JP7158220B2 - 測定装置および測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、測定装置および測定方法に関するものである。

被験体から採取した生体サンプルに含まれるデオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）の総量をinvitroで精度よく測定することが求められている。測定すべき量は、生体サンプル（例えば試験管内の液体内の細胞または培養皿内に播種された細胞）に含まれるＤＮＡの総量である。サンプル全体のうちから一定の率ｘで抜き取った部分を観察または測定し、その部分に含まれていたＤＮＡの総量を抜き取り率ｘで割ることで、サンプル全体に含まれるＤＮＡの総量を求めることができる。

サンプルに含まれるＤＮＡの総量を測定する方法として吸収法および蛍光法がある。吸収法では、ＤＮＡの吸収波長の光をサンプルに照射して該サンプルにおける光の吸収量を測定して、その吸収量からビアランバート則により該サンプル中のＤＮＡ総量を求めることができる。蛍光法では、サンプル中のＤＮＡを特異的に蛍光染色し、該サンプルに励起光を照射したときに生じる蛍光の強度を測定して、その蛍光強度から該サンプル中のＤＮＡ総量を求めることができる。

また、細胞核の一個当たりに含まれるＤＮＡの量は推測することが可能であることから、細胞核の領域を特異的に染色して、その染色領域の個数を数えることで、サンプルに含まれる細胞核の個数を求め、更に、この細胞核の個数からサンプル中のＤＮＡ総量を求めることができる（非特許文献１参照）。

国際公開第２０１６／１２１２５０号

Paul Held, et al, "Analysisof Nuclear Stained Cells, Using the CytationTM3 Cell ImagingMulti-Mode Microplate Reader with DAPI-Stained Cells," BioTek Instruments,Inc., Application Note, AN041013_13, Rev. 04/10/13.

しかし、サンプルの全体および部分の何れであっても、そこに含まれるＤＮＡの総量を精度よく求めることは困難である。すなわち、吸収法では、測定結果がＤＮＡ以外の光吸収物質の影響を受ける。蛍光法では、測定結果がＤＮＡ以外の蛍光物質の影響およびバックグラウンドの光（例えば自家蛍光）の影響を受け、また、蛍光染色の染色率が僅かな条件によって大きく変動する。吸収法および蛍光法の何れにおいても、濃いサンプルに対しては近似的に用いることができるが、薄いサンプルに対しては精度のよい測定は困難である。また、蛍光法では、サンプルの濃度が非常に濃く細胞同士が多層に上下に重なっている場合には、蛍光励起光の光軸に沿って励起光に近い側に存在する細胞が励起光を吸収してしまう。そのため、励起光から遠い側の細胞には十分な励起光が届かず、結果として得られた蛍光値が実際の細胞数と比べて過小評価されてしまう問題が生じる。これらの要因により、サンプル中のＤＮＡ総量を精度よく求めることは困難である。

また、染色領域の個数を数えることで細胞核の個数を求める場合には、次のような問題がある。すなわち、本来は一つの細胞核であるにも拘わらず、その細胞核が二つに分断されている場合、得られる細胞核の個数は実際より多くなる。逆に、本来は二つの細胞核であるにも拘わらず、それら二つの細胞核が互いに接触し又は重なっていて染色領域としては一つである場合、得られる細胞核の個数は実際より少なくなる。このように、染色領域の個数を数える場合も、細胞核の個数（さらにＤＮＡ総量）を精度よく求めることは困難である。

これまでに説明してきた問題点は、生体サンプル中の細胞核の個数（さらにＤＮＡ総量）を求める場合だけでなく、サンプル中の他の対象物の量を求める場合にも存在する。

本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、サンプル中の対象物の量を精度よく測定することができる装置および方法を提供することを目的とする。

本発明の測定装置は、(1) 対象物を含むサンプルの蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、(2) サンプルの干渉画像を取得する干渉画像取得部と、(3) 蛍光画像中の画素値が閾値より大きい領域に対応する干渉画像中の領域において、干渉画像に基づいてサンプルの光学的厚さの積分値を求める演算部と、を備える。

本発明の一側面による測定装置では、演算部は、干渉画像に基づいてサンプルの光学的厚さ画像を作成するとともに、蛍光画像中の画素値が閾値より大きい領域を示すマスク画像を作成し、光学的厚さ画像のうちマスク画像が示す領域においてサンプルの光学的厚さの積分値を求める。

本発明の他の一側面による測定装置では、干渉画像取得部がインコヒーレント光を用いて干渉画像を取得する。

本発明の更に他の一側面による測定装置では、干渉画像取得部および蛍光画像取得部それぞれの光学系の少なくとも一部が共通である。

本発明の測定方法は、(1) 対象物を含むサンプルの蛍光画像を蛍光画像取得部により取得する蛍光画像取得ステップと、(2) サンプルの干渉画像を干渉画像取得部により取得する干渉画像取得ステップと、(3) 蛍光画像中の画素値が閾値より大きい領域に対応する干渉画像中の領域において、干渉画像に基づいてサンプルの光学的厚さの積分値を求める演算ステップと、を備える。

本発明の一側面による測定方法では、演算ステップにおいて、干渉画像に基づいてサンプルの光学的厚さ画像を作成するとともに、蛍光画像中の画素値が閾値より大きい領域を示すマスク画像を作成し、光学的厚さ画像のうちマスク画像が示す領域においてサンプルの光学的厚さの積分値を求める。

