WO2018116818A1 - 細胞組織体の評価方法および薬効評価方法 - Google Patents

Abstract

培養された細胞組織体がどのような状態にあるかを、非侵襲で定量的に評価することのできる技術を提供する。本発明に係る細胞組織体の評価方法は、培養された細胞組織体を断層撮像する工程（ステップＳ１０３）と、撮像により取得された画像データに基づき、細胞組織体の三次元形状を表す立体データを作成する工程（ステップＳ１０４）と、立体データに基づき、細胞組織体に含まれる、互いに孤立した構造物の数を計数する工程（ステップＳ１０５）とを備える。

Description

細胞組織体の評価方法および薬効評価方法

　この発明は、培養された細胞組織体をその画像に基づいて評価する評価方法、および、その評価方法を用いて細胞組織体に対する化学物質の薬効を評価する薬効評価方法に関するものである。なお、この明細書にいう「薬効」は、例えば増殖の促進や病変の改善など生体に対し化学物質が及ぼす好ましい影響と、細胞を傷害する毒性等の悪影響との双方を含む概念である。

　新たな医薬品を開発する創薬の技術分野や、化学物質が生体に及ぼす影響を調べる薬効評価の技術分野では、化学物質が生体に及ぼす影響を調べるための実験が行われる。このような実験の例として、動物等の生体に化学物質を投与して変化を観察する、いわゆるin vivo試験と、容器中で人工的に培養された細胞や組織に化学物質を投与して観察する、いわゆるin vitro試験とが知られている。このうちin vitro試験は、実験用の生体を用いないため試験コストおよび動物愛護等の観点で有利なものである。しかしながら、生体内での化学物質の影響をより詳しく知ることができるという点では依然としてin vivo試験が有利である。

　近年では、幹細胞研究の高まりから組織分化に対する知見が蓄積されてきている。また、種々の臓器や器官について、その構造や機能を人工的に再現した組織様の構造体（例えば細胞組織体、オルガノイドなど）が作製されるようになってきている。このため、in vitro試験によっても、十分に詳しい知見を得ることができるようになりつつある。

　一方、培養された細胞組織体の状態を定量的に評価する技術としては、例えば特許文献１に記載されたものがある。この技術では、観察対象となる組織に対し、マーカーあるいはレポーターの導入など観察の便宜のための加工が施され、これらに起因する特有の発光が計測される。また他の方法としては、例えば特許文献２に記載されたように、培養された細胞組織体の光学像を撮像して画像処理により解析するものがある。

特開２００４－２７５０２９号公報 国際公開第２０１１／０２１５５８号

　対象物を加工して観察する方法や、細胞組織体の立体構造を撮像するために対象物をスライスして標本化する方法は、細胞組織体を変質させてしまう。このため、細胞組織体の経時変化を継続的に評価することが不可能である。また、立体的な細胞組織体を二次元画像面に投影した画像では、細胞組織体の立体構造を的確に表現することができない。これらの点で、上記従来技術には改善の余地が残されている。

　これに対し、細胞組織体の立体像を非侵襲で撮像する方法として、断層撮像技術、例えば光干渉断層撮像技術（Optical Coherent Tomography；ＯＣＴ）がある。この技術によれば、立体構造を有する細胞組織体の鮮明な立体像を撮像することが可能である。この撮像技術により撮像された細胞組織体の像を、細胞組織体の状態の定量的な評価に利用することが期待されるが、これまでそのような評価手法は確立されるに至っていない。

　この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、培養された細胞組織体がどのような状態にあるかを、非侵襲で定量的に評価することのできる技術を提供することを第１の目的とする。また、この発明は、細胞組織体に対する化学物質の薬効を、非侵襲で定量的に評価することのできる技術を提供することを第２の目的とする。

　この発明の一の態様は、細胞組織体の評価方法であって、上記第１の目的を達成するため、培養された細胞組織体を断層撮像する工程と、撮像により取得された画像データに基づき、前記細胞組織体の三次元形状を表す立体データを作成する工程と、前記立体データに基づき、前記細胞組織体に含まれる、互いに孤立した構造物の数を計数する工程とを備える。

　細胞の生存に好ましい環境で細胞組織体が培養されている場合、細胞組織体は一体的に所定の機能を有する状態を維持すると考えられる。一方、細胞を衰弱させるような環境で細胞組織体が培養されている場合、細胞が衰弱または死滅することによりその機能が失われてゆく。このとき、細胞間の結合が弱まることで細胞組織体の断片化が進行すると考えられる。このことから、培養された細胞組織体を構成する多数の細胞が一体のものとなっているか断片化しているかを評価することは、例えば培養環境の良否判定や、培養環境に添加された化学物質の細胞への影響を評価するための手法として有用なものとなり得る。

　本発明では、培養された細胞組織体を断層撮像することにより得られるデータから、細胞組織体を構成する孤立した構造物の数が計数される。細胞組織体の断片化が進むにつれて、細胞組織体を構成する構造物のうち、他の構造物から孤立したものの数が増えてゆく。したがって、このような孤立した構造物の計数結果によって、細胞組織体の状態を定量的に表現することが可能である。

　立体的な構造を有する細胞組織体を特定の撮像方向から撮像した二次元画像においては、画像において重なっている構造物間の接続状態を把握することができない。また、細胞組織体を含む標本を多層にスライスして撮像したとしても、各層間での構造物の接続状態が不明な場合もあり、また評価対象の細胞組織体を損傷してしまうことになる。

　一方、断層撮像の結果から得られる細胞組織体の三次元形状を表す立体データを用いれば、撮像範囲内の空間（撮像空間）において細胞組織体が占める空間領域を特定することができる。すなわち、細胞組織体を構成するある構造物が撮像空間内に占める空間領域の範囲を立体データから把握することが可能である。したがって、撮像空間中に存在する互いに孤立した構造物の数についても、立体データから求めることが可能である。

