CN111542749B - 荧光测定装置及荧光测定方法 - Google Patents

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Abstract

荧光测定装置(1A)具备取得包含对象物的荧光图像的荧光图像取得部(3)、取得包含对象物的干涉图像的干涉图像取得部(2)及运算部(4)。运算部(4)基于由干涉图像取得部取得的干涉图像，求出光学厚度图像，在共同地设定于由荧光图像取得部取得的荧光图像及光学厚度图像的双方的关注区域中，基于荧光图像的荧光强度的积分值和光学厚度图像的光学厚度的积分值，求出对象物的荧光表达率。由此，可实现能够正确地求出关注区域内的对象物的荧光表达率的荧光测定装置及荧光测定方法。

Description

荧光测定装置及荧光测定方法
技术领域
本发明涉及荧光测定装置及荧光测定方法。
背景技术
已知有在由荧光显微镜取得的细胞团的荧光图像中对荧光亮度高的细胞和荧光亮度低的细胞进行分类并进行统计解析的方法。例如，非专利文献1所记载的技术由数码相机取得包含对血液样本中所含的免疫染色呈阳性的细胞和呈阴性的细胞的荧光图像，基于该荧光图像，进行分类·统计解析。在该现有技术中，基于荧光图像中的荧光强度，辨别强烈发出荧光的阳性细胞和未发出荧光的(或荧光弱的)阴性细胞。
即，在通过免疫染色等方法对细胞团进行染色时，荧光强度为阈值以上的细胞(阳性细胞)判定为呈现所希望的抗原抗体反应，荧光强度为阈值以下的细胞(阴性细胞)判定为未呈现所希望的抗原抗体反应。基于该判定结果，能够计算细胞团中呈现了所希望的抗原抗体反应的细胞的比例。以这种荧光强度为指标来辨别细胞或细胞团的技术记载于专利文献1。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-20422号公报
专利文献2：国际公开第2016/121250号
非专利文献
非专利文献1：Benjamin R.Lee et al.,"A Digital Image Microscopy Systemfor Rare-Event Detection Using Fluorescent Probes",Cytometry 10,1989,pp.256-262
发明内容
发明所要解决的问题
本发明人发现了现有的辨别技术具有如下所述的问题。即，在现有的辨别技术中，因为仅以荧光图像中的荧光强度为指标，所以难以进行正确的辨别。厚度大的细胞或细胞团因为即使是荧光色素的表达率低的阴性细胞，也以沿着观察光学系统的光轴的厚度量来累计观察荧光，所以有时被误判定为是荧光强度大的阳性细胞。相反的，厚度小的细胞或细胞团因为即使是荧光色素的表达率高的阳性细胞，沿着观察光学系统的光轴的荧光的累计量也少，所以有时被误判定为是荧光强度小的阴性细胞。
例如，如图1所示，当荧光色素的表达率高的阳性细胞73p的厚度小，且荧光色素的表达率低的阴性细胞73n的厚度大时，有时沿着观察光学系统的光轴的阳性细胞73p的荧光的累计量少，且沿着观察光学系统的光轴的阴性细胞73n的荧光的累计量多，在这种情况下，成为误判定。
另外，如图2所示，在多孔板(Multi-well Plate)的某孔(well)中仅存在多数的阴性细胞73n，在其他孔中仅存在少数的阳性细胞73p，进而在其他孔中混合存在阴性细胞73n及阳性细胞73p的情况下，也成为误判定。即，仅根据各孔的荧光累计量，无法判定该孔中的阴性细胞73n及阳性细胞73p的混合比例。
这种问题不仅存在于通过荧光强度来辨别细胞的情况，也存在于通过荧光强度来辨别其他对象物的情况。
实施方式的目的在于，提供能够正确地求出关注区域内的对象物的荧光表达率的荧光测定装置及荧光测定方法。
解决问题的技术手段
实施方式是一种荧光测定装置。荧光测定装置具备：(1)荧光图像取得部，其取得包含对象物的荧光图像；(2)干涉图像取得部，其取得包含对象物的干涉图像；(3)运算部，其基于由干涉图像取得部取得的干涉图像，求出光学厚度图像，在共同地设定于由荧光图像取得部取得的荧光图像及光学厚度图像的双方的关注区域中，基于荧光图像的荧光强度的积分值和光学厚度图像的光学厚度的积分值，求出对象物的荧光表达率。
实施方式是一种荧光测定方法。荧光测定方法具备：(1)荧光图像取得步骤，其由荧光图像取得部取得包含对象物的荧光图像；(2)干涉图像取得步骤，其由干涉图像取得部取得包含对象物的干涉图像；(3)运算步骤，其基于由干涉图像取得部取得的干涉图像，求出光学厚度图像，在共同地设定于由荧光图像取得部取得的荧光图像及光学厚度图像的双方的关注区域中，基于荧光图像的荧光强度的积分值和光学厚度图像的光学厚度的积分值，求出对象物的荧光表达率。
发明的效果
根据实施方式，能够正确地求出关注区域内的对象物的荧光表达率。
附图说明
图1是对细胞的厚度及荧光累计量进行说明的图。
图2是对细胞的个数、荧光累计量及混合比例进行说明的图。
图3是表示荧光测定装置1A的结构的图。
图4是表示样本的结构的图。
图5是表示第一变形例的荧光测定装置1B的结构的图。
图6是表示第二变形例的荧光测定装置1C的结构的图。
图7是表示第三变形例的荧光测定装置1D的结构的图。
图8是表示干涉观察用光、激发光及荧光各自的波段之间的关系的例子的图，(a)表示干涉观察用光的波段比荧光波段长的情况，(b)表示干涉观察用光的波段与荧光波段一部分重叠的情况，(c)表示干涉观察用光的波段比激发光波段短的情况，以及(d)表示干涉观察用光的波段与激发光波段一部重叠的情况。
图9是对本实施方式的荧光测定装置的动作及本实施方式的荧光测定方法进行说明的时序图。
图10是表示由干涉图像取得部2取得的五个干涉图像I1～I5的图。
图11是表示由运算部4基于图10的干涉图像I1～I5并利用(2)式求出的相位图像Φ的图。
图12是表示由运算部4基于图11的相位图像Φ并利用(3)式求出的光学厚度图像OT的图。
图13是表示由荧光图像取得部3取得的荧光图像FL的图。
图14是表示在图12的光学厚度图像OT中对细胞区域进行分割处理之后的光学厚度图像的图。
图15是针对各细胞(各ROI)汇总面积、平均光学厚度、平均荧光强度及“平均荧光强度/平均光学厚度”的表。
图16是表示各ROI的平均荧光强度的曲线图。
图17是表示各ROI的“平均荧光强度/平均光学厚度”的曲线图。
图18是在分割后的图像中用灰色表示1000ד平均荧光强度/平均光学厚度”为80以上的ROI，且用白色表示1000ד平均荧光强度/平均光学厚度”为80以下的ROI的图。
图19是针对细胞团示意性地表示光学厚度图像及荧光图像的图，(a)表示光学厚度图像，以及(b)表示荧光图像。
图20是示意性地表示仅由阳性细胞73p构成的细胞团及仅由阴性细胞73n构成的细胞团的图。
图21是示意性地表示混合存在阳性细胞及阴性细胞的视野的像的图。
图22是对判定是阳性细胞及阴性细胞的哪一种的顺序进行说明的流程图。
图23是对评价阳性细胞及阴性细胞的混合比例的顺序进行说明的流程图。
图24是对第一变形例的ROI设定方法进行说明的图。
图25是对第二变形例的ROI设定方法进行说明的图。
图26是对第三变形例的ROI设定方法进行说明的图。
具体实施方式
下面，参照附图对荧光测定装置及荧光测定方法的实施方式进行详细的说明。此外，在附图的说明中，对相同的要素标注相同的符号，省略重复的说明。本发明不限定于这些例示。
