/G0에 처리 5시간 종결시까지 남겨두었다. 또한, 이것은 UPR 경로의 활성화가 세포 주기 정지를 초래한다는 관찰과 일치한다 (35, 36).

분열하는 세포의 질량 범위를, 개별 분열을 관찰하고 모세포 및 딸세포의 질량을 직접 측정함으로써 결정하였다. 총 ~600개의 세포 중에서, 모든 실험에 걸쳐서 28회의 세포 분열이 관찰되었다. 분열 횟수는 미처리 집단에 유리하게 편중되어 18:11이었다. 이것은 그 집단에서 관찰된 더 높은 성장 속도와 일치한다. 세포가 분열하는 질량이 엄격하게 조절되었고, 처리 및 미처리 집단에서 유사하였다 (도 5a). 분열에서 질량의 중앙값은, 각각 250 pg (+/- 40pg)의 질량 중앙값을 갖는 두 개의 생성된 딸세포에 의하여, 515 pg (+/- 75 pg)였다. 이 결과는 질량 값을 통해 집단 내 개별 세포가 세포 주기의 초기, 중기 및 후기에 존재할 것이라는 추론을 가능하게 한다. 대부분의 경우 딸세포에 대한 질량 분율이 ~50/50인 반면, 세포 분열의 소수는, 두 개의 딸세포 중 더 작은 것이 모세포 질량의 45% 미만을 유지함으로써, 크게 비대칭적이었다 (도 5b). 비대칭적 세포 분열을 겪는 두 개의 세포의 질량 맵(mass map)이 도 5c에 나타나 있다.

단일-세포 질량 측정을 위한 기타의 확립 및 출시된 방법을 뛰어 넘는 LCI의 분명한 이점이 존재한다. 비-부착성 세포를 요구하는 중공보(hollow cantilever) MEMS 질량 측정 장치와 달리 (5, 6), LCI는 부착성 세포 또는 비-부착성 세포와 동등하게 양립가능하다 (도 6). 부착성 세포에 의한 작업 능력은, 질량 축적/분포 및 세포:기질 상호작용 간의 관계를 탐지하는데 있어서, 및 사람의 악성종양의 벌크(bulk)를 형성하는 상피 세포 또는 기질 세포를 평가하는데 있어서, 절대적으로 중요하다. 또한, LCI는 질량 프로파일을 약물 개발에서 통상적으로 이용되는 세포 이동, 운동성, 및 조직 침입성 분석의 전체 분류와 연결시키기 위한 탁월한 접근법이다. 간섭 현미경은 검체에 대한 완전한 광학적 접근을 허용하고, 이는 고해상도 광학 현미경 사진(light micrograph) 및 형광 영상이 용이하게 수득되는 것을 의미한다. 이것은, 동시 평가를 위한, 질량 프로파일링과 세포 생물학에서 이용되는 형광 리포터 분석의 대규모 설비(armamentarium)의 조합된 이용을 가능하게 한다. 또한, LCI는 정량 추적(quantification tracking) 및 세포 분열 동안, 및 그 후의 개별 세포 질량의 정량화를 입증한다. 이것은, 처음으로, 예를 들면, 줄기 세포에서 질량 분배(mass partitioning)의 넓은 스펙트럼 프로파일링을 직접적으로 가능하게 할 것이다.

LCI는 대용량이고 시간에 따라 동일한 세포의 종적 측정을 가능하게 한다; 또한 그것은 대량 병렬되어, 수백 개의 종적 측정을 동시에 가능하게 하고 변화하는 조건으로 인한 실험-내 오차를 감소시킨다. 그러나, 때때로 위상으로부터 광학적 두께로의 전환은, 2π를 초과하는 위상 전이에서의 모호성으로 인하여, 음수 한 파장 (530 nm) 만큼 부정확하다. 이 상황은 세포와 인접한 영역이 실제 값보다 한 파장 미만인 겉보기 광학적 두께를 갖는 것을 초래한다. 이 오차는 광학적 두께에서 비물리적 불연속성으로 용이하게 검출되고, 영향받은 픽셀에 광학적 두께의 한 파장을 다시 더함으로써 교정된다. 이 교정 방법은, 이 문제를 해결하는 작업 내용(body of work)이 문헌에 존재함에도 불구하고, 현재 완전히 자동화되어있지 않다 (16).

