JP6630292B2 - 干渉観察装置および干渉観察方法 - Google Patents

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Description

本発明は、干渉観察装置および干渉観察方法に関するものである。
干渉画像を取得する干渉観察装置は、マイケルソン（Michelson）干渉計またはマッハツェンダ（Mach-Zehnder）干渉計の光学系を用いて、観察対象物で反射または透過した光と参照光とを干渉させることで、観察対象物の干渉画像を取得することができる。
非特許文献１〜５に記載または示唆された干渉観察装置は、マイケルソン干渉計の光学系を用い、光源から出力された光を分岐して第１分岐光および第２分岐光とし、第１分岐光を観察対象物で反射させ、第１分岐光と第２分岐光とを合波する。そして、この干渉観察装置は、その合波により生じる干渉光の画像を取得する。
これらのうち、非特許文献１，２に記載された干渉観察装置は、インコヒーレントな光を出力する光源（例えばハロゲンランプやＬＥＤ（Light Emitting Diode））を用いて干渉画像を取得する。非特許文献３，４に記載または示唆された干渉観察装置は、コヒーレントなレーザ光を出力する光源を用いて干渉画像を取得するとともに、干渉光の検出結果に基づいてマイケルソン干渉計における２つの光路の間の光路長差をフィードバック制御する。非特許文献５に記載された干渉観察装置は、インコヒーレントな光を出力する第１光源を用いて干渉画像を取得するとともに、コヒーレントなレーザ光を出力する第２光源を用いて干渉光の検出結果に基づいてマイケルソン干渉計における２つの光路の間の光路長差をフィードバック制御する。
非特許文献７〜１１に記載された干渉観察装置は、マッハツェンダ干渉計の光学系を用い、光源から出力された光を分岐して第１分岐光および第２分岐光とし、第１分岐光を観察対象物で透過または反射させ、第１分岐光と第２分岐光とを合波する。そして、この干渉観察装置は、その合波により生じる干渉光の画像を取得する。
これらのうち、非特許文献７〜９，１１に記載された干渉観察装置は、コヒーレントなレーザ光を出力する光源を用いる。また、非特許文献１０に記載された干渉観察装置は、時間的にインコヒーレントな光を出力する光源を用いる。非特許文献７〜９に記載された干渉観察装置は、マッハツェンダ干渉計における２つの光路の間の光路長差を調整する機能を備えていない。これに対して、非特許文献１０，１１に記載された干渉観察装置は、光路長差を調整する機能を備えている。
なお、干渉光検出結果に基づくフィードバック制御により干渉計における２つの光路の間の光路長差を一定に維持する技術を「位相ロック」という。また、該フィードバック制御により位相ロックにより維持される該光路長差の値を変更する技術を「位相シフト」という。
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位相ロック機能を有していない干渉観察装置は、定量性に優れた干渉画像を取得することが困難である。仮に、位相ロック機能を有していない干渉観察装置において定量性に優れた干渉画像を取得しようとすると、環境からの機械的なノイズより高速に位相シフトを行なうとともに、高速カメラにより干渉画像を取得することが考えられる。しかし、この場合、高価な高速ピエゾステージや高価な高速カメラが必要となることから、干渉観察装置も高価となる。また、この場合、カメラの露光時間が短いことから、光源から出力される光のパワーを大きくせざるを得ない。光に弱い生体などを観察対象物とする場合、このような高強度光を観察対象物に照射することは好ましくない。
レーザ光源から出力されたレーザ光による干渉光の検出結果に基づいて干渉画像の取得および位相ロックを行なう干渉観察装置は、定量性に優れた干渉画像を取得することができる。しかし、この干渉観察装置により取得される干渉画像は、スペックルノイズに代表される干渉ノイズにより画質が劣る。すなわち、レーザ光などの高コヒーレント光は、干渉計における２つの光路の間の光路長差に拘らず干渉することから光学調整が容易であるものの、望まれない光路を経た光（例えば途中の光学素子からの戻り光）による干渉も同時に引き起こす。このことにより回折ノイズが干渉画像に重畳することになる。また、レーザ光を用いたイメージングでは、スペックル状のノイズが画像に重畳することが知られている。
以上のように、インコヒーレント光を用いた場合には、干渉画像の画質が良好であるものの、光学調整が困難である。一方、高コヒーレント光を用いた場合には、光学調整が容易であるものの、干渉画像の画質が劣る。干渉画像の画質と光学調整の容易性との間にはトレードオフが存在する。
非特許文献５に記載された干渉観察装置は、インコヒーレント光を用いて画質が良好な干渉画像を取得することができ、レーザ光を用いて位相ロックおよび位相シフトを行なうことができる。しかし、この干渉観察装置は、２つの光源を備えることから高価となる。また、インコヒーレント光の光路とレーザ光の光路とを精確に一致させる必要があることから、装置の組み立てや搬送後等の再調整は、精密な作業を要し、光学系の専門家以外の一般利用者にとっては困難である。
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、画質が良好な干渉画像を容易に取得することができる安価な干渉観察装置および干渉観察方法を提供することを目的とする。
本発明の一実施形態による干渉観察装置は、観察対象物の干渉画像を取得する装置であって、(1) インコヒーレントな光を出力する光源と、(2) 光源から出力された光を分岐して第１分岐光および第２分岐光とし、第１分岐光を観察対象物で反射または透過させ、第１分岐光と第２分岐光とを合波して当該合波光を出力する干渉光学系と、(3) 合波光を受光して検出信号を出力する受光部と、(4) 検出信号に基づいて干渉画像を取得する画像取得部と、(5) 検出信号に基づいて合波光の干渉強度を求め、干渉強度が大きくなるように干渉光学系を調整する制御部と、を備える。
本発明の一実施形態による干渉観察方法は、観察対象物の干渉画像を取得する方法であって、(1) 干渉光学系により、光源から出力されたインコヒーレントな光を分岐して第１分岐光および第２分岐光とし、第１分岐光を観察対象物で反射または透過させ、第１分岐光と第２分岐光とを合波して当該合波光を出力し、(2) 受光部により、合波光を受光して検出信号を出力し、(3) 画像取得部により、検出信号に基づいて干渉画像を取得し、(4) 検出信号に基づいて合波光の干渉強度を求め、干渉強度が大きくなるように干渉光学系を調整する。
本発明によれば、画質が良好な干渉画像を容易に取得することができ、また、安価な装置構成とすることができる。
図１は、干渉観察装置１の構成を示す図である。 図２は、干渉観察装置１Ａの構成を示す図である。 図３は、干渉観察装置１Ｂの構成を示す図である。 図４は、干渉観察装置１Ｃの構成を示す図である。 図５は、干渉観察装置１Ｄの構成を示す図である。 図６は、表示部（ディスプレイ）に表示される情報の一例を示す図である。 図７は、フィードバック制御を行わなかった場合の位相の時間的変化を示すグラフである。 図８は、フィードバック制御を行った場合の位相の時間的変化を示すグラフである。 図９は、干渉画像を示す図である。 図１０は、干渉画像を示す図である。 図１１は、位相画像を示す図である。 図１２は、干渉観察装置２の構成を示す図である。 図１３は、干渉観察装置２Ａの構成を示す図である。 図１４は、干渉画像を示す図である。 図１５は、干渉画像を示す図である。 図１６は、位相画像を示す図である。 図１７は、干渉強度を最大化する方法を説明する図である。 図１８は、干渉強度を最大化する他の方法を説明する図である。 図１９は、干渉観察装置１Ｅの構成を示す図である。 図２０は、補正環付き対物レンズ３７を用いて透明物体越しのサンプル１０１を観察する場合のフォーカスを模式的に説明する図である。 図２１は、位相アンラッピングの前後それぞれの定量位相画像を示す図である。 図２２は、ステージ４６の移動量と干渉強度表示値との関係を示すグラフである。 図２３は、位相アンラッピングの前後それぞれの定量位相画像を示す図である。
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一または同様の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
（第１実施形態）
図１は、第１実施形態の干渉観察装置１の構成を示す図である。干渉観察装置１は、光源１０、レンズ１１、ビームスプリッタ２０、試料保持台３１、対物レンズ３２、ステージ３３〜３５、参照ミラー４１、レンズ４２、収差補正用プレート４３、ピエゾ素子４４、ステージ４５、チューブレンズ５１、ビームスプリッタ５２、撮像部６１、光検出器６２、画像取得部７１および制御部７２を備える。