图3是表示荧光测定装置1A的结构的图。荧光测定装置1A具备干涉图像取得部2、荧光图像取得部3、运算部4及时机控制电路5。干涉图像取得部2及荧光图像取得部3各自的光学系统的一部分是共同的。干涉图像取得部2包括光源11、分束器12、物镜13、物镜14、参考镜15、管透镜16、分束器17、摄像器18、压电元件21、光检测器22及相位控制电路23。荧光图像取得部3包括激发光源31、分束器32、管透镜16、激发光截止滤光器33及摄像器18。
干涉图像取得部2具有迈克尔逊干涉仪来作为双光束干涉仪，取得一个或多个对象物的干涉图像。荧光图像取得部3取得对象物的荧光图像。运算部4基于由干涉图像取得部2取得的干涉图像，求出光学厚度图像。再有，运算部4在共同地设定于由荧光图像取得部3取得的荧光图像及光学厚度图像的双方的关注区域中，基于荧光图像的荧光强度的积分值和光学厚度图像的光学厚度的积分值，求出对象物的荧光表达率。时机控制电路5通过控制光源11及激发光源31各自的光输出时机以及摄像器18的曝光时机，来控制由干涉图像取得部2进行的干涉图像取得及由荧光图像取得部3进行的荧光图像取得各自的时机。
对象物不限定于特定的细胞或生物样本。例如，作为对象物，可举出：培养细胞、永生细胞、原代培养细胞、癌细胞、脂肪细胞、肝脏细胞、心肌细胞、神经细胞、胶质细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、iPS细胞、及以上述细胞为基础而制作的细胞块(菌落或球状体)等。另外，作为对象物，不限于生物，也可举出工业样本、例如金属表面、半导体表面、玻璃表面、半导体元件的内部、树脂原材料表面、液晶、高分子化合物等。
在本实施方式的以下的说明中，如在图4中表示样本的结构例所示，设为对象物是放入到容器70的培养液72中的细胞73。在容器70的底部的内侧设有反射增强涂层71。
光源11输出干涉观察用的光。优选光源11输出非相干光。光源11是例如卤素灯等灯系光源、LED(Light emitting diode(发光二极管))光源、SLD(Super luminescentdiode(超发光二极管))光源、ASE(Amplified spontaneous emission(放大自发辐射))光源等。
分束器12与光源11光学地耦合，构成作为双光束干涉仪的迈克尔逊干涉仪。分束器12例如也可以是反射率和透过率之比为50：50的半透半反镜。分束器12将从光源11输出的光分支成两个光束而设为第一分支光及第二分支光。分束器12将第一分支光向物镜13输出，且将第二分支光向物镜14输出。
另外，分束器12输入由反射增强涂层71反射并经过了物镜13的第一分支光，并且输入由参考镜15反射并经过了物镜14的第二分支光。然后，分束器12将这些输入后的第一分支光和第二分支光合波，并将干涉光向管透镜16输出。
物镜13与分束器12光学地耦合，使从分束器12输出的第一分支光聚光于容器70内的细胞73。另外，物镜13输入由反射增强涂层71反射的第一分支光并向分束器12输出。
在分束器12和物镜13之间的第一分支光的光路上插入有分束器32。分束器32与激发光源31光学地连接。分束器32使从激发光源31输出的激发光、从光源11输出的光中的第一分支光、及由被照射了激发光的细胞73产生的荧光中的一部分反射，且使其余部分透过。
物镜13使从分束器32到达的激发光聚光于容器70内的细胞73。另外，物镜13输入由细胞73产生的荧光并向分束器12输出。分束器12将该荧光向管透镜16输出。
物镜14与分束器12光学地耦合，使从分束器12输出的第二分支光聚光于参考镜15的反射面。另外，物镜14输入由参考镜15的反射面反射的第二分支光并向分束器12输出。
管透镜16与构成干涉光学系统的分束器12光学地耦合，使从分束器12输出的干涉光及荧光经过分束器17而在摄像器18的摄像面成像。分束器17使干涉光及荧光各自的一部分反射且使其余部分透过。分束器17的反射率和透过率之比为例如20：80。
摄像器18与分束器17光学地耦合，对从分束器17到达的干涉光进行受光而取得干涉图像，另外，对从分束器17到达的荧光进行受光而取得荧光图像。摄像器18是例如CCD区域图像传感器及CMOS区域图像传感器等图像传感器。设置于摄像器18的受光面之前的激发光截止滤光器33使干涉光及荧光选择性地透过，且选择性地截止激发光。
压电元件21使反射面向与参考镜15的该反射面垂直的方向移动。压电元件21通过该反射面的移动，能够调节双光束干涉仪中的两个光束之间的光路长差(即相位差)。压电元件21能够以小于波长的分辨率来确定参考镜15的反射面的位置。在双光束干涉仪中两个光束之间的光路长差是可变的。
此外，当设从分束器12到反射增强涂层71的光学距离为L1，且设从分束器12到参考镜15的反射面的光学距离为L2时，双光束干涉仪中的两个光束之间的光路长差为2(L1-L2)。如果该光路长差为光源11的输出光的相干长度以下，则摄像器18能够取得清晰的干涉图像。在设光源11的输出光的中心波长为λ0时，双光束干涉仪中的两个光束之间的相位差Δφ用下式来表示。
[数1]
Δφ＝2π×2×(L1-L2)/λ0 (1)
光检测器22与分束器17光学地耦合，对从分束器17到达的干涉光进行受光并输出检测信号。光检测器22是例如光电二极管、雪崩光电二极管、光电倍增管，另外，也可以是线传感器(线性传感器)、CCD区域图像传感器、CMOS区域图像传感器等。
相位控制电路23与光检测器22电连接，输入从光检测器22输出的检测信号。另外，相位控制电路23与压电元件21电连接，控制由压电元件21进行的光路长差的调节动作。相位控制电路23基于所输入的检测信号，检测双光束干涉仪中的两个光束之间的光路长差。然后，相位控制电路23通过基于该检测结果的反馈控制，来控制由压电元件21进行的光路长差的调节动作。由此，能够使双光束干涉仪中的两个光束之间的光路长差为在设定值稳定化了的状态(锁定状态)。
干涉图像取得部2能够在锁定状态下将对象物(细胞73)的干涉图像由摄像器18摄像而取得。荧光图像取得部3能够将对象物(细胞73)的荧光图像由摄像器18摄像而取得。运算部4基于由干涉图像取得部2的摄像器18取得的干涉图像，求出对象物的光学厚度图像，基于该光学厚度图像及荧光图像，求出关注区域内的对象物的荧光表达率。
运算部4也可以是个人计算机及平板终端等具备处理器(例如CPU)和存储部(例如RAM或存储器)的计算机。另外，运算部4也可以是微机或FPGA。另外，运算部4也可以具备接受来自操作者的输入的输入部(键盘、鼠标、平板终端等)以及显示干涉图像及光学厚度图像等的显示部(显示器、平板终端等)。另外，运算部4优选具有在画面上显示图像等并且在其画面中接受由操作者进行的区域的指定的功能。
干涉图像取得部2的动作如下所述。从光源11输出的光由分束器12分支成两个光束并设为第一分支光及第二分支光，从分束器12输出第一分支光及第二分支光。从分束器12输出的第一分支光经过分束器32并由物镜13聚光于容器70内的细胞73，且由设置于容器70的底部的内侧的反射增强涂层71反射。由反射增强涂层71反射的第一分支光经过物镜13及分束器32而被输入到分束器12。从分束器12输出的第二分支光由物镜14聚光于参考镜15的反射面，且由其反射面反射。由参考镜15的反射面反射的第二分支光经过物镜14而被输入到分束器12。
从物镜13输入到分束器12的第一分支光、及从物镜14输入到分束器12的第二分支光由分束器12合波，并从分束器12输出干涉光。该干涉光在经过管透镜16之后由分束器17分支为两支，分别由摄像器18及光检测器22受光。从对干涉光进行了受光的光检测器22输出检测信号，基于该检测信号，由相位控制电路23检测双光束干涉仪中的两个光束之间的光路长差。然后，通过由相位控制电路23对压电元件21进行反馈控制，双光束干涉仪中的两个光束之间的光路长差成为在设定值稳定化了的状态(锁定状态)。由在锁定状态下对干涉光进行受光的摄像器18取得干涉图像，其干涉图像向运算部4输出。然后，由运算部4基于干涉图像，求出对象物(细胞73)的光学厚度图像。
