JP6984822B2 - 干渉画像取得装置および干渉画像取得方法 - Google Patents

干渉画像取得装置および干渉画像取得方法 Download PDF

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Description

本発明は、対象物の干渉画像を取得する装置および方法に関するものである。
特許文献１に、対象物の干渉画像を取得することができる装置および方法の発明が開示されている。この文献に記載された干渉画像取得装置は、光源と、この光源から出力された光を二光束に分岐した後に該二光束を合波して干渉光を出力する二光束干渉計と、この二光束干渉計から出力された干渉光を受光する撮像器とを備える。また、この干渉画像取得装置は、位相シフト法を用いて対象物の位相画像等を取得することもできる。すなわち、この干渉画像取得装置は、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を互いに異なる複数の設定値それぞれで安定化した状態とし、各状態において対象物の干渉画像を撮像器により取得し、これら取得した複数の干渉画像に基づいて位相画像等を求める。
国際公開第２０１６−１２１２５０号公報
Taewoo Kim, et. al, "White-lightdiffraction tomography of unlabelled live cells," Nature Photonics 8,256-263 (2014).
従来では、対象物を入れる容器の底部の内側に反射増強コーティングが設けられており、その反射増強コーティングの上に対象物が配置されていた。そして、二光束干渉計における二光束のうちの一方の第１光束は、対象物を透過した後に反射増強コーティングで反射されて再び対象物を透過して、他方の第２光束と合波されていた。しかし、例えば対象物が細胞である場合、容器の底部の内側に設けられた反射増強コーティングの上で細胞が培養されることとなり、その培養環境は細胞にとって好ましくない場合がある。
細胞の培養に適した環境で細胞を培養した後に、その細胞の干渉画像を取得したり位相画像等を取得したりする場合には、第１光束を反射させる反射ミラーを細胞に対して離間して配置する必要がある。従来技術では、このように反射ミラーと対象物とが互いに離間している場合には、鮮明な干渉画像等を取得することは困難である。
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、反射ミラーと対象物とが互いに離間している場合に鮮明な干渉画像を取得することができる装置および方法を提供することを目的とする。
本発明の干渉画像取得装置は、(1) インコヒーレントな光を出力する光源と、(2) 光源から出力された光を第１光束と第２光束とに分岐し、第１光束の光路上に配置された対象物を透過するとともに第１反射ミラーで反射された第１光束と、第２反射ミラーで反射された第２光束とを合波して、干渉光を出力する二光束干渉計と、(3) 二光束干渉計から出力された干渉光を受光する撮像面を有し、対象物の干渉画像を取得する撮像器と、を備える。二光束干渉計は、対象物に対して第１反射ミラーが離間して配置されており、第１反射ミラーで反射される第１光束の光路長と、第２反射ミラーで反射される第２光束の光路長との間の光路長差が、光源から出力される光のコヒーレント長以下である。撮像器は、撮像面と第１反射ミラーとの間の第１光学系において撮像面に対して共役となる位置に対象物を配置した状態で干渉画像を取得する。
本発明の一側面による干渉画像取得装置では、二光束干渉計において、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置と第１反射ミラーの反射面との間の光路長と、撮像面と第２反射ミラーとの間の第２光学系において撮像面に対して共役となる位置と第２反射ミラーの反射面との間の光路長と、が互いに等しい。二光束干渉計は、第２反射ミラーの反射面の上に設けられた透明層を有するのが好適である。
本発明の他の一側面による干渉画像取得装置では、二光束干渉計において、第１光束の光路長および第２光束の光路長それぞれが可変であり、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置に第１反射ミラーの反射面を配置するとともに光路長差をコヒーレント長以下とした後に、第１光束の光路長および第２光束の光路長を調整することにより、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置に対象物を配置する調整部を更に備える。
本発明の更に他の一側面による干渉画像取得装置では、二光束干渉計における合波時の第１光束と第２光束との間の位相差の検出結果に基づいて該位相差をフィードバック制御する位相制御部を更に備え、調整部は、第１光束の光路長および第２光束の光路長を調整する際に位相制御部により位相差を一定に維持する。
本発明の更に他の一側面による干渉画像取得装置では、撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて対象物の位相画像を求める演算部を更に備える。
本発明の更に他の一側面による干渉画像取得装置では、演算部は、撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて対象物の位相画像および強度画像を求める。
本発明の更に他の一側面による干渉画像取得装置では、二光束干渉計において、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置を第１光学系の光軸に沿って走査し、撮像器は、走査の各位置において干渉画像を取得し、演算部は、走査の各位置について位相画像および強度画像を求め、これら位相画像および強度画像に基づいて対象物の３次元像を求める。