この干渉観察装置１は、マイケルソン干渉計の光学系を有し、試料保持台３１により保持された観察対象物からの反射光に基づいて干渉画像を取得する。観察対象物は、特定の細胞や生体サンプルに限定されるものではない。例えば、観察対象物として、培養細胞、不死化細胞、初代培養細胞、がん細胞、脂肪細胞、肝臓細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および、これらの細胞のうち少なくとも１つの細胞をもとに作られた細胞塊（スフェロイド）などが挙げられる。また、観察対象物として、生体に限らず、工業サンプル、たとえば金属表面、半導体表面、ガラス表面、半導体素子の内部、樹脂素材表面、液晶、高分子化合物なども挙げられる。
光源１０は、インコヒーレントな光を出力する。光源１０は、例えばハロゲンランプなどのランプ系光源、ＬＥＤ（Light emitting diode）光源、ＳＬＤ（Super luminescent diode）光源、ＡＳＥ（Amplified spontaneous emission）光源等である。レンズ１１は、光源１０から出力された光をコリメートする。
ビームスプリッタ２０は、光源１０と光学的に結合され、マイケルソン干渉計の光学系を構成する。ビームスプリッタ２０は、例えばハーフミラーであってもよい。ビームスプリッタ２０は、レンズ１１によりコリメートされた光を２分岐して第１分岐光および第２分岐光とする。ビームスプリッタ２０は、第１分岐光を対物レンズ３２へ出力し、第２分岐光を収差補正用プレート４３へ出力する。また、ビームスプリッタ２０は、試料保持台３１に保持された観察対象物で反射されて対物レンズ３２を経た第１分岐光を入力するとともに、参照ミラー４１で反射されて収差補正用プレート４３を経た第２分岐光を入力し、これら入力した第１分岐光と第２分岐光とを合波して、当該合波光をレンズ５１へ出力する。
対物レンズ３２は、ビームスプリッタ２０と光学的に結合され、ビームスプリッタ２０から出力された第１分岐光を試料保持台３１により保持された観察対象物に集光する。また、対物レンズ３２は、観察対象物で反射された第１分岐光を入力してビームスプリッタ２０へ出力する。ステージ３３は、対物レンズ３２の光軸に平行な方向に試料保持台３１を平行移動させる。ステージ３４は、対物レンズ３２の光軸に交差する２方向（例えば、対物レンズ３２の光軸に直交する２方向）に試料保持台３１を平行移動させる。ステージ３５は、対物レンズ３２と試料保持台３１との間の距離を調整する。
レンズ４２は、ビームスプリッタ２０と光学的に結合され、ビームスプリッタ２０から出力され収差補正用プレート４３を経た第２分岐光を参照ミラー４１に集光する。また、レンズ４２は、参照ミラー４１で反射された第２分岐光を、収差補正用プレート４３を経てビームスプリッタ２０へ出力する。ピエゾ素子４４は、レンズ４２の光軸に平行な方向に参照ミラー４１を移動させる。ステージ４５は、参照ミラー４１とレンズ４２との間の距離を粗調整する。
チューブレンズ５１は、干渉光学系を構成するビームスプリッタ２０と光学的に結合され、ビームスプリッタ２０から出力された合波光を、ビームスプリッタ５２を経て撮像部６１の撮像面に結像させる。ビームスプリッタ５２は、干渉光学系を構成するビームスプリッタ２０と光学的に結合され、レンズ５１から到達した光を分岐する分岐部であり、一方の分岐光（第１検出光）を撮像部６１へ出力し、他方の分岐光（第２検出光）を光検出器６２へ出力する。ビームスプリッタ５２は、例えばハーフミラーであってもよい。
合波光を受光して検出信号を出力する受光部は、干渉光学系を構成するビームスプリッタ２０と光学的に結合され、撮像部６１および光検出器６２を含む。撮像部６１は、ビームスプリッタ５２から到達した第１検出光を受光して当該受光信号（第１検出信号）を出力する。撮像部６１は、例えば、ＣＣＤエリアイメージセンサやＣＭＯＳエリアイメージセンサなどのイメージセンサである。光検出器６２は、ビームスプリッタ５２から到達した第２検出光を受光して当該受光信号（第２検出信号）を出力する。光検出器６２は、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、ラインセンサ（リニアセンサ）、ＣＣＤエリアイメージセンサ、ＣＭＯＳエリアイメージセンサなどである。画像取得部（画像処理装置）７１は、撮像部６１から出力された第１検出信号に基づいて干渉画像を取得する。制御部（コントローラ）７２は、光検出器６２から出力された第２検出信号に基づいて制御を行う。
なお、画像取得部７１および制御部７２は、プロセッサ及びメモリ等を含むコンピュータである。また、画像取得部７１および制御部７２は、個別のコンピュータであってもよいし、１つのコンピュータであってもよい。コンピュータは、例えば、パーソナルコンピュータやタブレット端末などのスマートデバイスであってもよい。また、画像取得部７１または制御部７２は、利用者からの入力を受け付ける入力部（キーボード、マウス、タブレット端末等）や、干渉強度等を表示する表示部（ディスプレイ、タブレット端末、スピーカー、バイブレータなど）を備えていてもよい。なお、表示部がディスプレイやタブレット端末などのように、画面表示できる装置であれば、干渉強度と合わせて干渉画像などを表示してもよい。
試料側光学系（第１分岐光の光学系）および参照側光学系（第２分岐光の光学系）の何れにも、反射位置（観察対象物、参照ミラー４１）で光を結像するためのレンズ３２，４２が設けられている。このように双方の光学系に対物レンズ（または同等なレンズ）が設けられた干渉光学系はリニク（Linnik）型干渉計として知られている。図１に示される構成では、参照側光学系（第２分岐光の光学系）の軽量化の為に、対物レンズに替えて、小型で軽量な非球面アクロマティックレンズ４２および収差補正用プレート４３が用いられている。
ステージ３３は、対物レンズ３２の光軸方向に試料保持台３１を移動可能に構成され、試料側光学系（第１分岐光の光学系）の光路長を調整することができる。ピエゾ素子４４は、レンズ４２の光軸方向に参照ミラー４１を移動可能に構成され、参照側光学系（第２分岐光の光学系）の光路長を調整することができる。ピエゾ素子４４の代わりに、ステッピングモータあるいはサーボモータなどのアクチュエータを用いてもよい。ステージ３３およびピエゾ素子４４は、試料側光学系（第１分岐光の光学系）の光路長と試料側光学系（第１分岐光の光学系）の光路長との差を調整することができ、干渉光学系における分岐から合波までの第１分岐光と第２分岐光との間の光路長差を調整する光路長差調整部として作用する。制御部７２は、この光路長差調整部（ステージ３３、ピエゾ素子４４）による光路長差調整動作を制御する。
光源１０から出力されたインコヒーレントな光は、レンズ１１によりコリメートされた後、ビームスプリッタ２０により２分岐されて第１分岐光および第２分岐光とされる。第１分岐光は、対物レンズ３２により、試料保持台３１により保持された観察対象物に集光され、観察対象物の表面または内部で反射される。その反射された第１分岐光は、対物レンズ３２を経てビームスプリッタ２０に入力される。この第１分岐光は、観察対象物における反射の際に光学的な遅れを有する。第２分岐光は、収差補正用プレート４３を経て、レンズ４２により参照ミラー４１に集光され、参照ミラー４１により反射される。その反射された第２分岐光は、レンズ４２および収差補正用プレート４３を経てビームスプリッタ２０に入力される。
対物レンズ３２からビームスプリッタ２０に入力された第１分岐光、および、レンズ４２からビームスプリッタ２０に入力された第２分岐光は、ビームスプリッタ２０により合波される。その合波光は、チューブレンズ５１を経て、ビームスプリッタ５２により２分岐されて、撮像部６１により受光されるとともに、光検出器６２により受光される。画像取得部７１により、合波光を受光した撮像部６１から出力される第１検出信号に基づいて、干渉画像が取得される。また、制御部７２により、合波光を受光した光検出器６２から出力される第２検出信号に基づいて、光路長差調整部（ステージ３３、ピエゾ素子４４）による光路長差調整動作が制御される。
図１に示される構成では、試料保持台３１に保持された観察対象物と対物レンズ３２とをステージ３３により一体的に対物レンズ３２の光軸方向に移動することができるので、対物レンズ３２およびレンズ４２それぞれの結像条件を保ったまま光路長差を調整することができる。また、図２〜図５に示される変形例の干渉観察装置１Ａ〜１Ｄも、対物レンズ３２およびレンズ４２それぞれの結像条件を保ったまま光路長差を調整することができる。
図２に示される変形例の干渉観察装置１Ａは、図１に示される構成に対して、対物レンズ３２の位置を固定のままとする一方、参照ミラー４１，レンズ４２および収差補正用プレート４３を一体的にレンズ４２の光軸方向に移動させるステージ４６を備えている点で相違する。
図３に示される変形例の干渉観察装置１Ｂは、図１に示される構成に対して、試料保持台３１と対物レンズ３２との間の距離を調整するステージ３５に替えて、試料保持台３１とは独立に対物レンズ３２をその光軸方向に移動させるステージ３６を備えている点で相違する。この干渉観察装置１Ｂは、試料保持台３１を対物レンズ３２の光軸方向に移動させるステージ３３および対物レンズ３２をその光軸方向に移動させるステージ３６を協調的に制御することで、対物レンズ３２およびレンズ４２それぞれの結像条件を保ったまま光路長差を調整することができる。
