CN110114654B - 使用干涉条纹增强对比度并发现焦点的透射照明成像 - Google Patents

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Abstract

一种用于使用干涉条纹来增强对比度和/或发现焦点的透射照明系统和方法。在示例性方法中，可以通过散射和混合样品上游的光的至少一部分来降低所述光的相干性。可以使用降低相干性的光照射所述样品。可以检测所述样品的图像，所述图像是随着降低相干性的光的至少一部分穿过由所述样品限定的平面产生的。在所述样品被充分散焦以在所述图像中形成干涉条纹的情况下，可以执行所述检测的步骤。所述降低光的相干性的步骤可以使所述干涉条纹减弱。

Description

使用干涉条纹增强对比度并发现焦点的透射照明成像
相关申请
本申请要求于2016年10月26日提交的申请号为15/335,032的美国专利申请的优先权，所述申请的内容通过引用全部合并于此。
背景技术
可以使用成像显微镜来观察平面基片上支撑的一层生物细胞。显微镜可以被设计为执行透射照明成像，其中光传输通过细胞到达成像检测器。细胞可以在成像之前被染色或者可以不染色。
对细胞进行染色可以使细胞更容易检测，从而获得更好的图像质量。然而，大多数染色剂需要将细胞固定并因此细胞被杀死，这使得在需要细胞保持活力的情况下，这些染色剂是不合适的。已经开发出来了针对活体细胞的活力染色剂，但效用有限；活力染色剂选择性地仅对活体中的死细胞进行染色，或者会改变细胞生理机能。
对未染色的活体细胞进行成像通常是优选的。细胞可以直接成像，使得细胞的状态和它们的培养基(如果有的话)的组成受到最小的影响。然而，在未染色的情况下，细胞可能难以检测——细胞的边界和细胞中的细胞器，呈现较差的相对于背景的对比度，使得细胞和细胞的特征模糊不清。因此，以电子方式处理细胞的图像可能产生不准确的细胞参数(诸如，图像中存在的细胞数量)的值。可以通过成像显微镜利用光学技术(例如，相位对比度或微分干涉对比度(Nomarski))来改善对比度，但是这些技术大大增加了光学设计的成本和复杂性。因此，需要其他对未染色细胞进行成像的方法。
发明内容
本公开提供一种使用干涉条纹来增强对比度和/或发现焦点的透射照明系统和方法。在示例性方法中，可以通过散射和混合样品上游的光的至少一部分来降低所述光的相干性。可以使用降低相干性的光照射所述样品。可以检测所述样品的图像，所述图像是随着降低相干性的光的至少一部分穿过由所述样品限定的平面产生的。在所述样品被充分散焦以在所述图像中形成干涉条纹的情况下，可以执行所述检测的步骤。所述降低光的相干性的步骤可以使所述干涉条纹减弱。
附图说明
图1是检测使用非相干光照射的生物细胞的微弱图像的透射照明成像系统的示意图，其中细胞的焦点处于局部对比度最大值处，并且没有可见的干涉条纹。
图2是检测生物细胞图像的另一个透射照明成像系统的示意图，除了使用至少部分相干的光来照射细胞，该系统与图1所示相同，其中细胞的焦点处于局部对比度最大值处，并且具有大量可见的干涉条纹。
图3是根据本公开的各方面的检测生物细胞图像的示例性透射照明成像系统的示意图，除了使用相干等级介于图1和图2中间的光来照射细胞，该系统与图1和2所示相同，其中细胞的焦点处于局部对比度最大值处，可见的干涉条纹的数量介于图1和图2中间，使得图像的质量得到改善。
图4是根据本公开的各方面的检测生物细胞的改进图像的透射照明成像系统的示意图，除了照射光由两个光源产生之外，该系统与图3所示相同，其中使用与图3相同的、相干等级介于图1和2中间的光照射细胞。
图5是根据本公开的各方面的检测生物细胞的改善图像的透射照明成像系统的示意图，除了两个光源产生不同相干性的光，该系统与图4所示相同。
图6是根据本公开的各方面的检测生物细胞的改善图像的透射照明成像系统的示意图，除了没有将在细胞上游的照射光分裂成两个光束，该系统与图3所示相同。
图7是根据本公开的各方面的列出透射照明成像方法的示例性步骤的流程图。
图8是示出本公开的透射照明成像系统的焦点度量(即，对比度)和焦点位置之间的示例性关系的曲线图。
图9是根据本公开的各方面的具有图3的配置的示例性透射照明成像系统的更详细的示意图。
图10和11是根据本公开的方面的用于图6的透射照明成像系统的示例性照明子系统的更详细的示意图，其中示出了用于较低数值孔径照射(图10)的光路和用于较高数值孔径照射(图11)的光路。
图12是根据本公开的各方面的列出聚焦透射照明成像系统的方法的示例性步骤的流程图。
图13和14是使用图9的成像系统的工作模型检测的相同生物细胞场的图像，其中，生物细胞仅使用非相干光照射(图13)或使用非相干光与部分相干光的混合光照射(图14)。
图15和图16分别是根据本公开的各方面的使用图6的成像系统的工作模型检测的单层生物细胞的较低放大倍数和较高放大倍数图像，其中，成像系统配备有图10的照明子系统，并且漫射器被移除使得干涉条纹未被减弱。
图17和图18是使用与图16相同的工作模型、照射光路和放大倍数检测的单层生物细胞的图像，不同之处在于照明子系统的漫射器保持可操作地位于光学路径中。
图19是图17和图18中检测的生物细胞的另一图像，不同之处在于较低放大倍数。