本発明の干渉画像取得方法は、(1) 二光束干渉計において、光源から出力されたインコヒーレントな光を第１光束と第２光束とに分岐し、第１光束の光路上に配置された対象物を透過するとともに第１反射ミラーで反射された第１光束と、第２反射ミラーで反射された第２光束とを合波して、干渉光を出力する干渉ステップと、(2) 二光束干渉計から出力された干渉光を受光する撮像面を有する撮像器により対象物の干渉画像を取得する撮像ステップと、を備える。干渉ステップは、二光束干渉計において、対象物に対して第１反射ミラーが離間して配置されており、第１反射ミラーで反射される第１光束の光路長と、第２反射ミラーで反射される第２光束の光路長との間の光路長差を、光源から出力される光のコヒーレント長以下とする。撮像ステップは、撮像面と第１反射ミラーとの間の第１光学系において撮像面に対して共役となる位置に対象物を配置した状態で撮像器により干渉画像を取得する。
本発明の一側面による干渉画像取得方法では、干渉ステップは、二光束干渉計において、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置と第１反射ミラーの反射面との間の光路長と、撮像面と第２反射ミラーとの間の第２光学系において撮像面に対して共役となる位置と第２反射ミラーの反射面との間の光路長と、を互いに等しくする。二光束干渉計において、第２反射ミラーの反射面の上に透明層が設けられているのが好適である。
本発明の他の一側面による干渉画像取得方法では、二光束干渉計において、第１光束の光路長および第２光束の光路長それぞれが可変であり、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置に第１反射ミラーの反射面を配置するとともに光路長差をコヒーレント長以下とした後に、第１光束の光路長および第２光束の光路長を調整することにより、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置に対象物を配置する調整ステップを更に備える。
本発明の他の一側面による干渉画像取得方法では、調整ステップは、二光束干渉計における合波時の第１光束と第２光束との間の位相差の検出結果に基づいて該位相差をフィードバック制御する位相制御部により、第１光束の光路長および第２光束の光路長を調整する際に位相差を一定に維持する。
本発明の他の一側面による干渉画像取得方法では、撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて対象物の位相画像を求める演算ステップを更に備える。
本発明の他の一側面による干渉画像取得方法では、演算ステップは、撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて対象物の位相画像および強度画像を求める。
本発明の他の一側面による干渉画像取得方法では、干渉ステップは、二光束干渉計において、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置を第１光学系の光軸に沿って走査し、撮像ステップは、走査の各位置において干渉画像を撮像器により取得し、演算ステップは、走査の各位置について位相画像および強度画像を求め、これら位相画像および強度画像に基づいて対象物の３次元像を求める。
本発明の他の一側面による干渉画像取得方法では、透明材の一方側に対象物が配置され、透明材の他方側に第１反射ミラーが配置されており、干渉ステップは、対象物および透明材を順に経た後の第１光束を第１反射ミラーで反射させる。或いは、透明材の一方側に対象物が配置され、透明材の一方側において対象物と離間して第１反射ミラーが配置されており、干渉ステップは、透明材および対象物を順に経た後の第１光束を第１反射ミラーで反射させる。或いは、第１反射ミラーの反射面上に透明物質が配置され、透明物質の上または中に対象物が配置されており、干渉ステップは、対象物および透明物質を経た後の第１光束を第１反射ミラーで反射させる。或いは、対象物が細胞であり、透明物質がジェル状物質である。或いは、対象物が複数の細胞であり、これら複数の細胞のうちの少なくとも１個の細胞は透明物質の中に配置されており、これら複数の細胞は３次元的に密接していてもよい。或いは、対象物が種類の異なる複数の細胞であり、これら種類の異なる複数の細胞は透明物質の内部または表面で層を形成していてもよい。
本発明によれば、反射ミラーと対象物とが互いに離間している場合に鮮明な干渉画像を取得することができる。
図１は、干渉画像取得装置１の構成を示す図である。 図２は、サンプルの構成を示す図である。 図３は、干渉画像取得装置１の第１変形例の構成を示す図である。 図４は、干渉画像取得装置１の第２変形例の構成を示す図である。 図５は、実施例で用いたサンプルの構成を示す図である。 図６は、実施例で得られた複数の干渉画像に基づいて作成された位相画像を示す図である。 図７は、サンプルの第１変形例の構成を示す図である。 図８は、サンプルの第２変形例の構成を示す図である。 図９は、実施例で用いたサンプルの構成を示す図である。 図１０は、実施例で得られた複数の干渉画像に基づいて作成された位相画像を示す図である。 図１１は、図８に示されたサンプル構成例において複数の対象物が３次元的に分布している様子を示す図である。 図１２は、図８に示されたサンプル構成例において複数の対象物が３次元的に分布しており、複数の対象物の幾つかが３次元的に集合している様子を示す図である。 図１３は、図８に示されたサンプル構成例において複数の対象物が３次元的に分布しており、複数の対象物の幾つかが３次元的に集合していて、その集合体が複数種類の対象物を含んでいる様子を示す図である。 図１４は、第２光学系（参照光学系）の変形例の構成を示す図である。
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
図１は、干渉画像取得装置１の構成を示す図である。干渉画像取得装置１は、光源１１、ビームスプリッタ１２、対物レンズ１３、対物レンズ１４、第２反射ミラー１５、チューブレンズ１６、ビームスプリッタ１７、撮像器１８、第１反射ミラー２０、ピエゾ素子２１、光検出器２２、位相制御部２３、演算部３０、フォーカス調整機構６０および光路長差調整機構６１を備える。干渉画像取得装置１は、二光束干渉計としてマイケルソン干渉計を有し、対象物の干渉画像を取得する。