図４に示される変形例の干渉観察装置１Ｃは、図１に示される構成に対して、光源１０からビームスプリッタ２０への光路と、ビームスプリッタ２０から撮像部６１および光検出器６２への光路とを、入れ替えたものである。
図５に示される変形例の干渉観察装置１Ｄは、図１に示される構成に対して、ビームスプリッタ５２に替えてビームスプリッタ１２を備える点で相違し、光検出器６２の位置の点で相違する。ビームスプリッタ２０は、合波光をチューブレンズ５１およびレンズ１１の双方へ出力する。ビームスプリッタ１２は、光源１０とレンズ１１との間の光路上に設けられており、ビームスプリッタ２０から出力されレンズ１１により収斂された合波光の一部を反射させて光検出器６２へ入力させる。
本実施形態では、光源１０が出力するインコヒーレントな光を用いて干渉画像を取得することから、光路長差を制御して位相ロックおよび位相シフトを行なうことが必要である。何故なら、インコヒーレント光すなわち白色光の場合、光路長差がコヒーレンス長ΔＬＣ以下である場合に干渉が得られるからである。インコヒーレント光の中心波長をλ０とし、インコヒーレント光のスペクトル幅をΔλとすると、コヒーレンス長ΔＬＣは下記（１）式で表される。ＬＥＤの場合、コヒーレンス長ΔＬＣは１０μｍ程度である。ハロゲンランプの場合、コヒーレンス長ΔＬＣは１μｍ程度である。
本実施形態では、制御部７２が、ビームスプリッタ５２から出力された合波光を受光した光検出器６２から出力された検出信号に基づいて、光路長差調整部（ステージ３３、ピエゾ素子４４）による光路長差調整動作を制御して、位相ロックおよび位相シフトを行なう。
なお、厳密にはピエゾ素子４４による参照ミラー４１の移動は参照光学系の結像条件を乱してしまう。しかし、実際の参照ミラー４１のスキャン距離は、光の波長の半分程度であり、例えば光源１０として赤色ＬＥＤ（波長６１０ｎｍ）を用いた場合は高々３０５ｎｍである。この移動量は、レンズ４２（またはその同等品の対物レンズ）の焦点深度と同程度または有意に短い距離である。したがって、ピエゾ素子４４により参照ミラー４１を移動させても、実質的に参照側光学系の結像条件は保たれているとみなして差し支えない。
実際の実験環境においては、振動対策をしてある実験台において１秒あたり１０ｎｍ程度の光路長の振動は避けられず、また、振動対策をしていない実験台では１秒あたり１００ｎｍ以上の光路長の擾乱が生じることは珍しくない。そこで、高精度な干渉イメージングにおいては、光路長差のロックは不可欠である。
位相ロックとしては、非特許文献３，５，６に記載された技術（以下「第１位相ロック技術」という。）を用いることができる。これらの非特許文献に記載された位相ロック技術は、光源１０の出力光の波長に比べて十分小さい振幅で参照ミラー４１を正弦波的に高速に振動させ、そのときに光検出器６２から出力される検出信号を参照ミラー４１の振動周波数の１倍波および２倍波で同期検波することで、干渉光の位相を得るというものである。制御部７２は、この得られた位相値を目標値に近づけるべくフィードバック制御することで、光路長差をロックすることが可能となる。
制御部７２は、光検出器６２からのアナログ信号である検出信号を入力し、ステージ３３またはピエゾ素子４４を駆動制御するためのアナログ信号を出力する。制御部７２は、内部でアナログ処理をしてもよいしデジタル処理をしてもよい。後者の場合、例えば、制御部７２は、入力した検出信号をＡＤ変換してデジタル信号とし、そのデジタル信号を処理し、その処理により得られたデジタル信号をＤＡ変換してアナログ信号とし、そのアナログ信号を出力してもよい。デジタル信号の処理には、マイクロプロセッサやＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）が用いられてもよい。
光路長差に相当する位相差がΔφであるとき、光検出器６２が受光する光の強度Ｖは下記（２）式で表される。受光強度Ｖは、何れも未知数であるオフセット成分ＤＣおよび振幅ＡＣを含む。それ故、何等かの処理により、ＤＣおよびＡＣを含まない形で位相差Δφを抽出する必要がある。
光源１０の出力光の波長に比べて十分小さい振幅でピエゾ素子４４により参照ミラー４１を正弦波的に高速に振動させると、光検出器６２が受光する光の強度Ｖは下記（３）式で表される。αは、参照ミラー４１の振動の振幅に応じて決まる変調度である。ωは、振動の角周波数である。ｔは時間変数である。
この（３）式の右辺をフーリエ級数展開すると、近似式として下記（４）式が得られる。Ｊ１およびＪ２は第一種ベッセル関数である。（４ａ）式の右辺の第２項は振幅Ａωｔおよび角周波数ωで振動する。また、（４ａ）式の右辺の第３項は振幅Ａ２ωｔおよび角周波数２ωで振動する。したがって、光検出器６２から出力される検出信号を角周波数ωで同期検波することで振幅Ａωｔを得ることができ、検出信号を角周波数２ωで同期検波することで振幅Ａ２ωｔを得ることができる。
振幅Ａωｔと振幅Ａ２ωｔとの比は下記（５）式で表される。また、ＡＣは合波光の干渉強度を表しており、その干渉強度ＡＣは下記（６）式で表される。参照ミラー４１の振動の振幅が一定であるので、その振幅に基づいてＪ１(α)およびＪ２(α)を求めることができる。（５）式に基づいて光路長差に応じた位相差Δφを求めることができ、（６）式に基づいて干渉強度ＡＣをも求めることができる。制御部７２は、以上のような処理を行なう為に、同期検波回路，加算回路および乗除算回路を含む。
本実施形態は、インコヒーレント光を用いて位相ロックを行なうものである。従来では、インコヒーレント光の可干渉性が低いので、これを位相ロックに用いることは難しかった。しかし、本実施形態では、インコヒーレント光の干渉強度ＡＣを求めることによって、作業者に光学系の干渉状態を最適化するよう促すことができる。すなわち、干渉計の光路長差が光のコヒーレンス長に比べて十分に大きいとき、干渉強度ＡＣはゼロに近づく。干渉計の光路長差がゼロであるときに干渉強度ＡＣは最大値を取る。干渉強度ＡＣを求めて、この干渉強度ＡＣが大きくなるように光路長差を調整することができる。
非特許文献４に記載された "spatial filtering detector" を用いた位相ロック技術（以下「第２位相ロック技術」という。）も採用可能である。この技術では、光検出器６２に替えて、１次元方向に複数の画素が配列されたラインセンサまたは１次元方向に配列された複数の光検出器を用いる。以下では、等間隔に配列された４個の光検出器を用いる場合について説明する。測定側光学系および参照側光学系の双方または何れか一方に傾きを与えることで干渉縞が現れるようにし、この状態において４個の光検出器の受光強度Ｖ1〜Ｖ4が下記（７）式となるように干渉縞の傾きを調整する。
測定側光学系および参照側光学系の双方または何れか一方に傾きを与えるために、例えば、試料保持台３１または参照ミラー４１を傾斜させてもよいし、何れかのレンズを傾けてもよいし、また、所定方向に沿って厚みが異なる楔形状のプリズムを光路上に挿入してもよい。
この受光強度Ｖ1〜Ｖ4から下記（８）式によりＡ1，Ａ2が求められ、下記（９）式によりＡ1とＡ2との比が求められる。また、干渉強度ＡＣは下記（１０）式で表される。これらの式から、光路長差に応じた位相差Δφを求めることができ、干渉強度ＡＣをも求めることができる。制御部７２は、以上のような処理を単純な電気回路系で実現できることができる。
制御部７２は、このようにして光路長差に応じた位相差を求めるとともに干渉強度を求め、光路長差調整部（ステージ３３、ピエゾ素子４４）による光路長差調整動作を制御して、求めた干渉強度に基づいて光路長差を小さくするとともに、求めた位相差に基づいて光路長差を一定に維持する。なお、光路長差の調整に際して、ステージ３３およびピエゾ素子４４の何れを制御してもよいが、ステージ３３の制御により光路長差を粗調整することができ、ピエゾ素子４４の制御により光路長差を微調整することができる。
求めた干渉強度に基づいて光路長差を小さくする際に、自動的にステージ３３を移動させてもよい。また、利用者に干渉強度を通知して、利用者の操作によりステージ３３を移動させてもよい。例えば、画像取得部７１もしくは制御部７２の表示部、または、これらとは別に設けた表示部に、干渉強度を表示させて、干渉強度を利用者に知らせる。表示部は、ディスプレイ、ＬＥＤバー、アナログパネルメーター、デジタルパネルメーターなどの視覚的なものであってもよいし、干渉強度に応じた大きさの音を出力するブザーやスピーカーなどの聴覚的なものであってもよいし、また、干渉強度に応じた大きさの振動を利用者に与えるバイブレータなどの触覚的なものであってもよい。利用者は、表示部に表示された干渉強度が大きくなるように、ステージ３３を対物レンズ３２の光軸方向に移動させる。図６は、表示部（ディスプレイ）に表示される情報の一例を示す図である。この例では、干渉強度は、数値、バー、および、時間的変化を示すグラフの３つの態様で同時に表示されている。また、この例では、干渉画像および位相画像（後述）も表示されている。