本発明の他の一側面による測定方法では、干渉画像取得ステップにおいて、干渉画像取得部がインコヒーレント光を用いて干渉画像を取得する。

本発明の更に他の一側面による測定方法では、干渉画像取得部および蛍光画像取得部それぞれの光学系の少なくとも一部が共通である。

本発明の更に他の一側面による測定方法では、対象物が蛍光染色された細胞核であり、演算ステップにおいて細胞核の総量に比例する指標として積分値を求める。

本発明によれば、サンプル中の対象物の量を精度よく測定することができる。

図１は、測定装置１Ａの構成を示す図である。 図２は、サンプルの構成を示す図である。 図３は、第１変形例の測定装置１Ｂの構成を示す図である。 図４は、第２変形例の測定装置１Ｃの構成を示す図である。 図５は、第３変形例の測定装置１Ｄの構成を示す図である。 図６は、干渉観察用光、励起光および蛍光それぞれの波長帯域の間の関係の例を示す図である。図６（ａ）は干渉観察用光の波長帯域が蛍光波長帯域より長い場合を示す。図６（ｂ）は干渉観察用光の波長帯域が蛍光波長帯域と一部が重なっている場合を示す。図６（ｃ）は干渉観察用光の波長帯域が励起光波長帯域より短い場合を示す。図６（ｄ）は干渉観察用光の波長帯域が励起光波長帯域と一部が重なっている場合を示す。 図７は、本実施形態の測定装置の動作および本実施形態の測定方法を説明するタイミングチャートである。 図８は、蛍光画像を模式的に示す図である。 図９は、光学的厚さ画像を模式的に示す図である。 図１０は、蛍光画像（図８）に基づいて作成されたマスク画像を示す図である。 図１１は、光学的厚さ画像（図９）とマスク画像（図１０）との積の画像を示す図である。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

図１は、測定装置１Ａの構成を示す図である。測定装置１Ａは、干渉画像取得部２、蛍光画像取得部３、演算部４およびタイミング制御回路５を備える。干渉画像取得部２および蛍光画像取得部３それぞれの光学系の一部は共通である。干渉画像取得部２は、光源１１、ビームスプリッタ１２、対物レンズ１３、対物レンズ１４、参照ミラー１５、チューブレンズ１６、ビームスプリッタ１７、撮像器１８、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を含む。蛍光画像取得部３は、励起光源３１、ビームスプリッタ３２、チューブレンズ１６、励起光カットフィルタ３３および撮像器１８を含む。

干渉画像取得部２は、二光束干渉計としてマイケルソン干渉計を有し、１または複数の対象物の干渉画像を取得する。蛍光画像取得部３は、対象物の蛍光画像を取得する。演算部４は、蛍光画像中の画素値が閾値より大きい領域に対応する干渉画像中の領域において、干渉画像に基づいて光学的厚さの積分値を求める。好適には、演算部４は、干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を作成するとともに、蛍光画像中の画素値が閾値より大きい領域を示すマスク画像を作成し、光学的厚さ画像のうちマスク画像が示す領域において光学的厚さの積分値を求める。タイミング制御回路５は、光源１１および励起光源３１それぞれの光出力タイミングならびに撮像器１８の露光タイミングを制御することで、干渉画像取得部２による干渉画像取得および蛍光画像取得部３による蛍光画像取得それぞれのタイミングを制御する。

対象物は、光源１１から出力される光の波長において実質的に透明なものであって、蛍光染色されたものである。対象物は、特定の細胞や生体サンプルに限定されるものではない。例えば、対象物として、培養細胞、不死化細胞、初代培養細胞、がん細胞、脂肪細胞、肝臓細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および前記細胞をもとに作られた細胞塊（コロニーまたはスフェロイド）などが挙げられ、また、これらの細胞に含まれる細胞核が挙げられる。対象物は、生体に限られない。

本実施形態の以下の説明では、図２にサンプルの構成例が示されるように、対象物は、容器７０に入れられた液体７２中の蛍光染色された細胞核７３であるとする。容器７０の底部の内側には反射増強コーティング７１が設けられている。核分画により、弱い界面活性剤により細胞膜を溶解させ、遠心分離により細胞核のみを抽出することができる。

光源１１は干渉観察用の光を出力する。好適には光源１１はインコヒーレント光を出力する。光源１１は、例えばハロゲンランプなどのランプ系光源、ＬＥＤ（Light emitting diode）光源、ＳＬＤ（Super luminescent diode）光源、ＡＳＥ（Amplified spontaneous emission）光源等である。

ビームスプリッタ１２は、光源１１と光学的に結合され、二光束干渉計であるマイケルソン干渉計を構成する。ビームスプリッタ１２は、例えば、反射率と透過率との比が５０：５０であるハーフミラーであってもよい。ビームスプリッタ１２は、光源１１から出力された光を二光束に分岐して第１分岐光および第２分岐光とする。ビームスプリッタ１２は、第１分岐光を対物レンズ１３へ出力し、第２分岐光を対物レンズ１４へ出力する。

また、ビームスプリッタ１２は、反射増強コーティング７１で反射されて対物レンズ１３を経た第１分岐光を入力するとともに、参照ミラー１５で反射されて対物レンズ１４を経た第２分岐光を入力する。そして、ビームスプリッタ１２は、これら入力した第１分岐光と第２分岐光とを合波して、干渉光をチューブレンズ１６へ出力する。

対物レンズ１３は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された第１分岐光を容器７０内の細胞核７３に集光する。また、対物レンズ１３は、反射増強コーティング７１で反射された第１分岐光を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。

