CN103842769B - 通过活细胞干涉测量法的快速、大量平行单细胞药物响应测量 - Google Patents

通过活细胞干涉测量法的快速、大量平行单细胞药物响应测量 Download PDF

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Abstract

癌症治疗的核心问题是肿瘤细胞群中的单体细胞如何响应旨在阻止它们生长的药物。然而，无论是癌性细胞还是生理学细胞，细胞的绝对生长、它们物理质量上的变化，难于直接用常规技术测量。本发明的实施方式提供用于对暴露于变化环境的细胞的细胞质量进行快速的、实时定量的活细胞干涉测量法(LCI)。总之，LCI提供用于评估细胞群来确定、监测和测量单个细胞对例如对治疗用药物的响应的观念上的发展。

Description

通过活细胞干涉测量法的快速、大量平行单细胞药物响应 测量
政府资助声明
本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)资助的授权号为CA090571、CA107300和GM074509的政府支持下完成的。政府享有本发明中的某些权利。
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.Section119(e)的规定，本申请要求于2011年8月2日提交的题为“RAPID,MASSIVELY PARALLEL SINGLE-CELL DRUG RESPONSE MEASUREMENTS VIA LIVECELL INTERFEROMETRY”的共同待审的序号为61/514,353的美国临时专利申请的权益，将其内容并入本文作为参考。本申请涉及于2009年5月6日提交的第12/436,702号美国专利申请，将其内容并入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及能够用于检查一个或多个细胞的干涉测量系统、材料和技术。
发明背景
干涉显微镜提供用于测量细胞内部物质和其它透明物质的空间分布的有意义的生物物理学方法。先前已证实采用本技术，即活细胞干涉测量法(Live CellInterferometry,LCI)，能够灵敏地同时检测和追踪上百个细胞的纳米机械性质(1)。随着通过高磁性探针在细胞的表面上制作小的刻痕(indention)，还能够使用LCI来监测单个细胞内细胞质的动态流动(2)。研究表明细胞材料的几乎瞬时再分布源自于细胞表面的刻纹，其超出了常规的光学显微术的检测极限。
与细胞质量和充分表征的生物化学途径之间的关系一样，对单个细胞如何调整其尺寸缺乏认识。尽管早在19世纪50年代就开始对单个活细胞的定量的质量测量(3,4)，但是只有近期增加例如细胞质量测量的速度、精度和实用性的新方法变得可行。需要新方法来快速和同时测量一个或多个单个细胞的质量或大细胞种群内成簇的细胞的质量(7,8)。本文所公开的本发明的实施方式满足这点以及其它需求。
发明内容
本发明的实施方式包括，例如，能够用于测量一个或多个细胞的一种或多种特征或性质的干涉测量系统、方法和材料。该性质包括，例如，细胞质量、细胞体积、光学细胞稠度(optical cell thickness)(细胞密度)等。本发明的实施方式涉及观测干涉仪内部细胞的一种或多种特征或性质，并然后使用这些观测结果来表征细胞的生理学。
本发明的示例性实施方式是一种使用活细胞干涉测量法来观测细胞质量的方法。通常，该干涉测量法包括以下步骤：将细胞置于适于测量测试光束和参照光束之间的分数相移(fractional phase shift)的干涉显微镜的观测室中，使细胞暴露在处于照明波长(illumination wavelength)的测试光束下，并且然后测量在传播穿过细胞的测试光束和参照/对照光束之间的分数相移。然后能够使用该测量来推导细胞质量。
在本发明的常见实施方式中，使用以下方程式来观测细胞质量：
其中m是细胞的质量，α是描述相移和细胞质量之间关系的常数，是所测量的分数相移，λ是照明波长，并对整个全部细胞面积A进行积分。在本发明一些实施方式中，α=1.8×10-3m3kg-1。任选地，多次观测细胞质量以便观测细胞质量在一段时间内的变化(随时间的变化)。在本发明的一些实施方式中，实时对细胞质量进行定量。在本发明一些实施方式中，使用该方法来定量多个细胞的质量。
在本发明典型的实施方式中，使用活细胞干涉测量系统实施本方法，该系统包括可操作性连接于(operatively coupled)显微镜的检测器；包括适于容纳细胞的观测室的样品组件(sample assembly)；包括适于容纳参照细胞的参照室的参照组件(referenceassembly)；和用于将来自光源的光束分成测试束和参照束的分束器。在本发明一些实施方式中，观测室包括至少一根适于在室内循环细胞培养基(cell medium)的灌注管(perfusion conduit)。在本发明的一些实施方式中，活细胞干涉测量系统包括适于处理和存储细胞(一个或多个)一个或多个图像的处理器元件和记忆存储元件。在本发明一些实施方式中，观测细胞的质量性质以定量细胞对治疗用试剂(therapeutic agent)的响应。任选地，从罹患癌症的个体中获得一个或多个细胞，并且通常治疗用试剂是用于治疗癌症的试剂(例如，在旨在评价癌症细胞对治疗用试剂的敏感性的方法中)。
本发明的又一个实施方式是用于观测细胞对具体环境或一组环境条件(例如包括测试组合物，例如治疗用试剂，如HERCEPTIN(赫赛汀)的细胞培养物)的响应的方法。在本发明的该方法中，将细胞置于第一环境(例如，第一观测室)，并然后使用包括活细胞干涉测量法的方法观测第一环境中的细胞的质量性质。在本发明的方法中，使用包括活细胞干涉测量法的方法来比较第一环境中观测的质量性质和第二环境中观测的细胞的质量性质。通过这种方式，可以观测细胞对于第一环境的响应。在典型的方法中，第一环境包含测试组合物而第二环境不含测试组合物。在这些方法中，当细胞暴露于第一环境中的测试组合物时细胞的生理学因测试组合物而改变，并且这种改变由本发明的方法来观测(且通常和对照细胞比较，对照细胞并未暴露于测试组合物并因此不会因组合物而改变)。任选地，测试组合物包含抗生素、抗体、烷化剂、抗代谢物、细胞周期抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或细胞。在本发明的一些实施方式中，测试组合物在胞内起效，包含例如外源的多核苷酸，例如siRNA。
在本发明一些实施方式中，对质量性质进行观测的细胞作为分离的单独细胞存在于第一环境中。任选地，能够对质量性质进行观测的细胞以细胞簇(cluster)或团(clump)的形式存在于第一环境中。在本发明的一些实施方式中，观测存在于第一环境中的多个细胞的质量性质。在本发明的实施方式中，能够多次观测第一细胞中的一个或多个细胞的质量性质以便在一段时间期间观测一个或多个细胞的质量性质如何变化。任选地，例如，随时间的推移观测细胞质量性质的变化以监视时间(实时)质量概貌(temporal massprofile)。本发明一些实施方式包括以下步骤：比较所观测到的时间质量概貌和时间质量概貌的数据库，其中选择时间质量概貌的数据库以包括特征为对测试组合物的细胞敏感性(例如，处于在测试组合物存在下抑制细胞生长的情形下)的时间的质量概貌和特征为对测试组合物的细胞耐药性(cellular resistance)(例如，处于在测试组合物存在下不会抑制细胞生长的情形下)的时间的质量概貌。
本发明的其它示例性实施方式能够包括，例如用于定量细胞质量和/或观测一个或多个细胞的质量在响应环境刺激时如何变化的系统和方法。一些实施方式包括具有以下步骤的方法：将一个或多个细胞置于能够在测试束和参考束之间产生和测量分数相移的干涉显微镜的观测室中；将细胞暴露在处于照明波长的测试束下；测量在传播穿过细胞的测试束和传播穿过参考细胞的参考束之间的分数相移；以及用以下方程式确定一个或多个细胞的质量：
其中m是细胞的质量，α是描述相移和细胞质量之间关系的常数，是所测得的分数相移，λ是照明波长，并且对整个全部细胞面积A进行积分。
也研究了用于观测其它细胞性质的方法实施方式。例如，在本发明一些实施方式中，能够将该方法用于观测水性培养基中活细胞的光学稠度。任选地，本方法能够用于同时观测活细胞种群，例如用于确定、监测和测量在活细胞种群中针对刺激的静态(resting)和动态(dynamic)的细胞响应。通常在这些方法中，观测应对于暴露于刺激(例如治疗用药物)时的细胞响应的性质。在一些实施方式中，本发明的方法能够以平行的方式进行以概括种群中的细胞对内部或外部刺激的不同响应。任选地，本方法还包括从观测室中移去细胞并处理细胞用于进一步分析。在本发明一些实施方式中，本方法用于获取包含水性培养基中的活细胞的细胞具体概貌的信息，并随后将该信息于存储在记忆存储元件中。
研究了本发明的多种方法实施方式。例如，能够使用下述系统来实施本发明一些方法实施方式，该系统包括：具有Michelson干涉物镜(Michelson interferenceobjective)的显微镜；可操作性连接于显微镜的例如照相机(例如静物照相机(stillcamera)、视频照相机、电荷耦合器件(charge coupled devices,CCD)等)的检测器；包括适于容纳细胞的观测室的样品组件；以及包括参照室的参照组件。此外，该系统可以额外地包括适于存储一个或多个细胞图像的记忆存储元件和适于处理一个或多个细胞图像的处理器元件。在其它实施方式中，该显微镜是能够通过流体培养基观测干涉边缘的干涉显微镜。任选地，该系统能够观测多相移处的干涉图案，并然后能够关联所观测的干涉图案和细胞的光学稠度概貌。该通常的实施方式是非限定性的，因为本文所公开的系统能够采用多种结构。本发明的其它实施方式包括细胞适度(cellularfitness)的实时和非侵害性的标记物和观测细胞适度的方法。该系统和技术能够依赖于对细胞质量变化的观测。