干渉強度を大きくする際に、光路長差を最小化することがもっとも重要である。ただし、試料側光学系および参照側光学系の何れかの結像系のフォーカスや光軸がずれている場合にも干渉強度が小さくなる。したがって、干渉強度を大きくするには、第１に光路長差を調整して小さくするとともに、試料側光学系および参照側光学系それぞれの結像系のフォーカスや光軸の調整をも行なう。
干渉強度を最大化するアルゴリズムとしては、干渉強度を記録しながら調整機構（光路長差、フォーカス、光軸）のうちの１つを一方向に動かして行き、最適な位置を通り過ぎて干渉強度が下がり始めたら調整機構を逆方向に動かし、一方向のスキャン中に得られた最大強度の誤差数％以内の干渉強度が得られた地点を最適値とみなすという方法が考えられる。調整箇所が複数ある場合は、このような最適値の探索をそれぞれの調整箇所について順番に行い、調整が一巡したら必要に応じてもう一巡もしくは数回調整を繰り返すことで、光学系全体としての最適な状態を実現する、というアルゴリズムが考えられる。
また、干渉強度を最大化する方法として、断続的に位相ロックをかけながら、調整機構（光路長差、フォーカス、光軸）のうちの１つもしくは複数を移動させてもよい。たとえば、利用者の操作によりステージ３３を移動させながら干渉強度を最大化する場合、ステージ３３を含む光学系の機械的な要因により、実際の移動量は振動をともなったものとなる。そこで、図１７に示すように、位相ロックのＯＮ及びＯＦＦを繰り返しながら、干渉光学系を調整するようにすれば、断続的に光路長差が安定化される。図１７は、干渉強度を最大化する方法を説明する図である。この図は、ステージ３３の移動量、光路長差、ピエゾ素子４４の伸長長さ、位相ロックのＯＮ／ＯＦＦおよび合波光の撮像（露光）のＯＮ／ＯＦＦそれぞれの時間的変化を示している。
このように断続的に位相ロックを行いながら干渉光学系を調整する場合、位相ロックのＯＮ及びＯＦＦに合わせて、撮像部６１による合波光の撮像（露光）のＯＮ及びＯＦＦを行ってもよい。この場合、撮像部６１の露光期間が位相ロックのＯＮ期間に含まれるように、撮像部６１は制御される。例えば、制御部７２は、撮像部６１の露光期間が位相ロックのＯＮ期間に含まれるように、撮像部６１の撮像を制御する。そのため、作業者は、干渉光学系を調整しながら、定期的に位相ロックがＯＮの状態の干渉画像を確認できるので、機械的要因の影響を受けずに、干渉画像を確認することができる。
断続的に位相ロックを行いながら調整機構を移動させ、位相ロックがかかっているタイミングでの干渉画像を表示させる場合、各断続的位相ロックにおいて目標とする位相差を毎回同じ値にするのが望ましい。この場合、それぞれの位相ロックのＯＮ期間において、光路長差ＬはＬ＝ΔＬ＋Ｎλ（Ｎは整数、λは光源の中心波長、ΔＬは位相差に対応するオフセット光路長差）に安定化される。それ故、光路長差を調整していながらも、各干渉画像の撮像タイミングにおいては相対的な位相差が一定となる。これにより、干渉縞のパターンがほぼ同一であり、コントラストのみが異なる画像を順次取得することが可能となる。干渉強度を最大化させるという目的のために必要な情報は、干渉縞の位相ではなく干渉縞のコントラストであるので、コントラストのみ異なる干渉画像を観察しながら調整機構を移動させることは、干渉縞が変化している状態で調整機構を移動させることと比べて、作業者にとって作業の負担が少ない。
このように、干渉縞のコントラストは、副次的な干渉強度情報として有用である。また、光路長差のブレは、光路長差に直接関与しないフォーカスや光軸の調整においても、副次的に発生する。断続的に位相ロックを行いながら調整機構を移動させる方法は、フォーカスや光軸の調整においても有効である。
位相ロックがＯＮとなる期間と、位相ロックがＯＦＦとなる期間との配分、および、位相ロックのＯＮ及びＯＦＦが繰り返される周期は、適切に設定される必要がある。まず、位相ロックがＯＮとなる期間が短すぎると、位相ロックを安定化させるために不十分となり、また、撮像部６１による露光を行うにあたっても露光時間が不足する。そこで、位相ロック機構については、１ミリ秒〜５ミリ秒程度の遷移時間（光学系の機械的要因に依存する）で光路長を安定化させることができるので、位相ロックがＯＮとなる期間は少なくとも１ミリ秒より長いことが望ましい。ただし、反射率の低いサンプル（たとえばガラス表面など）を観察する場合は、干渉縞を十分な光量で撮像できるだけの時間幅を取ることが望ましく、撮像部６１の露光期間の観点から、少なくとも２０ミリ秒より長いことが望ましい。
一方、位相ロックがＯＮとなる期間が長すぎても問題になる場合がある。位相ロックのＯＮ及びＯＦＦが繰り返される周期は、位相ロックがＯＮとなる期間の逆数より小さくできない。たとえば、位相ロックがＯＮとなる期間が５秒であれば、当然ながら位相ロックのＯＮ及びＯＦＦが繰り返される周期も５秒より長くなくてはならない。この場合、干渉画像が表示される周期も５秒より長くなるので、作業者の操作性を損なうこととなる。更には、位相ロックがＯＮとなる期間が長い場合、ピエゾ素子４４の伸長範囲に関係した問題も生じる。位相ロックがＯＮとなっている間、調整機構（光路長差、フォーカス、光軸）の移動による光路長変化を打ち消すべく、フィードバック制御によりピエゾ素子４４の伸長距離が調整されるが、フィードバック制御に用いうるピエゾ素子４４の伸長範囲はたかだか±８μｍ程度であり、調整機構（光路長差、フォーカス、光軸）の移動による光路長変化がこの範囲を越えた場合、フィードバック制御がかからなくなる。これらのことから、位相ロックがＯＮとなる期間は、たとえば３秒以下が望ましい。
また、位相ロックのＯＮ及びＯＦＦが繰り返される周期に関しては、干渉画像が表示される周期と同一となるので、作業者の操作性を損なわないためには、３秒間よりも短いことが望ましい。位相ロックがＯＮとなる期間と、位相ロックのＯＮ及びＯＦＦが繰り返される周期とが好適に設定されれば、自動的に位相ロックがＯＦＦとなる期間の時間幅も求められることとなる。
図１７は、断続的に位相ロックを行いながら光路長を調整する場合のタイミングチャートを示すとともに、各期間の長さの具体的数値をも示す。位相ロックがＯＮとなる期間を２０ミリ秒とし、位相ロックのＯＮ及びＯＦＦが繰り返される周期を２００ミリ秒とした。この変形例では、２００ミリ秒間隔で、干渉画像を安定的に得ることができる。
なお、位相ロックがＯＦＦとなる期間を３０ミリ秒以下としてもよい。位相ロックがＯＦＦとなる期間では干渉画像が取得されないので、位相ロックがＯＦＦとなる期間が３０ミリ秒より大きいと、作業者にとってスムーズな干渉画像の切り替えが行われないので観察しにくい。それ故、位相ロックがＯＦＦとなる期間を３０ミリ秒以下とすることで、作業者にとってスムーズな干渉画像の切り替えを行うことができる。なお、位相ロックがＯＦＦとなる期間及びＯＮとなる期間を設定し、位相ロックのＯＮ及びＯＦＦが繰り返される周期を算出してもよいし、位相ロックがＯＦＦとなる期間及び位相ロックのＯＮ及びＯＦＦが繰り返される周期を設定し、位相ロックがＯＮとなる期間を設定してもよい。
また、図１８に示されるように、断続的な位相ロックに合わせて位相シフトを行ってもよい。図１８は、干渉強度を最大化する他の方法を説明する図である。この図も、ステージ３３の移動量、光路長差、ピエゾ素子４４の伸長長さ、位相ロックのＯＮ／ＯＦＦおよび合波光の露光のＯＮ／ＯＦＦそれぞれの時間的変化を示している。この図に示されるタイミングチャートにおいては、各位相ロック期間中に位相シフトを行っている。具体的には、複数（図１８では４回）の位相ロックのＯＮ期間が停滞期間を挟んで断続的に設けられ、各位相ロック期間中に位相シフトが実施される。その後、位相ロックのＯＦＦ期間が設けられ、再び複数の位相ロック期間が停滞時間を挟んで断続的に設けられ、再び各位相ロック期間中に位相シフトが実施される。位相シフト法としては、よく知られた４分のラムダ位相シフト法を用いることが望ましい。図１８に示す方法で、断続的に位相ロックを行いながら光路長差を調整することで、光路長差を調整しながらも、２００ミリ秒間隔で干渉画像および位相画像が得られることとなる。
次に、干渉観察装置１の実施例について説明する。図１に示される構成を用いた。光源１０として波長６１０ｎｍのＬＥＤを用いた。撮像部６１としてＣＣＤエリアイメージセンサを搭載したカメラを用いた。また、光検出器６２としてフォトダイオードを用いた。
観察対象物として、ハーフミラーで形成された保持基板の上に子宮頚部がん由来のＨｅＬａ細胞を培養してエタノール固定したものを用いた。観察時は、この細胞の上に純水を数滴たらし、その上にカバーガラスをかぶせ、上方から対物レンズ３２で細胞を観察した。