运算部4通过相移法，根据多个干涉图像，求出光学厚度图像。即，干涉图像取得部2设为将双光束干涉仪的光路长差在彼此不同的多个设定值分别稳定化了的状态并在各状态下取得干涉图像。运算部4基于由干涉图像取得部2取得的多个干涉图像，能够求出相位图像(参照专利文献2)。再有，运算部4根据该相位图像，能够求出光学厚度图像。
例如，干涉图像取得部2通过使用了压电元件21、光检测器22及相位控制电路23的反馈控制，使干涉光的相位差在某个初始相位稳定化，在使相位差稳定化了的状态下，由摄像器18取得干涉图像I1。接着，干涉图像取得部2使用压电元件21、光检测器22及相位控制电路23，使干涉光的相位差在“初始相位+π/2”稳定化，在使相位差稳定化了的状态下，由摄像器18取得干涉图像I2。同样，干涉图像取得部2在使干涉光的相位差在“初始相位+π”稳定化了的状态下，由摄像器18取得干涉图像I3，在使干涉光的相位差在“初始相位+3π/2”稳定化了的状态下，由摄像器18取得干涉图像I4，在使干涉光的相位差在“初始相位+2π”稳定化了的状态下，由摄像器18取得干涉图像I5。
运算部4使用这五个干涉图像I1～I5，进行下述(2)式的运算并求出相位图像Φ。arg是取得复数的偏角的运算符。i是虚数单位。运算部4在对该相位图像Φ进行了相位解包处理及背景失真校正处理之后，利用下述(3)式，求出光学厚度OT，并求出光学厚度图像。此外，这些式中出现的各参数是像素位置(x，y)的函数，这些式的运算针对每个像素来进行。
[数2]
Φ＝arg{(I1-2×I3+I5)+i(2×I2-2×I4)} (2)
[数3]
关于背景校正，通过使用以x、y为变量的多项式函数(例如泽尼克多项式)，能够得到良好的(平坦的)背景。另外，在背景中的失真成分的空间频率比各个样本的空间频率充分低的情况下，也能够进行高通滤波处理。光学厚度图像的背景中的平坦性在以光学厚度的标准偏差计时优选为小于5nm。
该光学厚度OT表示对透过了样本的光赋予的相位变化量。当设细胞73的厚度为d、细胞73的平均折射率为nc、培养液72的折射率为nm时，光学厚度OT由下式给出。
[数4]
OT＝d×(nc-nm) (4)
荧光图像取得部3的动作如下所述。从激发光源31输出的激发光由分束器32反射，由物镜13聚光照射到容器70内的细胞73。通过该激发光的照射而由细胞73产生的荧光经过物镜13、分束器32、分束器12、管透镜16、分束器17及激发光截止滤光器33，由摄像器18受光。对该荧光进行了受光的摄像器18能够取得荧光图像。运算部4输入该荧光图像。
接着，利用图5～图7对荧光测定装置的变形例的结构进行说明。荧光测定装置的结构(特别是干涉图像取得部及荧光图像取得部的结构)可进行其他各种的方式。此外，在表示变形例的结构的图5～图7中，省略运算部及时机控制电路的图示，另外，也省略干涉图像取得部的分束器17、光检测器22及相位控制电路23的图示。
图5所示的第一变形例的荧光测定装置1B当与图3所示的荧光测定装置1A的结构进行比较时，干涉图像取得部2及荧光图像取得部3的各结构大致相同，但在插入分束器32的位置这方面不同。分束器32在图3所示的荧光测定装置1A中设置于双光束干涉仪之中，与此相对，在图5所示的第一变形例的荧光测定装置1B中设置于双光束干涉仪之外，即设置于分束器12和管透镜16之间的光路上。
图6所示的第二变形例的荧光测定装置1C当与图3所示的荧光测定装置1A的结构进行比较时，在还具备分色镜34及荧光透过滤光器35这方面不同，且在与干涉图像取得用的摄像器18分开地还具备荧光图像取得用的摄像器36这方面不同。分色镜34与分束器12光学地耦合，输入从分束器12输出的干涉光及荧光。分色镜34使输入的干涉光及荧光中的干涉光选择性地反射，且使荧光选择性地透过。干涉图像取得用的摄像器18对由分色镜34反射的干涉光进行受光并取得干涉图像。荧光图像取得用的摄像器36对在分色镜34透过了的荧光进行受光并取得荧光图像。设置于摄像器36的受光面之前的荧光透过滤光器35使荧光选择性地透过。
图7所示的第三变形例的荧光测定装置1D当与至此为止的荧光测定装置1A～1C的结构进行比较时，在具有马赫曾德尔干涉仪来作为双光束干涉仪这方面不同。在第三变形例的荧光测定装置1D中，从光源11输出的干涉观察用的光由分束器12分支成两个光束而设为第一分支光及第二分支光，从分束器12输出第一分支光及第二分支光。从分束器12输出的第一分支光由镜41反射，透过细胞73，经过物镜13，被输入到分束器42。从分束器12输出的第二分支光由参考镜15反射，经过物镜14，被输入到分束器42。
从物镜13输入到分束器42的第一分支光、及从物镜14输入到分束器42的第二分支光由分束器42合波，从分束器42输出干涉光。该干涉光经过管透镜16，由摄像器18受光。由在双光束干涉仪中的两个光束之间的光路长差在设定值稳定化了的状态(锁定状态)下对干涉光进行了受光的摄像器18取得干涉图像，其干涉图像向运算部4输出。然后，由运算部4基于干涉图像，求出对象物(细胞73)的光学厚度图像。
从激发光源31输出的激发光由分束器42反射，由物镜13聚光照射到细胞73。通过该激发光的照射而由细胞73产生的荧光经过物镜13、分束器42、管透镜16及激发光截止滤光器33，由摄像器18受光。对该荧光进行了受光的摄像器18能够取得荧光图像。运算部4输入该荧光图像。
此外，在图3、图5、图6及图7的结构例中，有时能够使用分束器来代替分色镜，反之，有时能够使用分色镜来代替分束器。在分束器的情况下，反射率和透过率之比为例如20：80。
在这些荧光测定装置1A～1D的任一结构中，从光源11输出的干涉观察用的光均经过双光束干涉仪(迈克尔逊干涉仪或马赫曾德尔干涉仪)并且也经过放置于双光束干涉仪的中途的细胞，而在摄像器的受光面上形成干涉图像。另外，通过从激发光源31输出的激发光的照射而由细胞产生的荧光在摄像器的受光面上形成荧光图像。在荧光测定装置1A～1D中，干涉图像取得部2及荧光图像取得部3各自的光学系统的一部分(特别是物镜13)是共同的，能够相对于大致相同的视野取得干涉图像及荧光图像。
荧光测定装置1A～1D分别能够大致同时地取得干涉图像及荧光图像。第二变形例的荧光测定装置1C由于相互分开地具备干涉图像取得用的摄像器18和荧光图像取得用的摄像器36，因此能够同时地取得干涉图像及荧光图像。第二变形例的荧光测定装置1C也可以不具备时机控制电路。
荧光测定装置1A、1B、1D分别能够使用一个摄像器18而分时地交替地取得干涉图像及荧光图像。由于用于干涉图像及荧光图像各自的摄影的曝光时间短，因此荧光测定装置1A、1B、1D分别能够大致同时地取得干涉图像及荧光图像。例如，荧光摄像所需要的曝光时间为几百毫秒～几秒左右，与此相对，干涉摄像所需要的曝光时间可小于100毫秒。可认为如果在荧光摄像之后紧接着进行干涉摄像或者在干涉摄像之后紧接着进行荧光摄像，则不会发生比荧光的曝光时间大的运动伪影，即使是分时摄像，实质上也可看作是大致同时摄像。
本实施方式的荧光测定装置只要是能够相对于大致相同的视野大致同时地取得干涉图像及荧光图像的结构即可。即，干涉图像取得部2中的双光束干涉仪也可以是迈克尔逊干涉仪及马赫曾德尔干涉仪的任一种。导入激发光的位置可以在双光束干涉仪之中，也可以在双光束干涉仪之外。也可以由一个摄像器交替地对干涉图像及荧光图像进行摄像，也可以相互分开地具备干涉图像取得用的摄像器和荧光图像取得用的摄像器。