对于本领域的技术人员而言，通过下面包括附录的详细描述，本发明的其它目的、特征和优点将显而易见。然而，应当理解尽管详细描述和具体实施例表明本发明的一些实施方式，但是它们以示例而非限定的方式给出。可以作出本发明范围内的许多变化和修改而不会偏离本发明的精神，并且本发明包括全部的这些修改。
附图说明
图1示出了活细胞干涉仪(LCI)实施方式的示意图。LCI(a)是比较参比细胞的光学稠度和置于观测室的样品的光学稠度的Michelson型干涉显微镜。镜面的基底(mirroredsubstrate)悬浮于观测室中，允许LCI测量透明细胞的光学稠度。通过计算机控制显微镜物镜和观测室的相对位置，并且该相对位置是三维可移动的，从而允许快速的、自动化的图像获取。整个数据采集过程，保持观测室中的细胞处于标准细胞培养环境(例如，pH为7.4，37℃，5%的CO2)。活细胞干涉仪能够既测量贴壁细胞的质量又测量非贴壁细胞的质量。图像(b)显示用聚-L-赖氨酸涂覆基底后，几个附着于观测室基底的非贴壁H929细胞，而图像(c)显示直接在基底上培养的贴壁雌性印度麂细胞(9)。颜色图示表明光学稠度测量，相对于背景而言，蓝色是低光学稠度而红色是高光学稠度。
图2示出了用LCI获得的细胞群的高通量和纵向的测量。来自LCI的四个H929多发性骨髓瘤细胞的样品图像(a)显示六小时监测期间细胞的光学稠度概貌。颜色表示纳米级的相移，深蓝表示低稠度而白色/红色表示高稠度。这些样品图像是25个连续的CCD捕捉图像(每7分钟捕捉一次)的组合。插图显示整个单个细胞的相移测量。整个细胞的积分相移直接和细胞的干重(干质量)成比例。(b)在同一位置下在每个图像中确定数百个单独细胞(用红色描述)，并且(c)确定每个单独细胞的质量，能够随时确定高通量、种群水平的质量分布。(d)随时间纵向追踪单个细胞的质量以研究细胞生长动力学。测量结果以空心符号表示并具有线性最小方差的最佳拟合线。在本情况下测量的生长速率为6.5(se+/-0.72)pg/hr。以残差的标准偏差计的线性趋势的差异是5.0pg或中值细胞质量的1.17%。最大的峰-峰残差在102分钟为11pg或在该时间点为中值质量的2.61%。
图3示出了通过单细胞质量累积所概述的H929多发性骨髓瘤细胞的药物响应。H929多发性骨髓瘤细胞种群的LCI纵向质量测量结果，比较了经DMSO处理的对照细胞和经依霉素处理(10g/ml)的细胞的质量累积。采集5小时的数据。处理过的细胞比对照细胞更缓慢地生长。相对于实验#1的37℃，实验#2和#3在32℃进行，这是鉴于所观测的较慢的整体生长速率。散点图(a～b)显示在五小时时相对于它们的初始质量、单个细胞的生长(由初始质量归一化)。误差棒代表+/-2%的CV(测量误差的估计)。误差棒应用于全部数据，但为了清楚起见，在图中删除了大部分点的误差棒。在相对于时间的归一化质量的箱状图(c～d)中，圆圈表示样品中值，而三角形表示95%的中值置信区间。实箱表示25%和75%的界限，而须线(whisker)表示来自中值的两个标准偏差。
图4示出了H929对衣霉素的响应的分子概貌。处理过的和未处理的种群之间生长速率的偏离与在处理过的种群中转录因子CHOP(a)的上调和转录因子XBP1(b)的交替性剪接(alternative splicing)同时发生。CHOP和XBP1激活承担缓和内质网中的蛋白质错误折叠的影响的基因宿主。这点和已知的TM作用机理(蛋白质糖基化的抑制剂)相一致。(c)细胞周期数据显示G2/M相种群的快速减少和G1/G0种群的相应增大，这和细胞周期停滞一致。这种转变在处理三小时后变得显著，处理五小时结束时仍在G1/G0中保留了细胞的50%。
图5示出了细胞分裂的质量动力学。在全部实验中记录了来自经处理和未处理种群的28个分裂结果(来自总数约600个细胞)。(a)直接通过观测个体分裂和测量母子细胞的质量来确定分裂细胞的质量范围。插图(a)比较所测量的全部细胞的质量分布(经处理和未处理，虚线)和那些在实验过程中分裂的细胞的质量(红色表示分裂前，蓝色表示分裂后)。(b)令人惊奇地，多个细胞的分裂是高度不对称的(具有约占总母细胞质量的55%或更多保留在两个子细胞的较小者中)。(c)示出了5小时的时间过程中高度不对称分裂的两个实例。在这些分裂中子细胞的较小者(用星号表示)分别包含母细胞质量的35%和40%。这些分裂活动通过(b)中的红圈示出。误差棒代表+/-2%的CV(测量误差的估计(参见方法))。
图6示出了贴壁细胞质量的活细胞干涉仪测量。该图像显示了几个直接在经抛光的硅基底上培养的小鼠成纤维细胞。彩色图表明光学稠度的测量结果，相对于背景，蓝色是低光学稠度，而红色是高光学稠度。如所标明的，剩余的是四个细胞的质量测量，每两秒测量一次，持续200分钟。通过LCI容易地测量贴壁细胞和非贴壁细胞比较的较小光学稠度。
图7示出了经处理和未处理数据组的散点图。红色趋势线代表对数据的线性最小平方的拟合。给出用于每个拟合的p值，其表示在生长速率和细胞质量之间没有关联的可能性。由于未处理的对照中细胞质量的增加表明存在较慢生长的趋势，尽管统计学上不会显著至95%的置信度。经处理组Tm2和Tm3在生长速率和质量之间没有显示出关联，而对于Tm1，负斜率是显著的(p=0.02)。每个线性拟合的残差标准提供每个质量区段生长变异的估计。误差棒代表+/-2%的CV(测量误差的估计)。
图8示出了光学路径和LCI质量测量稳定性。沉积在硅上的金岛蒸气(goldislands vapor)(较低的插图)，高度约35nm，重复性测量140分钟以测试干涉仪的稳定性。在顶图中所示，三个代表性岛的平均高度在这一时间段内没有显示出有意义的偏移，且以高度的标准偏差给出的测量可重复性是约1.2埃或总高度的0.35%。类似地，通过重复测量80+分钟内部分熔化的直径为10μm的聚苯乙烯小球(b)来估计透明对象的质量测量稳定性。在顶图中，踪迹#1代表熔成簇的三个小球，而踪迹#2代表熔成簇的两个小球。其它的三个踪迹是来自单个小球。聚苯乙烯的质量测量的变化系数(coefficient of variation)类似于金岛平均高度所得的变化系数，<0.4%，在测量期间具有可忽略的偏移。在和那些用于测量活细胞的相同条件下在LCI观测室中收集数据，不同的是用水代替培养基。
图9示出了LCI的高精度质量测量。选择四个单个细胞(a至d)并追踪，以约12s的间隔进行98次连续测量。在这一时间段内(总共20min)，所观测的细胞表现出小的质量变化(参见质量对时间的插入图)，从而能够评估测量的可重现性。c和d中的细胞在这一时间段内表现出大于1皮克的平均质量变化，因此，c和d中的直方图表示所测得的质量减去最小平方拟合线(插入图中以红色显示)的线性部分，以去除任意源自生长的额外变化。将每个细胞的测量直方图通过Matlab中非线性最小方差拟合来拟合成高斯分布(Gaussiandistribution)。报告了每个分布的平均(μ)和标准偏差(σ)。全部标准偏差是小于分布平均值的1%，表明利用LCI的质量测量是高度可重现的。
图10示出了通过LCI在水中测量部分熔化的6μm直径的聚苯乙烯小球(FlowCheck,Polysciences Inc.)群的质量(a)。在制备期间，这些小球很少聚集，并经加热二聚体和三聚体融合成单一的、圆锥形簇。单聚体(110.7pg)、二聚体(213.7pg)和三聚体(308.1pg)的种群峰能够在直方图中区分开。单聚体种群质量的LCI-测量的标准偏差是7.5pg或平均值的6.8%，其超出制造者指出的15%的技术要求。四种不同哺乳动物细胞类型和6μm聚苯乙烯小球种群的质量分布汇总绘制成用于比较的直方图(b)。用LCI确定的小鼠红细胞(RBC)种群的平均质量能够和由其他技术(参见例如，Nie,Z.,et al.AnalyticalChemistry,2007.79:p.7401-7407；Vaysse,J.,et al.Mechanisms of Ageing andDevelopment,1988.44(3):p.265-276；Wirth-Dzieciolowska,E.,et al.Animal SciencePapers and Reports,2009.27(1):p.69-77；Magnani,M.,et al.Mechanisms of Ageingand Development,1988.42(1):p.37-47)和另一个使用微干涉测量法的小组(参见例如Mysliwski,A.,et al.Mechanisms of Ageing and Development,1985.29(2):p.107-110)所确定的公布值加以比较(c)。Nie等人使用新的质谱测量法测量小鼠RBC细胞质量，并还通过常规的光化学技术测量平均红细胞血红蛋白量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)(参见例如，Nie,Z.,et al.Analytical Chemistry,2007.79:p.7401-7407)。MCH通常占哺乳动物红细胞全部细胞质量的大部分。不同小鼠种类的MCH值的范围已良好地确立(参见例如Magnani,M.,et al.Mechanisms of Ageing and Development,1988.42(1):p.37-47;Mysliwski,A.et al.Mechanisms of Ageing and Development,1985.29(2):p.107-110;Wirth-Dzieciolowska,E.,et al.Animal Science Papers and Reports,2009.27(1):p.69-77)。使用由Nie等人给出的MCH比总质量的比值作为评估，能够比较小鼠RBC MCH的确定值和所测的平均小鼠RBC质量。预测值以红色显示。
图11示出了由LCI测量的四种不同活的或新制备的细胞类型的种群的质量分布：(a)小鼠WEHI-231B的淋巴瘤细胞，(b)来自15周大的雌性C57BL/6小鼠的红细胞(RBC)，(c)人体H929多骨髓瘤细胞，以及(d)使用标准技术通过逆转录病毒转导和过继细胞转移在C57BL/6小鼠中确立的初级骨髓(primary bone marrow)和急性髓细胞样白血病(acutemyeloid leukemia,AML)细胞的混合物。