ピエゾ素子４４による参照ミラー４１の振動の角周波数ωを２.３ｋＨｚとした。制御部７２により、光検出器６２から出力された検出信号のうち２.３ｋＨｚ成分および４.６ｋＨｚ成分を同期検波した。この同期検波結果に基づいて上記（５）式から位相差Δφを求め、この位相差Δφに基づいてピエゾ素子４４による参照ミラー４１の振動の中心位置をフィードバック制御して、位相ロックおよび位相シフトを行なった。
図７は、フィードバック制御を行わなかった場合の位相の時間的変化を示すグラフである。図８は、フィードバック制御を行った場合の位相の時間的変化を示すグラフである。フィードバック制御を行わなかった場合（図７）には、秒間１０ｎｍ程度の光路長のドリフトが認められる。これに対して、フィードバック制御を行った場合（図８）には、正確にπ／２ずつの位相シフトおよび位相ロックが実現されている。
図９および図１０は、位相シフトおよび位相ロックを行なって取得された干渉画像を示す図である。図９（ａ）に示される干渉画像Ｉ1(x,y)に対し、図９（ｂ）に示される干渉画像Ｉ2(x,y)はπ／２だけ位相が異なり、図１０（ａ）に示される干渉画像Ｉ3(x,y)はπだけ位相が異なり、図１０（ｂ）に示される干渉画像Ｉ4(x,y)は３π／２だけ位相が異なる。これらの干渉画像Ｉ1〜Ｉ4から下記（１１）式で定量位相画像Ψ(x,y)が求められた。なお、ｘ、ｙは、各画像における位置を示す変数である。このΨ(x,y)を位相アンラッピングし、ゼルニケ多項式を用いたシェーディング補正の計算によって背景の歪み成分を平坦化すると、図１１に示される定量位相画像が得られた。
次に、本実施形態の効果について説明する。本実施形態では、光源としてインコヒーレント光を出力するものを１つだけ備えればよいので、レーザ光源およびインコヒーレント光源の２つを備える構成（非特許文献５に記載された構成）と比較して、安価に構成することができ、また、装置の組み立てや搬送後等の再調整の際に容易にセットアップを行なうことができる。
また、本実施形態では、インコヒーレント光を用いて干渉画像を取得することから、その取得される干渉画像は、スペックルや回折ノイズが抑制された良好な画質を有することができる。本実施形態では、正確な位相ロックおよび位相シフトが可能であるので、光路長差の高速掃引や高速撮像を必要とせず、また、高強度光を観察対象物に照射することなく、定量性に優れた干渉画像を取得することができる。
次に、干渉観察装置１の他の変形例について図１９を用いて説明する。図１９は、干渉観察装置１Ｅの構成を示す図である。図２に示された構成と比較すると、この図１９に示される干渉観察装置１Ｅは、対物レンズ３２に替えて補正環付き対物レンズ３７を備える点で相違し、数値表示器７３およびスピーカー７４を更に備える点で相違する。干渉強度を表示する表示器として数値表示器７３およびスピーカー７４を用いる。例えば、対物レンズとして補正環付きの２０倍対物レンズ３７を用いる。光源１０として波長６１０ｎｍのＬＥＤを用いる。撮像部６１としてＣＣＤエリアイメージセンサを搭載したカメラを用いる。また、光検出器６２としてフォトダイオードを用いる。
本変形例は、補正環付きの対物レンズ３７を用いることを特徴とする。補正環付きの対物レンズは、内部の構成レンズを光軸方向に移動する機構を備え、スライドガラスなどの透明物体越しにサンプル表面を観察する際に、透明物体により生じた収差を補正し、高分解能なイメージを取得できる。
図２０は、補正環付き対物レンズ３７を用いて透明物体越しのサンプル１０１を観察する場合のフォーカスを模式的に説明する図である。図２０（ａ）に示されるように、透明物体がなくサンプル１０１の第一面を観察する際は、対物レンズ３７の補正環の値は０ｍｍに設定され、設計された焦点距離の位置にサンプル１０１を置くことで、ピントの合ったサンプル１０１の画像を得ることができる。これに対し、図２０（ｂ）に示されるように、スライドガラスなどの透明物体１０２越しにサンプル１０１の表面を観察する際は、補正環の値を透明物体１０２の厚さに合わせて適切に設定した上で、サンプル１０１を光軸方向に動かし、ピントの合ったサンプル１０１の画像を得ることができる。ここで注意すべきことは、ピントの合ったサンプル１０１の画像を得るためには、透明物体１０２の有無によって補正環の調整のみならず、サンプル１０１の光軸方向の位置も調整する必要があるという点である。
観察対象物として、ガラス上に厚さ約１００ｎｍのクロムを蒸着した顕微鏡用テストチャートを用い、上方から対物レンズ３２で細胞を観察した。テストチャート上にスライドガラスを置かない場合と、これを置いた場合の、二通りにおいて観察を行った。
ピエゾ素子４４による参照ミラー４１の振動の角周波数ωを２０ｋＨｚとした。制御部７２により、光検出器６２から出力された検出信号のうち２０ｋＨｚ成分および４０ｋＨｚ成分を同期検波した。この同期検波結果に基づいて上記（５）式から位相差Δφを求め、この位相差Δφに基づいてピエゾ素子４４による参照ミラー４１の振動の中心位置をフィードバック制御して、位相ロックおよび位相シフトを行なった。位相シフトの周期（＝干渉画像の取得周期）は６７ｍｓｅｃ間隔とし、前記π／２間隔での４点位相シフト法を用いて、２６８ｍｓｅｃ間隔で位相画像を取得した。
干渉強度として、上記（６）式のＡＣを制御部７２で計算し、対数的スケールに変換して用いた。実際には、20×log10(AC) の値を計算し、その計算結果を数値表示器７３に表示した。また、20×log10(AC) の値に対し正に相関する周波数にてスピーカー７４を矩形波駆動してビープ音を鳴らした。この構成により、ＡＣの値が低ければ周波数の低いビープ音が出力され、ＡＣの値が高ければ周波数の高いビープ音が出力された。干渉強度の表示値および音声出力周波数を更新する周期を５０ｍｓｅｃとした。干渉画像や位相画像の取得周期より干渉強度の表示値の更新間隔の方が速いので、干渉画像を参照するより効率的に光学調整を行うことができる。
最初に、テストチャート上に何も置かずに、干渉画像および位相画像の観察を行った。対物レンズの補正環の値は０ｍｍとした。数値表示器７３の表示値およびスピーカー７４からのビープ音を指標として、干渉強度が最も高くなるようステージ４５およびステージ４６を光軸方向に移動した後、明瞭な干渉画像および定量位相画像Ψ(x,y)が求められた。この定量位相画像（位相アンラッピング前）を図２１（ａ）に示す。なお、ｘ、ｙは、各画像における位置を示す変数である。このΨ(x,y)を位相アンラッピングし、ゼルニケ多項式を用いたシェーディング補正の計算によって背景の歪み成分を平坦化すると、図２１（ｂ）に示される定量位相画像が得られた。ピントの合った高精細な画像が得られている。
次に、テストチャート上に公称厚さ０.８ｍｍ〜１.０ｍｍのスライドガラスを置いて、干渉画像および位相画像の観察を行った。対物レンズの補正環の値は０.９ｍｍとした。スライドガラスがないときと比べて、サンプルステージを３９０μｍ下方に動かしたところで、ピントの合ったサンプル像が得られた。ピントを合わせた後、数値表示器７３の表示値とスピーカー７４からのビープ音を指標として、干渉強度が最も高くなるようステージ４６を用いて参照光学系全体を光軸方向に移動した。ステージ４６の移動方向は参照光路の光路長が長くなる方向をプラスとした。
ステージ４６の移動量と干渉強度表示値との関係を図２２に示す。ステージ４６を移動する前における干渉強度（＝20×log10(AC)）は５.０前後であったが、ステージ４６の移動量９１５μｍ付近において最大の干渉強度３５.８が得られた。また、スピーカー７４から出力されるビープ音の周波数は、ステージ４６の移動前が５２０Ｈｚであったのに対し、干渉強度最大になるようステージ４６を移動した際は２６００Ｈｚであった。
スライドガラスの厚さが９００μｍ程度であり、スライドガラスと空気の屈折率差が０.５であることを考えると、屈折率差に由来する光路長の増加分が片道４５０μｍ程度と考えられる。また、ピント調節のためにサンプルステージを動かしたので片道３９０μｍの光路長の増分が生じている。更には対物レンズの補正環の調整により内部の構成レンズが動いたことにより、片道７５μｍ程度の光路長変化が生じる。これらの複合的な要因によりスライドガラス挿入前と比べてサンプル側光路長が９１５μｍ増加したものと考えられる。
テストチャート上にスライドガラスを置いた状態で得られた定量位相画像（位相アンラッピング前）を図２３（ａ）に示す。なお、ｘ、ｙは、各画像における位置を示す変数である。このΨ(x,y)を位相アンラッピングし、ゼルニケ多項式を用いたシェーディング補正の計算によって背景の歪み成分を平坦化すると、図２３（ｂ）に示される定量位相画像が得られた。スライドガラス挿入前と同様にピントの合った高精細な画像が得られている。