외부 자극에 대한 세포의 반응을 7시간 동안 측정하였고, 12시간까지 비동요 배양을 관찰하였다. 원칙적으로, 세포가 엄격히 통제된 배양 조건하에서 수일 동안 생존을 유지하므로, 훨씬 더 긴 기간 동안 측정을 계속할 수 있다. LCI와 대안적인 접근법에 공통적인 한 가지 한계점은 (5, 7, 8), 세포가 관찰 챔버 내로 도입된 후, 또는 상이한 온도 또는 밀도를 갖는 배지가 도입된 후 시스템이 안정화되는데 요구되는 시간이다. 본 실험에서, 요구되는 경우 정착 시간(settling time)이 적어도 2배만큼 감소될 수 있음에도 불구하고, 보수적으로(conservatively) 1시간의 정착 시간을 허용하였다.

요약하면, 대용량 LCI 질량 프로파일링은, 의학적으로 관련있는 약물 반응과 같은, 단일-세포의, 집단 기반의 환경적 동요에 대한 반응을 정량하기 위한 민감하고 정확한 메커니즘이다.

예를 들면, 하기 문헌에 개시된, 기술분야에 알려져 있는 다양한 방법과 물질이 본 발명의 구체예를 제조 및/또는 이용하는데 적합할 수 있다.

상기 본문 내용에서 확인되는 괄호 안의 참고문헌( REFERENCES IDENTIFIED IN ABOVE TEXT IN PARENTHESIS )

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(36) Brewer, J.W., L.M. Hendershot, C.J. Sherr, and J.A. Diehl, Mammalian unfolded protein response inhibits cyclin D1 translation and cell-cycle progression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999. 96(15): p. 8505-8510.

실시예 2: 질량 프로파일링에 의한 단일 유방암 세포 및 집합된 유방암 세포의 실시간 약물 민감도 정량

앞서 논의된 바와 같이, 살아있는 세포의 질량 프로파일링은 시간에 따른 세포 질량에서의 피코그램-규모의 변화를 통해 치료제에 대한 반응을 신속하게 정량하기 위한 유망한 신규 접근법이다. 질량 프로파일링의 유의한 장벽은, 단리된 단일 세포보다는 환자-유래 시료 또는 조직 배양물에 더 일반적으로 존재하는 다형성(pleomorphic) 세포 집합 및 집괴에 대한 기존 방법의 처리 불능이다. 본 명세서에서, 단일 세포 및 콜로니를-형성하는 인간 유방암 세포주의 HER2-지향된(directed) 단일클론항체인 트라스트주맙 (헤르셉틴)에 대한 민감도의 신속하고 정확한 정량자(quantifier)로, 자동화된 살아있는 세포의 간섭법(automated Live Cell Interferometry: aLCI)에 대한 증거가 제공된다. 상대적 민감도는 종래의 증식 분석법에 의해 가능한 것보다 10 내지 100배 더 빠른 것으로 결정되었다. 집단화된 시료 평가에 있어서 aLCI의 진보성 및 속도는, 체외에서(ex vivo) 단기간 동안만 생존이 가능하고 세포 응집체 또는 집합의 형태로 존재할 가능성이 있는 환자-유래의 고형 종양 시료의 치료적 반응에 대하여 이용될 수 있다.