图12示出了来自图9a中所给出的数据中的代表性细胞的质量相对于时间的图(a)。虚线表示对数据的指数生长拟合。为了估计活细胞实验中测量差异的范围，将来自全部三个Tm-处理过的和DMSO对照的过程(分别表示为D1～D3和Tm1～Tm3)中的全部单个细胞质量相对于时间的数据拟合成简单的指数生长模型(mass(t)=m0*Ct，其中常数C接近于1(unity))，并将残差计算成每个时间点上的趋势数据和实际数据之间百分比差异。在箱图中，中线表示样品的中值，而三角形表示中值的95%置信区间。实箱表示25%和75%的界限，而须线表示平均值的两个标准偏差。残差对称分布于0左右，并在25%至75%的四分位数(IQR)的范围从0.0126(D2)到0.027(D3)变化。平均的IQR为0.02。
图13示出了由aLCI成像的多种单个细胞、细胞簇和密集菌落以及定量的质量。(a)MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3和BT-474乳腺癌细胞系的共聚焦图像。SK-BR-3和MDA-MB-231细胞系以单个细胞或松散的簇生长，然而BT-474和MCF-7细胞系以密集的多细胞菌落生长。红色是Alexa568Phalloidin肌动蛋白染色剂，而蓝色是DAPI核染色剂。(b)每个细胞系的质量分布相位图。用aLCI实时地、重现性地定量单个细胞、松散簇和密集菌落。颜色标尺表示以pg/μm2计的质量密度。比例尺是50μm。
图14示出了用aLCI对单细胞和大菌落的同时成像。(a)相图显示了靠近由约52个细胞组成的多细胞MCF-7菌落(21,660pg)的单MCF-7细胞(555pg)。颜色尺度表示以pg/μm2计的质量密度。(b)全部细胞系的生长速率相对于初始质量的复合散点图。重叠MDA-MB-231(红色)、MCF-7(蓝色)、SK-BR-3(蓝绿色)和BT-474(黑色)以表明细胞和菌落的尺寸范围和不同系的生长速率。形成系的菌落(MCF-7和BT-474)横跨从单细胞至大的多细胞菌落的范围。
图15示出了3～5h内由aLCI重现性定量的归因于群司珠单抗的乳腺癌细胞生长抑制。(a)用20μg/ml的群司珠单抗处理的每个细胞系的种群平均归一化质量相对于时间的图(误差棒表示标准误差)。(b)对于SKBR-3和BT-474系，源自群司珠单抗处理的生长抑制作用在7小时变得高度明显(p<0.001)。通过线性拟合至质量累积数据计算每小时的生长速率。
图16提供解释由7日增殖分析(第三栏)确定的赫赛汀(Herceptin)的敏感性，其显示于在六小时时收集的aLCI质量累积分析数据(第4栏)的旁边。O’Brien等人确定了HER2状态(参见例如Molecular Cancer Therapeutics.2010,9,1489-502)。
具体实施方式
除非另有限定，本文所使用的全部技术术语、标记和其它科技术语或专有名词旨在具有本发明所属的技术领域内的技术人员通常所理解的含义。在一些情形下，为了清楚和/或易于参考，本文可以定义具有通常所理解含义的术语，并且本文中涵盖这些定义不应该必然地解释成代表和本领域所通常理解的存在实质差别。本领域技术人员使用常规方法能很好地理解本文所描述或参考的许多技术和过程并常规使用。合适的话，除非另外指出，通常根据制造者定义的方案和/或参数实施涉及商业可得的试剂盒(kit)和试剂使用的步骤。下面定义多个术语。
在进一步描述本发明之前，应当理解本发明不限于所描述的特定实施方式，因为它们可以必然地变化。还应当理解本文所使用专有术语只是出于描述特定实施方式的目的，而不是旨在用于限定，因为本发明的范围仅通过所附的权利要求加以限定。同样必须指出正如本文和所附的权利要求中所使用的，除非上下文另外清楚地指出，单数形式“一个(a)”“和(and)”和“这个(the)”包括复数的指示物。因此，例如，引用“测试组合物(a testcomposition)”包括多个该测试组合物等。说明书和相关权利要求中所列的表示成能够在数字上以数值而不是全部数目为特征的数值(例如溶液中化合物的浓度)的全部数字理解成由术语“约”修饰。在提供数值范围的情况下，理解成每个插入值(除非上下文另外清楚地指出，下限单位的十分之一的数值、在上下限之间的数值和其它另外指出的或在所指出范围内的插入值)包括在本发明内。这些小范围内的上下限可以独立地包含于较小的范围内，并且也包括在本发明内，其受所指范围内的任何具体排外的限制。在所指出的范围包括一个或两个界限的情况下，那些排除一个或两个所包括的界限的范围也包括于本发明中。
本文提到的全部公开物并入本文作为参考，用于公开和描述与所引用的这些公开物相关联的方法和/或材料。针对在本申请的提交日之前的公开内容，引证本文所引用的公开物。本文中没有内容旨在解释为不给予发明人凭借发明较早的优先权日或在先的日期使公开日期提前的权利。此外，实际公开物的日期可以不同于所标明的且要求独立验证。
本文所公开的发明具有很多实施方式。本发明的实施方式提供用于观测和/或表征细胞一个或多个性质的方法、材料和系统，该细胞的性质为例如其质量和/或细胞质量在响应不同环境条件时如何变化。本发明示例性的实施方式包括使用干涉测量法来获取细胞质量的信息和/或表征一个或多个和细胞质量相关的细胞性质。能够通过本发明的实施方式来观测示例性细胞性质可以包括例如应对刺激时细胞骨架重塑行为，例如该刺激包括暴露于药物或其它生物活性试剂以及多种其它因素。在本发明的一些实施方式中，所观测的现象是对应于或关联于病理状况，例如异常的细胞分裂(例如发生于癌变前或癌变细胞)。在本发明的一些实施方式中，其中对活动进行观测的细胞膜是单个细胞的膜。在本发明的其它实施方式中，观测多个细胞的膜性质。在一些实施方式中，该膜是组织中的细胞膜。在其它实施方式中，该膜是细胞群体内(例如，取自母体或建立的细胞系中的初级细胞的体外细胞培养物)的细胞膜。本发明的典型实施方式中，该细胞为真核(例如哺乳动物的)细胞。
在本发明的典型的干涉测量实施方式中，干涉仪使用例如Michelson构造。此外，和干涉测量技术(包括光谱分辨干涉测量法、波长扫描干涉测量法、数字全息术等)相关的方法和元件能够用于本发明的实施方式。尽管能够采用许多干涉测量显微镜系统和方法以用于本发明的实施方式，但是本发明的其它实施方式能够使用扫描光学显微镜、共焦显微镜等。描述能够适用于本发明实施方式的光学概括方法(optical profiling method)和材料的示例性和非限定性列表公开于例如第20100284016号、第20050248770号、第20050225769号、第20050200856号、第20050195405号、第20050122527号、第20050088663号、第20040252310号、第20050117165号、第20030234936号、第20040066520号、第20080018966号和第20050167578号美国专利申请，在这里将其内容并入作为参考。
本发明的实施方式使用光学的轮廓测量技术(profilometry technique)来提供例如高度测量、形状测量以及其它细胞膜形状的调变和其它关联细胞质量的性质的测量。取决于测试细胞或细胞种群的形状、尺寸等，这些技术通常使用结构化光线通过聚焦光学性质、光干涉等来以经济实用的方式优化结果。Moire'技术、ESPI(电子散斑干涉测量法，electronic speckle-pattern interferometry)、激光扫描、照相测量法和干涉测量法是所研制的用于实施三维形状测量的示例性技术。白光垂直扫描干涉测量法(white-lightvertical scanning interferometry,VSI)，也通常称作白光干涉测量法或相干雷达(coherence radar)用于成像小物体，通常是那些具有不超过几微米粗糙度的物体。VSI方法学是基于对由两个干涉的、多色的波阵面形成的相干峰的检测。该方法具有例如绝对的深度辨别、快速测量周期和高垂直分辨率的优点。VSI的一个优点是该方法能和其它测量技术相结合的简易性，其它测量技术是例如相移干涉测量法(phase-shiftinginterferometry,PSI)，其在精确度上优越但可能缺乏VSI的扫描深度。PSI通常用作轮廓上具有细小变化的光滑表面的测量(参见K.Creath,"Temporal Phase MeasurementMethods,"Interferogram Analysis,Institute of Physics Publishing Ltd.,Bristol,1993,pp.94-140)。VSI通常用于测量具有宽像素间高度范围的光滑和/或粗糙表面(K.G.Larkin,"Efficient Nonlinear Algorithm for Envelope Detection in WhiteLight Interferometry,"J.Opt.Soc.Am.,A/Vol.13,832-843(1996)。已经将VSI和PSI的结合用于，例如测量具有PSI精度的大步长(C.Ai,U.S.Pat.No.5,471,303)。PSIOTF技术(VSI和PSI相结合的特例)改善较大高度范围内的光滑表面的测量(参见例如Harasaki etal.,"Improved Vertical Scanning Interferometry,"Appl.Opt.39,2107-2115,2000)。典型的VSI和PSI系统和方法公开于例如第5,133,601号、第5,471,303号美国专利和第6,449,048号美国专利和第20020196450号美国专利申请，将其内容并入作为参考。