対象物は、特定の細胞や生体サンプルに限定されるものではない。例えば、対象物として、培養細胞、不死化細胞、初代培養細胞、がん細胞、脂肪細胞、肝臓細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および前記細胞をもとに作られた細胞塊（コロニーまたはスフェロイド）などが挙げられる。また、対象物として、生体に限らず、工業サンプル、たとえばガラスの内部、半導体素子の内部、樹脂素材の内部、液晶、高分子化合物なども挙げられる。
本実施形態の以下の説明では、図２にサンプルの構成例が示されるように、対象物は、容器７０に入れられた培養液７２中の細胞７３であるとする。容器７０の内部は蓋７１により密閉されている。容器７０の底部（透明材）の外側に第１反射ミラー２０が配置されている。
光源１１はインコヒーレントな光を出力する。光源１１は、例えばハロゲンランプなどのランプ系光源、ＬＥＤ（Light emitting diode）光源、ＳＬＤ（Superluminescent diode）光源、ＡＳＥ（Amplified spontaneous emission）光源等である。
ビームスプリッタ１２は、光源１１と光学的に結合され、二光束干渉計であるマイケルソン干渉計を構成する。ビームスプリッタ１２は、例えば、透過率と反射率との比が１：１であるハーフミラーであってもよい。ビームスプリッタ１２は、光源１１から出力された光を二光束に分岐して第１光束および第２光束とする。ビームスプリッタ１２は、第１光束を対物レンズ１３へ出力し、第２光束を対物レンズ１４へ出力する。
また、ビームスプリッタ１２は、第１反射ミラー２０で反射されて対物レンズ１３を経た第１光束を入力するとともに、第２反射ミラー１５で反射されて対物レンズ１４を経た第２光束を入力する。そして、ビームスプリッタ１２は、これら入力した第１光束と第２光束とを合波して、干渉光をチューブレンズ１６へ出力する。
対物レンズ１３は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された第１光束を容器７０内の細胞７３に集光する。また、対物レンズ１３は、第１反射ミラー２０で反射された第１光束を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。
対物レンズ１４は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された第２光束を第２反射ミラー１５へ出力する。また、対物レンズ１４は、第２反射ミラー１５の反射面で反射された第２光束を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。フォーカス調整機構６０は、第２反射ミラー１５に対して相対的に対物レンズ１４を光軸方向に沿って移動させることで、対物レンズ１４と第２反射ミラー１５との間の距離を調整することができる。光路長差調整機構６１は、対物レンズ１４、第２反射ミラー１５およびフォーカス調整機構６０を光軸方向に沿って移動させることで、第１光束と第２光束との間の光路長差を調整することができる。
チューブレンズ１６は、二光束干渉計を構成するビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された干渉光を、ビームスプリッタ１７を経て撮像器１８の撮像面に結像する。ビームスプリッタ１７は、チューブレンズ１６から到達した光を２分岐して、一方の光束を撮像器１８へ出力し、他方の光束を光検出器２２へ出力する。ビームスプリッタ１７は、例えばハーフミラーであってもよい。
撮像器１８は、ビームスプリッタ１７と光学的に結合され、ビームスプリッタ１７から到達した干渉光を受光して干渉画像を取得する。撮像器１８は、例えば、ＣＣＤエリアイメージセンサおよびＣＭＯＳエリアイメージセンサなどのイメージセンサである。
ピエゾ素子２１は、第２反射ミラー１５の反射面に垂直な方向に該反射面を移動させる。ピエゾ素子２１は、この反射面の移動により、二光束干渉計における二光束の間の光路長差（すなわち位相差）を調整することができる。ピエゾ素子２１は、波長未満の分解能で、第２反射ミラー１５の反射面の位置を決めることができる。二光束干渉計において二光束の間の光路長差は可変である。
なお、ビームスプリッタ１２から第１反射ミラー２０までの光学的距離をＬ１とし、ビームスプリッタ１２から第２反射ミラー１５の反射面までの光学的距離をＬ２とすると、二光束干渉計における二光束の間の光路長差は２（Ｌ１−Ｌ２）である。この光路長差が光源１１の出力光のコヒーレント長以下であれば、撮像器１８は明瞭な干渉画像を取得することができる。この光路長差の調整に際して、必要とされる光路長差の調整幅がピエゾ素子２１の可動距離よりも大きい場合は、光路長差調整機構６１を用いてもよい。光源１１の出力光のコヒーレント長は光源１１の波長帯域幅に反比例する。例えば光源１１がハロゲンランプであればコヒーレント長はおよそ１μｍであり、光源１１がＬＥＤ光源であればコヒーレント長はおよそ３μｍであり、光源１１がＳＬＤ光源またはＡＳＥ光源であればコヒーレント長はおよそ１０〜５０μｍである。光源１１の出力光の中心波長をλ０としたとき、二光束干渉計における二光束の間の位相差Δφは次式で表されるものとする。
Figure 0006984822
光検出器２２は、ビームスプリッタ１７と光学的に結合され、ビームスプリッタ１７から到達した干渉光を受光して検出信号を出力する。光検出器２２は、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管であり、また、ラインセンサ（リニアセンサ）、ＣＣＤエリアイメージセンサ、ＣＭＯＳエリアイメージセンサなどであってもよい。
位相制御部２３は、光検出器２２と電気的に接続され、光検出器２２から出力される検出信号を入力する。また、位相制御部２３は、ピエゾ素子２１と電気的に接続され、ピエゾ素子２１による光路長差の調整動作を制御する。位相制御部２３は、入力した検出信号に基づいて、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を検出する。そして、位相制御部２３は、この検出結果に基づくフィードバック制御により、ピエゾ素子２１による光路長差の調整動作を制御する。これにより、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を設定値で安定化した状態（ロック状態）とすることができる。