미국에서 2011년에, 230,480명의 여성이 유방암으로 진단받았고 39,520명의 여성이 이 질환에 의해 사망하였다 (예를 들면, R. Siegel, et al. CA Cancer J Clin. 2011, 61, 212-36을 참조한다). 이 보편적인 악성 종양에 대한 임상 경과 및 결과는, 통상적으로 종양 서브타입, 임상 등급 및 단계, 및 에스트로겐 (ER), 프로게스테론 (PR), 및 증폭된 HER2 세포 표면 수용체의 발현을 포함한, 임상 평가의 조합에 의해 안내되는 치료법에도 불구하고, 가변적이다 (예를 들면, M. Ignatiadis, et al. Clin Cancer Res. 2009, 15,1848-52; M. Ignatiadis, et al. Nat Rev Clin Oncol. 2012, 9, 12-4을 참조한다). 불행하게도, ER, PR, 및/또는 증폭된 HER2 표면 수용체를 발현하는 유방암은 이들 수용체-결합 경로를 표적으로 하는 치료법에 항상 반응하지는 않아서, 이들 바이오마커 단독 발현 분석을 치료 결정에 불충분하게 만든다. 예를 들면, 증폭된 HER2 발현을 갖는 유방암은 종종 인간화된 단일클론항체 트라스트주맙 (헤르셉틴)에 대해 반응하지 않는다 (예를 들면, JA. Wilken, et al. Primary trastuzumab resistance: new tricks for an old drug. In: Braaten D, editor. Toward Personalized Medicine for Cancer 2010. p. 53-65을 참조한다). 또한, 초기에 반응하는, 수용체-양성 종양은 시간에 따라 표적화된 치료에 대하여 불응성이 되고, 이는 HER2-증폭된 유방암뿐 아니라 기타 유형의 여러 암에 대하여 발생한다 (예를 들면, R. Nahta, et al. Breast Cancer Research. 2006, 8을 참조한다).

유방암과 기타 암에서 현재 바이오마커 접근법의 공통적인 특징 및 실패는, 그들의, 특정 환자에 대한 특정 제제의 종양 세포의 반응을 직접 평가하지 않는, 일반적으로 고정된, 스냅샷-인-타임(snapshot-in-time) 대용성이다. 이용가능한 경우, 보다 우수한 접근법은 실시간 모니터링에 의해 종양이 일련의 후보 치료법에 어떻게 반응하는지를 신속하게 결정하고, 그 후 특정 환자의 질환에 대하여 가장 효과적인 제제(들)를 선택하는 것일 수 있다. 살아있는 세포에 대한 실시간 질량 프로파일링은 우수한 접근법을 제공할 수 있는 신규하고 재현가능한 생물물리학적 측정 양식이다. 살아있는 세포의 질량 프로파일링은 주로 광학적 방법 (예를 들면, G. Popescu, et al. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2008, 295, C538-C44; B. Rappaz, et al. Optics Express. 2005, 13, 9361-73; J. Reed, et al. Biophys J. 2011, 101,1025-31; J. Reed, et al. ACS Nano. 2008, 2, 841-6을 참조한다) 또는 마이크로-제작된(micro-fabricated) 센서 (예를 들면, M. Godin, et al. Applied Physics Letters. 2007;91; K. Park, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010, 107, 20691-6를 참조한다)를 이용하여 달성되고, 성장-억제성 또는 세포독성 제제에 대한 세포 반응의 검출을 포함한, 변화하는 외부 환경에 노출된 세포 집단에서 단일-세포 건조 질량 변화의 신속하고, 연속적인 정량을 산출할 수 있다 (예를 들면, J. Reed, et al. Biophys J. 2011, 101,1025-31을 참조한다). 불행하게도, 기술적인 한계로 인해, 살아있는 세포의 질량 프로파일링은, 박테리아, 효모, 및 림프구와 같은, 공간적으로 분리된 단일 세포로 존재하는 세포 타입에 제한되었다. 이것은, 유방암에서와 같은, 고형 종양의 치료적 반응 검사에 있어서 질량 프로파일링의 효율적인 이용에 대한 실질적인 장애물이다. 일반적으로, 절개된(dissected) 고형 종양 시료는 기계적으로 분리된(disaggregated) 경우조차, 순수한 단일 세포로서 보다는, 크고 작은 다세포 집괴, 시트(sheet), 또는 구체의 조합으로 존재한다. 또한, 고형 종양을 단일세포로 분리시키는데 요구되는 교반은 세포에 손상을 가할 수 있고, 악성종양 표현형의 유지에 중요하고 제제 반응성을 평가하는데 요구될 수 있는 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 파괴한다 (예를 들면, BE. Miller, et al. Cancer Res. 1981, 41, 4378-81; MS. Wicha, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982, 79, 3213-7을 참조한다).