如上所述，本发明的方法包括使用本文所公开系统来观测细胞的质量性质的方法。实施方式包括例如膜的观测，其中用实时相测量因素(例如光学细胞稠度(细胞密度)、细胞体积等)观测膜运动。一个这样的方法是用于观测细胞性质(和/或细胞种群)的方法，该方法包括将细胞置于具有Michelson干涉物镜的光学显微镜的细胞观测室中，并使用该Michelson干涉物镜来观测细胞。通常，在该实施方式中，能够将质量性质和细胞的可观测性质，例如细胞密度和/或细胞体积等相关联，并且用这种方式本方法允许观测细胞的质量性质。
本发明的一个示例性实施方式是使用活细胞干涉测量法来观测细胞质量的方法。通常，该方法包括以下步骤：将细胞置于适于测量测试光束和参照光束之间的分数相移的干涉显微镜的观测室；将细胞暴露在处于照明波长的测试光束下；测量在传播穿过细胞的测试光束和参照光束(例如，传播穿过对照或参照细胞的光束)之间的分数相移。在本发明的一些实施方式中，技术人员能够使用显微镜来测量传播穿过细胞的测试束和传播穿过参照细胞的参照束之间的分数相移，其中该分数相移和细胞性质相关联。然后能够使用该测量来推导细胞质量。
在本发明的通常实施方式中，使用以下方程式来观测/推导细胞质量：
其中，m是细胞质量，α是描述相移和细胞质量之间关系的常数，是测得的分数相移，λ是照明波长，并且对全部细胞面积(A)进行积分。在本发明一些实施方式中，α=1.8×10-3m3kg-1。任选地，多次观测细胞质量以便观测细胞质量在一段时间内如何变化。在本发明一些实施方式中，实时定量细胞质量。在本发明一些实施方式中，使用本方法来定量多个细胞的质量。
在本发明典型的实施方式中，使用活细胞干涉测量系统来实施本方法，该活细胞干涉测量系统包括可操作连接于显微镜的检测器；包括适于容纳细胞的观测室的样品组件；包括适于容纳参照细胞的参照室的参照组件；和用于将来自光源的光束分成测试束和参照束的分束器。在本发明一些实施方式中，观测室包含至少一根适于在室内循环细胞培养基的灌注管。在本发明的一些实施方式中，活细胞干涉测量系统包括适于处理和存储一个或多个细胞图像的处理器元件和记忆存储元件。在本发明一些实施方式中，观测细胞性质(例如细胞质量、细胞重量、细胞体积等)的集合以定量细胞对治疗用试剂的响应。任选地，例如，从罹患癌变的个体中获得细胞并使用治疗用试剂来治疗癌症。
本发明的又一个实施方式是用于观测细胞对具体环境的响应的方法，具体环境例如包括如赫赛汀(HERCEPTIN)的治疗用试剂的环境。在本发明的该方法中，将细胞置于第一环境中并然后使用包括活细胞干涉测量法的方法观测第一环境中细胞的质量性质。通常这种比较包括观测源自第一和第二环境中患者的相同系(例如癌变系)的细胞。用这种方式，能够观测细胞对第一环境和/或第二环境的响应。通常，在这些方法中，第一环境包含测试组合物而第二环境不包含测试组合物。任选地，测试组合物包括抗生素、抗体、烷化剂、抗代谢物、细胞周期抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、siRNA或细胞(例如，如抗原呈递细胞的人体免疫细胞)。在这些方法中，使用包括活细胞干涉测量法的方法来比较第一环境中所观测的质量性质和第二环境中所观测的质量性质。
在本发明一些实施方式中，对质量性质进行观测的细胞在第一环境中以分离的单个细胞形式存在。任选地，能够观测到的质量性质的细胞以细胞簇或团(例如，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个细胞的聚集体)存在于第一环境中。在本发明的一些实施方式中，观测存在于第一环境中的多个细胞的质量性质。在本发明的实施方式中，能够多次观测第一环境中的一个或多个细胞的质量性质以便观测一段时间内一个或多个细胞的质量性质如何变化。任选地，例如随时观测细胞的质量性质的变化以观测时间的质量概貌(例如细胞质量在一段时间内变化的具体方式)。本发明的一些实施方式包括比较所观测的时间质量概貌和时间质量概貌的数据库的步骤，其中所选择的时间质量概貌的数据库包括以细胞对测试组合物的敏感性为特征的时间质量概貌和以细胞对测试组合物的耐性为特征的时间质量概貌。
本发明的其它示例性实施方式能够包括例如，用于定量细胞质量和/或观测在响应于环境刺激时一个或多个细胞质量如何变化的系统和方法。一些实施方式包括包含以下步骤的方法：将一个或多个细胞置于能够在测试束和参照束之间产生和测量分数相移的干涉测量显微镜的观测室中；将细胞暴露于处于照明波长下的测试束；测量在传播穿过细胞的测试束和传播穿过参照细胞的参照束之间的分数相移；和用以下方程式确定一个或多个细胞的质量：
其中m是细胞质量，α是描述相移和细胞质量之间关系的常数，是所测得的分数相移，λ是照明波长，且对整个的全部细胞面积A进行积分。
关注了用于观测质量和/或其它细胞性质的方法实施方式。例如，在本发明一些实施方式中，该方法能够用于观测在水性培养基中活细胞的光学稠度。任选地，该方法能够用于同时观测活细胞种群，例如用于确定、监测和测量活细胞的种群中对刺激的静态和动态的细胞响应。通常在这些方法中，观测响应于细胞暴露在例如治疗用药物的刺激下的性质。在一些实施方式中，能够以高度平行的方式实施本发明的方法以概括种群中的细胞随内部或外部刺激的不同响应。任选地，该方法进一步包括从观测室中除去细胞并处理细胞以用于进一步分析。在本发明一些实施方式中，该方法用于获得包含水性培养基中的活细胞的细胞具体概貌的信息并随后将该信息存储在记忆存储元件中。
本发明研究了多种方法实施方式。例如，能够使用包括以下部件的系统来实施本发明一些方法实施方式：具有Michelson干涉物镜的显微镜；可操作性连接于显微镜的例如照相机(例如静物照相机、视频照相机、电荷耦合器件(CCD)等)的检测器；包括适于容纳细胞的观测室的样品组件；和包括参照室的参照组件。此外，该系统可以额外地包括适于存储一个或多个细胞图像的记忆存储元件和适于处理一个或多个细胞图像的处理器元件。在其它的实施方式中，显微镜是能够穿过流体培养基观测干涉边缘的干涉显微镜。任选地，系统能够观测多段位移的干涉图案，并然后将所观测到的干涉图案和细胞的光学稠度概貌相关联。这些常见的实施方式是非限定性的，因为本文所公开的系统能够采用多种构造。本发明的其它实施方式包括细胞适合度的实时和非侵害性标记物和观测细胞适合度的方法。本发明的另一个实施方式是用于观测细胞质量性质的系统，包括：显微镜；可操作性连接于显微镜的、例如点检测器、线检测器的检测器、微辐射测定仪(microbolometer)或照相机(例如静物照相机、视频照相机、电感耦合器件(CCD)、其它使用显微术的图像捕获装置)的检测器；包括适于容纳细胞的观测室的样品组件；和包括参照室的参照组件。该系统和技术依赖于对细胞质量变化的观测。
本发明的其它实施方式包括用于获得一个或多个细胞图像的系统，该系统包括：能够从干涉测量边缘提取信息的干涉显微镜；可操作性连接于干涉显微镜的检测器；包括适于容纳细胞的观测室的样品组件；和适于基本匹配样品组件的光路长度的参照组件。本发明的一个典型实施方式是用于获得细胞图像的系统，该系统包括：具有Michelson干涉物镜的显微镜；可操作性连接于显微镜的照相机；包括适于容纳细胞的观测室的细胞组件；和包括适于容纳流体(例如，置于观测室的培养基、RPMI、PBS、水等)的参照室的参照组件。
系统的实施方式适于使用本领域内已知的和/或本文所描述的多种元件和方法。例如，尽管样品和/或参照室通常包含流体，但是也能够在本发明的实施方式中使用不需要流体单元(例如传输介质(TTM))物镜(例如通过使用盐)的其它实施方式。此外，在本发明一些实施方式中，容纳细胞的样品室是封闭的，而在其它实施方式中，细胞室可以是顶部开口的(即不需要盖子)。本发明的实施方式能够包括通常通过控制构成样品和参照组件的元件的尺寸和结构来匹配干涉测量系统臂之间的光路差异。例如，在本发明一些实施方式中，参照组件进一步包括：第一光学窗口；适于保持第一光学窗口的第一壳元件；第二光学窗口；适于保持第二光学窗口的第二壳元件；和多个一次性的球状间隔物元件，该球状间隔物元件在第一光学窗口和第二光学窗口之间且适于将第一和第二光学窗口分开成限定的距离。这仅是实现该目的的一种方式的示例性和非限定性实例，并且有多种匹配这些臂之间的光路差异的其它方式(例如，在实施方式中，其中能够只彼此相对地移动一个匹配细胞室的平板、两个楔子来改变光路，能够使用不同类型的间隔物来代替球状间隔物单元，等等)
本发明的另一个实施方式包括提供具有分束器、参照镜和补偿流体单元的干涉仪的步骤，其中所述流体单元用于调整由围绕样品的流体所引起的光路差异。该方法能够包括使用压电转换器来减小少量的光路，从而导致测试束和参照束之间的相移。该方法能够包括确定由光传播穿过透明细胞体所带来的相的变化。该方法能够包括用以下公式确定与所测的相位延迟相关的细胞质量：
其中m是细胞质量，α是描述相移和细胞质量之间关系的常数，是所测得的分数相移，λ是照明波长，且对整个的全部细胞面积A进行积分。
本发明的实施方式包括这些系统的多种变体。例如，在一些实施方式中，观测室包括至少一根适于在室内循环细胞培养基的灌注管。本发明的一些实施方式进一步包括适于处理和存储一个或多个细胞图像的处理器元件和记忆存储元件。在本发明一些实施方式中，用另一种本领域中已知的例如荧光标记物(例如绿色荧光蛋白)的标记物/探针来标记细胞，并且该系统包含适于成像这些经标记的细胞的光学元件。本发明的一些实施方式包括用于观测细胞性质的附加元件，例如用于FT红外光谱、拉曼光谱等的装置和方法(例如，基于软件的方法)。
本发明的方法能够用于获得涉及一种或多种细胞性质的多种信息。例如，在本发明一些实施方式中，该方法能够用于例如观测水性培养基中活细胞的光学稠度。对于视野内全部细胞，本发明的实施方式能够用于以每11秒1张的图像获取速率(可以通过修改增大至每1/1000秒1张)、在1nm的垂直分辨率下测量的液体(即培养基)中活细胞的光学稠度。该观测提供有用的信息，包括例如，细胞中的蛋白质、核酸和其它分子的测量，这些物质阻止干涉测量光返回至视场内的整个细胞体的水平轴的基于像素的CCD检测器照相机。