撮像器１８は、ロック状態において対象物（細胞７３）の干渉画像を撮像して取得することができる。演算部３０は、撮像器１８により取得された干渉画像に基づいて対象物の複素振幅画像、位相画像および強度画像を求めることができる。演算部３０は、パーソナルコンピュータおよびタブレット端末などのコンピュータであってもよい。また、演算部３０は、操作者からの入力を受け付ける入力部（キーボード、マウス、タブレット端末など）、ならびに、干渉画像および位相画像等を表示する表示部（ディスプレイ、タブレット端末など）を備えていてもよい。また、演算部３０は、画面に画像等を表示するとともに、その画面において操作者による領域の指定を受け付ける機能を有するのが好適である。
本実施形態では、図２に示されるとおり、透明材（容器７０の底部）の一方側に細胞７３が配置され、該透明材の他方側に第１反射ミラー２０が配置されている。すなわち、対象物である細胞７３に対して第１反射ミラー２０が離間して配置されている。そして、二光束干渉計において、第１反射ミラー２０で反射される第１光束の光路長と、第２反射ミラー１５で反射される第２光束の光路長との間の光路長差は、光源１１から出力される光のコヒーレント長以下とされる（干渉ステップ）。この光路長差の調整に際しては、ピエゾ素子２１の伸長または収縮を用いてもよいし、光路長差調整機構６１を用いてもよい。また、撮像器１８は、撮像面と第１反射ミラー２０との間の第１光学系において撮像面に対して共役となる位置に細胞７３を配置した状態で干渉画像を取得する（撮像ステップ）。第１光学系は、対物レンズ１３およびチューブレンズ１６を含む。このようにすることで、鮮明な干渉画像を取得することができる。
また、二光束干渉計において、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置と第１反射ミラー２０の反射面との間の光路長と、撮像面と第２反射ミラー１５との間の第２光学系において撮像面に対して共役となる位置と第２反射ミラー１５の反射面との間の光路長と、を互いに等しくするのが好適である（干渉ステップ）。第２光学系は、対物レンズ１４およびチューブレンズ１６を含む。第２光学系において撮像面に対して共役となる位置と第２反射ミラー１５の反射面との間の光路長を調整するにあたっては、フォーカス調整機構６０を用いるのが好適である。このようにすることで、更に鮮明な干渉画像を取得することができる。
光源１１から出力された光はビームスプリッタ１２により二光束に分岐されて第１光束および第２光束とされ、ビームスプリッタ１２から第１光束および第２光束が出力される。ビームスプリッタ１２から出力された第１光束は、対物レンズ１３により容器７０内の細胞７３に集光され、細胞７３および容器７０の底部を透過し、容器７０の底部の外側に設けられた第１反射ミラー２０で反射される。第１反射ミラー２０で反射された第１光束は、対物レンズ１３を経てビームスプリッタ１２に入力される。ビームスプリッタ１２から出力された第２光束は、対物レンズ１４により第２反射ミラー１５の反射面に入射され、その反射面で反射される。第２反射ミラー１５の反射面で反射された第２光束は、対物レンズ１４を経てビームスプリッタ１２に入力される。
対物レンズ１３からビームスプリッタ１２に入力された第１光束、および、対物レンズ１４からビームスプリッタ１２に入力された第２光束は、ビームスプリッタ１２により合波されて、ビームスプリッタ１２から干渉光が出力される。この干渉光は、チューブレンズ１６を経た後にビームスプリッタ１７により２分岐されて、撮像器１８および光検出器２２それぞれにより受光される。干渉光を受光した光検出器２２から検出信号が出力され、この検出信号に基づいて位相制御部２３により二光束干渉計における二光束の間の光路長差が検出される。そして、位相制御部２３によるピエゾ素子２１に対するフィードバック制御により、二光束干渉計における二光束の間の光路長差が設定値で安定化した状態（ロック状態）とされる。ロック状態において干渉光を受光した撮像器１８により干渉画像が取得され、その干渉画像は演算部３０へ出力される。そして、演算部３０により、干渉画像に基づいて対象物（細胞７３）の位相画像等が求められる。
例えば、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御部２３を用いたフィードバック制御により干渉光の位相差を或る初期位相で安定化させて、位相差を安定化させた状態で干渉画像Ｉ１を撮像器１８により取得する。次に、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御部２３を用いて干渉光の位相差を“初期位相＋π／２”で安定化させ、位相差を安定化させた状態で干渉画像Ｉ２を撮像器１８により取得する。同様にして、干渉光の位相差を“初期位相＋π”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ３を撮像器１８により取得し、干渉光の位相差を“初期位相＋３π／２”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ４を撮像器１８により取得する。
演算部３０は、これら４つの干渉画像Ｉ１〜Ｉ４を用いて、次式の演算を行って位相画像φを求める（演算ステップ）。なお、Ｉ１〜Ｉ４およびφは画素位置（ｘ，ｙ）の関数であり、次式の演算は画素毎に行われる。argは複素数の偏角を取得する演算子である。ｉは虚数単位である。
Figure 0006984822
図３は、干渉画像取得装置１の第１変形例の構成を示す図である。図１に示された干渉画像取得装置１の構成と比較すると、図３に示される第１変形例の干渉画像取得装置１Ａは、反射ミラー１９およびステージ４１を備える点で相違する。
反射ミラー１９は、ビームスプリッタ１２と対物レンズ１４との間の第２光束の光路上に設けられており、第２光束を反射させる。この反射ミラー１９が設けられることにより、対物レンズ１３および対物レンズ１４それぞれの光軸を互いに平行にすることができ、また、第１反射ミラー２０および第２反射ミラー１５それぞれの反射面を互いに平行にすることができる。
ステージ４１は、対物レンズ１３および対物レンズ１４それぞれの光軸に沿った方向に、容器７０、第１反射ミラー２０、ピエゾ素子２１および第２反射ミラー１５を移動させることができる。すなわち、第１光束の光路長および第２光束の光路長それぞれを可変とすることができる。