另外，为了相对于大致相同的视野取得干涉图像及荧光图像，优选干涉图像取得部及荧光图像取得部各自的光学系统的一部分是共同的，但干涉图像取得部和荧光图像取得部也可以不具备光学系统的共同部分。只要即使干涉图像取得部和荧光图像取得部是分开的光学系统，也能够相对于大致相同的视野取得干涉图像及荧光图像即可。
接着，利用图8对从光源11输出的干涉观察用的光的波段、从激发光源31输出的激发光的波段、及通过激发光照射而由细胞73产生的荧光的波段之间的关系进行说明。图8是表示干涉观察用光、激发光及荧光各自的波段之间的关系的例子的图。通常，荧光波段位于比激发光波段更长的波长侧。
在图8的(a)所示的例子中，干涉观察用光的波段比荧光波段长，以可通过分光的方法来与荧光分离的程度远离荧光波段。在这种情况下，也能够使用一个摄像器而分时地交替地取得干涉图像及荧光图像，也优选使用两个摄像器而同时地取得干涉图像及荧光图像。
在图8的(b)所示的例子中，干涉观察用光的波段与荧光波段一部分重叠。在这种情况下，能够使用一个摄像器而分时地交替地取得干涉图像及荧光图像。由于能够使干涉图像和荧光图像之间的色差最小，因此优选。但是，无法使用两个摄像器而同时地取得干涉图像及荧光图像。
在图8的(c)所示的例子中，干涉观察用光的波段比激发光波段短，以可通过分光的方法来与激发光分离的程度远离激发光波段。在这种情况下，也能够使用一个摄像器而分时地交替地取得干涉图像及荧光图像，也能够使用两个摄像器而同时地取得干涉图像及荧光图像。但是，有时干涉图像和荧光图像之间的色差成为问题，在这种情况下，优选使用高精度地校正了色差的光学系统。
在图8的(d)所示的例子中，干涉观察用光的波段与激发光波段一部分重叠。在这种情况下，能够使用一个摄像器而分时地交替地取得干涉图像及荧光图像，但无法使用两个摄像器而同时地取得干涉图像及荧光图像。
接着，利用图9对本实施方式的荧光测定装置的动作及本实施方式的荧光测定方法的顺序进行说明。图9是对本实施方式的荧光测定装置的动作及本实施方式的荧光测定方法进行说明的时序图。该图表示光源11的光输出期间、激发光源31的激发光输出期间、摄像器的曝光期间、及干涉光的相位差(双光束干涉仪中的两个光束之间的相位差)的时间变化的例子。荧光测定方法具有干涉图像取得步骤、荧光图像取得步骤及运算步骤。该图表示使用一个摄像器而分时地交替地进行干涉图像取得步骤及荧光图像取得步骤时的动作例。
在干涉图像取得步骤中，光源11输出干涉观察用的光，激发光源31不输出激发光。干涉图像取得部2通过使用了压电元件21、光检测器22及相位控制电路23的反馈控制，从初始相位起各π/2地阶段性地设定干涉光的相位差，在各个阶段中，在使相位差在设定值稳定化了的状态下，由摄像器18对干涉图像I1～I5进行摄像。
在荧光图像取得步骤中，光源11不输出干涉观察用的光，激发光源31输出激发光。该期间的相位差处于不稳定的自由状态。荧光图像取得部3由摄像器18对荧光图像FL进行摄像。
通过交替地重复进行干涉图像取得步骤和荧光图像取得步骤，能够依次取得干涉图像I1～I5及荧光图像FL。另外，也可以根据需要，在针对某个视野进行干涉图像取得步骤及荧光图像取得步骤并取得了干涉图像及荧光图像之后，利用例如电动载物台使样本移动，并针对其他视野进行干涉图像取得步骤及荧光图像取得步骤而取得干涉图像及荧光图像。通过这样做，能够针对多个视野分别取得干涉图像及荧光图像。
在运算步骤中，运算部4基于由干涉图像取得部2取得的干涉图像I1～I5，通过上述的方法，求出光学厚度图像。然后，运算部4在共同地设定于荧光图像及光学厚度图像的双方的关注区域中，基于荧光图像的荧光强度的积分值和光学厚度图像的光学厚度的积分值，求出细胞的荧光表达率。
在运算步骤中，运算部4使用在干涉图像取得步骤及接下来的荧光图像取得步骤中取得的干涉图像及荧光图像，或者使用在荧光图像取得步骤及接下来的干涉图像取得步骤中取得的荧光图像及干涉图像，进行光学厚度图像的计算、关注区域的设定及荧光表达率的计算的各处理。运算步骤也可以与干涉图像取得步骤及荧光图像取得步骤的双方或任一方并行地进行。
下面，示出具体的实施例的结构及图像例并更详细地对实施方式进行说明。使用了图3所示的荧光测定装置1A的结构。作为光源11，使用中心波长525nm的LED。作为激发光源31，使用组合了中心波长475nm的LED和中心波长475nm且半值全宽25nm的光学滤光器而成的结构，对输出光进行了波段限制。分束器12的反射率和透过率之比为50：50。分束器17的反射率和透过率之比为20：80。分束器32的反射率和透过率之比为20：80。作为激发光截止滤光器33，使用截止波长500nm的长波长透过滤光器。
物镜13及物镜14各自的焦点距离为9mm。管透镜16的焦点距离为125mm。摄像器18的摄像元件尺寸为4.8mm×3.6mm。样本面上的视野尺寸为345.6μm×259.2μm。作为样本的细胞73，播种使用通过绿色荧光色素(green fluorescent protein、GFP)进行了荧光染色的来源于宫颈癌的培养细胞。取得干涉图像I1～I5时的时间间隔为67毫秒。取得各干涉图像时的曝光时间为0.5毫秒。取得荧光图像FL时的曝光时间为1500毫秒。
图10是表示由干涉图像取得部2取得的五个干涉图像I1～I5的图。图11是表示由运算部4基于图10的干涉图像I1～I5并利用(2)式而求出的相位图像Φ的图。图12是表示由运算部4基于图11的相位图像Φ并利用(3)式而求出的光学厚度图像OT的图。图13是表示由荧光图像取得部3取得的荧光图像FL的图。图14是表示在图12的光学厚度图像OT中对细胞区域进行分割处理后的光学厚度图像的图。这些图像是相同视野的图像。根据图14的分割处理后的光学厚度图像，能够明确地识别各个细胞的区域，在该图像的视野内可识别出26个细胞的存在。在图14中，对各个细胞标注编号(#1～#26)。
运算部4将各个对象物的区域设为关注区域(Region of Interest、ROI)。运算部4在共同地设定于光学厚度图像及荧光图像的双方的各ROI中，基于荧光图像的荧光强度的积分值和光学厚度图像的光学厚度的积分值，求出对象物的荧光表达率。
ROI内的平均光学厚度是ROI内的光学厚度积分值除以ROI的像素数所得的值，用下述(5)式表示。ROI内的平均荧光强度是ROI内的荧光强度积分值除以ROI的像素数所得的值，用下述(6)式表示。ROI内的“平均荧光强度/平均光学厚度”用下述(7)式表示。ROI内的“平均荧光强度/平均光学厚度”表示为ROI内的荧光强度积分值和光学厚度积分值之比。运算部4求出该(7)式所示的ROI内的荧光强度积分值除以光学厚度积分值所得的值来作为ROI内的对象物的荧光表达率的指标。
[数5]
[数6]
[数7]
图15是针对各细胞(各ROI)汇总面积、平均光学厚度、平均荧光强度及“平均荧光强度/平均光学厚度”的表。图16是表示各ROI的平均荧光强度的曲线图。图17是表示各ROI的“平均荧光强度/平均光学厚度”的曲线图。在图16及图17中，横轴为细胞的编号。
这里，例如，在单纯的基于平均荧光强度的评价中，#17的细胞被判定为在26个细胞中荧光属于第2强，GFP的表达较大。但是，在“平均荧光强度/平均光学厚度”的评价中，#17的细胞在26个细胞中仅为第12位的大小。
由于细胞的光学厚度与细胞的厚度大致成比例，因此表明光学厚度大的细胞在物理上也厚。在厚细胞中，因为荧光光子的量累计其厚度的量，所以在单纯的基于平均荧光强度的评价中，有可能被估计为比实际荧光色素的表达率相对高的表达率。与此相对，如果进行基于“平均荧光强度/平均光学厚度”的评价，则通过利用光学厚度将荧光强度标准化，能够更正确地估计荧光色素的表达率。