　このように、細胞組織体における孤立した構造物の数は、細胞組織体の状態を定量的に評価する指標として有用なものである。本発明では、評価対象である細胞組織体を断層撮像して得られた立体データに基づき計数された、細胞組織体中の孤立した構造物の数を評価指標として細胞組織体が評価される。これにより、培養された細胞組織体がどのような状態にあるかを、非侵襲で定量的に評価することが可能である。

　また、この発明の他の態様は、化学物質の薬効を評価する薬効評価方法であって、上記第２の目的を達成するため、培養された前記細胞組織体に対し、評価対象の前記化学物質を投与する工程と、前記化学物質を投与された前記細胞組織体を、上記の細胞組織体の評価方法により評価する工程と、前記細胞組織体の評価結果に基づいて、細胞組織体に対する前記化学物質の薬効を判定する工程とを備えている。

　このように構成された発明では、化学物質が投与された細胞組織体の状態を評価するために、上記した評価方法が適用される。これにより細胞組織体の状態が定量化されて表されることとなるので、化学物質の薬効についても定量的な基準に基づく判定が可能となる。すなわち、本発明によれば、細胞組織体に対する化学物質の薬効を、非侵襲で定量的に評価することができる。

　本発明の細胞組織体の評価方法によれば、断層撮像された細胞組織体の立体データから求められる孤立した構造物の数によって、細胞組織体の状態が評価される。そのため、細胞組織体を非侵襲かつ定量的に評価することが可能である。また、本発明の薬効評価方法によれば、化学物質を投与された細胞組織体を断層撮像して得られる立体データに基づく細胞組織体の評価結果を用いて、当該化学物質の細胞組織体に対する薬効が評価される。そのため、非侵襲かつ定量的な薬効評価が可能である。

　この発明の前記ならびにその他の目的と新規な特徴は、添付図面を参照しながら次の詳細な説明を読めば、より完全に明らかとなるであろう。ただし、図面は専ら解説のためのものであって、この発明の範囲を限定するものではない。

断層撮像を行うための画像処理装置の構成例を示す原理図である。 この画像処理装置における撮像原理を説明する第１の図である。 この画像処理装置における撮像原理を説明する第２の図である。 ＯＣＴ装置の具体的構成例を示す第１の図である。 ＯＣＴ装置の具体的構成例を示す第２の図である。 この実施形態の毒性試験の処理内容を示すフローチャートである。 断層画像から得られる立体像の例を示す図である。 毒性試験の結果の一例を示す第１の図である。 毒性試験の結果の一例を示す第２の図である。 毒性試験の結果の一例を示す第３の図である。 細胞組織体の表示例を模式的に示す図である。

　以下、本発明にかかる細胞組織体の評価方法および化学物質の薬効評価方法につき、その具体的な実施形態を説明する。本実施形態では、容器内で培養された細胞組織体に評価対象となる薬剤等の化学物質が投与される。そして、時間経過に伴う細胞組織体の変化を観察することにより、当該化学物質が細胞組織体に及ぼす薬効を調べる。化学物質の薬効についてはいくつかの評価結果から総合的に判断されるが、本実施形態では、その１つとして、本発明にかかる細胞組織体の評価方法が用いられる。

　この実施形態では、底面が平坦かつ透明な培養容器に注入された培地中で、化学物質の薬効を確かめようとする細胞組織体が、予め培養される。培養された細胞組織体に評価対象の化学物質が投与され、所定時間の経過後に細胞組織体の断層画像が撮像される。得られた断層画像の解析結果に基づき細胞組織体の状態が評価され、その結果に基づき細胞組織体に対する化学物質の薬効が評価される。

　なお、以下では具体例として、ラットの腎臓幹細胞から培養により作成された腎臓様構造体（「細胞組織体」に相当）に対する化学物質の毒性を評価する毒性試験に本発明が適用された実施形態を説明する。しかしながら、本発明が評価の対象とする細胞組織体の種類や、評価の目的等についてはこれらに限定されるものではない。

　最初に、断層画像を撮像するための画像処理装置の構成と、当該画像処理装置による撮像原理とについて説明する。その後に、撮像により取得されたデータを用いた、細胞組織体の状態および化学物質の薬効の評価方法について説明する。

　図１は断層撮像を行うための画像処理装置の構成例を示す原理図である。この画像処理装置１は、培地中で培養された細胞、細胞集塊等の各種試料を被撮像物として断層撮像する。また、得られた断層画像を画像処理して、試料の立体像を作成する。なおここでは、適宜の培養容器に注入された培地中で培養された細胞組織体の試料を被撮像物とした例について説明するが、被撮像物はこれに限定されない。以下の各図における方向を統一的に示すために、図１に示すようにＸＹＺ直交座標軸を設定する。ここでＸＹ平面が水平面を表す。また、Ｚ軸が鉛直軸を表し、より詳しくは（－Ｚ）方向が鉛直下向き方向を表している。

　画像処理装置１は保持部１０を備えている。保持部１０は、容器１１をその開口面を上向きにして略水平姿勢に保持する。容器１１は、例えばガラス製または樹脂製の透明で、均質な平底を有する浅皿状のディッシュと呼ばれる器具である。容器１１には予め適宜の培地Ｍが所定量注入され、培地中では容器１１の底部１１１に試料Ｓｐが培養されている。図１では１つの試料Ｓｐのみが記載されているが、１つの容器１１内で複数の試料Ｓｐが培養されていてもよい。

　保持部１０により保持された容器１１の下方に、撮像ユニット２０が配置される。撮像ユニット２０には、被撮像物の断層画像を非接触、非破壊（非侵襲）で撮像することが可能な光干渉断層撮像（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）装置が用いられる。詳しくは後述するが、ＯＣＴ装置である撮像ユニット２０は、被撮像物への照明光を発生する光源２１と、ビームスプリッタ２２と、物体光学系２３と、参照ミラー２４と、分光器２５と、光検出器２６とを備えている。