ビームスプリッタ１２と対物レンズ１３との間の第１分岐光の光路上にビームスプリッタ３２が挿入されている。ビームスプリッタ３２は、励起光源３１と光学的に接続されている。ビームスプリッタ３２は、励起光源３１から出力された励起光、光源１１から出力された光のうちの第１分岐光、および、励起光が照射された細胞核７３で発生した蛍光のうち、一部を反射させ、残部を透過させる。

対物レンズ１３は、ビームスプリッタ３２から到達した励起光を容器７０内の細胞核７３に集光する。また、対物レンズ１３は、細胞核７３で発生した蛍光を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。ビームスプリッタ１２は、この蛍光をチューブレンズ１６へ出力する。

対物レンズ１４は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された第２分岐光を参照ミラー１５の反射面に集光する。また、対物レンズ１４は、参照ミラー１５の反射面で反射された第２分岐光を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。

チューブレンズ１６は、干渉光学系を構成するビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された干渉光および蛍光を、ビームスプリッタ１７を経て撮像器１８の撮像面に結像する。ビームスプリッタ１７は、干渉光および蛍光それぞれの一部を反射させ残部を透過させる。ビームスプリッタ１７の反射率と透過率との比は例えば２０：８０である。

撮像器１８は、ビームスプリッタ１７と光学的に結合され、ビームスプリッタ１７から到達した干渉光を受光して干渉画像を取得し、また、ビームスプリッタ１７から到達した蛍光を受光して蛍光画像を取得する。撮像器１８は、例えば、ＣＣＤエリアイメージセンサおよびＣＭＯＳエリアイメージセンサなどのイメージセンサである。撮像器１８の受光面の前に設けられている励起光カットフィルタ３３は、干渉光および蛍光を選択的に透過させ、励起光を選択的に遮断する。

ピエゾ素子２１は、参照ミラー１５の反射面に垂直な方向に該反射面を移動させる。ピエゾ素子２１は、この反射面の移動により、二光束干渉計における二光束の間の光路長差（すなわち位相差）を調整することができる。ピエゾ素子２１は、波長未満の分解能で、参照ミラー１５の反射面の位置を決めることができる。二光束干渉計において二光束の間の光路長差は可変である。

なお、ビームスプリッタ１２から反射増強コーティング７１までの光学的距離をＬ１とし、ビームスプリッタ１２から参照ミラー１５の反射面までの光学的距離をＬ２とすると、二光束干渉計における二光束の間の光路長差は２（Ｌ１－Ｌ２）である。この光路長差が光源１１の出力光のコヒーレント長以下であれば、撮像器１８は明瞭な干渉画像を取得することができる。光源１１の出力光の中心波長をλ０としたとき、二光束干渉計における二光束の間の位相差Δφは次式で表されるものとする。

光検出器２２は、ビームスプリッタ１７と光学的に結合され、ビームスプリッタ１７から到達した干渉光を受光して検出信号を出力する。光検出器２２は、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管であり、また、ラインセンサ（リニアセンサ）、ＣＣＤエリアイメージセンサ、ＣＭＯＳエリアイメージセンサなどであってもよい。

位相制御回路２３は、光検出器２２と電気的に接続され、光検出器２２から出力される検出信号を入力する。また、位相制御回路２３は、ピエゾ素子２１と電気的に接続され、ピエゾ素子２１による光路長差の調整動作を制御する。位相制御回路２３は、入力した検出信号に基づいて、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を検出する。そして、位相制御回路２３は、この検出結果に基づくフィードバック制御により、ピエゾ素子２１による光路長差の調整動作を制御する。これにより、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を設定値で安定化した状態（ロック状態）とすることができる。

干渉画像取得部２は、ロック状態において対象物（細胞核７３）の干渉画像を撮像器１８により撮像して取得することができる。蛍光画像取得部３は、対象物（細胞核７３）の蛍光画像を撮像器１８により撮像して取得することができる。演算部４は、蛍光画像中の画素値が閾値より大きい領域に対応する干渉画像中の領域において、干渉画像に基づいて光学的厚さの積分値を求める。

演算部４は、ＲＡＭおよびＲＯＭ等のメモリならびにＣＰＵ等のプロセッサ（演算回路）を有するパーソナルコンピュータおよびスマートデバイスなどのコンピュータであってもよい。また、演算部４は、操作者からの入力を受け付ける入力部（キーボード、マウス、タッチパネルなど）、ならびに、干渉画像および光学的厚さ画像等を表示する表示部（ディスプレイなど）を備えていてもよい。また、演算部４は、画面に画像等を表示するとともに、その画面において操作者による領域の指定を受け付ける機能を有するのが好適である。

干渉画像取得部２の動作は次のとおりである。光源１１から出力された光はビームスプリッタ１２により二光束に分岐されて第１分岐光および第２分岐光とされ、ビームスプリッタ１２から第１分岐光および第２分岐光が出力される。ビームスプリッタ１２から出力された第１分岐光は、ビームスプリッタ３２を経て、対物レンズ１３により容器７０内の細胞核７３に集光され、容器７０の底部の内側に設けられた反射増強コーティング７１で反射される。反射増強コーティング７１で反射された第１分岐光は、対物レンズ１３およびビームスプリッタ３２を経て、ビームスプリッタ１２に入力される。ビームスプリッタ１２から出力された第２分岐光は、対物レンズ１４により参照ミラー１５の反射面に集光され、その反射面で反射される。参照ミラー１５の反射面で反射された第２分岐光は、対物レンズ１４を経てビームスプリッタ１２に入力される。