任选地，本方法能够用于观测水性培养基中活细胞的细胞质量性质。例如，对于每个细胞，能够从得自本文所公开系统的实施方式的观测结果来计算液体中的细胞质量。通过收集一段时间内这种计算结果，能够评估响应于环境(例如，与如抗原呈递细胞的其它细胞的相互作用、与如赫赛汀的试剂的相互作用等)的细胞光学稠度(质量)的适应性或非适应性变化。透过该信息，然后能够例如推导视野内每个细胞的生物物理学参数，例如粘弹性(通常使用本领域已知的计算)。通过这种方式，技术人员能够随时间观测在变化条件下的细胞质量性质。在本发明又一个实施方式中，对于静止的或应对某种环境条件的种群中的每个单独的细胞，能够推导出细胞质量的“签名(signatures)”。在本发明另一个实施方式中，能够从视场中隔离和回收具有特殊性质的单独活细胞，这是因为在干涉仪视场中确定了它们的位置。研究了进一步操作，例如回收所观测的细胞用于额外的分析。能够使用例如吸液管进行回收以允许进一步研究(即过继转移到小动物中，从而进一步测试多种环境，例如单个细胞的微阵列基因表达分析等)。
如上所述，在本发明的一些实施方式中，该方法用于观测水性培养基中活细胞的质量性质。任选地，该方法用于观测活细胞种群，例如用于观测在活细胞种群中对刺激的静态和动态响应。在本发明一些实施方式中，能够同时测量在活细胞种群中的多个细胞的静态和/或动态响应。通常在这些方法中，观测响应于细胞暴露于刺激的性质，该刺激为例如将组合物引入细胞培养基。任选地，本方法进一步包括从观测室中移去细胞和处理细胞以进一步分析。在本发明一些实施方式中，该方法用于获得包含水性培养基中活细胞的细胞具体概貌的信息，并然后将该信息存储于记忆存储元件中。在本发明一些实施方式中，用合适尺寸的“孔道(hole)”(例如纳米孔或微米孔)能够将细胞排列以用于更加均一、更大密度和更高通量的分析(例如通过本领域内已知的光刻胶沉积工艺)。
对确定测试细胞的特征有用的本发明实施方式能够和计算机系统和数据库相结合。用于确定测试细胞特征的方法通常涉及确定测试细胞的细胞特征性概貌以产生测试概貌，并且比较测试概貌和在目标数据库中的参照概貌。该方法进一步包括概貌信息库(例如，根据和各种例如细胞对治疗用试剂的敏感性或耐性概貌相关的具体生理学条件来分类的概貌信息库)的产生以及测试概貌和概貌库中的概貌的比较。这样的比较能够使用本领域已知的软件方法来提供最佳的匹配，例如识别和测试概貌基本相同的参照概貌。然后，该参照概貌能够用于关联测试细胞的一种或多种特征。
如上所述，能够将细胞特征的概貌汇编于数据库中，并使用数据库中的信息来比较测试细胞概貌和数据库中的参照概貌。该比较能够由训练过的人(例如，临床医生、技术人员等)来完成，或由计算机或其它机器来完成。目标的诊断分析对于识别任意类型的异常细胞是有用的，例如，本发明的诊断分析对于识别生物样品(例如活组织检查，以及在单体体内中)中的癌变细胞是有用的。
能够将从在各种生理学条件下的和处于各种生理学状态的多种细胞类型的分析得到的数据汇编于数据库中，以便，例如训练神经网络用于细胞类型和细胞生理学状态的独立检测。如上所述，获得细胞特征概貌，并训练神经网络以识别各种细胞类型、在各种生理学状态下的细胞，和响应于各种刺激的细胞的细胞。神经网络对于识别癌变细胞、癌变前细胞和处于其它病理学条件的细胞是有用的。
能够适用于本发明实施方式中的通常方法和材料公开于第20100284016号美国专利申请，将其内容并入本文作为参考。下面公开和本发明的实施方式相关联的进一步的方面、元件和方法。
如上所指出的，本发明的实施方式涉及活细胞干涉测量技术。该技术在本领域内是已知的。描述活细胞干涉测量(LCI)系统、方法和材料的示例性、非限定性的公开物公开于例如Teitell等人的第2010/0284016号美国专利申请公开物、Popescu等人的第2009/0290156号美国专利申请公开物、Reed,J.等人，ACS Nano.2008,2,841-6；Reed,J.等人，Nanotechnology2008,19,235101和Reed,J.等人，Biophys J.2011,101,1025-31，将其内容并入作为参考。
如下是物理原理基础(physical principal underlying)LCI:给予传播穿过透明细胞体的相干光或半相干光的相变和细胞的材料密度成线性比例(9～11)。干涉显微镜能够测量这些相变，对于微米尺寸目标，精确度超过波长的1/1000，对于可见光优于0.5nm。然后能够通过下式关联细胞质量和所测得每个细胞的相滞后(9)：
其中m是细胞质量，α是描述相移和细胞质量之间关系的常数，是所测得的分数相移，λ是照明波长，且对整个的全部细胞面积A进行积分。这里，α=1.8×10-3m3kg-1，其和作为考虑到细胞正常成分的平均值的Ross(9)一致。α的精确值是未知的，然而，基于现有的独立测量，假定(1)整个浓度的大范围内α保持不变，且(2)α因细胞成分改变不可能变化超过约5%(11～13)。然而，α的具体值不会影响比较生长速率的测量精确度(参见图2、3)和细胞分裂后的相对子细胞质量(参见图5)的测量精确度。图1示出了LCI的示意图，以及贴壁细胞和非贴壁细胞的常规光学稠度图像。
由于是宽视野成像技术，LCI提供上百个细胞的同时质量测量(图2)。通过数据采集，细胞能够保持处于标准培养盘中的生理学条件(例如，pH为7.4，37℃，5%的CO2)下，确保周期性的纵向测量长达6小时或更长(图2a)。凭借自动化图像处理算法，能够在每张快速演替的图像中确定上百个细胞并对其质量统计(mass-profiled)(图2b)。在这些条件下，单个细胞的质量测量是高度可重复的(<3%CV;参见方法部分：测量误差(Methods:MeasurementErrors))。因此，在每个时间点上，可以确定细胞质量的种群宽度的分布(图2c)。另外，能够长时间追踪单个细胞以产生生长速率曲线(非水性细胞(non-aqueous cell)质量变化)，如图2d所示。
提供以下的实施例以便更加充分地理解本发明。这些实施例只是示例性的，并且不应该解释成以任何方式限定本发明。
实施例1：对本发明的实施方式有用的示例性方法和材料
干涉仪
之前已经详细的描述了活细胞干涉仪(1)。简而言之，该系统是基于改进型VeecoNT9300光学轮廓仪(optical profiler)的光学显微镜，装有20X0.28NA Michelson干涉物镜，该物镜不仅可以用常规光学分辨率(对于20x的物镜，1.16μm)观测侧面特征而且可以在1纳米尺度以下观测反射目标的高度维度。Michelson干涉仪由分束器、参考反射镜(reference mirror)和用于调整由样品周围的流体引起的光路差异的补偿流体单元(compensating fluid cell)。相移干涉测量(PSI)方法用于获取原位细胞体的相图(14)。测量过程中，压电转换器稍微减小光路(光程)，从而导致测试束和参照束之间的相移。该系统记录在许多不同相移下的所得到的干涉图案的辐照度，并然后使用PSI算法通过对辐照度数据积分来转换辐照度至相波前数据(phase wavefront data)。正如惯例所设定的，自动聚焦和PSI测量周期采用12秒。PSI测量本身采用1～2秒，并受限于照相机帧速率(60fps)。在本实验中，每7分钟获取包括400～1,000个细胞的一组25张图像。25张图像的每个组包括数百个细胞，具有来自本文呈现的前5张图像的数据，并且因此每次运行(run)包括约80个细胞。测量所选定的每个图像内的全部细胞。
数据分析
源自Veeco NT9300的软件允许对从相图中人工选择的细胞进行自动化光学稠度测量。如在本文中所描述的，使用转化常数α=1.8×10-3m3kg-1(与Ross(9)一致)将光学稠度转化为质量。每个细胞的界限自动通过算法来选择，该算法使用由像素高度的直方图所确定的阈值将目标从背景中区分开(15)。原始相图向光学稠度的转化使用一系列良好确定的“相打开(phase unwrapping)”路径(16)。任选地，通过减一波长(negative onewavelength)(530nm)因子将相位转化为光学稠度是不准确的，这导致含细胞的邻近区域具有比真实值小一波长的表观光学稠度。这种误差容易被检测为光学稠度的非物理的突变，并通过增加一光学稠度波长(one wavelength of optical thickness)至受影响的像素来校正。这过程现阶段不是完全自动化的。
测量误差的定量
在电磁理论(17,18)中，通过包括超速离心(3,4,10～12,19～21)、蛋白质溶液、水凝胶和透明薄膜的折射法(22～24)，x-射线密度测定法(25)和电子显微镜(26～30)的多种参照技术确定了用于细胞质量测量的干涉显微镜的准确性。为了表征该LCI系统的准确性和稳定性，我们进行了几个基准实验，图8-11给出了其细节。LCI质量测量的变化系数(CV)的下限确定为约0.35%，该下限为干涉测量光学路径(1.2埃；图8a)的时间稳定性的函数。针对连续测量模拟细胞(CV<0.4%，图8b)的部分熔融的聚苯乙烯小球，以及针对真实的活细胞的短暂重复测量(CV<1%，图9)来确定类似CV。我们测量了通常在流式细胞仪(Flow Check,Polysciences Inc)中用作校准标准的6μm直径的聚苯乙烯球的种群(图10a)，且对于该流式细胞仪，制造者提供了种群平均体积和标准偏差，由LCI确定的种群质量CV(6.8%)大大小于由制造者确定的值(15%)。我们还测量了从15周大的雌性C57BL/6小鼠中新鲜获得的红细胞(RBC)种群(图10b～c)。小鼠的RBC充当信息独立标准(informative independentstandard)，这是因为对于平均细胞质量，存在确定的数值范围(由光化学的方法和其它方法确定)。我们的LCI-确定的平均RBC细胞质量的数值，19.4pg，和已公布的数值范围(15～21pg)(9～12,31)高度一致。最后，作为对比，我们测量了多种哺乳动物细胞类型的种群质量(图10b,11)。这些结果以及小鼠RBC和聚苯乙烯球数据绘制于图9b中。为了估算在多小时的活细胞实验中测量差异的范围，将全部单个细胞质量对时间数据(表示约480个细胞)拟合成简单的指数生长模型(质量(t)=m0*Ct，其中常数C接近于1)，并将残差计算成在每个时间点上趋势数据和实际数据之间的百分比差值(图12a)。残差对称性地分布于0左右(图12b)，并在25～75%的四分位数(IQR)的范围从0.0126(c2)变化至0.027(c3)。平均IQR为0.02。总和考虑，这些结果表明测量重复性的下限位于0.5～1.0%数量级和上限为2.0～3.0%。活细胞短时间测量和长时间测量的主要区别是形状的改变，其在超出小时的尺度下发生。这能够由以下因素导致积分光学稠度的差异增加：(1)在区分细胞界限中的小误差，(2)存在于“圆形的(rounded)”细胞边缘处的紧密分开条纹的光学“平均”，以及(3)α(质量对光学稠度的常数)数值的电势变化，尽管之前的研究结果表明该误差是相对小的(3)。已经确立的，(1)α不受浓度变化的影响，甚至高达结晶蛋白质(crystallized protein)溶液的界限(9)，(2)α反映了和特定位置下的光相互作用的质量(9～12,13)，并因此不受随细胞生长细胞占据视野内多大面积的影响，以及(3)在整个细胞中发现的材料的宽范围内，α值保持接近于0.0018(32)。