　また、画像処理装置１はさらに、装置の動作を制御する制御ユニット３０と、撮像ユニット２０の可動機構を制御する駆動制御部４０とを備えている。制御ユニット３０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）３１、Ａ／Ｄコンバータ３２、信号処理部３３、３Ｄ復元部３４、インターフェース（ＩＦ）部３５、画像メモリ３６およびメモリ３７などを備えている。

　ＣＰＵ３１は、所定の制御プログラムを実行することで装置全体の動作を司る。ＣＰＵ３１が実行する制御プログラムや処理中に生成したデータは、メモリ３７に保存される。Ａ／Ｄコンバータ３２は、撮像ユニット２０の光検出器２６から受光光量に応じて出力される信号をデジタルデータに変換する。信号処理部３３は、Ａ／Ｄコンバータ３２から出力されるデジタルデータに基づき適宜の信号処理を行って、被撮像物の断層画像を作成する。３Ｄ復元部３４は、撮像された複数の断層画像の画像データに基づいて、撮像された細胞集塊の立体像（３Ｄ像）を作成する機能を有する。信号処理部３３により作成された断層画像の画像データおよび３Ｄ復元部３４により作成された立体像の画像データは、画像メモリ３６により適宜記憶保存される。

　インターフェース部３５は画像処理装置１と外部との通信を担う。具体的には、インターフェース部３５は、外部機器と通信を行うための通信機能と、ユーザからの操作入力を受け付け、また各種の情報をユーザに報知するためのユーザインターフェース機能とを有する。この目的のために、インターフェース部３５には入力デバイス３５１および表示部３５２が接続されている。入力デバイス３５１は、装置の機能選択や動作条件設定などに関する操作入力を受け付け可能な、例えばキーボード、マウス、タッチパネルなどである。表示部３５２は、信号処理部３３により作成された断層画像や３Ｄ復元部３４により作成された立体像など各種の処理結果を表示する、例えば液晶ディスプレイである。

　また、ＣＰＵ３１は駆動制御部４０に制御指令を与え、これに応じて駆動制御部４０は撮像ユニット２０の可動機構に所定の動作を行わせる。次に説明するように、駆動制御部４０により実行される撮像ユニット２０の走査移動と、光検出器２６による受光光量の検出との組み合わせにより、被撮像物である細胞組織体の断層画像が取得される。

　図２Ａおよび図２Ｂはこの画像処理装置における撮像原理を説明する図である。より具体的には、図２Ａは撮像ユニット２０における光路を示す図であり、図２Ｂは試料Ｓｐの断層撮像の様子を模式的に示す図である。前記したように、撮像ユニット２０は光干渉断層撮像（ＯＣＴ）装置として機能するものである。なお、ここでは説明のために試料Ｓｐを略球形として表示しているが、実際の撮像において試料Ｓｐの形状は特に限定されない。例えば後述するように、幹細胞から分化培養された腎臓様構造体は多岐に枝分かれした複雑な構造を有している。

　撮像ユニット２０では、例えば発光ダイオードまたはスーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）などの発光素子を有する光源２１から、広帯域の波長成分を含む低コヒーレンス光ビームＬ１が出射される。光ビームＬ１はビームスプリッタ２２に入射して分岐し、破線矢印で示すように一部の光Ｌ２が容器１１に向かい、一点鎖線矢印で示すように一部の光Ｌ３が参照ミラー２４に向かう。

　容器１１に向かった光Ｌ２は、物体光学系２３を経て容器１１に入射する。より具体的には、ビームスプリッタ２２から出射される光Ｌ２は、物体光学系２３を介して容器底部１１１に入射する。物体光学系２３は、ビームスプリッタ２２から容器１１に向かう光Ｌ２を容器１１内の試料Ｓｐに収束させる機能と、試料Ｓｐから出射される反射光を集光してビームスプリッタ２２に向かわせる機能とを有する。図では物体光学系２３は単一の対物レンズにより代表的に表されているが、複数の光学素子が組み合わされたものであってもよい。

　物体光学系２３は、駆動制御部４０に設けられた焦点調整機構４１により、Ｚ方向に移動可能となっている。これにより、被撮像物に対する物体光学系２３の焦点位置がＺ方向に変更可能となっている。物体光学系２３の光軸は鉛直方向と平行であり、したがって平面状の容器底部１１１に垂直である。また、物体光学系２３への照明光の入射方向は光軸と平行であり、その光中心が光軸と一致するように、物体光学系２３の配置が定められている。

　試料Ｓｐが光Ｌ２に対する透過性を有するものでなければ、容器底部１１１を介して入射した光Ｌ２は試料Ｓｐの表面で反射される。一方、試料Ｓｐが光Ｌ２に対してある程度の透過性を有するものである場合、光Ｌ２は試料Ｓｐ内まで進入してその内部の構造物により反射される。光Ｌ２として例えば近赤外線を用いることで、入射光を試料Ｓｐ内部まで到達させることが可能である。試料Ｓｐからの反射光は散乱光として種々の方向に放射される。そのうち物体光学系２３の集光範囲内に放射された光Ｌ４が、物体光学系２３で収束されてビームスプリッタ２２へ送られる。

　参照ミラー２４は、駆動制御部４０に設けられたミラー駆動機構４２により移動可能に支持されている。これにより、参照ミラー２４は、その反射面を光Ｌ３の入射方向に対し垂直姿勢に、しかも該入射方向に沿った方向（図ではＹ方向）に移動可能となっている。参照ミラー２４に入射した光Ｌ３は反射面で反射されて、入射光路を逆向きに辿るように進む光Ｌ５としてビームスプリッタ２２に向かう。この光Ｌ５が参照光となる。ミラー駆動機構４２により参照ミラー２４の位置が変更されることにより、参照光の光路長が変化する。