対物レンズ１３からビームスプリッタ１２に入力された第１分岐光、および、対物レンズ１４からビームスプリッタ１２に入力された第２分岐光は、ビームスプリッタ１２により合波されて、ビームスプリッタ１２から干渉光が出力される。この干渉光は、チューブレンズ１６を経た後にビームスプリッタ１７により２分岐されて、撮像器１８および光検出器２２それぞれにより受光される。干渉光を受光した光検出器２２から検出信号が出力され、この検出信号に基づいて位相制御回路２３により二光束干渉計における二光束の間の光路長差が検出される。そして、位相制御回路２３によるピエゾ素子２１に対するフィードバック制御により、二光束干渉計における二光束の間の光路長差が設定値で安定化した状態（ロック状態）とされる。ロック状態において干渉光を受光した撮像器１８により干渉画像が取得され、その干渉画像は演算部４へ出力される。そして、演算部４により、干渉画像に基づいて対象物（細胞核７３）の光学的厚さ画像が求められる。

演算部４は、位相シフト法により、複数の干渉画像から光学的厚さ画像を求める。すなわち、干渉画像取得部２は、二光束干渉計の光路長差を互いに異なる複数の設定値それぞれで安定化した状態とし各状態において干渉画像を取得する。演算部４は、干渉画像取得部２により取得された複数の干渉画像に基づいて位相画像を求めることができる（特許文献１参照）。更に、演算部４は、この位相画像から光学的厚さ画像を求めることができる。

例えば、干渉画像取得部２は、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を用いたフィードバック制御により干渉光の位相差を或る初期位相で安定化させて、位相差を安定化させた状態で干渉画像Ｉ１を撮像器１８により取得する。次に、干渉画像取得部２は、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を用いて干渉光の位相差を“初期位相＋π／２”で安定化させ、位相差を安定化させた状態で干渉画像Ｉ２を撮像器１８により取得する。同様にして、干渉画像取得部２は、干渉光の位相差を“初期位相＋π”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ３を撮像器１８により取得し、干渉光の位相差を“初期位相＋３π／２”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ４を撮像器１８により取得し、干渉光の位相差を“初期位相＋２π”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ５を撮像器１８により取得する。

演算部４は、これら５つの干渉画像Ｉ１～Ｉ５を用いて、下記（２）式の演算を行って位相画像Φを求める。argは複素数の変換を取得する演算子である。ｉは虚数単位である。演算部４は、この位相画像Φに対して位相アンラップ処理および背景歪み補正処理をした後、光学的厚さＯＴを下記（３）式で求めて光学的厚さ画像を求める。なお、これらの式に現れる各パラメータは画素位置（ｘ，ｙ）の関数であり、これらの式の演算は画素毎に行われる。

背景補正については、ｘ，ｙを変数とする多項式関数（たとえばゼルニケ多項式）を用いることで良好な（フラットな）バックグラウンドを得ることができる。また、背景における歪み成分の空間周波数が個々のサンプルの空間周波数よりも十分に低い場合には、ハイパスフィルタリング処理をすることもできる。光学的厚さ画像の背景における平坦性は、光学的厚さの標準偏差にして５ｎｍ未満であるのが好ましい。

この光学的厚さＯＴは、サンプルを透過した光に与えられた位相変化量を表したものである。細胞核７３の厚さをｄとし、細胞核７３の平均的な屈折率をｎ_ｃとし、液体７２の屈折率をｎ_ｍとすると、光学的厚さＯＴは次式で与えられる。

蛍光画像取得部３の動作は次のとおりである。励起光源３１から出力された励起光は、ビームスプリッタ３２で反射され、対物レンズ１３により容器７０内の細胞核７３に集光照射される。この励起光の照射により細胞核７３で発生した蛍光は、対物レンズ１３、ビームスプリッタ３２、ビームスプリッタ１２、チューブレンズ１６、ビームスプリッタ１７および励起光カットフィルタ３３を経て、撮像器１８により受光される。この蛍光を受光した撮像器１８は蛍光画像を取得することができる。演算部４は、この蛍光画像を入力する。

次に、図３～図５を用いて、測定装置の変形例の構成について説明する。測定装置の構成（特に干渉画像取得部および蛍光画像取得部の構成）は、他に様々な態様が可能である。なお、変形例の構成を示す図３～図５では、演算部およびタイミング制御回路の図示が省略されており、また、干渉画像取得部のビームスプリッタ１７、光検出器２２および位相制御回路２３の図示も省略されている。

図３に示される第１変形例の測定装置１Ｂは、図１に示された測定装置１Ａの構成と比較すると、干渉画像取得部２および蛍光画像取得部３の各構成については略同様であるが、ビームスプリッタ３２が挿入されている位置の点で相違する。ビームスプリッタ３２は、図１に示された測定装置１Ａでは二光束干渉計の中に設けられていたのに対して、図３に示される第１変形例の測定装置１Ｂでは、二光束干渉計の外であって、ビームスプリッタ１２とチューブレンズ１６との間の光路上に設けられている。