细胞系和组织培养
保持H929人类多发性骨髓瘤细胞在37℃下、5%的CO2下和补充有10%规定的胎牛血清(HyClone)和抗生素的RPMI1640生长培养基中。观测室是4.5cm的直径和1.5cm的深度，并具有置于塑料架顶部的2x2cm的硅质基底，使得硅靠近流体表面的顶部。通过一块光学玻璃(BK7glass,Quartz Plus,Inc.,Brookline,NH)来实现成像细胞以形成均一厚度的样品室，该光学玻璃通过置于三个600μm的不锈钢珠(Salem Specialty Ball Company,Canton,CT)顶部的方式和硅表面分离开。使用蠕动灌注泵以0.5mL/min的速率使充入含5%CO2的空气的起泡培养基连续流过温育室。样品室上的530nm波长的LED光照(Luxeon Star LED,Brantford,Ontario)入射光具有15μW的功率，铺展成1.2mm直径的光照斑点。尽管没有确定实验持续时间的上限，但是在这种构型下测量细胞对外部刺激的响应长达7小时，并观测不受干扰的培养物长达12小时。
药物处理、细胞周期分析和核酸分离
以1x106细胞/孔的密度将H929细胞接种于6-孔培养平板中。在将细胞置于LCI的观测室之前，在向培养基中以10mg/ml的浓度添加具有1μL的衣霉素(T7765;Sigma-Aldrich)的DMSO或单独的DMSO，DMSO/培养基(1:1000的稀释度)。在细胞置于观测室的1小时后开始质量测量以便使实验体系稳定，即培养物驯化、温度稳定等。对于细胞周期分析，收集来自每个时间点的细胞，并用含碘化丙啶的低渗DNA着色缓冲液温育，并随后通过流式细胞仪来分析。使用Trizol试剂(Invitrogen)提取每个时间点的RNA。
反转录、RT-PCR和定量RT-PCR
使用Superscript III first strand cDNA合成试剂盒(Invitrogen)由3μg具有寡(dT)引物的总RNA来合成cDNA。使用Platinum Taq(Invitrogen)在58℃的退火温度下进行XBP1剪接的和未剪接同种型的RT-PCR持续25个循环。如所描述的(33)，使用SYBR green实时PCR试剂盒(Diagenode)和AppliedBiosystems(Foster City,CA,USA)7700序列检测器进行CHOP(DDIT3)mRNA的定量RT-PCR。分析样品的36b4表达作为归一化对照。引物序列按需可得。
结果和讨论
先前未报道以细胞接细胞(cell-by-cell)为基础，长时间尺度内(几小时)针对同时测量约100个细胞的整个种群的质量累积动力学。为了测试LCI质量概貌分析能够快速确定对外部细胞刺激的响应(例如药物响应)的假使，我们将H929多发性骨髓瘤细胞暴露于药物衣霉素(TM)(一种蛋白质糖基化的抑制剂)(34)，并通过连续测量超过五小时的质量来比较经TM处理过的细胞和未处理过的对照细胞的生长概貌。
我们确定H929细胞质量的初始分布是接近对数正态分布的，范围在200～700pg。大多数细胞具有大于200pg且小于400pg的质量，而小部分(36%)的比平均值大得多，其质量在500pg以上。处理过的和未处理过的种群都表现出生长，但处理过的细胞的质量累积速率要慢得多(图3)。两个种群的生长概貌明显不同(图3a～b)，并且在两者中，少数细胞表现出质量显著的增加(+15%的增幅)或少量的至没有质量累积(<5%的增幅)。处理过的种群生长的抑制出现在两小时内，并且到四小时时是显而易见的(图3c～d)。因此，在几个小时的处理期间，实现整个种群检测和细胞药物响应的定量。处理过的和未处理的组的生长速率的差异(图3c～d)在五小时时接近于在同一时间点时的经处理和未经处理的培养物之间的差异等级。这些实验隔日进行，同时从原种(master stock)中取出不同的传代培养物。因此，它们是“生物学的”而不是“技术上的”复制品，并且行为上的差异可能反映生物学的差异。我们对对照的样品使用技术上的复制品以判断测量误差为<3%CV。然而，我们注意到，在每个经处理的样品和每个未经处理的样品之间归一化的最终质量的差异(最终/初始)在统计学上是有意义的，p<0.05(图3c～d)。这提供了LCI能够检测在经处理的和未经处理的细胞种群之间的生长速率的差异。
在单个细胞水平上，无论是经处理的细胞还是未经处理的细胞，在实验误差内的单独细胞的生长速率很大程度地依赖于细胞质量(图7)。一个例外是经处理的种群Tm1，其在该种族较大的细胞亚群中表现出趋向缓慢生长的统计学上显著的线性趋势。这种差异的原因是不清楚。有意思的是，具有任何特定质量分数的生长速率的展开不能完全由测量误差来解释，也暗含该差异的生物学起源。该差异(以生长对质量数据的线性最小平方拟合的残差标准来显示)的范围为3.15.8%(图12)，尽管我们估计质量测量的误差<3%CV(参见方法中误差的讨论)。
为了关联质量累积动力学和生物化学信号，我们用PCR描绘分子标记物并对处理过的种群进行细胞周期分析。在处理过的和未处理的种群之间生长速率的差异和转录因子CHOP及XBP1的剪接形式(“XBP1-s”)的上调是同步发生的，在处理过的种群中(图4a～b)。CHOP和XBP1-s激活承担缓和内质网构造中的蛋白质错误折叠(mis-folding)的影响的基因宿主，通过分子伴侣的增大制造以助于蛋白质折叠和错误折叠的蛋白质的加速降解(所谓的解折叠蛋白质响应、UPR和ER-辅助蛋白质降解、ERAD，路径)(35)。这和已知的TM作用机理是一致的(34)。UPR和ERAD分子路径均是在大范围疾病(包括多发性骨髓瘤)中治疗干预的新兴目标。
XBP1是环境依赖性的正向的或负向的细胞生长调节剂且在多发性骨髓瘤细胞中不同(34)。它的双极转录电势的分子动力学并未被充分理解。在我们实验条件下，XBP1mRNA剪接的诱发与减慢的质量累积相关联，而不是与细胞的皱缩和凋亡相关联。对细胞质量的这种时间确定的、非破坏性测量极大地有助于对增值促进和抑制的分子信号的冲突解释，通过常规技术(包括免疫组织化学或qPCR)加以分析。细胞周期数据表明G2/M相种群的快速减少和G1/G0种群相应地增大，这和细胞周期停滞相一致(图4c)。这种变换在TM暴露三小时后变得显著，五小时处理结束时在G1/G0中保留50%的细胞。这也和UPR路径激活导致细胞周期停滞的观测结果一致(35,36)。
我们通过观测单体分裂和直接测量母子细胞的质量来确定分裂细胞的质量范围。在整个全部实验中，观测了全部约600个细胞中的28个细胞分裂。分裂数目是非对称的，有利于未处理的种群，18:11。这和所观测到的未处理种群的较高的生长速率是一致的。细胞分裂时的质量是严格控制的且在经处理的和未经处理的种群两者中是相似的(图5a)。分裂时的中值质量为515pg(+/-75pg)，两个生成的子细胞每个具有250pg(+/-40pg)的中值质量。这一结果使我们通过种群中单个细胞的质量数值可以推导出其可能处于细胞周期的早、中和晚期。尽管大多数情形下，子细胞的质量分数为约50/50，少数细胞分裂是高度不对称的，两个子细胞中较小者保留小于45%的母细胞质量(图5b)。经历不对称细胞分裂的两个细胞的质量图谱显示于图5c中。
LCI具有明显优于其他确立的和出现的单细胞质量测量方法的优点。不同于中空悬臂MEMS质量测量装置(5,6)，其要求非贴壁细胞，LCI对于贴壁或非贴壁细胞同样适用(图6)。处理贴壁细胞的能力对于探究质量积累/分布和细胞:基底相互作用之间的关系以及对于评估上皮或间质细胞(该间质细胞形成人类恶性肿瘤块)类型绝对关键。LCI还是用于关联质量分布和全部种类细胞的迁移、游动性和通常用于药物发现的组织侵袭力分析。干涉测量显微镜允许对样品的全光学接近，意味着容易地得到高分辨率的光学照片和荧光图像。这能够将质量概貌分析和用于细胞生物学的荧光指针分析(fluorescent reporterassay)的大量设备组合使用，用于同时测定。此外，LCI展现出定量追踪和处于或随后处于细胞分裂的单独细胞质量的定量。这将直接首次能够进行例如干细胞的质量分配的广谱分析。
LCI是高通量的并允许随时间对同一细胞的纵向测量，它也是高度平行的，使得同时进行上百个纵向测量并降低源于条件变化的实验间误差。然而，偶尔地，由于对大于2π位移的不确定性，通过减一波长(530nm)因子将相位转化为光学稠度是不准确的。这种情形导致具有细胞的邻近区域具有比真实值小一波长的表观光学稠度。这种误差作为光学稠度的非物理性突变易于检测并通过对受影响的像素再加一光学稠度波长来校正。目前这种校正过程不是全自动地，尽管阐述这一问题的主体工作已存在于文献(16)。
我们已经测量了长达7小时的细胞对外部刺激的响应，并观测不受干扰的培养物长达12小时。原则上，测量能够持续长得多的持续期，因为在严格控制的培养条件下细胞能够存活数天。一个对于LCI和任选的方法(5,7,8)常见的限制是在细胞引入观测室或在引入具有不同温度或密度的培养基后，用于稳定系统所需的时间。在本实验中，我们保守地采用一小时的稳定时间，尽管该稳定时间按需能够至少减半。