　試料Ｓｐの表面もしくは内部の反射面で反射された反射光Ｌ４と、参照ミラー２４で反射された参照光Ｌ５とは、ビームスプリッタ２２を介して光検出器２６に入射する。このとき、反射光Ｌ４と参照光Ｌ５との間で位相差に起因する干渉が生じるが、干渉光の分光スペクトルは反射面の深さにより異なる。つまり、干渉光の分光スペクトルは被撮像物の深さ方向の情報を有している。したがって、干渉光を波長ごとに分光して光量を検出し、検出された干渉信号をフーリエ変換することにより、被撮像物の深さ方向における反射光強度分布を求めることができる。このような原理に基づくＯＣＴ撮像技術は、フーリエドメイン（Fourier Domain）ＯＣＴ（ＦＤ－ＯＣＴ）と称される。

　この実施形態の撮像ユニット２０は、ビームスプリッタ２２から光検出器２６に至る干渉光の光路上に分光器２５が設けられている。分光器２５としては、例えばプリズムを利用したもの、回折格子を利用したもの等を用いることができる。干渉光は分光器２５により波長成分ごとに分光されて光検出器２６に受光される。

　光検出器２６が検出した干渉光に応じて光検出器２６から出力される干渉信号をフーリエ変換することで、試料Ｓｐのうち、光ビームＬ２の入射位置における深さ方向、つまりＺ方向の反射光強度分布が求められる。容器１１に入射する光ビームＬ２をＸ方向に走査することで、ＸＺ平面と平行な平面における反射光強度分布が求められ、その結果から当該平面を断面とする試料Ｓｐの断層画像を作成することができる。以下、本明細書では、Ｘ方向へのビーム走査によってＸＺ平面と平行な断面における１つの断層画像Ｉｔを取得する一連の動作を、１回の撮像と称することとする。

　Ｙ方向におけるビーム入射位置を多段階に変更しながら、その都度断層画像の撮像が行われる。図２Ｂに示すように、試料ＳｐをＸＺ平面と平行な断面で断層撮像した多数の断層画像Ｉｔを得ることができる。Ｙ方向の走査ピッチを小さくすれば、試料Ｓｐの立体構造を把握するのに十分な分解能の画像データを得ることができる。Ｘ方向およびＹ方向へのビーム走査は、例えば図示しないガルバノミラー等の光路を変化させる光学部品を用いてビーム入射位置をＸＹ方向に変化させる方法、試料Ｓｐを担持する容器１１と撮像ユニット２０とのいずれかをＸＹ方向に移動させてこれらの相対位置を変化させる方法などにより実現可能である。

　なお、上記の原理説明では、撮像ユニット２０において光源２１からの光を照明光と参照光とに分岐させる分波機能、および信号光と参照光とを合成して干渉光を生じさせる機能がビームスプリッタ２２により実現されている。一方、近年では、ＯＣＴ装置においてこのような分波・合波機能を担うものとして、以下に例示するような光ファイバカプラが用いられる場合がある。

　図３Ａおよび図３ＢはＯＣＴ装置の具体的構成例を示す図である。なお、理解を容易にするために、以下の説明では、上記した原理図の構成と同一のまたは相当する構成に同一符号を付すものとする。その構造および機能は、特に説明のない限り上記原理図のものと基本的に同じであり、詳しい説明は省略する。また、光ファイバカプラによる干渉光を検出するＯＣＴ撮像原理も基本的に上記と同じであるので、詳しい説明を省略する。

　図３Ａに示す構成例では、撮像ユニット２０ａは、ビームスプリッタ２２に代わる分波・合波器として光ファイバカプラ２２０を備えている。光ファイバカプラ２２０を構成する光ファイバの１つ２２１は光源２１に接続されており、光源２１から出射される低コヒーレンス光は、光ファイバカプラ２２０により２つの光ファイバ２２２，２２４への光に分岐される。光ファイバ２２２は物体系光路を構成する。より具体的には、光ファイバ２２２の端部から出射される光はコリメータレンズ２２３を介して物体光学系２３に入射する。被撮像物からの反射光（信号光）は物体光学系２３、コリメータレンズ２２３を介して光ファイバ２２２に入射する。

　他の光ファイバ２２４は参照系光路を構成する。より具体的には、光ファイバ２２４の端部から出射される光はコリメータレンズ２２５を介して参照ミラー２４に入射する。参照ミラー２４からの反射光（参照光）はコリメータレンズ２２５を介して光ファイバ２２４に入射する。光ファイバ２２２を伝搬する信号光と光ファイバ２２４を伝搬する参照光とが光ファイバカプラ２２０において干渉する。干渉光は、光ファイバ２２６および分光器２５を介して光検出器２６に入射する。光検出器２６により受光された干渉光から被撮像物における反射光の強度分布が求められることは上記原理通りである。

　図３Ｂに示す例でも、撮像ユニット２０ｂに光ファイバカプラ２２０が設けられる。ただし光ファイバ２２４は使用されず、光ファイバ２２２から出射される光の光路に対してコリメータレンズ２２３およびビームスプリッタ２２７が設けられる。そして、前述の原理通り、ビームスプリッタ２２７により分岐される２つの光路にそれぞれ物体光学系２３、参照ミラー２４が配置される。このような構成ではビームスプリッタ２２７により信号光と参照光とが合成され、それにより生じた干渉光が光ファイバ２２２，２２６を通って光検出器２６へ導かれる。

　これらの例では、図２Ａの原理図では空間中を進行する、各光の光路の一部が光ファイバに置き換えられているが、動作原理は同じである。これらの例においても、焦点調整機構４１が物体光学系２３を容器１１に対し接近・離間方向に移動させる。これにより、被撮像物に対する物体光学系２３の焦点深さを調整することが可能である。また、ミラー駆動機構４２が参照ミラー２４を光の入射方向に沿って移動させる。これにより、参照光の光路長を変更可能である。