次に、補正環付き対物レンズを用いた場合において特徴的な本実施形態の効果について説明する。サンプル上にスライドガラス等の透明物体が存在する場合、補正環付きの対物レンズを用いて透明物体の厚さに起因する観察光の波面収差を補正することで、ピントの合った高精細な画像を得ることができる。しかし、インコヒーレント光を用いた干渉観察光学系においては、サンプル光と参照光との光路長を等しくする必要があり、本実施形態における数値表示器７３やスピーカー７４などの表示手段なくしては、使用者の操作によってサンプル光および参照光それぞれの光路長を互いに等しくするのは難しい。また、特定の透明物体厚さのサンプルに特化して補正環および参照光路側光路長を固定した装置においては、その装置を透明物体の厚さの異なるサンプルに対して用いることができず、汎用性を損なう。本実施形態は、任意の厚さの透明物体を伴うサンプルに対して、補正環付き対物レンズの補正環を使用者が調整し、数値表示器７３やスピーカー７４などの表示手段を指標として参照光路側光路長を調整することにより、汎用的にかつ高い操作性で高精細な定量位相画像を得ることができるという利点を備えている。
本実施形態の観察対象となるサンプルとしては、ガラス面の下に電気的な素子が存在するフラットパネルディスプレイや、光学フィルム下に封入された電気素子などが考えられる。また、波長１０００ｎｍ以上の近赤外光に対してシリコンなどの半導体は透明であり、インコヒーレントな近赤外光を用いることで半導体集積回路の配線面をシリコン越しに観察するような場合も、本変形実施形態の範疇である。また、本実施形態は透明物体について固体形状の物体に限るものではなく、培養液などの透明な液体越しに細胞などのサンプルを観察する場合においても、本実施形態は有効である。
（第２実施形態）
図１２は、第２実施形態の干渉観察装置２の構成を示す図である。干渉観察装置２は、光源１０、レンズ１１、レンズ１３、ビームスプリッタ２１、ビームスプリッタ２２、試料保持台８１、対物レンズ８２、ビームスプリッタ８３、固定ミラー８４、参照ミラー９１、対物レンズ９２、ビームスプリッタ９３、ピエゾ素子９４、ステージ９５，９６、チューブレンズ５１、ビームスプリッタ５２、ミラー５３、撮像部６１、光検出器６２、画像取得部７１および制御部７２を備える。
この干渉観察装置２は、マッハツェンダ干渉計の光学系を有し、試料保持台８１により保持された観察対象物からの透過光に基づいて干渉画像を取得する。観察対象物は、特定の細胞や生体サンプルに限定されるものではない。例えば、観察対象物として、培養細胞、不死化細胞、初代培養細胞、がん細胞、脂肪細胞、肝臓細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および、これらの細胞のうち少なくとも１つの細胞をもとに作られた細胞塊（スフェロイド）などが挙げられる。また、観察対象物として、生体に限らず、透過型の構成で計測可能な工業サンプル、たとえばガラス内部、半導体素子の内部、樹脂素材、液晶、高分子化合物、光学素子なども挙げられる。
光源１０は、インコヒーレントな光を出力する。光源１０は、例えばハロゲンランプなどのランプ系光源、ＬＥＤ（Light emitting diode）光源、ＳＬＤ（Super luminescent diode）光源、ＡＳＥ（Amplified spontaneous emission）光源等である。レンズ１１，１３は、光源１０から出力された光を、試料保持台８１により保持された観察対象物に集光する。
ビームスプリッタ２１およびビームスプリッタ２２は、マッハツェンダ干渉計を構成する。ビームスプリッタ２１は、光源１０と光学的に結合され、光源１０から出力されてレンズ１１，１３を経た光を入力し、その光を２分岐して第１分岐光および第２分岐光とする。ビームスプリッタ２１は、例えばハーフミラーであってもよい。ビームスプリッタ２１は、第１分岐光を測定側光学系のビームスプリッタ８３へ出力し、第２分岐光を参照側光学系のビームスプリッタ９３へ出力する。ビームスプリッタ２２は、ビームスプリッタ２１と光学的に結合され、測定側光学系を経た第１分岐光を入力するとともに、参照側光学系を経た第２分岐光を入力し、これら入力した第１分岐光と第２分岐光とを合波して、当該合波光をミラー５３へ出力する。ビームスプリッタ２２は、例えばハーフミラーであってもよい。
測定側光学系には、試料保持台８１、対物レンズ８２、ビームスプリッタ８３および固定ミラー８４が設けられている。ビームスプリッタ８３は、干渉光学系を構成するビームスプリッタ２１と光学的に結合され、ビームスプリッタ２１から出力された第１分岐光を入力して固定ミラー８４へ出力し、固定ミラー８４で反射された第１分岐光を入力して試料保持台８１へ出力する。対物レンズ８２は、観察対象物を透過した第１分岐光を入力してビームスプリッタ２２へ出力する。なお、ビームスプリッタ８３および固定ミラー８４に替えて、反射ミラーを用いてもよい。
参照側光学系は、参照ミラー９１、対物レンズ９２、ビームスプリッタ９３、ピエゾ素子９４およびステージ９５，９６が設けられている。ビームスプリッタ９３は、干渉光学系を構成するビームスプリッタ２１と光学的に結合され、ビームスプリッタ２１から出力された第２分岐光を入力して参照ミラー９１へ出力し、参照ミラー９１で反射された第２分岐光を入力して対物レンズ９２へ出力する。対物レンズ９２は、ビームスプリッタ９３と光学的に結合され、ビームスプリッタ９３から到達した光を入力してビームスプリッタ２２へ出力する。ピエゾ素子９４およびステージ９５は、ビームスプリッタ９３と参照ミラー９１との間の光学系の光軸方向に参照ミラー９１を移動させる。ステージ９６は、対物レンズ９２の光軸方向に対物レンズ９２を移動させる。
チューブレンズ５１は、干渉光学系を構成するビームスプリッタ２２と光学的に結合され、ビームスプリッタ２２から出力されミラー５３で反射された合波光を、ビームスプリッタ５２を経て撮像部６１の撮像面に結像させる。ビームスプリッタ５２は、干渉光学系を構成するビームスプリッタ２２と光学的に結合され、レンズ５１から到達した光を分岐する分岐部であり、一方の分岐光（第１検出光）を撮像部６１へ出力し、他方の分岐光（第２検出光）を光検出器６２へ出力する。
合波光を受光して検出信号を出力する受光部は、撮像部６１および光検出器６２を含む。撮像部６１は、ビームスプリッタ５２から到達した第１検出光を受光して当該受光信号（第１検出信号）を出力する。撮像部６１は、例えば、ＣＣＤエリアイメージセンサやＣＭＯＳエリアイメージセンサなどのイメージセンサである。光検出器６２は、ビームスプリッタ５２から到達した第２検出光を受光して当該受光信号（第２検出信号）を出力する。光検出器６２は、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、ラインセンサ（リニアセンサ）、ＣＣＤエリアイメージセンサ、ＣＭＯＳエリアイメージセンサなどである。画像取得部７１は、撮像部６１から出力された第１検出信号に基づいて干渉画像を取得する。制御部７２は、光検出器６２から出力された第２検出信号に基づいて制御を行う。
なお、画像取得部７１および制御部７２は、プロセッサ及びメモリ等を含むコンピュータである。また、画像取得部７１および制御部７２は、個別のコンピュータであってもよいし、１つのコンピュータであってもよい。コンピュータは、例えば、パーソナルコンピュータやタブレット端末などのスマートデバイスであってもよい。また、画像取得部７１または制御部７２は、利用者からの入力を受け付ける入力部（キーボード、マウス、タブレット端末等）や、干渉強度等を表示する表示部（ディスプレイ、タブレット端末、スピーカー、バイブレータ）を備えていてもよい。なお、表示部がディスプレイやタブレット端末などのように、画面表示できる装置であれば、干渉強度と合わせて干渉画像などを表示してもよい。
光源１０から出力された光は、レンズ１１，１３により測定側光学系にある観察対象物において結像され、さらに対物レンズ８２およびチューブレンズ５１により撮像部６１および光検出器６２それぞれの受光面において結像される。また、光源１０から出力された光は、レンズ１１，１３により参照光学系にある特定位置において結像され、さらに対物レンズ９２およびチューブレンズ５１により撮像部６１および光検出器６２それぞれの受光面において結像される。
ピエゾ素子９４は、参照側光学系（第２分岐光の光学系）の光路長を微調整することができる。ピエゾ素子４４の代わりに、ステッピングモータあるいはサーボモータなどのアクチュエータを用いてもよい。ステージ９５は、参照側光学系の光路長を粗調整することができる。ピエゾ素子９４およびステージ９５は、試料側光学系（第１分岐光の光学系）の光路長と試料側光学系（第１分岐光の光学系）の光路長との差を調整することができ、干渉光学系における分岐から合波までの第１分岐光と第２分岐光との間の光路長差を調整する光路長差調整部として作用する。制御部７２は、この光路長差調整部（ステージ９５、ピエゾ素子９４）による光路長差調整動作を制御する。
光源１０から出力されたインコヒーレントな光は、レンズ１１，１３を経て、ビームスプリッタ２１により２分岐されて第１分岐光および第２分岐光とされる。第１分岐光は、ビームスプリッタ８３を経て固定ミラー８４に入力されて反射される。その反射された第１分岐光は、ビームスプリッタ８３を経て、試料保持台３１により保持された観察対象物に集光され、観察対象物を透過する。その透過した第１分岐光は、対物レンズ８２を経てビームスプリッタ２２に入力される。この第１分岐光は、観察対象物における透過の際に光学的な遅れを有する。第２分岐光は、ビームスプリッタ９３を経て参照ミラー９１に入力されて反射される。その反射された第２分岐光は、ビームスプリッタ９３および対物レンズ９２を経てビームスプリッタ２２に入力される。