总之，高通量的LCI质量概貌分析是用于定量单个细胞、基于对环境扰动相应(例如医学相关的药物响应)的种群的敏感和准确的机制。
能够采纳本领域内已知的多种方法和材料来实现和/或使用本发明的实施方式，例如那些公开于以下参考文献中的。
前文中用括弧指出的参考文献
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实施例2：通过质量概貌分析定量单个和成簇乳腺癌细胞的实时药物灵敏性
如上所述，活细胞质量概貌分析是通过细胞质量随时间的皮克级变化来快速定量对治疗试剂的响应的有前景的新方法。质量分析的重大障碍是现存方法不足以处理多形的细胞簇和团，细胞簇和团而不是分离的单个细胞更通常地存在于来源自病体的样品或组织培养物。本文中，提供自动活细胞干涉仪(aLCI)作为单个细胞和菌落形成人乳腺癌细胞系对HER2-引导的单克隆抗体(HER2-directed monoclonal antibody)、群司珠单抗(赫赛汀)的灵敏性的快速和准确的定量器的证据。确定了相对灵敏性比可行的常规增殖分析快数十至数百倍。这些aLCI在成簇样品评价和速度上领先并可用于对来源自病体的实体瘤样品的治疗响应测试，来源自病体的实体瘤样品在离体条件下仅存活短时间并可能以细胞聚集体和簇的形式。
在美国，2011年有230480个妇女诊断出乳腺癌并有39520个妇女死于该疾病(参见例如，R.Siegel,et al.CA Cancer J Clin.2011,61,212-36)。这种常见的恶性肿瘤的临床过程和结果是可变的，尽管治疗通常由临床评估的组合来评估，该临床评估包括肿瘤亚类、临床等级和阶段(grade and stage)以及雌激素(EP)、孕酮(PR)和增强的HER2细胞表面受体的表达(参见例如M.Ignatiadis,et al.Clin Cancer Res.2009,15,1848-52;M.Ignatiadis,et al.Nat RevClin Oncol.2012,9,12-4)。不幸地，表达EP、PR和/或增强的HER2表面受体的乳腺癌不总是响应于以这些受体关联的途径为目标的诊断，使得仅分析这些生物标记物的表达不足以得出治疗决定。例如，具有增强HER2表达的乳腺癌通常对于人源化的单克隆抗体群司珠单抗(赫赛汀)不响应(参见例如JA.Wilken,et al.Primarytrastuzumab resistance:new tricks for an old drug.In:Braaten D,editor.TowardPersonalized Medicine for Cancer2010.p.53-65)。此外，初始响应性、受体阳性的肿瘤可能随时间的推移变成对靶向治疗为耐受的，这在HER2增强的乳腺癌(参见例如R.Nahta,et al.Breast Cancer Research.2006,8)以及同样很多其他类型的癌症中出现。
现有的乳腺癌和其它癌症的生物标记物方法的常见特点和不足是它们通常是静态、实时快照的替代性(surrogate nature)不会直接评估肿瘤细胞对用于具体病患的特定制剂的响应。高级方法(如果存在的话)是能够通过实时监测肿瘤如何对一组待选治疗的响应，并然后选取对特定病患疾病最有效的制剂(一种或多种)。活细胞的实时质量分析是可以提供高级方法的新的和可重复的生物物理测量方式。使用光学方法(参见例如G.Popescu,et al.American Journal of Physiology-Cell Physiology.2008,295,C538-C44;B.Rappaz,et al.Optics Express.2005,13,9361-73;J.Reed,et al.BiophysJ.2011,101,1025-31;J.Reed,et al.ACS Nano.2008,2,841-6)或微构造传感器(参见例如M.Godin,et al.Applied Physics Letters.2007;91;K.Park,et al.Proc Natl Acad SciU S A.2010,107,20691-6)实现活细胞质量概貌分析，并能够在暴露于变化的外部环境的细胞种群中产生单个细胞干质量变化的快速、连续的定量，包括检测细胞对生长抑制剂或细胞毒素剂的响应(参见例如J.Reed,et al.Biophys J.2011,101,1025-31)。不幸地，由于技术限制，活细胞质量概貌分析目前局限于作为空间隔离的单个细胞(例如细菌、酵母菌和淋巴细胞)存在的细胞类型。这是质量概貌分析用于实体瘤治疗响应测试(例如在乳腺癌中)的有效利用的主要路障。通常，经解剖的肿瘤样品(甚至是机械解聚的情况)以小的和大的多细胞团、层或球而不是纯粹的单个细胞的形式存在。同样，分离实体瘤成单个细胞所需的搅拌可能会破坏细胞和扰乱细胞间和细胞-基质间相互作用，其可能对恶性表型的保持是关键的且是评估制剂响应性所需的(参见例如BE.Miller,et al.Cancer Res.1981,41,4378-81;MS.Wicha,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1982,79,3213-7)。
使用如本文所公开的质量概貌分析，称作自动活细胞干涉测量法(automatedLive Cell Interferometry,aLCI)，已经克服了这种抑制障碍。使用aLCI已经能够分析以单个细胞和大菌落或簇形式生长在培养基中的乳腺癌的治疗响应动力学。这些组织化的菌落在数目上多达50个细胞，并且还可以准确地测量更大的菌落。从暴露于群司珠单抗超过六小时的四种乳腺癌细胞系中已经定量了细胞或菌落种群的生长动力学。在该研究中，在事先不知晓哪种乳腺癌系表达增强的HER2表面受体或表达水平的情况下进行aLCI。通过定量单个细胞/单个菌落的质量累积，非常高准确地快速区分群司珠单抗-敏感性和耐药性肿瘤。显然，aLCI确定敏感性和耐药性细胞和菌落比使用常规技术的可行方法(例如细胞增殖测定)快约对数级。在速度和敏感性的改进允许评估敏感性HER2-增强乳腺癌响应以及相对的耐HER2-增强乳腺癌响应。它也允许转移至通常脆弱的临床，取自病患的细胞仅短时间内存活的，并且如果样品不全部是实体瘤类型，该样品更容易为单个细胞和多个细胞聚集菌落的异种混合物的形式。
使用具有20μg/ml临床级群司珠单抗的共培养液(co-incubation)的aLCI实时进行四个人体乳腺癌细胞系的质量响应概貌分析。对于每种细胞类型，同时测量只含培养基的对照孔和含群司珠单抗的经处理孔。BT-474和SK-BR-3这两个系具有高水平表面受体表达的增强的HER2，并且对体外的群司珠单抗表现出不同的灵敏性(由5～7天的增殖分析所评估)，然而其他两种系，MCF-7和MDA-MB-231，在正常含量下表达HER2受体并是耐群司珠单抗的(参见例如NA.O'Brien,et al.Molecular Cancer Therapeutics.2010,9,1489-502)。重要地，这些细胞系生长成非常不同的形态。MDA-MB-231和SK-BR-3生长成单个细胞或松散的脱聚簇，而MCF-7和BT-474系生长成密集的多细胞菌落(图13)。在单个的MCF-7细胞(质量约5x102pg)和大菌落(约22x103pg)之间的相对大小涵盖44倍的质量差异(图14)。
在7小时内，连续测量上百个单个细胞和菌落的质量。以30分钟间隔对每个细胞系的平均质量累积速率绘图以表征在经处理组和对照组中的整个种群响应(图15a)。HER2的正常表达系(MCF-7和MDA-MB-231)的经处理样品和对照样品随时间表现出相同的质量增加。相对地，对于HER2增强的高表达系(BT-474和SK-BR-3)，经处理的样品和对照样品的生长速率在约4h的处理时开始岔开。群司珠单抗敏感系(SK-BR-3和BT-474)在生长速率上表现出高度显著的差异(p<0.001)而不敏感系(MCF-7和MDA-MB-231)没有表现出不同(图15b)。BT-474系比SK-BR-3系对群司珠单抗更具响应性，6h后对照-经处理的质量倍数变化分别为1.70+/-0.39和1.24+/-0.10(平均+/-标准误差，图16)。两个敏感系中，SK-BR-3最初以分离的单个细胞存在而BT-474生长成小菌落，表明菌落形成不可预测或不是群司珠单抗敏感性或抗性(耐药性)所需要的。也比较了对群司珠单抗aLCI-测量的响应和用常规多天、细胞计数生长-抑制方法所确定的响应。在全部四种情形下，由aLCI测量的6h内的群司珠单抗敏感性是和由细胞计数所测量的3～7天内的敏感性一致(图16)。
这些结果表明不论所检测细胞的物理构型或关联，采用aLCI的活细胞质量定量能够快速和灵敏地检出在乳腺癌中对群司珠单抗的生物响应。其它近期发展的活细胞质量概貌分析方法，例如MEMS微-共振器，取决于微-共振器的构造，能够即时高准确地测量单个细胞质量(参见例如M.Godin,et al.Applied Physics Letters.2007;91;K.Park,etal.Proc Natl Acad Sci U S A.2010,107,20691-6)。该方法的缺点是为了实现足够的灵敏性，共振器的活性区域必须是微米或更小的数量级，这使得连续测量单个细胞和更大的多细胞菌落的混合物(正如大多数实体瘤类型所出现的)是非常困难(即便不是不可能)。
通常，定量的相位光学显微镜方法，包括aLCI，具有和MEMS-基的方法相同的质量测量精度和准确度(参见例如，Popescu,et al.American Journal of Physiology-CellPhysiology.2008,295,C538-C44;J.Reed,et al.Biophys J.2011,101,1025-31)，并它们在细胞簇和团研究中的应用受限于和高通量相位成像相关的实际困难，而不是受限于基本的物理限制。转换原相位图像至质量信息在计算上是挑战性的，特别是在具有复杂内部结构和相比于照明波长的较大光学稠度细胞簇和对象的情形中(参见例如D.Ghiglia,etal.Two-Dimensional Phase Unwrapping:Theory,Algorithms,and Software:JohnWiley&Sons;1998)。加快对聚集细胞簇、片和球的治疗响应的分析和定量的速度提供在实体瘤诊断中用于制剂选择和预测的令人兴奋的新机会。