ステージ４１は、対象物である細胞７３を配置する位置を調整する調整部として用いられる。すなわち、先ず、ステージ４１により、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置に第１反射ミラー２０の反射面を配置し、フォーカス調整機構６０を用いて第２光学系において第２反射ミラー１５の反射面と撮像面とを互いに共役な位置関係にし、かつ第１光学系と第２光学系との間の光路長差をコヒーレント長以下とする（干渉ステップ）。
その後に、ステージ４１により、第１光束の光路長および第２光束の光路長を調整することにより、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置に対象物を配置する（調整ステップ）。この状態では、自動的に、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置と第１反射ミラー２０の反射面との間の光路長と、撮像面と第２反射ミラー１５との間の第２光学系において撮像面に対して共役となる位置と第２反射ミラー１５の反射面との間の光路長と、が概ね互いに等しくなる。このようにすることで、対象物の配置を容易に調整することができ、また、第１光学系および第２光学系それぞれにおける撮像面に対する共役位置を容易に調整することができる。
上記干渉ステップにおいて、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置に第１反射ミラー２０の反射面を配置し、第２光学系において第２反射ミラー１５の反射面と撮像面とを共役な位置とするにあたっては、フォーカス調整を容易にするために、第１反射ミラー２０および第２反射ミラー１５の一方または両方の反射面に色素または微小なキズ等により目印を付けて用いてもよい。この目印は、対象物の撮像時にはステージ４１により第１光束および第２光束の光路長が調整されることによりデフォーカスするため、対象物の画像撮像時においては画像に影響を与えない。
なお、ステージ４１による第１反射ミラー２０および第２反射ミラー１５それぞれの位置調整量が互いに同じであっても、第１光学系と第２光学系との間で光学条件が相違することにより、第１光束および第２光束それぞれの光路長調整量が互いに異なる場合がある。したがって、第１光束の光路長および第２光束の光路長を調整する際に、位相制御部２３によるフィードバック制御により、ピエゾ素子２１を駆動して位相差を一定に維持するのが好適である。
また、図１４に示すように、第１光学系と第２光学系との間での光学条件の相違を低減するために、第２反射ミラー１５の反射面の上側に透明層２４を設けてもよい。この透明層２４の材質は、第１光学系において第１反射ミラー２０と対象物との間にある容器７０の底部（後述する図８では透明物質９５）と同一または屈折率が概ね等しいものを用いるのが好ましい。例えば容器７０がポリスチレン製の細胞培養容器底面部である場合は、透明層２４もポリスチレンであるのが好ましい。この構成においては、前記調整ステップによって第１光束の実長および第２光束の実長を互いに同一距離だけ増加または減少させた際に、第１光束の光路長および第２光束の光路長の双方に関しても互いに同一距離だけ増加または減少するので都合が良い。
なお、容器７０、第１反射ミラー２０、ピエゾ素子２１および第２反射ミラー１５をステージ４１により移動させることに替えて又は加えて、光源１１、ビームスプリッタ１２、対物レンズ１３、対物レンズ１４および反射ミラー１９を含む光学系２を移動させてもよい。
図４は、干渉画像取得装置１の第２変形例の構成を示す図である。図３に示された第１変形例の干渉画像取得装置１Ａの構成と比較すると、図４に示される第２変形例の干渉画像取得装置１Ｂは、ステージ４１に替えて、ステージコントローラ５０、第１ステージ５１および第２ステージ５２を備える点で相違する。
第１ステージ５１は、対物レンズ１３の光軸に沿った方向に、容器７０および第１反射ミラー２０を移動させることができる。第２ステージ５２は、対物レンズ１４の光軸に沿った方向に、ピエゾ素子２１および第２反射ミラー１５を移動させることができる。すなわち、第１光束の光路長および第２光束の光路長それぞれを互いに独立に可変とすることができる。ステージコントローラ５０は、第１ステージ５１および第２ステージ５２それぞれの動作を制御する。
ステージコントローラ５０、第１ステージ５１および第２ステージ５２は、対象物である細胞７３を配置する位置を調整する調整部として用いられる。すなわち、先ず、第１ステージ５１により、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置に第１反射ミラー２０の反射面を配置するとともに、第２ステージ５２（およびピエゾ素子２１）により光路長差をコヒーレント長以下とし、さらにフォーカス調整機構６０を用いて第２光学系において第２反射ミラー１５の反射面と撮像面とを共役な位置関係にする。その後に、第１ステージ５１により第１光束の光路長を調整するとともに、第２ステージ５２により第２光束の光路長を調整することにより、第１光学系において撮像面に対して共役となる位置に対象物を配置する（調整ステップ）。このようにすることで、対象物の配置を容易に調整することができ、また、第１光学系および第２光学系それぞれにおける撮像面に対する共役位置を容易に調整することができる。
第２変形例においても、第１光束の光路長および第２光束の光路長を調整する際に、位相制御部２３によるフィードバック制御により、ピエゾ素子２１を駆動して位相差を一定に維持するのが好適である。また、図１４に示すように、第２反射ミラー１５の反射面の上側に透明層２４を設けてもよい。また、第１ステージ５１による容器７０および第１反射ミラー２０の移動ならびに第２ステージ５２によるピエゾ素子２１および第２反射ミラー１５の移動に替えて又は加えて、光源１１、ビームスプリッタ１２、対物レンズ１３、対物レンズ１４および反射ミラー１９を含む光学系２を移動させてもよい。