対物レンズ８２からビームスプリッタ２２に入力された第１分岐光、および、対物レンズ９２からビームスプリッタ２２に入力された第２分岐光は、ビームスプリッタ２２により合波される。その合波光は、ミラー５３およびチューブレンズ５１を経て、ビームスプリッタ５２により２分岐されて、撮像部６１により受光されるとともに、光検出器６２により受光される。画像取得部７１により、合波光を受光した撮像部６１から出力される第１検出信号に基づいて、干渉画像が取得される。また、制御部７２により、合波光を受光した光検出器６２から出力される第２検出信号に基づいて、光路長差調整部（ステージ９５、ピエゾ素子９４）による光路長差調整動作が制御される。
図１３は、変形例の干渉観察装置２Ａの構成を示す図である。この干渉観察装置２Ａは、図１２に示される構成に対して、ビームスプリッタ２１が図１２におけるビームスプリッタ８３の機能を兼ねる点、ビームスプリッタ２２が図１２におけるビームスプリッタ５２の機能を兼ねる点、光路長差補償板８５およびミラー８６を備える点、ならびに、レンズ５１に替えてレンズ５４およびレンズ５５を備える点、で相違する。図１２に示される構成と比べて、図１３に示される構成は、ビームスプリッタの個数が２つ少ないので、安価にすることができる。
干渉画像を取得するためには、測定側光学系（第１分岐光の光学系）および参照側光学系（第２分岐光の光学系）それぞれの光路長を互いに一致させなくてはならない。観察対象物は例えば培養液中の細胞であるが、培養液は対象とする細胞によって成分が異なり、成分が異なると屈折率も異なる。また、観察対象物を容れるサンプルチャンバーの厚みも、製造誤差等の影響により一定とは限らない。これらのことから、様々の観察対象物について、どのような光路長差を参照側光学系に与えるべきかについては、その都度光路長差を掃引して確かめる必要がある。このことから従来では透過型の干渉観察装置においてレーザ光源を用いる構成が好まれてきた。
これに対して、本実施形態では、インコヒーレント光源を用いる。また、干渉観察装置２は、インコヒーレント光源のうちでも、空間的にインコヒーレントな拡散光を出力する光源（ハロゲンランプやＬＥＤ等）を用いることができる。すなわち、干渉観察装置２では、光源１０から対物レンズ８２，９２に到る迄の全ての光学素子は、光源１０出力時のビーム径と比べて十分に大きな開口（例えば１０ｍｍ以上）を有することから、空間的にインコヒーレントな光を用いたインコヒーレント照明（つまり、高ＮＡの照明）が可能となっている。光源１０とビームスプリッタ２１との間に設けられた２つのレンズ１１，１３により、対物レンズ８２，９２の前焦点面付近に光源１０の出力光を集光させることができ、それにより光源１０の出力光を高効率に利用することができ、かつ、高ＮＡの照明を実現することができる。
第２実施形態でも、光源１０が出力するインコヒーレントな光を用いて干渉画像を取得することから、光路長差を制御して位相ロックおよび位相シフトを行なうことが必要である。第２実施形態においても、前述した第１位相ロック技術または第２位相ロック技術を用いて、制御部７２は、光路長差に応じた位相差を求めるとともに干渉強度を求め、光路長差調整部（ステージ９５、ピエゾ素子９４）による光路長差調整動作を制御して、求めた干渉強度に基づいて光路長差を小さくするとともに、求めた位相差に基づいて光路長差を一定に維持する。なお、光路長差の調整に際して、ステージ９５およびピエゾ素子９４の何れを制御してもよいが、ステージ９５の制御により光路長差を粗調整することができ、ピエゾ素子９４の制御により光路長差を微調整することができる。
次に、干渉観察装置２Ａの実施例について説明する。図１３に示される構成を用いた。光源１０として波長５８０ｎｍのＬＥＤを用いた。レンズ１３は、おおよそ対物レンズ８２，９２の上側焦点面に光が集光するようにした。参照側光学系ではビームスプリッタ１個分だけ多くガラスを光が透過するので、物体側光学系に光路長差補償板８５としてビームスプリッタと同じ大きさのガラス板を挿入した。対物レンズ８２，９２として倍率２０倍の対物レンズを用いた。
撮像部６１としてＣＣＤエリアイメージセンサを搭載したカメラを用いた。また、光検出器６２としてフォトダイオードを用いた。ビームスプリッタ２１から対物レンズ８２，９２に到る迄の全ての光学素子は、その位置でのＬＥＤ光のビーム径を十分にカバーできる大きさの開口とした。
観察対象物として、乾燥固定したコンフルエントなＨｅＬａ細胞を用いた。観察時は、この細胞の上に純水を数滴たらし、その上にカバーガラスをかぶせ、下方から対物レンズ８２で細胞を観察した。
図１４および図１５は、位相シフトおよび位相ロックを行なって取得された干渉画像を示す図である。図１４（ａ）に示される干渉画像Ｉ1(x,y)に対し、図１４（ｂ）に示される干渉画像Ｉ2(x,y)はπ／２だけ位相が異なり、図１５（ａ）に示される干渉画像Ｉ3(x,y)はπだけ位相が異なり、図１５（ｂ）に示される干渉画像Ｉ4(x,y)は３π／２だけ位相が異なる。これらの干渉画像Ｉ1〜Ｉ4から上記（１１）式で定量位相画像Ψ(x,y)が求められた。このΨ(x,y)を位相アンラッピングし、ゼルニケ多項式を用いたシェーディング補正の計算によって背景の歪み成分を平坦化すると、図１６に示される定量位相画像が得られた。
次に、本実施形態の効果について説明する。本実施形態でも、光源としてインコヒーレント光を出力するものを１つだけ備えればよいので、レーザ光源およびインコヒーレント光源の２つを備える構成（非特許文献５に記載された構成）と比較して、安価に構成することができ、また、装置の組み立てや搬送後等の再調整の際に容易にセットアップを行なうことができる。
また、本実施形態でも、インコヒーレント光を用いて干渉画像を取得することから、その取得される干渉画像は、スペックルや回折ノイズが抑制された良好な画質を有することができる。本実施形態でも、正確な位相ロックおよび位相シフトが可能であるので、光路長差の高速掃引や高速撮像を必要とせず、また、高強度光を観察対象物に照射することなく、定量性に優れた干渉画像を取得することができる。
さらに、本実施形態では、空間的にインコヒーレントな光を出力する光源１０を用いることにより、観察対象物に対する照明の開口数を大きくすることができるので、空間分解能が向上し、回折ノイズやスペックルノイズの発生が抑制される。
また、本実施形態では、制御部７２が光検出器６２から出力された検出信号（第２検出信号）の振幅成分を抽出し、検出信号の振幅成分に基づいて干渉強度ＡＣを求めるので、この干渉強度ＡＣが大きくなるように光路長差を調整することが容易にできる。
（変形例）
本発明の一側面に係る干渉光学装置および干渉観察方法は、上記した実施形態および構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。
本発明の一実施形態による干渉観察装置は、観察対象物の干渉画像を取得する装置であって、(1) インコヒーレントな光を出力する光源と、(2) 光源から出力された光を分岐して第１分岐光および第２分岐光とし、第１分岐光を観察対象物で反射または透過させ、第１分岐光と第２分岐光とを合波して当該合波光を出力する干渉光学系と、(3) 合波光を受光して検出信号を出力する受光部と、(4) 検出信号に基づいて干渉画像を取得する画像取得部と、(5) 検出信号に基づいて合波光の干渉強度を求め、干渉強度が大きくなるように干渉光学系を調整する制御部と、を備える。
本発明の一実施形態による干渉観察方法は、観察対象物の干渉画像を取得する方法であって、(1) 干渉光学系により、光源から出力されたインコヒーレントな光を分岐して第１分岐光および第２分岐光とし、第１分岐光を観察対象物で反射または透過させ、第１分岐光と第２分岐光とを合波して当該合波光を出力し、(2) 受光部により、合波光を受光して検出信号を出力し、(3) 画像取得部により、検出信号に基づいて干渉画像を取得し、(4) 検出信号に基づいて合波光の干渉強度を求め、干渉強度が大きくなるように干渉光学系を調整する。
また、上記の干渉観察装置または干渉観察方法において、検出信号に基づいて、干渉光学系における分岐から合波までの第１分岐光と第２分岐光との間の光路長差に応じた位相差を求め、位相差に基づいて干渉光学系における光路長差を一定に維持するのが好適である。
また、上記の干渉観察装置または干渉観察方法において、干渉強度が大きくなるように干渉光学系における光路長差を調整するのが好適であり、また、干渉強度が大きくなるように干渉光学系における第１分岐光および第２分岐光の双方または何れか一方の光路上にある光学素子の光軸を調整するのも好適である。
また、上記の干渉観察装置または干渉観察方法において、表示部により干渉強度を示すのが好適である。このとき、表示部により、干渉強度の時間的変化をグラフとして表示するのが好適であり、干渉強度を数値として表示するのも好適であり、干渉強度を音として出力するのも好適である。