본 명세서에 개시된, 자동화된 살아있는 세포의 간섭법 (aLCI)으로 지칭되는, 질량 프로파일링 접근법을 이용하여, 이 억제성 장벽이 극복되었다. aLCI에 의하여, 단일 세포로 및 대형 콜로니 또는 집합으로 배양액에서 성장하는 유방암의 치료적 반응 동역학을 프로파일링하였다. 이들 조직화된 콜로니는 50개 세포까지의 크기를 갖고, 또한 훨씬 더 큰 콜로니는 정확하게 측정될 수 있다. 6시간 동안 트라스트주맙에 노출된 4개의 유방암 세포주로부터 얻은 세포 또는 콜로니 집단의 성장 동역학을 정량화하였다. 이 연구에서, aLCI는 어느 유방암 세포주가 증폭된 HER2 표면 수용체를 발현하는지 또는 어느 수준에서 발현하는지에 대하여 선행 지식없이 수행되었다. 트라스트주맙-민감성 및 저항성 종양은 매우 높은 정확성을 갖는 단일-세포/단일-콜로니 질량 축적을 정량함으로써 신속하게 식별되었다. 특히, aLCI는, 세포 증식 분석법과 같은 종래 기술을 이용한 경우에 가능한 것보다 민감성 및 저항성 세포 및 콜로니를 약 로그-차수(log-order) 더 신속하게 확인하였다. 속도 및 민감도에 있어서의 이러한 개선은 민감도 대비 불응성 HER2-증폭된 유방암 반응을 평가하는 것을 가능하게 한다. 또한, 종종 파손되기 쉬운, 환자 유래 세포가 단기간 동안에만 생존가능하고, 모두 고형 종양 타입이 아닌 경우 다수의 경우에, 시료가 단일 세포와 응집된 집괴의 불균일 혼합물의 형태로 존재할 가능성이 가장 높은 경우에, 임상으로의 이동(translation)을 가능하게 한다.

4개의 인간 유방암 세포주에 대한 질량 반응 프로파일링이 20 ug/ml 임상 등급의 트라스트주맙의 공동-인큐베이션에 의해 aLCI를 이용하여 실시간으로 수행되었다. 각 세포 타입에 있어서, 배양 배지만을 함유하는 대조군 웰(well)과 트라스트주맙을 함유하는 처리 웰을 동시에 측정하였다. 두 개의 세포주인 BT-474 및 SK-BR-3은, 높은 수준의 표면 수용체 발현을 갖는 증폭된 HER2를 갖고, 5 내지 7일 증식 분석법에 의해 평가된 바와 같이 인 비트로에서 트라스트주맙에 차등적으로 민감한 반면, 다른 두 개의 세포주인 MCF-7 및 MDA-MB-231은, 정상 수준에서 HER2 수용체를 발현하고 트라스트주맙 저항성을 갖는다 (예를 들면, NA. O'Brien, et al. Molecular Cancer Therapeutics. 2010, 9, 1489-502을 참조한다). 중요하게도, 이들 세포주는 매우 상이한 형태학을 가지며 성장한다. MDA-MB-231 및 SK-BR-3 세포주는 단일 세포로 또는 느슨하게 분리된 군집으로 성장하는 반면, MCF-7 및 BT-474 세포주는 밀집된 다세포 콜로니로 성장한다 (도 13). 단일 MCF-7 세포 (질량 ~5 x 10² pg)와 대형 콜로니 (~22 x 10³ pg) 간의 상대적인 규모는 질량에서 44배 차이를 포함한다 (도 14).