　以下、この画像処理装置１を用いた毒性試験の方法について詳説する。画像処理装置１の構成は、上記したビームスプリッタを用いるもの、光ファイバカプラを用いるもののいずれであっても適用可能である。また、断層画像を撮像するための撮像装置としては上記したＦＤ－ＯＣＴ撮像装置に限定されない。例えばタイムドメインＯＣＴ（ＴＤ－ＯＣＴ）撮像装置など他の撮像原理に基づくものも適用可能である。

　なお、以下に示す処理は、画像処理装置１に設けられたＣＰＵ３１が、メモリ３７に予め記録された制御プログラムを実行することにより実現されるものとするが、これに限定されない。例えば、図４のステップＳ１０４以降の処理については、画像処理装置１とは別のコンピューター装置が、画像処理装置１からＯＣＴ撮像データを受け取って処理する構成であってもよい。このようにすれば、画像処理装置１のＣＰＵ３１は撮像に特化された処理のみを実行すればよいこととなり、その処理負荷が軽減される。

　図４はこの実施形態の毒性試験の処理内容を示すフローチャートである。毒性試験においては、最初に毒性試験の対象となる細胞組織体が、適宜の容器中で培養される（ステップＳ１０１）。例えば、ラットの腎臓由来幹細胞から分化培養された腎臓様構造体が、この場合の細胞組織体として用いられる。例えばハンギングドロップ法を用いた培養により、生体内での形態に近い三次元構造を有する細胞組織体を形成することができる。

　こうして培養された細胞組織体に対して、毒性の評価対象とされる化学物質が所定量だけ投与されることで、試料Ｓｐが作製される（ステップＳ１０２）。投与から予め定められた所定時間が経過した時刻が撮像時刻として設定される。撮像時刻が到来すると、画像処理装置１により試料Ｓｐが断層撮像される（ステップＳ１０３）。後述するように、撮像時刻は複数設定されていてもよい。

　前記したように、１回の撮像によって、ＸＺ平面と平行な断面での試料Ｓｐの断層画像の撮像データが取得される。撮像位置をＹ方向に異ならせながら複数回撮像が行われることで、試料Ｓｐの三次元構造を表す立体像に対応する撮像データが取得される。

　なお、Ｙ方向における撮像位置を同一にした状態で、物体光学系２３の焦点位置をＺ方向に異ならせて複数回撮像が行われてもよい。ＦＤ－ＯＣＴ撮像においては、検出される分光スペクトルが被撮像物の深さ方向の情報を有しており、深さ方向における一定の範囲の情報を、１回の撮像で取得することが可能である。しかしながら、深さ方向に位置を変えて複数回の撮像を行うようにすれば、１回の撮像でカバーすべき深さ方向の範囲を小さくすることができる。このため、例えば物体光学系２３としてＮＡ（開口数）の大きいものを使用することによって、画像の分解能を向上させることが可能である。複数回の撮像で得られた断層画像を合成することで、深さ方向の撮像範囲が広く、かつ分解能の高い断層画像を得ることができる。

　各断層画像は、ＸＺ平面に平行な１つの断面における試料Ｓｐの構造を表す。信号処理部３３および３Ｄ復元部３４が実行する適宜の補間方法を適用した画像処理により、Ｙ方向に撮像位置を異ならせた複数の断層画像間がＹ方向に補間される。こうすることで、試料Ｓｐの三次元画像（立体像）に対応する立体データが作成される（ステップＳ１０４）。立体像については、例えば表示部３５２に表示出力することでユーザに提示することが可能である。

　図５は断層画像から得られる立体像の例を示す図である。適宜の３Ｄビューアソフトウェアを用いると、複数の撮像により得られた断層画像から求められる試料Ｓｐの立体像を、コンピューター装置の表示画面に表示させることができる。図５の画像例は、培地中で幹細胞から培養された腎臓様構造体を示している。図に示すように、培養された腎臓様構造体は、多数の分岐腕が中心部から外部に向けて放射状に延びた形態を有している。

　この場合に表示される試料の像は、立体構造物である試料をある視線方向から見たときの形状を、二次元平面に投影したものである。したがって、当該視線方向において構造物が前後に重なっているとき、奥側の構造物は手前側の構造物に遮蔽されてしまう。ただし、複数回の断層撮像で得られる撮像データから立体データが作成されている。したがって、３Ｄビューアを用いることで、任意の視線方向から見た試料Ｓｐの像を表示させることが可能である。そのため、画像中で重なり合う構造物が、連続したものか互いに孤立したものかを視認することは可能である。

　このように、断層撮像により得られた撮像データに基づいて細胞組織体である試料Ｓｐの立体構造を特定し、これを例えば立体像として表示出力することが可能である。したがって、ユーザは観察対象である細胞組織体がどのような形状をしているかを画面上で確認することができる。これにより、ユーザは、細胞組織体が活性な状態であるか衰弱した状態であるかを定性的に評価することが可能である。

　しかしながら、このような観察者の主観的判断による評価は、評価結果が観察者の熟練度に左右されがちである。また個々に形状が異なる複数の試料間での比較が困難である。そこで、撮像された細胞組織体の状態を客観的かつ定量的に表す指標が導入されることが望ましい。ＯＣＴ断層撮像による撮像結果から作成される立体データを用いれば、このような目的に好適な指標を求めることが可能である。以下、その考え方の一例を説明する。