图18是在分割后的图像中用灰色表示1000ד平均荧光强度/平均光学厚度”为80以上的ROI，且用白色表示1000ד平均荧光强度/平均光学厚度”为80以下的ROI的图。这样，通过设定适当的阈值，并进行各ROI的“平均荧光强度/平均光学厚度”和阈值的大小比较，能够高精度地判定该ROI是阳性细胞及阴性细胞的哪一种。
本实施方式的荧光测定装置及荧光测定方法如果不仅是分别分离的细胞，而且将多个细胞的集合体即细胞团设为ROI，则基于其ROI的“平均荧光强度/平均光学厚度”，能够正确地求出细胞团的荧光表达率。细胞团是如菌落或球状体那样多个细胞集合而成的集合体。所谓菌落，典型上是多个细胞在空间上形成了一个细胞群的集团而成的。所谓球状体，典型上是细胞堆积至厚度100μm以上且变成球体状而成的细胞团。一个球状体典型地包含1000个～几万个细胞。
即使在细胞团中堆积有细胞，也可针对相同视野取得光学厚度图像(图19的(a))及荧光图像(图19的(b))，在这些图像中，在细胞团的区域设定ROI1～ROI3。于是，通过基于各ROI的“平均荧光强度/平均光学厚度”求出荧光表达率，能够判定各ROI的细胞团所含的各细胞是阳性细胞73p及阴性细胞73n的哪一种(图20)，另外，能够评价各ROI的细胞团中的阳性细胞及阴性细胞的混合比例。
此外，在如球状体那样的细胞团那样具有厚度的对象物中，通过激发光或荧光在该对象物内衰减，荧光强度有时不与厚度成比例。在这种情况下，优选利用厚度来校正荧光强度。
另外，本实施方式的荧光测定装置及荧光测定方法如果以包含容器内的细胞的全体的方式设定ROI，则能够基于其ROI的“平均荧光强度/平均光学厚度”，而正确地求出该容器内的细胞的全体的荧光表达率。例如，如果将多孔板的各个孔设为ROI，则不管各孔中存在的细胞的个数如何，均能够通过基于各ROI的“平均荧光强度/平均光学厚度”求出荧光表达率，来判定各ROI的细胞是阳性细胞及阴性细胞的哪一种，另外，能够评价各ROI中的阳性细胞及阴性细胞的混合比例。此外，为了针对多孔板的多个孔取得光学厚度图像及荧光图像，优选进行平铺摄影。
接着，对评价ROI中的阳性细胞及阴性细胞的混合比例的方法进行说明。在本实施方式中，关于例如抗原抗体反应等所希望的反应，即使阳性(positive)细胞及阴性(negative)细胞混合存在，也不细分细胞而能够评价阳性细胞及阴性细胞的混合比例。
即使是不呈现所希望的反应的阴性细胞，也有时通过自身荧光或或特异荧光色素的局部存在的影响，来观察某种程度的荧光。通过该自身荧光或非特异荧光色素的局部存在的影响，即使视野内的细胞全部是阴性细胞，也可观测到由荧光引起的光子。因此，阳性细胞及阴性细胞的混合比例不一定与荧光强度成比例。但是，在本实施方式中，如下所述，能够求出阳性细胞及阴性细胞的混合比例。
图21是示意性地表示阳性细胞及阴性细胞混合存在的视野的像的图。在该图中，阳性细胞用灰色区域来表示，阴性细胞用白色区域来表示。阳性细胞及阴性细胞也可以分别被单独地分离，还可以被堆积。在该图所示的例子中，在ROI1仅存在阳性细胞73p。在ROI2仅存在阴性细胞73n。在ROI3混合存在阳性细胞及阴性细胞，另外，细胞被堆积。在包含所有ROI1～ROI3的ROI0中混合存在阳性细胞及阴性细胞。针对这种视野，取得光学厚度图像及荧光图像。此外，该视野也可以是平铺多个摄像区域的视野并连接在一起而成的复合视野。
设定仅包含具有第一阈值以上的荧光表达率的第一对象物(阳性细胞)的第一关注区域(ROI1)，求出该ROI1内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值Rp(下述(8)式)。优选在ROI1内包含多个阳性细胞。另外，设定仅包含具有第二阈值以下的荧光表达率的第二对象物(阴性细胞)的第二关注区域(ROI2)，求出该ROI2内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值Rn(下述(9)式)。优选在ROI2内包含多个阴性细胞。此外，即使是明确的阴性细胞群，通过自身荧光等的影响，Rn也有可能具有非零的任一值，但通过以下所示的方法，能够校正该自身荧光等的影响，因此没有问题。
[数8]
[数9]
设定测定对象的关注区域(ROI0)，求出该ROI0内的荧光强度的积分值FLtotal除以光学厚度的积分值OTtotal所得的值Rmix(下述(10)式)。当设ROI0内的阳性细胞及阴性细胞的混合比例为x：(1-x)时，ROI0内的荧光强度的积分值FLtotal用下述(11)式表示。根据这些式，x用下述(12)式表示。由该(12)式可知，x相对于Rmix具有线性关系。如果ROI0内的所有细胞是阳性细胞，则Rmix＝Rp，x＝1。如果ROI0内的所有细胞是阴性细胞，则Rmix＝Rn，x＝0。
[数10]
[数11]
FLtotal＝OTtotal·x·Rp+OTtotal·(1-x)·Rn (11)
[数12]
这样，测定对象的关注区域(ROI0)中的阳性细胞及阴性细胞的混合比例根据表示仅包含阳性细胞的ROI1的“平均荧光强度/平均光学厚度”的Rp、表示仅包含阴性细胞的ROI2的“平均荧光强度/平均光学厚度”的Rn、及表示ROI0的“平均荧光强度/平均光学厚度”的Rmix来求出。
一直以来，为了在混合有阳性细胞及阴性细胞的样本中求出混合比例，需要细分细胞，其分割处理中的误差成为计数结果的较大的不确定因素。与此相对，在本实施方式中，即使不细分细胞，也能够估计出混合比例。这种优点特别是在估计如ROI0(或ROI3)那样阳性细胞及阴性细胞混合地集合而成的细胞团中的混合比例时是有用的。这是因为，在这种细胞集合化而成的细胞团中，细胞彼此大多上下重叠，因此难以细分细胞。
在本实施方式中，在对这种细胞团设定关注区域时，不需要以恰当地包围细胞团的方式设定。这是因为，在本实施方式中，必要的Rmix的值用(10)式表示，即使严格地取得ROI，另外，即使ROI超出实际的细胞团，也只是在(10)式的分母及分子均加上零的不同。
在本实施方式中，在计算混合比例时，优选每一个细胞的“平均荧光强度/平均光学厚度”在阳性细胞和阴性细胞之间明确地不同。因此，不优选应用到在反应过程中荧光强度随时间变化的那样的实验系统中。相反，本实施方式能够有效地应用于混合有不管是否表达荧光色素均发出自身荧光的细胞群和表达荧光色素的细胞群的样本。
另外，在本实施方式中，在无法忽略阳性细胞和阴性细胞之间的光学体积的差异的情况下，在分别对阳性细胞及阴性细胞预估每一个细胞的光学厚度的积分值即光学体积中，优选进行如下所述的运算。阳性细胞的光学体积平均值OVp用下述(13)式表示。阴性细胞的光学体积平均值OVn用下述(14)式表示。
[数13]
[数14]
当设ROI0所含的细胞的个数为n时，ROI0内的荧光强度的积分值FLtotal设为由阳性细胞引起的荧光强度积分值和由阴性细胞引起的荧光强度积分值之和，用下述(15)式来表示。另外，ROI0内的光学厚度的积分值OTtotal设为由阳性细胞引起的光学体积和由阴性细胞引起的光学体积之和，用下述(16)式来表示。
[数15]
FLtotal＝n·x·OVpRp+n·(1-x)·OVnRn (15)
[数16]
OTtotal＝n·x·OVp+n·(1-x)·OVn (16)
设阳性细胞的光学体积平均值OVp和阴性细胞的光学体积平均值OVn之比为α(下述(17)式)。这时，Rmix用下述(18)式表示。根据该式，x用下述(19)式表示。这里，当设α＝1时，该(19)式与(12)式一致。