図４に示される第２変形例の測定装置１Ｃは、図１に示された測定装置１Ａの構成と比較すると、ダイクロイックミラー３４および蛍光透過フィルタ３５を更に備える点で相違し、干渉画像取得用の撮像器１８とは別に蛍光画像取得用の撮像器３６を更に備える点で相違する。ダイクロイックミラー３４は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合されており、ビームスプリッタ１２から出力した干渉光および蛍光を入力する。ダイクロイックミラー３４は、入力した干渉光および蛍光のうち、干渉光を選択的に反射させ、蛍光を選択的に透過させる。干渉画像取得用の撮像器１８は、ダイクロイックミラー３４で反射された干渉光を受光して干渉画像を取得する。蛍光画像取得用の撮像器３６は、ダイクロイックミラー３４で透過した蛍光を受光して蛍光画像を取得する。撮像器３６の受光面の前に設けられている蛍光透過フィルタ３５は、蛍光を選択的に透過させる。

図５に示される第３変形例の測定装置１Ｄは、これまでの測定装置１Ａ～１Ｃの構成と比較すると、二光束干渉計としてマッハツェンダ干渉計を有する点で相違する。第３変形例の測定装置１Ｄでは、光源１１から出力された干渉観察用の光はビームスプリッタ１２により二光束に分岐されて第１分岐光および第２分岐光とされ、ビームスプリッタ１２から第１分岐光および第２分岐光が出力される。ビームスプリッタ１２から出力された第１分岐光は、ミラー４１で反射され、細胞核７３を透過し、対物レンズ１３を経て、ビームスプリッタ４２に入力される。ビームスプリッタ１２から出力された第２分岐光は、参照ミラー１５で反射され、対物レンズ１４を経て、ビームスプリッタ４２に入力される。

対物レンズ１３からビームスプリッタ４２に入力された第１分岐光、および、対物レンズ１４からビームスプリッタ４２に入力された第２分岐光は、ビームスプリッタ４２により合波されて、ビームスプリッタ４２から干渉光が出力される。この干渉光は、チューブレンズ１６を経て、撮像器１８により受光される。二光束干渉計における二光束の間の光路長差が設定値で安定化した状態（ロック状態）において干渉光を受光した撮像器１８により干渉画像が取得され、その干渉画像は演算部４へ出力される。そして、演算部４により、干渉画像に基づいて対象物（細胞核７３）の光学的厚さ画像が求められる。

励起光源３１から出力された励起光は、ビームスプリッタ４２で反射され、対物レンズ１３により細胞核７３に集光照射される。この励起光の照射により細胞核７３で発生した蛍光は、対物レンズ１３、ビームスプリッタ４２、チューブレンズ１６および励起光カットフィルタ３３を経て、撮像器１８により受光される。この蛍光を受光した撮像器１８は蛍光画像を取得することができる。演算部４は、この蛍光画像を入力する。

なお、図１，図３，図４および図５の構成例において、ダイクロイックミラーに替えてビームスプリッタを用いることができる場合があり、逆に、ビームスプリッタに替えてダイクロイックミラー用いることができる場合がある。ビームスプリッタの場合、反射率と透過率との比は例えば２０：８０である。

これら測定装置１Ａ～１Ｄの何れの構成においても、光源１１から出力された干渉観察用の光は、二光束干渉計（マイケルソン干渉計またはマッハツェンダ干渉計）を経るとともに、二光束干渉計の途中に置かれた細胞核をも経て、撮像器の受光面上に干渉画像を形成する。また、励起光源３１から出力された励起光の照射によって細胞核で発生した蛍光は、撮像器の受光面上に蛍光画像を形成する。測定装置１Ａ～１Ｄでは、干渉画像取得部２および蛍光画像取得部３それぞれの光学系の一部（特に対物レンズ１３）は共通であり、略同一視野に対して干渉画像および蛍光画像を取得することができる。

測定装置１Ａ～１Ｄそれぞれは、干渉画像および蛍光画像を略同時に取得することができる。第２変形例の測定装置１Ｃは、干渉画像取得用の撮像器１８と蛍光画像取得用の撮像器３６とを互いに別個に備えているので、干渉画像および蛍光画像を同時に取得することができる。第２変形例の測定装置１Ｃは、タイミング制御回路を備えていなくてもよい。

測定装置１Ａ，１Ｂ，１Ｄそれぞれは、１つの撮像器１８を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することができる。干渉画像および蛍光画像それぞれの撮像の為の露光時間が短いので、測定装置１Ａ，１Ｂ，１Ｄそれぞれは、干渉画像および蛍光画像を略同時に取得することができる。例えば、蛍光撮像に要する露光時間は数百ミリ秒～数秒程度であるのに対し、干渉撮像に要する露光時間は１００ミリ秒未満とすることが可能である。蛍光撮像直後に干渉撮像を行う又は干渉撮像直後に蛍光撮像を行うとすれば、蛍光の露光時間と比べて大きなモーションアーチファクトが発生することはないと考えられ、時分割撮像であっても実質的には略同時撮像と見なしうる。

本実施形態の測定装置は、略同一視野に対して干渉画像および蛍光画像を略同時に取得することができる構成であればよい。すなわち、干渉画像取得部２における二光束干渉計は、マイケルソン干渉計およびマッハツェンダ干渉計の何れであってもよい。励起光を導入する位置は、二光束干渉計の中であってもよいし外であってもよい。１つの撮像器により干渉画像および蛍光画像を交互に撮像してもよいし、干渉画像取得用の撮像器と蛍光画像取得用の撮像器とが互いに別個に備えられていてもよい。

また、略同一視野に対して干渉画像および蛍光画像を取得するためには、干渉画像取得部および蛍光画像取得部それぞれの光学系の一部が共通であるのが好適であるが、干渉画像取得部と蛍光画像取得部とは光学系の共通部分を備えていなくてもよい。干渉画像取得部と蛍光画像取得部とが別個の光学系であっても、略同一視野に対して干渉画像および蛍光画像を取得することができればよい。