　複数回の撮像によりカバーされる撮像範囲内の空間（以下、「撮像空間」と称する）に含まれる細胞組織体の構造については、適宜の画像解析処理により求めることができる。例えば、撮像空間内で、その輝度から細胞組織体中の構造物の表面に属すると見なせる点があれば、当該点に対して空間的に連結性を有する点を順次探索することにより、当該構造物の輪郭を特定することができる。このような探索には公知の画像処理、例えば領域分割処理を適用することができる。このような画像処理により、撮像空間中で空間的に連結性を有する１つの閉曲面で囲まれる空間領域が、１つの構造物に対応するオブジェクトとして特定される。空間的な連結性を持たない互いに孤立した構造物（以下、「孤立構造物」ということがある）は、それぞれ異なるオブジェクトと見なされる。

　立体構造を有する細胞組織体の形状については、適宜の画像編集ソフトウェアを使用した３Ｄモデリング処理により、数値データとして表すことが可能である。例えば、細胞組織体の表面を微小な多角形（ポリゴン）の集合体として近似的に表現する方法を用いることができる。例えば三角形メッシュを用いた方法が適用可能である。このような表現方法では、立体像中に含まれ空間的な連結性を有する１つの構造物の表面が、ポリゴンの集合体として表現される。言い換えれば、１つの構造物の形状は、その表面を近似的に表す各ポリゴンの座標情報を集めたポリゴンデータにより特定される。

　このように、ＯＣＴ断層撮像により得られる画像データから、細胞組織体に含まれる各構造物を３Ｄモデル化した立体データ（例えばポリゴンデータ）を作成しておくことができる。こうすることで、以後は表示画面上で任意の方向から見た細胞組織体の像を表示することが可能になる。例えば、必要に応じて画面内で像を回転させることも可能である。

　また、このような立体データから、細胞組織体中に含まれる各構造物の表面積や体積の近似値等、当該構造物の形状的特徴を表す各種の指標値を算出することが可能である。また、立体データで特定されるオブジェクトの個数が、細胞組織体を構成する構造物の数を指標する。これらの指標値は、細胞組織体の状態を定量的に評価するための指標ともなり得る。

　すなわち、撮像された細胞組織体が高い活性を有するものであれば、例えば包絡体積で表される大きさが同程度である衰弱した細胞組織体よりも、その表面積、体積が大きくなると考えられる。一方、細胞組織体を構成する孤立構造物の数については、細胞組織体が衰弱するほど多くなると考えられる。その理由は以下の通りである。多数の細胞が有機的に結び付くことで一定の機能を有する細胞組織体では、高い活性を有することが孤立構造物を増加させる理由にならない。典型的には、高度に組織化された細胞組織体は単一の構造物からなる。これに対し、細胞組織体を構成する細胞が衰弱すると、相互の結び付きが弱くなり、組織の断片化が進んで孤立構造物の数が増えると考えられる。

　特にＯＣＴ断層撮像では試料Ｓｐにダメージを与えない非侵襲の撮像が可能である。このことから、同一の試料Ｓｐを時間間隔をおいて複数回撮像することで、細胞組織体の状態の変化を継続的に観察することが可能である。したがって、細胞組織体が特定の環境下で、例えば化学物質が投与された状態で、どのように変化してゆくかを経時的に評価することができる。

　このことは、細胞組織体に対する化学物質の毒性試験において大きな利点となる。例えば、試料に投与された化学物質が細胞を障害する毒性を有するものである場合、時間とともに細胞組織体の崩壊が進行する。このとき立体データから把握される細胞組織体中の孤立構造物の数は、経時的に増加してゆくことになると考えられる。すなわち、化学物質が投与されることで、細胞組織体を構成する孤立構造物の数が増加した場合、この化学物質は、当該細胞組織体に対する毒性を有するものであると判定することができる。

　立体物を二次元平面に投影して表示画面に表示する際、本来は互いに孤立した構造物同士が画像内で重なり合うことで、それらが一体のものか互いに孤立したものかの判断が難しい場合があり得る。たとえ任意の視線方向から細胞組織体の像を表示することができるとしても、表示画像から孤立構造物の個数を把握することは容易でない。これに対し、ＯＣＴ断層撮像に基づく立体データでは、空間的に連結性を有する閉曲面で囲まれる空間領域として個々の孤立構造物を分離することができるので、細胞組織体中の孤立構造物の個数を確実に計数することが可能である。

　図４に戻って毒性試験の説明を続ける。ＯＣＴ断層撮像結果から作成された立体データおよび上記原理に基づき、化学物質の毒性が評価される。具体的には、ステップＳ１０４で作成された立体データを用いて、試料Ｓｐに含まれる孤立構造物が計数される（ステップＳ１０５）。このとき、後述するように、立体データに基づき細胞組織体の体積および表面積が併せて求められてもよい。

　同一の試料Ｓｐについて、過去の（例えば化学物質投与前の）ある時点における孤立構造物の個数が予めわかっているとき、今回新たに求められた計数結果と元の個数との比較により、細胞組織体の状態が評価される。すなわち、孤立構造物の数が有意に増加していれば（ステップＳ１０６においてＹＥＳ）、細胞組織体の断片化が進行していると判定される（ステップＳ１０７）。一方、孤立構造物の個数に有意な増加が見られなければ（ステップＳ１０６においてＮＯ）、細胞組織体の断片化の進行はないと判定される（ステップＳ１０８）。

　試料Ｓｐを引き続き観察し評価する必要があるときには（ステップＳ１０９においてＹＥＳ）、ステップＳ１０３に戻り、次の撮像時刻が到来すれば再びＯＣＴ断層撮像を実行し、上記と同様の処理を実行すればよい。

　ＯＣＴ撮像およびそれに基づく細胞組織体の評価が全て終了すると（ステップＳ１０９においてＮＯ）、評価対象である化学物質の毒性の有無が最終的に判定される（ステップＳ１１０）。すなわち、化学物質の投与により細胞組織体の断片化が進行したと判断される場合には、当該化学物質が当該細胞組織体に対する毒性を有するものであると判定される。一方、細胞組織体の有意な断片化が見られない場合には、当該化学物質は当該細胞組織体に対して毒性を有していないと判定される。