[数17]
[数18]
[数19]
接着，利用图22及图23的流程图对本实施方式的荧光测定装置的动作及荧光测定方法的顺序进行说明。
图22是对判定是阳性细胞及阴性细胞的哪一种的顺序进行说明的流程图。在步骤S11中，基于由干涉图像取得部取得的干涉图像，取得光学厚度图像。在步骤S12中，由荧光图像取得部取得荧光图像。根据需要，在步骤S13中，也可以分别对光学厚度图像及荧光图像平铺多个视野。
在步骤S14中，设定ROI。ROI的设定可以手动进行，也可以由运算部4自动地进行。ROI的形状可以是任意的。ROI的设定也可以是整个视野、多孔板的各孔、各个细胞、及细胞团的任一种。在步骤S15中，求出各ROI的光学厚度积分值，在步骤S16中，求出各ROI的荧光强度积分值。在步骤S17中，关于各ROI，求出“平均荧光强度/平均光学厚度”，以此为荧光表达率的指标，判定是阳性细胞及阴性细胞的哪一种。于是，在步骤S18中，关于各ROI，也可以将“平均荧光强度/平均光学厚度”显示为数值，还可以显示利用“平均荧光强度/平均光学厚度”进行了色彩区分的图像。
图23是对评价阳性细胞及阴性细胞的混合比例的顺序进行说明的流程图。在步骤S21中，基于由干涉图像取得部取得的干涉图像，取得光学厚度图像。在步骤S22中，由荧光图像取得部取得荧光图像。根据需要，在步骤S23中，也可以分别对光学厚度图像及荧光图像平铺多个视野。
在步骤S24中，设定仅包含阳性细胞的ROI1，且设定仅包含阴性细胞的ROI2，另外，设定测定对象的关注区域(ROI0)。在步骤S25中，对ROI1计算Rp((8)式)。在步骤S26中，对ROI2计算Rn((9)式)。在步骤S27中，对ROI0计算Rmix((10)式)。然后，在步骤S28中，计算混合比例x((12)式)。也可以将该混合比例显示为数值，还可以用与混合比例相应的模拟彩色来显示图像。
接着，对各种变形例进行说明。本发明不限定于上述实施方式，可进行各种变形。
图24是对第一变形例的ROI设定方法进行说明的图。在该例中，分别在多孔板的6个孔中放有细胞，对各孔设定ROI。在ROI1的孔中仅放有阴性细胞73n。在ROI2的孔中仅放有阳性细胞73p。在测定对象的ROI3-1～4各自的孔中放有阴性细胞及阳性细胞的双方。阴性细胞及阳性细胞的混合比例也可以分别针对4个ROI3-1～4单独地求出，还可以针对综合4个ROI3-1～4而成的一个ROI来求出。
图25是对第二变形例的ROI设定方法进行说明的图。在该例中，在相互独立的6个容器(Dish1～6)中分别放有细胞，在各容器中设定ROI。在ROI1的容器(Dish1)中仅放有阴性细胞73n。在ROI2的容器(Dish2)中仅放有阳性细胞73p。在测定对象的ROI3-1～4各自的容器(Dish3～6)中放有阴性细胞及阳性细胞的双方。在该例中，阴性细胞及阳性细胞的混合比例也可以分别针对4个ROI3-1～4而单独地求出，还可以针对综合4个ROI3-1～4而成的一个ROI来求出。
图26是对第三变形例的ROI设定方法进行说明的图。在该例中，在多孔板的12个孔中分别放有细胞，对各孔设定ROI。在3个ROI1-1～3的孔中仅放有阴性细胞73n，也可以针对综合这些ROI1-1～3而成的一个ROI来求出Rn。在3个ROI2-1～3的孔中仅放有阳性细胞73p，也可以针对综合这些ROI2-1～3而成的一个ROI来求出Rp。在其他6个测定对象的ROI各自的孔中放有阴性细胞及阳性细胞的双方。阴性细胞及阳性细胞的混合比例也可以分别针对6个ROI而单独地求出，还可以针对综合这6个ROI而成的一个ROI来求出。
用于在干涉图像取得部中取得干涉图像的光源11也可以是激光光源，但优选为非相干光源。在使用激光光源作为光源11的情况下，通过激光的高干涉性，有时在取得的光学厚度图像的背景中产生不规则的散斑噪声，有可能成为ROI内的光学厚度积分值的误差的主要原因。与此相对，在使用非相干光源作为光源11的情况下，散斑噪声的发生得到抑制，ROI内的光学厚度积分值的误差小，因此优选。
另外，关于在原本不存在细胞的区域中观察到的那样的背景荧光，优选尽可能为零。为了实现这种条件，优选使用光学厚度图像的信息，将光学厚度图像中光学厚度大致为零的区域看作是荧光图像中荧光背景的区域，进行背景校正或阴影校正。
关于背景荧光成分的校正，也可以进行使用了荧光强度的积分值的校正来代替对图像的阴影校正。在使用荧光强度的积分值的情况下，设置不存在细胞的关注区域ROI0，在使ROI0的形状、面积及摄像时的条件与测量对象的ROI1～ROIn(在该ROI中也可以仅放入阳性细胞73p及阴性细胞73n的任一方，也可以混合存在双方)相同之后，预先求出ROI0中的荧光强度的积分值。在ROI0不包含细胞，但关于培养液及试剂，优选与测量对象的ROI同样地添加。在该条件中，关于在测量对象的ROI1～ROIn中计算出的荧光强度的ROI内积分值，如果将在ROI0中计算出的荧光强度的ROI内积分值作为背景荧光而减去之后，用于后级的处理，则能够进行背景荧光的校正。
另外，在求出荧光强度的ROI内积分值时，在ROI的大小与干涉摄像和荧光摄像所共用的摄像器18或荧光摄像专用的摄像器36的整个受光区域大致对应的情况下，也可以在荧光摄像时预先模拟地或数字地将摄像器18或摄像器36的像素整体合并，实质上与以整个受光区域为受光面的单一元件的受光器同样地使用，以所得到的值为荧光强度的ROI内积分值。在这种情况下，由于无法进行基于图像的背景校正或阴影校正，因此优选进行使用了作为不存在细胞的ROI的上述ROI0的背景荧光校正。
另外，在求出荧光强度的ROI内积分值时，在如图6所示的第二变形例的荧光测定装置1C那样与干涉图像取得用的摄像器18分开地还具备设置于荧光摄像面的荧光图像取得用的摄像器36的情况下，也可以将荧光图像取得用的摄像器36替换为单一元件的受光器。该单一元件的受光器中的受光面的位置及大小优选与投影到荧光摄像面的ROI的位置及大小大致一致。该单一元件的受光器是例如光电二极管、雪崩光电二极管、或者光电倍增管等。
在使该单一元件中的受光器的受光面的位置及大小与投影到荧光摄像面的ROI的位置及大小大致一致时，也可以在样本面和荧光摄像面之间设置缩小光学系统或放大光学系统，并适当地调节样本面和荧光摄像面之间的放大倍率或缩小倍率。另外，在ROI的形状和上述单一元件的受光器中的受光面的形状相互不同的情况下(例如在ROI为圆形，且该受光器的受光面为矩形的情况下)，也可以通过将具有物理性的遮光部的掩模设置于上述单一元件的受光器中的受光面之前，来使该单一元件的受光器中的受光面的位置及大小实质上与投影到荧光摄像面的ROI的位置及大小大致一致。
荧光测定装置及荧光测定方法不限定于上述实施方式及结构例，可进行各种变形。
上述实施方式的荧光测定装置采用如下结构：具备(1)荧光图像取得部、(2)干涉图像取得部、以及(3)运算部，该荧光图像取得部取得包含对象物的荧光图像；该干涉图像取得部取得包含对象物的干涉图像；该运算部基于由干涉图像取得部取得的干涉图像，求出光学厚度图像，在共同地设定于由荧光图像取得部取得的荧光图像及光学厚度图像的双方的关注区域中，基于荧光图像的荧光强度的积分值和光学厚度图像的光学厚度的积分值，求出对象物的荧光表达率。
在上述的荧光测定装置中，也可以采用如下结构：运算部将关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值作为关注区域内的对象物的荧光表达率的指标而求出。