図２に示されるサンプル構成例を用いた実施例について説明する。図５は、実施例で用いたサンプルの構成を示す図である。容器７０として３５ｍｍΦのプラスチックディッシュを用いた。容器７０の底部の厚さは１ｍｍであった。蓋７１の中央部の下面が培養液７２に接することで、培養液７２の液面が空気に触れないようにして、培養液７２の液面が変動しないようにした。対象物としての細胞７３としてＨｅＬａ細胞を用いた。対物レンズ１３，１４それぞれの倍率は１０倍であった。光源１１の出力光波長は６３３ｎｍであり、出力光帯域幅は３ｎｍであった。光源１１のコヒーレント長はおよそ５０μｍであった。図６は、実施例で得られた複数の干渉画像に基づいて作成された位相画像を示す図である。本実施例では、鮮明な干渉画像が得られたことにより、この図に示されるような鮮明な位相画像が得られた。
図７は、サンプルの第１変形例の構成を示す図である。この図に示される第１変形例のサンプルは、対物レンズ１３が倒立型顕微鏡の一部である場合に好適である。対象物は、容器８０に入れられた培養液８２中の細胞８３である。第１反射ミラー２０は、容器８０の底部の内側に、スペーサ８４により容器８０の底部と離間して配置されている。第１反射ミラー２０の少なくとも反射面は培養液８２に接している。対象物としての細胞８３は、容器８０の底部、第１反射ミラー２０およびスペーサ８４により囲われた空間に存在する。容器８０の上部は蓋８１が被せられている。すなわち、このサンプル構成例では、容器８０の底部（透明材）の一方側に細胞８３が配置され、該透明材の該一方側において細胞８３と離間して第１反射ミラー２０が配置されている。対物レンズ１３から出力された第１光束は、容器８０の底部（透明材）および細胞８３を順に経た後に第１反射ミラー２０で反射される。
図８は、サンプルの第２変形例の構成を示す図である。この図に示される第２変形例のサンプルにおいては、対象物は、容器９０に入れられた培養液９２中の細胞９３である。第１反射ミラー２０は、容器９０の底部の内側に配置されている。第１反射ミラー２０は、容器９０の底部の内側に形成された反射増強コーティングであってもよい。第１反射ミラー２０の反射面上に透明物質９５が配置され、この透明物質９５の上または中に対象物としての細胞９３が配置されている。容器９０の内部は蓋９１により密閉されている。対物レンズ１３から出力された第１光束は、細胞９３および透明物質９５を経た後に第１反射ミラー２０で反射される。対象物が細胞である場合、透明物質は、その細胞を培養するジェル状物質（例えば、マトリゲル、コラーゲンおよびゼラチン等）であってもよい。
図８に示されるサンプル構成例を用いた実施例について説明する。図９は、実施例で用いたサンプルの構成を示す図である。容器９０として、底部の内側の面に反射増強コーティングを形成したガラスボトムディッシュを用いた。この反射増強コーティングを第１反射ミラー２０として用いた。この第１反射ミラー２０の上にマトリゲル層を透明物質９５として配置した。マトリゲル層の厚さは凡そ百μｍであった。蓋９１の中央部の下面が培養液９２に接することで、培養液９２の液面が空気に触れないようにして、培養液９２の液面が変動しないようにした。対象物としての細胞９３として初代培養（primary culture）のリンパ管内皮細胞を用いた。対物レンズ１３，１４それぞれの倍率は１０倍であった。光源１１の出力光波長は６３３ｎｍであった。図１０は、実施例で得られた複数の干渉画像に基づいて作成された位相画像を示す図である。本実施例でも、鮮明な干渉画像が得られたことにより、この図に示されるような鮮明な位相画像が得られた。
図１１は、図８に示されたサンプル構成例において対象物が３次元的に分布している様子を示す図である。例えば、細胞外マトリクスと呼ばれるジェル状物質（マトリゲル、コラーゲン、ゼラチン等）を透明物質９５として用いて、ジェル状物質の上で培養した細胞は、培養を続けていく間にジェル状物質内に侵入してジェル状物質内を３次元的に遊走し、組織構造を形成することが知られている。また、ジェル状物質としてのマトリゲル上で培養した脈管内皮細胞は、当初は分散的に播種した場合であっても、培養を続けていく間に自己組織化によって血管様またはリンパ管様の構造を自発的に形成することが知られている。これはチューブフォーメーションと呼ばれる。チューブフォーメーションが適切に起こっているか否かを観察することによって細胞の性質を判断することが可能である。
本実施形態では、このように対象物が３次元的に分布している場合に、対象物の３次元像を求めることができる（非特許文献１参照）。すなわち、二光束干渉計において第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置を第１光学系の光軸に沿って走査し、撮像器１８は、その走査の各位置において干渉画像を取得する。第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置を光軸に沿って走査するにあたっては、前記第１変形例または前記第２変形例の構成を用いるのが好ましい。演算部３０は、共役位置の走査の各位置について対象物の位相画像および強度画像を求め、これらに基づいて対象物の３次元像を求める。
図１２は、図８に示されたサンプル構成例において複数の対象物が３次元的に分布しており、複数の対象物の幾つかが３次元的に集合している様子を示す図である。対象物の３次元分布において対象物同士が３次元的に密接し、一部の対象物は他の対象物の直上に配置されている。例えば、細胞外マトリクスと呼ばれるジェル状物質（マトリゲル、コラーゲン、ゼラチン等）を透明物質９５として用いて培養した細胞９３は、培養期間が長くなるにつれて、細胞分裂または自己組織化により細胞同士が３次元的に密接した配置をとることがある。このような３次元的配置において、一部または全部の細部はジェル状物質内に埋没する。このようなサンプル構成においても同様に、二光束干渉計において第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置を第１光学系の光軸に沿って走査し、撮像器１８がその走査の各位置において干渉画像を取得することにより、共役位置の走査の各位置について対象物の位相画像および強度画像を演算部３０において求め、これらに基づいて対象物の３次元像を求めることが可能である。