　なお、毒性の有無の判断に際しては、上記以外にさらなる評価基準が設けられてもよい。例えば前記したように、細胞組織体の表面積や体積もその状態を指標する指標値となり得るものである。細胞組織体が複数の孤立構造物を含む場合、それらの表面積または体積の合計が指標値となる。また、同一の試料について互いに異なる時刻で複数回評価を行い、細胞組織体の状態の経時的な変化から化学物質の毒性を評価する。その他に、投与量（濃度）の異なる複数の試料の評価結果から、総合的に毒性が判定されてもよい。

　図６Ａないし図６Ｃは毒性試験の結果の一例を示す図である。上記した試験方法を検証するために、本願出願人は以下のような実験を行った。実験は、細胞組織体の例である培養された腎臓様構造体に腎毒性物質として知られるシスプラチン（ＣｉｓＰｔ）を投与し、ＯＣＴ撮像により得られる指標値を用いて毒性を定量的に評価するというものである。より具体的には、ラットの腎臓由来幹細胞からの分化培養で作成された腎臓様構造体に、種々の濃度のシスプラチンを添加して試料を作成した。そして、投与から所定時間経過後の試料をＯＣＴ撮像し、得られた立体データから指標値として細胞組織体の表面積、体積および孤立構造物の個数をそれぞれ算出した。試料は各濃度につき複数作成され、指標値はそれらの平均値である。図６Ａおよび図６Ｂは、投与されたシスプラチンの濃度と指標値との関係を示すグラフである。

　図６Ａはシスプラチンの濃度と細胞組織体の体積との関係を示している。また、図６Ｂはシスプラチンの濃度と細胞組織体の表面積との関係を示している。ただし、体積および表面積は、シスプラチンを投与しない群における値に対する相対値である。シスプラチン添加群では、非添加群と比較して有意な相対体積、相対表面積の減少が認められる。しかも、シスプラチン濃度が高いほど減少が顕著である。これらの結果は、シスプラチンが細胞を衰弱させる毒性を有していることを示している。

　一方、図６Ｃは、シスプラチンの濃度と孤立構造物の個数との関係を示している。シスプラチン非添加群でも複数の孤立構造物が計数されているが、孤立構造物の数はシスプラチン濃度の上昇に伴って有意に増加している。シスプラチンによる腎毒性では、ネフロンの近位尿細管と呼ばれる部位が障害されて切断されることが知られている。この腎臓様構造体においても、シスプラチン添加群で断片化が進行する傾向が確認された。すなわち、孤立構造物の個数が増加するという結果は、シスプラチンの腎毒性を表している。

　このように、腎臓様構造体に対するシスプラチンの毒性試験においては、ＯＣＴ撮像データに基づき求められた指標値である腎臓様構造体の体積または表面積の減少、および孤立構造物の個数の増加は、いずれもシスプラチンが腎毒性を有することを示すものとなった。したがって、これらの指標値は単独でも毒性の有無の判定材料となり得る。しかしながら、これらの指標値の組み合わせにより総合的に判定されることが望ましい。例えば、毒性により組織の断片化が進行していても、体積や表面積は有意な変化を示さない場合があり得るからである。特に表面積については、組織の分断化により却って値が増加することがあり得る。

　なお、ＯＣＴ撮像結果の一利用態様である、上記した毒性試験においては、撮像により得られた画像を表示することは必須ではない。しかしながら、ユーザの便宜のために撮像された細胞組織体の画像を表示することは有用である。この場合、断層撮像された画像、複数の断層画像から復元された立体像（３Ｄ像）などを表示する以外に、例えば次のようにすることもできる。

　図７は細胞組織体の表示例を模式的に示す図である。前記したように、ＯＣＴ撮像データから作成される立体データでは、細胞組織体中に含まれる互いに孤立した構造物は、個別のオブジェクトとして取り扱われている。したがって、オブジェクトごとに異なる画像加工を施すことで、実際の撮像空間においては互いに孤立しているが、表示画像において互いに重なり合って一体に見える構造物を、視認により識別可能な態様で表示することも可能である。

　図７に示す表示画像Ｉｍの例では、画像では重なっているが実際には互いに孤立している複数の構造物Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４に異なるハッチングが付されている。したがって、ユーザは、これらの構造物が細胞組織体において接続しておらず互いに孤立したものであることを容易に認識することができる。ここでは説明のためにハッチングにより構造物を区別したが、実際の表示画像においては、例えば孤立した構造物を色分けによって区別することが可能である。

　以上のように、この実施形態では、培養された細胞組織体の状態を評価する指標値の１つとして、細胞組織体に含まれる互いに孤立した構造物の個数が用いられる。このような孤立構造物の個数は組織の断片化の進行程度を表しており、細胞組織体の状態を定量的に示す指標として機能するものである。孤立構造物の個数は、ＯＣＴ断層撮像により得られたデータに基づき算出することが可能であり、評価対象である細胞組織体にダメージを与えることなく非侵襲で取得可能な指標値である。そのため、細胞組織体の経時的な変化を評価するのに適しており、例えば細胞組織体に対する化学物質の薬効評価に好適に適用することが可能である。より具体的には、例えば化学物質が細胞組織体に及ぼす毒性を調べる毒性試験に利用することができる。

　なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記実施形態は、特定の細胞組織体に対する化学物質の毒性試験に本発明の思想を適用したものである。しかしながら、評価対象となる細胞組織体は上記に限定されるものではなく任意である。特に、上記した腎臓様構造体のように、細胞組織体が多岐に分岐した複雑な構造を取るものに有効である。