在上述的荧光测定装置中，也可以采用如下结构：运算部基于仅包含具有第一阈值以上的荧光表达率的第一对象物的第一关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值、仅包含具有第二阈值以下的荧光表达率的第二对象物的第二关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值、及测定对象的关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值，求出测定对象的关注区域内的第一对象物及第二对象物的混合比例。
在上述的荧光测定装置中，也可以采用如下结构：运算部基于光学厚度图像来设定关注区域。
在上述的荧光测定装置中，也可以采用如下结构：运算部使用光学厚度图像的信息，对荧光图像进行背景校正及阴影校正，求出该校正后的荧光图像的荧光强度的积分值。
在上述的荧光测定装置中，也可以采用如下结构：干涉图像取得部使用非相干光来取得干涉图像。
在上述的荧光测定装置中，也可以采用如下结构：干涉图像取得部及荧光图像取得部各自的光学系统的至少一部分是共同的。
在上述的荧光测定装置中，也可以采用如下结构：荧光图像取得部取得包含对象物的集合体的荧光图像，干涉图像取得部取得包含集合体的干涉图像，运算部基于由荧光图像取得部取得的荧光图像中的集合体的荧光强度的积分值、根据由干涉图像取得部取得的干涉图像而求出的光学厚度图像中的集合体的光学厚度的积分值，求出集合体的荧光表达率。
上述实施方式的荧光测定方法采用如下结构：具备：(1)荧光图像取得步骤，其由荧光图像取得部取得包含对象物的荧光图像；(2)干涉图像取得步骤，其由干涉图像取得部取得包含对象物的干涉图像；(3)运算步骤，其基于由干涉图像取得部取得的干涉图像，求出光学厚度图像，在共同地设定于由荧光图像取得部取得的荧光图像及光学厚度图像的双方的关注区域中，基于荧光图像的荧光强度的积分值和光学厚度图像的光学厚度的积分值，求出对象物的荧光表达率。
在上述的荧光测定方法中，也可以采用如下结构：在运算步骤中，将关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值作为关注区域内的对象物的荧光表达率的指标而求出。
在上述的荧光测定方法中，也可以采用如下结构：在运算步骤中，基于仅包含具有第一阈值以上的荧光表达率的第一对象物的第一关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值、仅包含具有第二阈值以下的荧光表达率的第二对象物的第二关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值、及测定对象的关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值，求出测定对象的关注区域内的第一对象物及第二对象物的混合比例。
在上述的荧光测定方法中，也可以采用如下结构：在运算步骤中，基于光学厚度图像，设定关注区域。
在上述的荧光测定方法中，也可以采用如下结构：在运算步骤中，使用光学厚度图像的信息，对荧光图像进行背景校正及阴影校正，求出该校正后的荧光图像的荧光强度的积分值。
在上述的荧光测定方法中，也可以采用如下结构：在干涉图像取得步骤中，干涉图像取得部使用非相干光，取得干涉图像。
在上述的荧光测定方法中，也可以采用如下结构：干涉图像取得部及荧光图像取得部各自的光学系统的至少一部分是共同的。
在上述的荧光测定方法中，也可以采用如下结构：在荧光图像取得步骤中，由荧光图像取得部取得包含对象物的集合体的荧光图像，在干涉图像取得步骤中，由干涉图像取得部取得包含集合体的干涉图像，在运算步骤中，基于由荧光图像取得部取得的荧光图像中的集合体的荧光强度的积分值、根据由干涉图像取得部取得的干涉图像而求出的光学厚度图像中的集合体的光学厚度的积分值，求出集合体的荧光表达率。
在上述的荧光测定方法中，也可以采用如下结构：对象物为细胞。
在上述的荧光测定方法中，也可以采用如下结构：在荧光图像取得步骤中，由荧光图像取得部对在各孔放入了作为对象物的细胞的多孔板进行平铺摄影而取得荧光图像，在干涉图像取得步骤中，由干涉图像取得部对多孔板进行平铺摄影而取得干涉图像，在运算步骤中，分别在荧光图像及光学厚度图像中对多孔板的各孔设定关注区域。
产业上的可利用性
实施方式可作为能够正确地求出关注区域内的对象物的荧光表达率的荧光测定装置及荧光测定方法来利用。
符号的说明
1A～1D…荧光测定装置、2…干涉图像取得部、3…荧光图像取得部、4…运算部、5…时机控制电路、11…光源、12…分束器、13、14…物镜、15…参考镜、16…管透镜、17…分束器、18…摄像器、21…压电元件、22…光检测器、23…相位控制电路、31…激发光源、32…分束器、33…激发光截止滤光器、34…分色镜、35…荧光透过滤光器、36…摄像器、41…镜、42…分束器、70…容器、71…反射增强涂层、72…培养液、73…细胞。

Claims (38)

1.一种荧光测定装置，其中，
具备：
荧光图像取得部，其取得包含对象物的荧光图像；
干涉图像取得部，其取得包含所述对象物的干涉图像；
运算部，其基于由所述干涉图像取得部取得的干涉图像，求出光学厚度图像，在共同地设定于由所述荧光图像取得部取得的荧光图像及所述光学厚度图像的双方的关注区域中，基于所述荧光图像的荧光强度的积分值和所述光学厚度图像的光学厚度的积分值，求出所述对象物的荧光表达率，
所述运算部将所述关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值作为所述关注区域内的所述对象物的荧光表达率的指标而求出，
所述干涉图像取得部及所述荧光图像取得部各自的光学系统的至少一部分是共同的。
2.根据权利要求1所述的荧光测定装置，其中，
所述运算部基于仅包含具有第一阈值以上的荧光表达率的第一对象物的第一关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值、仅包含具有第二阈值以下的荧光表达率的第二对象物的第二关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值、及测定对象的关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值，求出所述测定对象的关注区域内的所述第一对象物及所述第二对象物的混合比例。
3.根据权利要求1所述的荧光测定装置，其中，
所述运算部基于所述光学厚度图像，设定关注区域。
4.根据权利要求2所述的荧光测定装置，其中，
所述运算部基于所述光学厚度图像，设定关注区域。
5.根据权利要求1所述的荧光测定装置，其中，
所述运算部使用所述光学厚度图像的信息对所述荧光图像进行背景校正及阴影校正，求出该校正后的荧光图像的荧光强度的积分值。
6.根据权利要求2所述的荧光测定装置，其中，
所述运算部使用所述光学厚度图像的信息对所述荧光图像进行背景校正及阴影校正，求出该校正后的荧光图像的荧光强度的积分值。
7.根据权利要求3所述的荧光测定装置，其中，
所述运算部使用所述光学厚度图像的信息对所述荧光图像进行背景校正及阴影校正，求出该校正后的荧光图像的荧光强度的积分值。
8.根据权利要求4所述的荧光测定装置，其中，
所述运算部使用所述光学厚度图像的信息对所述荧光图像进行背景校正及阴影校正，求出该校正后的荧光图像的荧光强度的积分值。
9.根据权利要求1所述的荧光测定装置，其中，