수백 개의 개별 세포 및 콜로니의 질량을 연속적으로 7시간 동안 정량하였다. 30분 간격으로 각 세포주에 대한 평균 질량 축적 속도를 처리군 및 대조군에서 전체 집단의 반응을 특징짓는 그래프로 나타내었다 (도 15a). HER2 정상 발현 세포주인 MCF-7 및 MDA-MB-231의 처리 시료 및 대조 시료는 시간에 따라 질량에서 동일한 증가를 나타내었다. 대조적으로, HER2 증폭된 고발현 세포주인 BT-474 및 SK-BR-3의 처리 시료 및 대조 시료의 성장 속도는 ~4시간의 처리에서 나뉘기 시작하였다. 트라스트주맙 민감성 세포주인 SK-BR-3 및 BT-474는, 성장 속도에서 매우 유의한 차이 (p< 0.001)를 나타낸 반면, 비민감성 세포주인 MCF-7 및 MDA-MB-231은 유의한 차이를 나타내지 않았다 (도 15b). BT-474 세포주는, 6시간 후 대조군 대 처리군의 질량 배수 변화가 각각 1.70 +/- 0.39 및 1.24 +/- 0.10을 가져, SK-BR-3 세포주에서보다 트라스트주맙에 대하여 더 반응성이 높았다 (평균 +/- 표준 오차; 도 16). 두 민감성 세포주 중, SK-BR-3은 주로 단리된 단일 세포로 존재하는 반면, BT-474는 작은 콜로니로 성장하여, 콜로니 형성이 트라스트주맙 민감성 또는 저항성을 예측하거나 그에 요구되는 것이 아니라는 것을 나타낸다. 또한, aLCI-측정된, 트라스트주맙에 대한 반응을 종래의 복수-일 세포 계수 성장-억제 분석법(multi-day, cell counting growth-inhibition assay)에 의해 결정된 것과 비교하였다. 모든 4가지 경우에서, 6시간 동안 aLCI에 의해 측정된 트라스트주맙 민감성은 3 내지 7일 동안 세포 계수에 의해 측정된 것과 일치하였다 (도 16).

이 결과는, aLCI를 통한 살아있는 세포의 정량화가, 검사될 세포의 물리적 구조 또는 결합에 무관하게 유방암에서 트라스트주맙에 대한 생물학적 반응성을 신속하고 민감하게 검출할 수 있다는 것을 나타낸다. MEMS 마이크로-공진기와 같은, 기타의, 최근에 개발된, 살아있는 세포의 질량 프로파일링 방법은, 마이크로-공진기의 구조에 의존하여, 순간적으로 높은 정확도로 단일 세포의 질량을 측정할 수 있다 (예를 들면, M. Godin, et al. Applied Physics Letters. 2007;91; K. Park, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010, 107, 20691-6을 참조한다). 그 접근법의 문제점은 충분한 민감도를 달성하기 위하여, 공진기의 활성 영역이 대략 마이크론 또는 그 보다 더 작아야만 하고, 이는 불가능하지는 않지만, 대부분의 고형 종양 타입에 대해 발생하는, 단일 세포와 보다 큰 다세포 콜로니의 혼합물의 연속적인 측정을 매우 어렵게 만든다는 점이다.

일반적으로, aLCI를 포함한 정량적인 위상 광학 현미경 접근법은, MEMS-기반 접근법과 동등한 질량 측정 정밀성 및 정확성을 갖고 (예를 들면, G. Popescu, et al. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2008, 295, C538-C44; J. Reed, et al. Biophys J. 2011, 101,1025-31을 참조한다), 세포 집합 및 집괴의 연구에 대한 그의 적용은, 근본적인 물리적 한계에 의하기보다는, 고용량 위상 영상화와 관련된 실제적인 어려움에 의해 제한되었다. 미가공 위상 영상의 질량 정보로의 전환은, 특히 세포 집합 및 복잡한 내부 구조와 조명 파장에 비하여 큰 광학적 두께를 갖는 물체의 경우, 계산적으로(computationally) 도전을 요구할 수 있다 (예를 들면, D. Ghiglia, et al. Two-Dimensional Phase Unwrapping: Theory, Algorithms, and Software: John Wiley & Sons; 1998을 참조한다). 응집된 세포 집괴, 시트, 및 구체에 대한 치료적 반응의, 증가된 분석 및 정량 속도는 제제 선택 및 고형 종양 치료에서의 진단에 있어서 흥미로운 신규한 기회를 제공한다.

재료 및 방법

세포주 및 배양

BT-474, SK-BR-3, MDA-MB-231, 및 MCF-7 유방암 세포주를 American Type Culture Collection (Rockville, MD)으로부터 수득하였다. 모든 세포주를 10% 우태아 혈청 (Omega; Tarzana, CA) 및 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 및 L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 (Cellgro; Manassas, VA) 성장 배지에 유지시켰다.