次に、図６を用いて、光源１１から出力される干渉観察用の光の波長帯域、励起光源３１から出力される励起光の波長帯域、および、励起光照射により細胞核７３で発生する蛍光の波長帯域の間の関係について説明する。図６は、干渉観察用光、励起光および蛍光それぞれの波長帯域の間の関係の例を示す図である。一般に、蛍光波長帯域は励起光波長帯域より長波長側にある。

図６（ａ）に示される例では、干渉観察用光の波長帯域は、蛍光波長帯域より長く、分光的手法により蛍光と分離し得る程度に蛍光波長帯域から離れている。この場合、１つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することもできるし、２つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を同時に取得するのも好適である。

図６（ｂ）に示される例では、干渉観察用光の波長帯域は、蛍光波長帯域と一部が重なっている。この場合、１つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することはできる。干渉画像と蛍光画像との間の色収差を最小にすることができるので好ましい。ただし、２つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を同時に取得することはできない。

図６（ｃ）に示される例では、干渉観察用光の波長帯域は、励起光波長帯域より短く、分光的手法により励起光と分離し得る程度に励起光波長帯域から離れている。この場合、１つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することもできるし、２つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を同時に取得することもできる。ただし、干渉画像と蛍光画像との間の色収差が問題となる場合があり、その場合には、高精度に色収差を補正した光学系を用いることが望ましい。

図６（ｄ）に示される例では、干渉観察用光の波長帯域は、励起光波長帯域と一部が重なっている。この場合、１つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することはできるが、２つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を同時に取得することはできない。

次に、図７を用いて、本実施形態の測定装置の動作および本実施形態の測定方法の手順について説明する。図７は、本実施形態の測定装置の動作および本実施形態の測定方法を説明するタイミングチャートである。この図は、光源１１の光出力期間、励起光源３１の励起光出力期間、撮像器の露光期間、および、干渉光の位相差（二光束干渉計における二光束の間の位相差）の時間変化の例を示している。本実施形態の測定方法は、干渉画像取得ステップ、蛍光画像取得ステップおよび演算ステップを有する。この図は、１つの撮像器を用いて干渉画像取得ステップおよび蛍光画像取得ステップを時分割で交互に行う場合の動作例を示している。

干渉画像取得ステップにおいては、光源１１は干渉観察用の光を出力し、励起光源３１は励起光を出力しない。干渉画像取得部２は、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を用いたフィードバック制御により干渉光の位相差を初期位相からπ／２ずつ段階的に設定し、各々の段階において位相差を設定値に安定化させた状態で干渉画像Ｉ１～Ｉ５を撮像器１８により撮像する。

蛍光画像取得ステップにおいては、光源１１は干渉観察用の光を出力せず、励起光源３１は励起光を出力する。この期間の位相差は、安定してないフリー状態にある。蛍光画像取得部３は蛍光画像ＦＬを撮像器１８により撮像する。

干渉画像取得ステップと蛍光画像取得ステップとを交互に繰り返すことで、干渉画像Ｉ１～Ｉ５および蛍光画像ＦＬを次々と取得することができる。また、必要に応じて、或る視野に対して干渉画像取得ステップおよび蛍光画像取得ステップを行って干渉画像および蛍光画像を取得した後、例えば電動ステージによりサンプルを移動させて、他の視野に対して干渉画像取得ステップおよび蛍光画像取得ステップを行って干渉画像および蛍光画像を取得してもよい。このようにすることで、複数の視野それぞれに対して干渉画像および蛍光画像を取得することができる。

演算ステップにおいて、演算部４は、干渉画像取得部２により取得された干渉画像Ｉ１～Ｉ５に基づいて、前述した手法により光学的厚さ画像を求める。演算部４は、蛍光画像中の画素値が閾値より大きい領域に対応する干渉画像中の領域において、干渉画像に基づいて光学的厚さの積分値を求める。

演算ステップにおいて、演算部４は、干渉画像取得ステップおよびこれに続く蛍光画像取得ステップで取得された干渉画像および蛍光画像を用いて、または、蛍光画像取得ステップおよびこれに続く干渉画像取得ステップで取得された蛍光画像および干渉画像を用いて、後述する各処理を行う。演算ステップは、干渉画像取得ステップおよび蛍光画像取得ステップの双方または何れか一方と並列的に行ってもよい。

次に、演算部４による処理（演算ステップ）について詳細に説明する。演算ステップにおいて、演算部４は、干渉画像取得部２により取得された干渉画像および蛍光画像取得部３により取得された蛍光画像を用いて、次のような処理を行う。

演算部４は、干渉画像取得部２により取得された複数の干渉画像から上記（２）式に基づいて位相画像を求め、さらに、この位相画像から上記（３）式に基づいて光学的厚さ画像を求める。なお、上記（３）式に示されるとおり位相値Φと光学的厚さＯＴとは互いに比例関係にあるので、位相画像と光学的厚さ画像とは実質的に互いに等価であると言ってよい。

図８は、蛍光画像を模式的に示す図である。図９は、光学的厚さ画像を模式的に示す図である。これらの蛍光画像および光学的厚さ画像は、実質的に同じ期間において実質的に同じ視野について撮像することにより得られたものである。対象物は蛍光染色された細胞核であるとして以下に説明する。