所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
10.根据权利要求2所述的荧光测定装置，其中，
所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
11.根据权利要求3所述的荧光测定装置，其中，
所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
12.根据权利要求4所述的荧光测定装置，其中，
所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
13.根据权利要求5所述的荧光测定装置，其中，
所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
14.根据权利要求6所述的荧光测定装置，其中，
所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
15.根据权利要求7所述的荧光测定装置，其中，
所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
16.根据权利要求8所述的荧光测定装置，其中，
所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的荧光测定装置，其中，
所述荧光图像取得部取得包含对象物的集合体的荧光图像，
所述干涉图像取得部取得包含所述集合体的干涉图像，
所述运算部基于由所述荧光图像取得部取得的荧光图像中的所述集合体的荧光强度的积分值、根据由所述干涉图像取得部取得的干涉图像而求出的光学厚度图像中的所述集合体的光学厚度的积分值，求出所述集合体的荧光表达率。
18.一种荧光测定方法，其中，
具备：
荧光图像取得步骤，其由荧光图像取得部取得包含对象物的荧光图像；
干涉图像取得步骤，其由干涉图像取得部取得包含所述对象物的干涉图像；
运算步骤，其基于由所述干涉图像取得部取得的干涉图像，求出光学厚度图像，在共同地设定于由所述荧光图像取得部取得的荧光图像及所述光学厚度图像的双方的关注区域中，基于所述荧光图像的荧光强度的积分值和所述光学厚度图像的光学厚度的积分值，求出所述对象物的荧光表达率，
在所述运算步骤中，将所述关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值作为所述关注区域内的所述对象物的荧光表达率的指标而求出，
所述干涉图像取得部及所述荧光图像取得部各自的光学系统的至少一部分是共同的。
19.根据权利要求18所述的荧光测定方法，其中，
在所述运算步骤中，基于仅包含具有第一阈值以上的荧光表达率的第一对象物的第一关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值、仅包含具有第二阈值以下的荧光表达率的第二对象物的第二关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值、及测定对象的关注区域内的荧光强度的积分值除以光学厚度的积分值所得的值，求出所述测定对象的关注区域内的所述第一对象物及所述第二对象物的混合比例。
20.根据权利要求18所述的荧光测定方法，其中，
在所述运算步骤中，基于所述光学厚度图像，设定关注区域。
21.根据权利要求19所述的荧光测定方法，其中，
在所述运算步骤中，基于所述光学厚度图像，设定关注区域。
22.根据权利要求18所述的荧光测定方法，其中，
在所述运算步骤中，使用所述光学厚度图像的信息对所述荧光图像进行背景校正及阴影校正，求出该校正后的荧光图像的荧光强度的积分值。
23.根据权利要求19所述的荧光测定方法，其中，
在所述运算步骤中，使用所述光学厚度图像的信息对所述荧光图像进行背景校正及阴影校正，求出该校正后的荧光图像的荧光强度的积分值。
24.根据权利要求20所述的荧光测定方法，其中，
在所述运算步骤中，使用所述光学厚度图像的信息对所述荧光图像进行背景校正及阴影校正，求出该校正后的荧光图像的荧光强度的积分值。
25.根据权利要求21所述的荧光测定方法，其中，
在所述运算步骤中，使用所述光学厚度图像的信息对所述荧光图像进行背景校正及阴影校正，求出该校正后的荧光图像的荧光强度的积分值。
26.根据权利要求18所述的荧光测定方法，其中，
在所述干涉图像取得步骤中，所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
27.根据权利要求19所述的荧光测定方法，其中，
在所述干涉图像取得步骤中，所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
28.根据权利要求20所述的荧光测定方法，其中，
在所述干涉图像取得步骤中，所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
29.根据权利要求21所述的荧光测定方法，其中，
在所述干涉图像取得步骤中，所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
30.根据权利要求22所述的荧光测定方法，其中，
在所述干涉图像取得步骤中，所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
31.根据权利要求23所述的荧光测定方法，其中，
在所述干涉图像取得步骤中，所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
32.根据权利要求24所述的荧光测定方法，其中，
在所述干涉图像取得步骤中，所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
33.根据权利要求25所述的荧光测定方法，其中，
在所述干涉图像取得步骤中，所述干涉图像取得部使用非相干光取得干涉图像。
34.根据权利要求18～33中任一项所述的荧光测定方法，其中，
在所述荧光图像取得步骤中，由所述荧光图像取得部取得包含对象物的集合体的荧光图像，
在所述干涉图像取得步骤中，由所述干涉图像取得部取得包含所述集合体的干涉图像，
在所述运算步骤中，基于由所述荧光图像取得部取得的荧光图像中的所述集合体的荧光强度的积分值、根据由所述干涉图像取得部取得的干涉图像而求出的光学厚度图像中的所述集合体的光学厚度的积分值，求出所述集合体的荧光表达率。
35.根据权利要求18～33中任一项所述的荧光测定方法，其中，
所述对象物为细胞。
36.根据权利要求34所述的荧光测定方法，其中，
所述对象物为细胞。
37.根据权利要求35所述的荧光测定方法，其中，
在所述荧光图像取得步骤中，由所述荧光图像取得部对在各孔放入了作为所述对象物的细胞的多孔板进行平铺摄影而取得荧光图像，
在所述干涉图像取得步骤中，由所述干涉图像取得部对所述多孔板进行平铺摄影而取得干涉图像，
在所述运算步骤中，分别在所述荧光图像及所述光学厚度图像中对所述多孔板的各孔设定关注区域。
38.根据权利要求36所述的荧光测定方法，其中，
在所述荧光图像取得步骤中，由所述荧光图像取得部对在各孔放入了作为所述对象物的细胞的多孔板进行平铺摄影而取得荧光图像，
在所述干涉图像取得步骤中，由所述干涉图像取得部对所述多孔板进行平铺摄影而取得干涉图像，
在所述运算步骤中，分别在所述荧光图像及所述光学厚度图像中对所述多孔板的各孔设定关注区域。
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