약물 치료

임상 등급의 트라스트주맙 (헤르셉틴) (Genentech; South San Francisco, CA)을 20 ug/ml으로 사용하였다.

증식 분석법

5 x 10⁴개의 세포를 12-웰 플레이트에 파종하고 처리 시작 전 2일 동안 부착 및 성장시켰다. 20 ug/ml 헤르셉틴에 의한 처리 0, 3, 5, 및 7일차에, 세포를 트립신처리하고 계수하였다. 폴드 변화(fold change)를 계산하기 위하여, 대조군 및 약물 처리된 시료에 대하여 배가 시간(doubling time)을 결정하고 (DT = t*(log(2)/log(N_t/N₀))) 폴드 변화를 DT_drug/DT_ctrl로 취하였다. DT = 배가 시간, t = 시간, N_t = 시간 t에서 세포의 개수 또는 질량, N₀ = 시간 t = 0에서 세포의 개수 또는 질량.

공초점 영상화

세포를 챔버형 커버글라스(chambered coverglass) 상에 파종하고 밤새도록 부착시켰다. 세포를 1 x PBS, pH 7.4 중 3.7% 포름알데히드에 의해 고정시키고 0.1% Triton-X에서 투과성을 증진시켰다(permeablized). 그 후 시료를 Alexa 568-팔로이딘 액틴 염색 (Invitrogen; Grand Island, NY) 및 DAPI에 의해 인큐베이션하였다. Zen 2010 소프트웨어를 이용한 Zeiss LSM 780 CCD 카메라에 의해 공초점 영상을 촬영하였다.

간섭계

살아있는 세포의 간섭계는 이전에 기술되었다 (예를 들면, J. Reed, et al. Biophys J. 2011, 101, 1025-31; J. Reed, et al. ACS Nano. 2008, 2, 841-6; J. Reed, et al. Nanotechnology. 2008, 19). 이 시스템은 20X 0.28NA 마이켈슨 간섭 대물렌즈를 갖는, 변형된 Bruker NT9300 광학 프로파일러 (Bruker; Tucson, AZ)로 구성되어 있다. 마이켈슨 간섭계는 빔 스플리터, 기준 거울을 포함하고, 시료 주위의 유체에 의해 유도된 광로 차이의 이유가 되는 유체 세포를 보완한다. 위상 전이 (PSI) 방법은 세포 시료의 위상 영상을 캡처하는데 이용되었다. 다중-시료 영상화를 가능하게 하기 위하여, aLCI는 각 시료 웰에서 커버 글라스 광로 길이에서의 작은 차이에 대하여 간섭계 기준 거울을 조정하기 위한 작은 모터를 이용한다.

데이터 분석

Matlab (Mathworks Inc., Natick, MA)에서 작성된, 관습화된(custom), 다단계 프로그램을 이용하여 영상 분석을 수행하였다. 제1 단계는, Bruker Vision software (Bruker Nano Inc., Tuscon, AZ)에 의해 이용되는 Goldstein 위상 펼침 알고리즘에 의한 처리 후 남아있는 위상-오차 (정량적 위상 영상화에 내재하는 모호성으로 인한 정수 파장 오차)를 제거하기 위한 위상-펼침 단계였다. 이 알고리즘은 배경 수준 미만의 정수 파장 점프(integer wavelength jump) 및 비물리적 일탈(excursion)을 제거하기 위하여 각 픽셀로부터 떨어진 다중 랜덤 워크(multiple random walk)를 이용한다. 제2 단계는 국부 적응형 중앙값 필터(local adaptive median filter)와 워터쉐드 변환(watershed transform)의 조합을 이용하여 각 영상을 세포 또는 콜로니 물체로 분할하는 것이다. 마지막으로, 영상 분할에 의해 확인된 물체는 IDL 입자 추적 코드(particle tracking code)에 기반하여, Daniel Blair 및 Eric Dufresne에 의해 Matlab을 위하여 개조된 입자 추적 코드를 이용하여 추적되었다 (예를 들면, JC. Crocker, et al. Journal of Colloid and Interface Science. 1996, 179, 298-310을 참조한다).