図１３は、図８に示されたサンプル構成例において複数の対象物が３次元的に分布しており、複数の対象物の幾つかが３次元的に集合していて、その集合体が複数種類の対象物を含んでいる様子を示す図である。例えば、細胞外マトリクスと呼ばれるジェル状物質（マトリゲル、コラーゲン、ゼラチン等）を透明物質９５として用い、最初に透明物質９５の内部に埋没させて第１種類の細胞９３Ａを培養し、次に透明物質９５の表面に第２種類の細胞９３Ｂを培養してもよい。このような培養条件では、第２種類の細胞９３Ｂは、先に培養された第１種類の細胞９３Ａが放出する化学物質等の影響によって、第１種類の細胞９３Ａと３次元的に密接する位置に遊走し、３次元的構造を形成する。例えば、第１種類の細胞として線維芽細胞を用い、第２種類の細胞として血管またはリンパ管系の脈管内皮細胞を用いることで、生体内でのリンパ管または血管の構造を模したサンプルを構成することができる。
このようなサンプル構成においても同様に、二光束干渉計において第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置を第１光学系の光軸に沿って走査し、撮像器１８がその走査の各位置において干渉画像を取得することにより、共役位置の走査の各位置について対象物の位相画像および強度画像を演算部３０において求め、これらに基づいて対象物の３次元像を求めることが可能である。共役位置の走査においては、透明物質９５の内部に埋没した第１種類の細胞９３Ａを観察するよう条件を設定してもよいし、第１種類の細胞の上に配置された第２種類の細胞９３Ｂを観察するよう条件を設定してもよい。
以上のように本実施形態では、反射ミラーと対象物とが互いに離間している場合に、鮮明な干渉画像を取得することができ、さらに鮮明な位相画像を取得することができる。図２に示されるサンプル構成例では、容器の底部の内側に反射増強コーティングが施されていなくてもよいので、容器として安価な市販のディッシュを用いることができる。また、図２に示されるサンプル構成例では、例えば対象物が感染性のある細胞である等の理由により再利用ができない場合には、測定後に容器のみを廃棄すればよいので、ランニングコストが低く、廃棄物量も抑えられる。図７に示されるサンプル構成例でも、容器の底部の内側に反射増強コーティングが施されていなくてもよいので、容器として安価な市販のディッシュを用いることができる。図８に示されるサンプル構成例では、対象物について３次元的な観察を行うことができる。
１，１Ａ，１Ｂ…干渉画像取得装置、１１…光源、１２…ビームスプリッタ、１３，１４…対物レンズ、１５…第２反射ミラー、１６…チューブレンズ、１７…ビームスプリッタ、１８…撮像器、１９…反射ミラー、２０…第１反射ミラー、２１…ピエゾ素子、２２…光検出器、２３…位相制御部、２４…透明層、３０…演算部、４１…ステージ、５０…ステージコントローラ、５１…第１ステージ、５２…第２ステージ、６０…フォーカス調整機構、６１…光路長差調整機構、７０…容器、７１…蓋、７２…培養液、７３…細胞、８０…容器、８１…蓋、８２…培養液、８３…細胞、８４…スペーサ、９０…容器、９１…蓋、９２…培養液、９３…細胞、９３Ａ…第１種類の細胞、９３Ｂ…第２種類の細胞、９５…透明物質。

Claims (22)

  1. インコヒーレントな光を出力する光源と、
    前記光源から出力された光を第１光束と第２光束とに分岐し、前記第１光束の光路上に配置された対象物を透過するとともに第１反射ミラーで反射された前記第１光束と、第２反射ミラーで反射された前記第２光束とを合波して、干渉光を出力する二光束干渉計と、
    前記二光束干渉計から出力された干渉光を受光する撮像面を有し、前記対象物の干渉画像を取得する撮像器と、
    を備え、
    前記二光束干渉計は、前記対象物に対して前記第１反射ミラーが離間して配置されており、前記第１反射ミラーで反射される前記第１光束の光路長と、前記第２反射ミラーで反射される前記第２光束の光路長との間の光路長差が、前記光源から出力される光のコヒーレント長以下であり、
    前記撮像器は、前記撮像面と前記第１反射ミラーとの間の第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置に前記対象物を配置した状態で前記干渉画像を取得する、
    干渉画像取得装置。
  2. 前記二光束干渉計において、前記第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置と前記第１反射ミラーの反射面との間の光路長と、前記撮像面と前記第２反射ミラーとの間の第２光学系において前記撮像面に対して共役となる位置と前記第２反射ミラーの反射面との間の光路長と、が互いに等しい、
    請求項１に記載の干渉画像取得装置。
  3. 前記二光束干渉計は、前記第２反射ミラーの反射面の上に設けられた透明層を有する、
    請求項１または２に記載の干渉画像取得装置。
  4. 前記二光束干渉計において、前記第１光束の光路長および前記第２光束の光路長それぞれが可変であり、
    前記第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置に前記第１反射ミラーの反射面を配置するとともに前記光路長差をコヒーレント長以下とした後に、前記第１光束の光路長および前記第２光束の光路長を調整することにより、前記第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置に前記対象物を配置する調整部を更に備える、
    請求項１〜３の何れか１項に記載の干渉画像取得装置。
  5. 前記二光束干渉計における合波時の前記第１光束と前記第２光束との間の位相差の検出結果に基づいて該位相差をフィードバック制御する位相制御部を更に備え、
    前記調整部は、前記第１光束の光路長および前記第２光束の光路長を調整する際に前記位相制御部により前記位相差を一定に維持する、
    請求項４に記載の干渉画像取得装置。
  6. 前記撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて前記対象物の位相画像を求める演算部を更に備える、
    請求項１〜５の何れか１項に記載の干渉画像取得装置。
  7. 前記演算部は、前記撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて前記対象物の位相画像および強度画像を求める、