図８に示されるように、蛍光画像において、蛍光染色液の濃度の不均一性または細胞核の個体差により、蛍光強度が大きい細胞核（図中で濃色の領域）と、蛍光強度が小さい細胞核（図中で淡色の領域）と、が存在する。また、蛍光画像において、一個の完全な形状を有する細胞核（図中で円形または楕円形の領域）と、一個の細胞核が二つに分断されたもの（図中で略半円形の領域）と、二個の細胞核が互いに接触し又は重なって見かけの上で融合しているもの（図中において二つの円形または楕円形の各一部が互いに重なった形状の領域）と、が存在する。

このように、個々の細胞核の間で蛍光の発現率にバラツキがあることから、蛍光輝度の総和から細胞核の個数を精度よく求めることば困難である。また、見かけ上融合した細胞核や分断された細胞核が存在することから、蛍光を発する領域の個数を数えることによっても、細胞核の個数を精度よく見積もることは困難である。細胞核の個数を精度よく求めることができなければ、ＤＮＡ量を精度よく求めることも困難である。

一方、光学的厚さ画像は、各位置における物質の濃度および厚さに比例した画素値（光学的厚さ）を有する。したがって、領域内に含まれる物質が全て同じ物質であると見なせる場合は、その領域内の画素値の総和を求めることで、その領域に含まれる物質の総量を知ることができる。

しかし、光学的厚さ画像では、物質の種類が分からないので、細胞核以外のものが含まれている可能性がある。蛍光画像（図８）と光学的厚さ画像（図９）とを対比すると、光学的厚さ画像（図９）において矢印で示される三つの領域は、蛍光画像（図８）において蛍光を発していないことから、蛍光染色された細胞核を表すものではないことが分かる。光学的厚さ画像において細胞核以外の物体が現れる原因としては、核分画の作業の際に細胞核以外の物体（例えば細胞内小器官）を完全に除去することができないことが挙げられる。

このように、蛍光画像および光学的厚さ画像それぞれは上記のような問題点を有していることから、蛍光画像および光学的厚さ画像のうちの一方の画像のみを用いる場合には、サンプル中の細胞核の個数を精度よく求めることは困難である。

本実施形態では、蛍光画像および光学的厚さ画像の双方を用いることにより、サンプル中の細胞核の個数を精度よく求めることができ、さらに、サンプル中のＤＮＡ総量を精度よく求めることができる。すなわち、本実施形態では、蛍光画像が有する蛍光性対象物に対する特異性を利用することで、光学的厚さ画像が有する上記の物質識別性に関する問題点を解消して、光学的厚さ画像が有する上記の定量性に関する利点を活かす。

蛍光画像は、定量性の点で劣るものの、蛍光性対象物に対する特異性を有している。そこで、演算部４は、蛍光画像（図８）中の画素値が閾値より大きい領域を示すマスク画像を作成することができる。図１０は、蛍光画像（図８）に基づいて作成されたマスク画像を示す図である。マスク画像（図１０）は、蛍光画像（図８）中の各画素値を適切な閾値によって二値化したものである。マスク画像（図１０）において、白色領域は、蛍光画素値が閾値より大きい領域、すなわち、蛍光を発する細胞核の領域である。黒色領域は、蛍光画素値が閾値より小さい領域である。マスク画像（図１０）において、白色領域内の各画素値を１とし、黒色領域内の各画素値を０とする。

光学的厚さ画像（図９）にマスク画像（図１０）を乗算することで、光学的厚さ画像（図９）のうちマスク画像（図１０）が示す領域（すなわち、蛍光を発する細胞核の領域）を抽出することができる。図１１は、光学的厚さ画像（図９）とマスク画像（図１０）との積の画像を示す図である。この積画像（図１１）では、光学的厚さ画像（図９）にあった細胞核以外の物体が除外され、光学的厚さ画像（図９）にあった細胞核のみが示されることになる。

積画像（図１１）の各位置の画素値（光学的厚さ）は、該位置における細胞核の濃度および厚さに比例している。そこで、演算部４は、この積画像（図１１）の画素値を視野全体に亘って積分する。これにより得られる積分値Ｖ_Ｎは、その視野にある細胞核の総量に比例する指標であり、また、その視野にあるＤＮＡの総量に比例する指標でもある。

光学的厚さの測定値は再現性がある値であるので、例えば個々の細胞核を明確に分別することができ細胞核の個数が明確であるサンプルについて積画像（図１１）の画素値を視野全体に亘って積分し、その積分値を視野内の細胞核の個数で除算することにより、細胞核一個当たりの平均の積分値Ｖ_１を求めることができる。測定対象のサンプルについて積画像（図１１）の画素値を視野全体に亘って積分して得られた積分値Ｖ_Ｎを、細胞核一個当たりの平均の積分値Ｖ_１で除算することにより、該サンプルの該視野にある細胞核の個数を求めることができ、さらに、該サンプルの該視野にあるＤＮＡの総量を求めることができる。

なお、画像取得時の倍率が異なると、同じ視野であっても該視野内の画素数が異なることから、視野全体に亘る画素値の積分値も異なる。したがって、画像取得時の倍率が異なる場合には、その倍率によって積分値を補正する。例えば、視野全体に亘る画素値の積分値を該視野内の画素数で除算することにより、画像取得時の倍率によらない値とすることができる。

また、１つの視野に限られるものではなく、複数の視野を繋ぎ合わせた複合視野であってもよい。複合視野について取得された蛍光画像および干渉画像に基づいて同様にして細胞核の個数を求めることができる。