Claims

시험용 물질에 대한 세포의 반응을 관찰하는 방법으로서:
(a) 하나 이상의 세포를 상기 시험용 물질을 포함하는 제1 환경에 배치하는 단계;
(b) 살아있는 세포의 간섭법(live cell interferometry)을 수행하여 상기 제1 환경 내 세포의 질량에 비례하는 측정치(measurement)를 결정하는 단계로, 여기서 상기 살아있는 세포의 간섭법은 상기 세포를 통해 전파하는 광의 시험용 빔(test beam)과 광의 기준 빔(reference beam) 간 프랙셔널 위상 전이(fractional phase shift)를 측정하는 단계, 측정되는 세포(들)의 경계(boundary)를 결정하는 단계, 및 이 경계를 사용, 상기 세포의 면적에 대해 상기 프랙셔널 위상 전이를 적분(integration)하여 상기 측정치를 제공하는 단계를 포함하고;
(c) 살아있는 세포의 간섭법을 수행하여 상기 시험용 물질을 포함하지 않는 제2 환경 내 세포의 질량에 비례하는 측정치를 결정하는 단계, 여기서 상기 살아있는 세포의 간섭법은 상기 세포를 통해 전파하는 광의 시험용 빔과 광의 기준 빔 간 프랙셔널 위상 전이를 측정하는 단계, 측정된 세포(들)의 경계를 결정하는 단계, 및 이 경계를 사용, 상기 세포의 전체 면적에 대해 상기 프랙셔널 위상 전이를 적분하여 상기 측정치를 제공하는 단계를 포함하고; 및
(d) 단계 (b)에서 결정된 측정치와 단계 (c)에서 결정된 측정치 간 차이가 시험용 물질에 대한 세포의 반응을 나타내는, 단계 (b)에서 결정된 측정치를 단계 (c)에서 결정된 측정치와 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 방법은 처리의 4번째 시간(fourth hour)까지 시험용 약물에 대한 상기 세포의 반응을 검출하기에 충분한 민감도를 제공하는 것인, 시험용 물질에 대한 세포의 반응을 관찰하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 방법은 처리 2시간 이내에 시험용 물질에 대한 상기 세포의 반응을 검출하기에 충분한 민감도를 제공하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 살아있는 세포의 간섭법을 수행하여 상기 제1 환경 내 세포의 질량에 비례하는 측정치를 결정하는 단계는 단일 세포의 측정을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 살아있는 세포의 간섭법을 수행하여 상기 제1 환경 내 세포의 질량에 비례하는 측정치를 결정하는 단계는 세포의 집합(cluster) 또는 세포 집괴(clump)의 측정을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 세포의 집합은 적어도 5개의 세포를 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 시험용 물질은 항생제, 항체, 알킬화제, 항대사물질(antimetabolite), 세포 주기 억제제, 토포아이소머라제 억제제, siRNA 또는 세포를 포함하는 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 시험용 물질은 HER2에 결합하는 항체를 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 살아있는 세포의 간섭법을 수행하여 상기 제1 환경 내 세포의 질량에 비례하는 측정치를 결정하는 단계는 복수 회 수행되어 일정 시간 동안 상기 세포의 질량에서의 변화 양상이 관찰되는 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 세포의 질량에서의 변화는 시간적 질량 프로파일(temporal mass profile)을 관찰하기 위해 경시적으로 관찰되는 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 관찰된 시간적 질량 프로파일을 시간적 질량 프로파일의 데이터베이스와 비교하는 단계를 더 포함하고, 상기 시간적 질량 프로파일의 데이터베이스는 상기 시험용 조성물에 대한 세포 민감도의 특징을 나타내는 시간적 질량 프로파일 및 상기 시험용 조성물에 대한 세포 내성의 특징을 나타내는 시간적 질량 프로파일을 포함하도록 선택되는 것인 방법.
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청구항 1에 있어서, 상기 세포의 질량에 비례하는 측정치는 하기 식을 이용하여 전환되고:

여기서 m은 세포의 질량이고, α는 위상 전이와 세포 질량 간의 관계를 기술하는 상수이며, Ψ는 측정된 프랙셔널 위상 전이이고, λ는 조명 파장이며, 적분은 전체 세포 면적인 A에 대해 수행되는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, α=1.8 × 10^-3 m³kg^-1인 것인 방법.
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