    請求項６に記載の干渉画像取得装置。
  8. 前記二光束干渉計において、前記第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置を前記第１光学系の光軸に沿って走査し、
    前記撮像器は、前記走査の各位置において干渉画像を取得し、
    前記演算部は、前記走査の各位置について位相画像および強度画像を求め、これら位相画像および強度画像に基づいて前記対象物の３次元像を求める、
    請求項７に記載の干渉画像取得装置。
  9. 二光束干渉計において、光源から出力されたインコヒーレントな光を第１光束と第２光束とに分岐し、前記第１光束の光路上に配置された対象物を透過するとともに第１反射ミラーで反射された前記第１光束と、第２反射ミラーで反射された前記第２光束とを合波して、干渉光を出力する干渉ステップと、
    前記二光束干渉計から出力された干渉光を受光する撮像面を有する撮像器により前記対象物の干渉画像を取得する撮像ステップと、
    を備え、
    前記干渉ステップは、前記二光束干渉計において、前記対象物に対して前記第１反射ミラーが離間して配置されており、前記第１反射ミラーで反射される前記第１光束の光路長と、前記第２反射ミラーで反射される前記第２光束の光路長との間の光路長差を、前記光源から出力される光のコヒーレント長以下とし、
    前記撮像ステップは、前記撮像面と前記第１反射ミラーとの間の第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置に前記対象物を配置した状態で前記撮像器により前記干渉画像を取得する、
    干渉画像取得方法。
  10. 前記干渉ステップは、前記二光束干渉計において、前記第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置と前記第１反射ミラーの反射面との間の光路長と、前記撮像面と前記第２反射ミラーとの間の第２光学系において前記撮像面に対して共役となる位置と前記第２反射ミラーの反射面との間の光路長と、を互いに等しくする、
    請求項９に記載の干渉画像取得方法。
  11. 前記二光束干渉計において、前記第２反射ミラーの反射面の上に透明層が設けられている、
    請求項９または１０に記載の干渉画像取得方法。
  12. 前記二光束干渉計において、前記第１光束の光路長および前記第２光束の光路長それぞれが可変であり、
    前記第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置に前記第１反射ミラーの反射面を配置するとともに前記光路長差をコヒーレント長以下とした後に、前記第１光束の光路長および前記第２光束の光路長を調整することにより、前記第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置に前記対象物を配置する調整ステップを更に備える、
    請求項９〜１１の何れか１項に記載の干渉画像取得方法。
  13. 前記調整ステップは、前記二光束干渉計における合波時の前記第１光束と前記第２光束との間の位相差の検出結果に基づいて該位相差をフィードバック制御する位相制御部により、前記第１光束の光路長および前記第２光束の光路長を調整する際に前記位相差を一定に維持する、
    請求項１２に記載の干渉画像取得方法。
  14. 前記撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて前記対象物の位相画像を求める演算ステップを更に備える、
    請求項９〜１３の何れか１項に記載の干渉画像取得方法。
  15. 前記演算ステップは、前記撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて前記対象物の位相画像および強度画像を求める、
    請求項１４に記載の干渉画像取得方法。
  16. 前記干渉ステップは、前記二光束干渉計において、前記第１光学系において前記撮像面に対して共役となる位置を前記第１光学系の光軸に沿って走査し、
    前記撮像ステップは、前記走査の各位置において干渉画像を前記撮像器により取得し、
    前記演算ステップは、前記走査の各位置について位相画像および強度画像を求め、これら位相画像および強度画像に基づいて前記対象物の３次元像を求める、
    請求項１５に記載の干渉画像取得方法。
  17. 透明材の一方側に前記対象物が配置され、前記透明材の他方側に前記第１反射ミラーが配置されており、
    前記干渉ステップは、前記対象物および前記透明材を順に経た後の前記第１光束を前記第１反射ミラーで反射させる、
    請求項９〜１６の何れか１項に記載の干渉画像取得方法。
  18. 透明材の一方側に前記対象物が配置され、前記透明材の前記一方側において前記対象物と離間して前記第１反射ミラーが配置されており、
    前記干渉ステップは、前記透明材および前記対象物を順に経た後の前記第１光束を前記第１反射ミラーで反射させる、
    請求項９〜１６の何れか１項に記載の干渉画像取得方法。
  19. 前記第１反射ミラーの反射面上に透明物質が配置され、前記透明物質の上または中に前記対象物が配置されており、
    前記干渉ステップは、前記対象物および前記透明物質を経た後の前記第１光束を前記第１反射ミラーで反射させる、
    請求項９〜１６の何れか１項に記載の干渉画像取得方法。
  20. 前記対象物が細胞であり、前記透明物質がジェル状物質である、
    請求項１９に記載の干渉画像取得方法。
  21. 前記対象物が複数の細胞であり、前記複数の細胞のうちの少なくとも１個の細胞は前記透明物質の中に配置されており、前記複数の細胞は３次元的に密接している、
    請求項１９または２０に記載の干渉画像取得方法。
  22. 前記対象物が種類の異なる複数の細胞であり、前記種類の異なる複数の細胞は前記透明物質の内部または表面で層を形成している、
    請求項１９〜２１の何れか１項に記載の干渉画像取得方法。
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