　また、上記実施形態における試料は幹細胞から培養により分化させた組織様構造体である。しかしながら、本発明の適用対象となる細胞組織体はこれに限定されず、生体から採取された細胞や組織を培養したもの、細胞が球状に凝集したもの（スフェア）、複数種の細胞から形成された器官様の構造体（オルガノイド）をなすものなども、本発明の評価対象となり得る。ＯＣＴによる撮像においては、試料に対し撮像のための特別な加工を必要としないため、このように種々の起源を有する細胞組織体を対象とすることができる。

　また、評価の目的も毒性試験に限定されるものではない。例えば培地の種類や温湿度環境など細胞組織体を培養するための培養条件の評価や、薬剤による病変組織への影響の評価などにも、本発明を適用することが可能である。また化学物質を投与せず単に細胞組織体の状態を評価する目的にも本発明を適用することが可能である。この場合において、上記実施形態では孤立構造物の個数の増加が化学物質の毒性の指標値となっているが、計数される孤立構造物の個数が有する意味は、評価の目的によって変わることもあり得る。

　また、上記実施形態では、ＯＣＴ撮像装置である画像処理装置１が、撮像された細胞組織体の状態の評価まで行う機能を有する。しかしながら、前述したように、撮像を行う主体と、撮像データに基づく画像処理や評価を行う主体とが別の装置であってもよい。また、断層撮像を行うための撮像方法はＯＣＴに限定されず、他の撮像原理に基づくものであっても、それにより得られたデータに基づく上記した評価を実行することが可能である。

　また、上記実施形態では、ＯＣＴ撮像により得られるデータのみに基づいて細胞組織体の評価を行っている。しかしながら、これらのデータと、例えば適宜の試薬を用いた別の実験により得られる結果とを組み合わせて細胞組織体が評価されてもよい。

　以上、具体的な実施形態を例示して説明してきたように、この発明にかかる細胞組織体の評価方法は、立体データから特定される、空間的な連結性を有する閉曲面で囲まれる空間領域が１つの構造物として計数される構成であってもよい。このような空間領域については、画像から連結性を有する領域を抽出する適宜の画像処理によって特定することが可能である。また、細胞組織体のうち連続性を有する部位が１つの構造物として扱われる一方、空間的に連続せず互いに孤立した部位はそれぞれ異なる構造物として扱われる。そのため、細胞組織体を構成する構造物の数を的確に計数することができる。

　また、断層撮像は光コヒーレンストモグラフィ（ＯＣＴ）技術によりなされてもよい。この撮像技術では細胞組織体の断面構造を撮像することが可能である。複雑に入り組んだ構造を有する細胞組織体であっても、その立体データを作成するのに十分な情報を得ることが可能である。したがって、ＯＣＴ撮像された画像データを本発明の評価に供することで、細胞組織体の定量的評価を高い精度で行うことが可能になる。

　また、断層撮像が時間間隔を空けて複数回実行され、各撮像に対応する立体データのそれぞれについて計数が行われてもよい。このような構成によれば、同一の細胞組織体の経時的な状態変化を評価することが可能となる。本発明では、非侵襲での撮像と撮像結果に基づく評価とを組み合わせることで、評価のための作業が細胞組織体にダメージを与えることが回避される。そのため、このような同一試料の継続的な観察、評価が可能である。

　また、本発明にかかる薬効評価方法においては、立体データに基づき構造物の総面積および総体積の少なくとも一方が算出され、その算出結果と構造物の計数結果とに基づき、化学物質の薬効が判定されてもよい。このように複数の指標に基づき総合的に評価を行うことで、評価の精度をより高めることが可能である。

　以上、特定の実施例に沿って発明を説明したが、この説明は限定的な意味で解釈されることを意図したものではない。発明の説明を参照すれば、本発明のその他の実施形態と同様に、開示された実施形態の様々な変形例が、この技術に精通した者に明らかとなるであろう。故に、添付の特許請求の範囲は、発明の真の範囲を逸脱しない範囲内で、当該変形例または実施形態を含むものと考えられる。

　この発明は、培養された細胞組織体に及ぼす化学物質の作用を調べる目的に適用することが可能であり、例えば生体内で有効に作用する薬剤の創薬に役立てることができる。

　１　画像処理装置
　１０　保持部
　２０　撮像ユニット
　２１　光源
　２２　ビームスプリッタ
　２４　基準ミラー
　２６　光検出器
　３０　制御ユニット
　３３　信号処理部
　３４　３Ｄ復元部
　３５２　表示部
　Ｓｐ　試料

Claims (6)

1. 　培養された細胞組織体を断層撮像する工程と、
   　撮像により取得された画像データに基づき、前記細胞組織体の三次元形状を表す立体データを作成する工程と、
   　前記立体データに基づき、前記細胞組織体に含まれる、互いに孤立した構造物の数を計数する工程と
   を備える細胞組織体の評価方法。
2. 　前記立体データから特定される、空間的な連結性を有する閉曲面で囲まれる空間領域が、１つの前記構造物として計数される請求項１に記載の細胞組織体の評価方法。
3. 　光コヒーレンストモグラフィにより前記断層撮像が行われる請求項１または２に記載の細胞組織体の評価方法。
4. 　前記断層撮像が時間間隔を空けて複数回実行され、各撮像に対応する前記立体データのそれぞれについて前記計数が行われる請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞組織体の評価方法。
5. 　培養された細胞組織体に対し、評価対象の化学物質を投与する工程と、
   　前記化学物質を投与された前記細胞組織体を、請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞組織体の評価方法により評価する工程と、
   　前記細胞組織体の評価結果に基づいて、前記細胞組織体に対する前記化学物質の薬効を判定する工程と
   を備える薬効評価方法。
6. 　前記立体データに基づき前記構造物の総面積および総体積の少なくとも一方を算出し、その算出結果と前記構造物の計数結果とに基づき、前記化学物質の薬効を判定する請求項５に記載の薬効評価方法。

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