また、上記の干渉観察装置または干渉観察方法において、干渉光学系がマイケルソン干渉計を含むものであってもよいし、干渉光学系がマッハツェンダ干渉計を含むものであってもよい。
また、上記の干渉観察装置または干渉観察方法において、受光部は、合波光を受光して第１検出信号を出力するイメージセンサと、合波光を受光して第２検出信号を出力する光検出器とを有し、画像取得部は、第１検出信号に基づいて干渉画像を取得し、制御部は、第２検出信号に基づいて位相差及び干渉強度を求めてもよい。
第１位相ロック技術および第２位相ロック技術の何れの場合にも、位相ロック用の光検出器６２として、複数の画素が２次元配列されたカメラを用いて、何れかの画素から出力される検出信号に基づいて位相ロックを行なってもよい。
また、撮像部６１の何れかの画素から出力される検出信号に基づいて位相ロックを行なってもよい。また、干渉画像取得用の撮像部６１および位相ロック用の光検出器６２の双方の機能を有する１つの受光素子を用いてもよい。これらの場合には、受光部を１つの受光素子で構成できるので、装置を小型化することができ、光学系を容易に調整することができる。
また、干渉画像取得用の撮像部６１から出力される検出信号に基づいて合波光の干渉強度を求めてもよい。また、撮像部６１および光検出器６２それぞれから出力される検出信号に基づいて合波光の干渉強度を求めてもよい。
撮像部６１により撮像された画像に干渉縞が複数現れる状態においては、撮像部６１の２次元配列された複数の画素のうち何れかの画素を、ラインセンサまたは１次元配列された複数の光検出器の代替物とみなして、第２位相ロック技術により干渉強度を求めることができる。或いは、第１位相ロック技術と同様に、撮像部６１の撮像速度と比べて十分遅い周波数でピエゾ素子を変調して、撮像部６１により得られた干渉画像の時間変化から前述のアルゴリズムによって干渉強度を計算することもできる。
また、撮像部６１の何れかの画素からの検出信号を高速に読み出すことで、干渉強度のモニタリングに限らず位相ロックまでをも行うこととしてもよい。近年のＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラの技術革新により１ｋＨｚを超えるフレームレートが実現されており、このようなフレームレートは、第１位相ロック技術および第２位相ロック技術の何れの場合においても、位相情報を導出するのに十分な速度である。
また、干渉光学系における分岐から合波までの第１分岐光の光路および第２分岐光の光路の双方または何れか一方に、印加電圧値によって屈折率または幾何学的厚みが変化する液晶素子（例えば、液晶レンズ）やプリズムを挿入してもよく、この場合にも干渉光学系における分岐から合波までの第１分岐光の光路と第２分岐光の光路との間の光路長差を調整することができる。
本発明の一側面は、画質が良好な干渉画像を容易に取得することができ、また、安価な装置構成とすることができる干渉観察装置および干渉観察方法として利用可能である。
１，１Ａ〜１Ｅ，２，２Ａ…干渉観察装置、１０…光源、１１…レンズ、１２…ビームスプリッタ、１３…レンズ、２０，２１，２２…ビームスプリッタ（干渉光学系）、３１…試料保持台、３２…対物レンズ、３３〜３６…ステージ、３７…補正環付き対物レンズ、４１…参照ミラー、４２…レンズ、４３…収差補正用プレート、４４…ピエゾ素子、４５，４６…ステージ、５１…チューブレンズ、５２…ビームスプリッタ、５４，５５…レンズ、６１…撮像部、６２…光検出器、７１…画像取得部、７２…制御部、７３…数値表示器、７４…スピーカー、８１…試料保持台、８２…対物レンズ、８３…ビームスプリッタ、８４…固定ミラー、８５…光路長差補償板、９１…参照ミラー、９２…対物レンズ、９３…ビームスプリッタ、９４…ピエゾ素子、９５，９６…ステージ。

Claims (20)

  1. インコヒーレントな光を出力する光源と、
    前記光源から出力された光を分岐して第１分岐光および第２分岐光とし、前記第１分岐光を観察対象物で反射または透過させ、前記第１分岐光と前記第２分岐光とを合波して当該合波光を出力する干渉光学系と、
    前記合波光を撮像して第１検出信号を出力するイメージセンサと、前記合波光を受光して第２検出信号を出力する光検出器とを有する受光部と、
    前記第１検出信号に基づいて干渉画像を取得する画像取得部と、
    前記第２検出信号に基づいて前記合波光の干渉強度を求め、前記干渉強度が大きくなるように前記干渉光学系を調整する制御部と、
    を備え、
    前記制御部が、前記第２検出信号に基づいて、前記干渉光学系における分岐から合波までの前記第１分岐光と前記第２分岐光との間の光路長差に応じた位相差を求め、前記位相差に基づいて前記干渉光学系における前記光路長差を一定に維持するＯＮ期間と前記干渉光学系における前記光路長差を一定に維持しないＯＦＦ期間とを繰り返し行い、
    前記イメージセンサが、前記合波光を撮像する期間がＯＮ期間に含まれるように設定される、
    干渉観察装置。
  2. 前記制御部が、前記干渉強度が大きくなるように前記干渉光学系における分岐から合波までの前記第１分岐光と前記第２分岐光との間の光路長差を調整する、
    請求項１に記載の干渉観察装置。
  3. 前記制御部が、前記干渉強度が大きくなるように前記干渉光学系における前記第１分岐光および前記第２分岐光の双方または何れか一方の光路上にある光学素子の光軸を調整する、
    請求項１または２に記載の干渉観察装置。
  4. 前記干渉強度を示す表示部を更に備える、
    請求項１〜３の何れか１項に記載の干渉観察装置。
  5. 前記表示部が前記干渉強度の時間的変化をグラフとして表示する、
    請求項４に記載の干渉観察装置。
  6. 前記表示部が前記干渉強度を数値として表示する、
    請求項４に記載の干渉観察装置。
  7. 前記表示部が前記干渉強度を音として出力する、
    請求項４に記載の干渉観察装置。
  8. 前記干渉光学系がマイケルソン干渉計またはマッハツェンダ干渉計を含む、
    請求項１〜７の何れか１項に記載の干渉観察装置。
  9. 前記ＯＮ期間は１ミリ秒以上３秒以下である、
    請求項１〜８の何れか１項に記載の干渉観察装置。
  10. 前記ＯＦＦ期間は３０ミリ秒以下である、
    請求項１〜９の何れか１項に記載の干渉観察装置。
  11. 干渉光学系を用いて、光源から出力されたインコヒーレントな光を分岐して第１分岐光および第２分岐光とし、前記第１分岐光を観察対象物で反射または透過させ、前記第１分岐光と前記第２分岐光とを合波して当該合波光を出力し、
    イメージセンサおよび光検出器を有する受光部を用いて、前記イメージセンサにより前記合波光を受光して第１検出信号を出力し、前記光検出器により前記合波光を受光して第２検出信号を出力し、
    画像取得部を用いて、前記第１検出信号に基づいて干渉画像を取得し、
    前記第２検出信号に基づいて前記合波光の干渉強度を求め、前記干渉強度が大きくなるように前記干渉光学系を調整し、
    前記第２検出信号に基づいて、前記干渉光学系における分岐から合波までの前記第１分岐光と前記第２分岐光との間の光路長差に応じた位相差を求め、
    前記位相差に基づいて前記干渉光学系における前記光路長差を一定に維持するＯＮ期間と前記干渉光学系における前記光路長差を一定に維持しないＯＦＦ期間とを繰り返し行い、
    前記イメージセンサによる前記合波光を撮像する期間がＯＮ期間に含まれるように設定される、
    干渉観察方法。
  12. 前記干渉強度が大きくなるように前記干渉光学系における分岐から合波までの前記第１分岐光と前記第２分岐光との間の光路長差を調整する、
    請求項１１に記載の干渉観察方法。
  13. 前記干渉強度が大きくなるように前記干渉光学系における前記第１分岐光および前記第２分岐光の双方または何れか一方の光路上にある光学素子の光軸を調整する、
    請求項１１または１２に記載の干渉観察方法。
  14. 表示部を用いて、前記干渉強度を示す、
    請求項１１〜１３の何れか１項に記載の干渉観察方法。
  15. 前記表示部は、前記干渉強度の時間的変化をグラフとして表示する、
    請求項１４に記載の干渉観察方法。
  16. 前記表示部は、前記干渉強度を数値として表示する、
    請求項１４に記載の干渉観察方法。
  17. 前記表示部は、前記干渉強度を音として出力する、
    請求項１４に記載の干渉観察方法。
  18. 前記干渉光学系がマイケルソン干渉計またはマッハツェンダ干渉計を含む、
    請求項１１〜１７の何れか１項に記載の干渉観察方法。
  19. 前記ＯＮ期間は１ミリ秒以上３秒以下である、
    請求項１１〜１８の何れか１項に記載の干渉観察方法。
  20. 前記ＯＦＦ期間は３０ミリ秒以下である、
    請求項１１〜１９の何れか１項に記載の干渉観察方法。
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