材料和方法
细胞系和培养物
从American Type Culture Collection(Rockville,MD)获得BT-474、SK-BR-3、MDA-MB-231和MCF-7的乳腺癌细胞系。全部系保存在补充由10%胎牛血清(Omega;Tarzana,CA)和1%青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI1640(Cellgro;Manassas,VA)生长培养基中。
药物处理
以20μg/ml的剂量使用临床级群司珠单抗(赫赛汀)(Genentech;South SanFrancisco,CA)。
增殖分析
开始处理前，接种5x104个细胞至12-孔的平板中并使其贴壁和生长两天。在第0、3、5和7天用20μg/ml的赫赛汀处理，使细胞胰酶化(trypsinize)并计数。为了计算倍数变化，确定对照样品和经药物处理的样品的倍增时间(doubling time)(DT=t*(log(2)/log(Nt/N0)))，和倍数变化表示作DTdrug/DTctrl。DT=倍增时间，t=时间，Nt=在t时的细胞数目或质量，N0=时间为t=0时的细胞数目或质量。
共焦成像
接种细胞至隔开的盖玻片上并使其贴壁过夜。用在1x PBS(pH为7.4)中的3.7%的甲醛固定细胞，并在0.1%的Triton-X中通透化。然后，用Alexa568-Phalloidin actinstain(Invitrogen;Grand Island,NY)和DAPI温育样品。用具有Zen2010软件的ZeissLSM780CCD相机获取共焦图像。
干涉仪
先前已经描述了活细胞干涉仪(参见例如，J.Reed,et al.Biophys J.2011,101,1025-31;J.Reed,et al.ACS Nano.2008,2,841-6;J.Reed,et al.Nanotechnology.2008,19)。该系统由具有20X0.28NA的Michelson干涉物镜的改良型Bruker NT9300光学轮廓仪(Bruker;Tucson,AZ)组成。Michelson干涉仪包括分束器、参考反射镜和用于解决由样品周围的流体引起的光路差异的补偿流体单元。相移(PSI)方法用于捕获细胞样品的相位图像。为了使多个样品成像，aLCI使用小电动机来调整干涉仪参考反射镜在每个样品孔处盖玻片光路长度上的微小差异。
数据分析
使用常规的、由Matlab(Mathworks Inc.,Natick,MA)写入的多步程序进行图像分析。第一步是用于除去由使用Bruker Vision软件(Bruker Nano Inc.,Tuscon,AZ)的Goldstein相位打开算法处理后保留的相位误差(由于定量相位成像中固有的模糊产生的整体波长误差)。该算法使用离开每个像素的多个随机游动(walk)来消除整体波长跳跃和在背景水平以下的非物理性的偏差。第二步是使用局部自适应中值滤波器和分水岭变换的组合来将每个图像分割成细胞或菌落对象。最后，使用适用于基于IDL颗粒追踪代码(particle tracking code)的Daniel Blair和Eric Dufresne的Matlab的颗粒追踪代码追踪由图像分割确定的对象(参见例如JC.Crocker,et al.Journal of Colloid andInterface Science.1996,179,298-310)。

Claims (39)

1.观测细胞对测试试剂的响应的方法，所述方法包括：
(a)在含有所述测试试剂的第一环境中，提供至少一个细胞；
(b)进行活细胞干涉测量法以测定与在所述第一环境中的细胞的质量成比例的测量结果，其中所述活细胞干涉测量法包括测量在传播穿过细胞的测试光束和参照光束之间的分数相移，测定所测量的细胞的界限，并且使用此界限，在所述细胞的整个面积上对所述分数相移积分以提供所述测量结果；以及
(c)进行活细胞干涉测量法以测定与在缺少所述测试试剂的第二环境中的细胞的质量成比例的测量结果，其中所述活细胞干涉测量法包括测量在传播穿过细胞的测试光束和参照光束之间的分数相移，测定所测量的细胞的界限，并且使用此界限，在所述细胞的整个面积上对所述分数相移积分以提供所述测量结果；和
(d)比较(b)中所测定的测量结果和在(c)中所测定的测量结果，其中所述在(b)中所测定的测量结果和在(c)中所测定的测量结果的差异指示所述细胞对所述测试试剂的响应，并且其中所述方法提供在处理至四小时足以检测所述细胞对所述测试试剂响应的灵敏度。
2.根据权利要求1的方法，其中所述方法提供在处理的两小时内足以检测所述细胞对所述测试试剂响应的灵敏度。
3.根据权利要求1的方法，其中观测了质量性质的至少一个细胞以分离的单细胞存在于第一环境中。
4.根据权利要求1的方法，其中观测了质量性质的至少一个细胞以细胞簇或细胞团存在于第一环境中。
5.根据权利要求4的方法，其中所述细胞簇或细胞团包含至少5个细胞。
6.根据权利要求4的方法，其中所述细胞簇或细胞团包含至少10个细胞。
7.根据权利要求4的方法，其中所述细胞簇或细胞团包含至少25个细胞。
8.根据权利要求4的方法，其中所述细胞簇或细胞团包含至少50个细胞。
9.根据权利要求1的方法，其中对存在于第一环境中的多个细胞的质量性质进行观测。
10.根据权利要求1的方法，其中所述测试试剂包括抗生素、抗体、烷化剂、抗代谢物、细胞周期抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、siRNA或细胞。
11.根据权利要求10的方法，其中所述测试试剂包括结合HER2的抗体。
12.根据权利要求1的方法，其中对第一环境中的细胞的质量性质进行多次观测以便观测细胞的质量性质在一段时间内如何变化。
13.根据权利要求12的方法，其中随时间观测细胞的质量性质的改变以观测时间质量概貌。
14.根据权利要求13的方法，进一步包括比较所观测的时间质量概貌和时间质量概貌的数据库，其中选择时间质量概貌的数据库以包括特征为对所述测试试剂的细胞敏感性的时间质量概貌和特征为对所述测试试剂的细胞耐药性的时间质量概貌。
15.根据 权利要求1的方法，其中所述方法包括：
(a)将细胞置于适于测量测试光束和参照光束之间的分数相移的干涉显微镜的观测室；
(b)将细胞暴露在处于照明波长的测试光束下；
(c)测量在传播穿过细胞的测试光束和参照光束之间的分数相移；
(d)使用步骤(c)中得到的测量结果来观测细胞的质量。
16.根据权利要求1或15的方法，其中使用以下方程式来观测细胞的质量：
其中m是细胞的质量，α是描述相移和细胞质量之间关系的常数，是所测量的分数相移，λ是照明波长，以及对整个细胞面积A进行积分。
17.根据权利要求16的方法，其中α＝1.8×10-3m3kg-1。
18.根据权利要求1或15的方法，其中多次观测细胞的质量以便观测细胞的质量在一段时间内如何变化。
19.根据权利要求1或15的方法，其中所述方法用于定量多个细胞的质量。
20.根据权利要求1或15的方法，其中鉴定了至少一百个细胞并确定了随时间的推移每个单独的细胞的质量。
21.根据权利要求1或15的方法，其中在测量时间点处最大的峰-峰残差为中值质量的2.61％。
22.根据权利要求1或15的方法，其中使用活细胞干涉测量系统实施所述方法，该活细胞干涉测量系统包括：
(a)可操作性连接于显微镜的检测器；
(b)包括适于容纳细胞的观测室的样品组件；
(c)包括适于容纳参照细胞的参照室的参照组件；以及
(d)用于将来自光源的光束分成测试束和参照束的分束器。
23.根据权利要求22的方法，其中所述观测室包括镜面的基底。
24.根据权利要求22的方法，其中所述显微镜是能够通过流体培养基观测干涉边缘的干涉显微镜。
25.根据权利要求22的方法，其中所述显微镜包括Michelson干涉物镜。
26.根据权利要求22的方法，其中所述活细胞干涉测量系统包括检测器。
27.根据权利要求26的方法，其中所述检测器选自由以下组成的组：静物照相机、视频照相机和电荷耦合器件(CCD)。
28.根据权利要求22的方法，其中所述系统能够观测多相移处的干涉图案，并将观测的所述干涉图案和细胞的光学稠度概貌关联。
29.根据权利要求22的方法，其中所述显微镜的物镜和所述观测室的相对位置通过计算机来控制且是三维可移动的。
30.根据权利要求22的方法，其中所述观测室中的细胞保持在标准细胞培养环境中。
31.根据权利要求22的方法，其中观测室包括至少一根适于在室内循环细胞培养基的灌注管。
32.根据权利要求22的方法，其中活细胞干涉测量系统包括适于处理一个或多个细胞图像的处理器元件和/或存储一个或多个细胞图像的记忆存储元件。
33.根据权利要求1或15的方法，其中测量了至少六小时的细胞的光学稠度概貌。
34.根据权利要求1或15的方法，其中观测细胞的质量性质来定量细胞对于治疗组合物的响应。
35.根据权利要求34的方法，其中从罹患癌症的个体获得细胞，并使用治疗组合物来治疗癌症。
36.根据权利要求1或15的方法，其中所述方法观测水性培养基中活细胞的光学稠度。
37.根据权利要求1或15的方法，其中所述方法提供了细胞的生长速率的测量。
38.根据权利要求37的方法，其中所述方法提供了处理过的和未处理的细胞之间生长速率的差异的测量。
39.根据权利要求1或15的方法，其中所述方法提供了分裂细胞群(dividing cellpopulation)中的母细胞和子细胞的质量的测量。
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