例えば、サンプルが細胞懸濁液である場合、まず、核分画によりサンプル中の細胞の細胞膜を溶解させ細胞核のみを抽出する。このようにして抽出された主として細胞核のみが集まった溶液を、予め容積が分かっている容器に注入する。細胞核のみが集まった溶液の量が１ｍLであり、これを十分に懸濁させた溶液の一部を１０ｍｍ×１０ｍｍ×１ｍｍ（高さ）の容器に注入したとすると、この容器の容積１００μＬは元のサンプルの１／１０に相当する。この容器に入れられたサンプルのうち１ｍｍ×１ｍｍの視野について蛍光画像および干渉画像を取得する。この視野に含まれるサンプル量は、元のサンプルの１／１０００に相当する。

そして、蛍光画像からマスク画像を作成し、干渉画像から光学的厚さ画像を作成する。さらに、マスク画像および光学的厚さ画像から積画像を作成して、この積画像の積分値Ｖ_Ｎを求める。この積分値Ｖ_Ｎを細胞核一個当たりの平均の積分値Ｖ_１で除算することにより、視野にある細胞核の個数を求める。これにより求めた視野内の細胞核の個数を１０００倍することにより、元のサンプルに含まれる細胞核の個数を求めることができる。細胞核の一個当たりに含まれるＤＮＡの量は推測することが可能であるので、元のサンプルに含まれるＤＮＡの総量をも求めることができる。

従来の吸収法と比較すると、本実施形態では、測定結果に対するＤＮＡ以外の吸光物質の影響が抑制され、液体サンプルの場合であっても溶液自体の吸収の影響が抑制される。また、本実施形態では、濃度の低いサンプルに対しても精度よく測定することが可能である。

従来の蛍光法と比較すると、本実施形態では、測定結果に対する蛍光の染まりムラや蛍光発現率のバラツキの影響が抑制され、測定結果に対する自家蛍光の影響も抑制される。また、本実施形態では、濃度が非常に高く複数の細胞核が上下に重なっている場合であっても精度よく測定することが可能であるとともに、自家蛍光やバックグラウンド蛍光が無視できなくなるような濃度の低いサンプルに対しても精度よく測定することが可能である。

従来の染色細胞核を計数する方法と比較すると、本実施形態では、見かけ上融合した細胞核または分断された細胞核が存在している場合であっても、精度よく測定することが可能である。また、本実施形態では、細胞核の領域を画定するためのセグメンテーション処理が不要であるので、該処理に起因する誤差が無く、高速な処理が可能である。

１Ａ～１Ｄ…測定装置、２…干渉画像取得部、３…蛍光画像取得部、４…演算部、５…タイミング制御回路、１１…光源、１２…ビームスプリッタ、１３，１４…対物レンズ、１５…参照ミラー、１６…チューブレンズ、１７…ビームスプリッタ、１８…撮像器、２１…ピエゾ素子、２２…光検出器、２３…位相制御回路、３１…励起光源、３２…ビームスプリッタ、３３…励起光カットフィルタ、３４…ダイクロイックミラー、３５…蛍光透過フィルタ、３６…撮像器、４１…ミラー、４２…ビームスプリッタ、７０…容器、７１…反射増強コーティング、７２…液体、７３…細胞核。

Claims (9)

1. 対象物を含むサンプルの蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、
   前記サンプルの干渉画像を取得する干渉画像取得部と、
   前記蛍光画像中の画素値が閾値より大きい領域に対応する前記干渉画像中の領域において、前記干渉画像に基づいて前記サンプルの光学的厚さの積分値を求める演算部と、
   を備える測定装置。
2. 前記演算部は、前記干渉画像に基づいて前記サンプルの光学的厚さ画像を作成するとともに、前記蛍光画像中の画素値が閾値より大きい領域を示すマスク画像を作成し、前記光学的厚さ画像のうち前記マスク画像が示す領域において前記サンプルの光学的厚さの積分値を求める、
   請求項１に記載の測定装置。
3. 前記干渉画像取得部がインコヒーレント光を用いて干渉画像を取得する、
   請求項１または２に記載の測定装置。
4. 前記干渉画像取得部および前記蛍光画像取得部それぞれの光学系の少なくとも一部が共通である、
   請求項１～３の何れか１項に記載の測定装置。
5. 対象物を含むサンプルの蛍光画像を蛍光画像取得部により取得する蛍光画像取得ステップと、
   前記サンプルの干渉画像を干渉画像取得部により取得する干渉画像取得ステップと、
   前記蛍光画像中の画素値が閾値より大きい領域に対応する前記干渉画像中の領域において、前記干渉画像に基づいて前記サンプルの光学的厚さの積分値を求める演算ステップと、
   を備える測定方法。
6. 前記演算ステップにおいて、前記干渉画像に基づいて前記サンプルの光学的厚さ画像を作成するとともに、前記蛍光画像中の画素値が閾値より大きい領域を示すマスク画像を作成し、前記光学的厚さ画像のうち前記マスク画像が示す領域において前記サンプルの光学的厚さの積分値を求める、
   請求項５に記載の測定方法。
7. 前記干渉画像取得ステップにおいて、前記干渉画像取得部がインコヒーレント光を用いて干渉画像を取得する、
   請求項５または６に記載の測定方法。
8. 前記干渉画像取得部および前記蛍光画像取得部それぞれの光学系の少なくとも一部が共通である、
   請求項５～７の何れか１項に記載の測定方法。
9. 前記対象物が蛍光染色された細胞核であり、
   前記演算ステップにおいて前記細胞核の総量に比例する指標として前記積分値を求める、
   請求項５～８の何れか１項に記載の測定方法。

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