图20是图19的图像的经处理的形式，其中，已经选择性地去除了高阶(高频)干涉条纹。
图21是根据本公开的各方面的在使用快速傅里叶变换(FFT)算法将每个图像变换到频域之后，在不同焦点位置处检测的相同生物细胞场的一系列图像。
图22是通过绘制来自图21的每个图像的对应区域的像素数据而生成的曲线图。
图23是由图22的曲线图限定的两个不同参数的曲线图并被绘制为焦点位置的函数。
具体实施方式
本公开提供了使用干涉条纹来增强对比度和/或找到焦点的透射照明成像的系统和方法。在示例性方法中，通过散射和混合至少一部分光，可以在样品的上游降低光的相干性。可以用相干性降低的光照射样品。可以检测样品的图像，其中，利用已经通过由样品限定的平面的相干性降低的至少一部分光来创建图像。可以在样品充分散焦的情况下执行图像检测，以在图像中形成干涉条纹。降低光的相干性的步骤可以减弱干涉条纹。
提供了一种用于透射照明成像的系统。该系统可包括用于产生至少部分相干的光的光源，以及用于支撑样品的载物台。该系统还可以包括漫射器、物镜、聚焦机构、成像检测器和处理器。漫射器可以可操作地设置在光源和载物台之间的光路中，并且可以被配置为通过散射和混合光源产生的光来降低入射在样品上的光的相干性。物镜可以被配置为收集已经通过由样品限定的平面的光。聚焦机构可以被配置为调整载物台和物镜之间的距离。成像检测器可以被配置为检测从物镜接收的光。处理器可以被配置为使聚焦机构充分地散焦样品，使得在由成像检测器收集的图像中形成干涉条纹。漫射器还可以被配置为减少但不完全消除干涉条纹的形成。
提供了一种聚焦成像系统的方法。在该方法中，可以检测样品的一个或多个图像。图像可以包含干涉条纹，并可以使用成像检测器被检测。可以将一个或多个图像中的每一个变换到频域。可以从每个变换后的图像获得一个或多个值。可以基于来自每个变换后的图像的一个或多个值来调整样品在成像检测器上的焦点。可以在调整后的焦点处检测样品的图像。
本公开的系统和方法相对于现有技术具有各种优点。优点可以包括以下的任何组合：(a)未染色的活体细胞的更清晰的图像、(b)更精确的细胞参数测量值、(c)经济且稳健的光学设计，和/或(d)基于更少的检测图像自动聚焦等。
在以下部分中描述了本公开的其他方面：(I)使用减弱的干涉条纹的透射照明成像系统，(II)使用减弱的干涉条纹的透射照明成像方法，(III)用于透射照明成像的示例性系统配置，(IV)使用变换后的图像自动聚焦的成像方法和(V)示例。
I.其中干涉条纹减弱的透射照明成像系统
该部分提供使用减弱的干涉条纹来增强对比度的示例性透射照明成像系统的概述；见图1到图6。图1和图2用于与图3到图6进行比较，并且没有使用减弱的干涉条纹。
图1示出了使用成像检测器56检测样品54(这里是生物细胞)的图像52的透射照明成像系统50。使用由非相干的光源58产生的光照射细胞。光遵循60指示的光路：从光源58通过细胞到达检测器56。由于使用非相干的光(由偏移、异相波形62示意性地表示)照射细胞，所以通过与细胞边缘和/或细胞中的细胞器(例如，细胞核)的相互作用产生的光不存在空间差异性干涉。因此，图像52中细胞相对于的背景具有低对比度，并且难以通过眼睛或通过对图像的数字处理可靠地识别细胞。
图2示出了使用成像检测器56检测样品54的图像72的另一个透射照明成像系统70。与图1的成像系统50相反，该系统使用至少部分相干的光源74产生的光(由同相波形76示意性地表示)照射细胞。细胞以及特别是细胞的外部和内部特征(例如，膜)对光的散射、折射和/或衍射导致产生干涉条纹78，相对于图1的图像52，干涉条纹78增加了图像72的对比度。然而，干涉条纹不仅包括最接近这些特征的一阶条纹，还包括更远离这些特征并且使图像的解释复杂化的二阶、三阶、四阶甚至更高阶条纹。干涉条纹可以通过相长干涉和/或相消干涉产生。
图3示出了检测图像82的示例性透射照明成像系统80，在图像82中，干涉条纹78存在但相对于图2的成像系统70被减弱。使用比图1更大的相干性并且比图2更小的相干性的光照射样品54的细胞，选择性地消除了比低阶条纹更微弱的高阶干涉条纹。结果，图像82更整洁，并且可以被数字处理以更准确地识别其细胞或特征。
成像系统80利用漫射器84产生中间相干性的光。由部分相干的光源74产生的光束在样品54的细胞的上游被分裂。分裂光束的一部分(由86表示)保持至少部分相干。分裂光束的另一部分(由88表示)与漫射器84相互作用以降低光的相干性。分裂光束的各部分在细胞处或细胞的上游重新组合。
图4示出了检测图像82的另一示例性透射照明成像系统90，在图像82中，如图3的成像系统80中那样，干涉条纹78存在但相对于图2的成像系统70被减弱。与如图3中分裂来自单个、至少部分相干的光源74的光束不同，成像系统90使用一对至少部分相干的光源74a、74b。来自光源74a的光遵循绕过漫射器84到达样品54的细胞的光路，而来自光源74b的光与漫射器84相互作用。不同相干性的两光束在细胞处或在细胞的上游组合以产生中间相干性的光束。
图5示出了检测图像82的另一示例性透射照明成像系统100，如在图3的成像系统80中那样，在图像82中，干涉条纹78存在但相对于图2的成像系统70被减弱。通过将由非相干的光源58产生的非相干的光束与由光源74产生的至少部分相干的光束组合来产生中间相干性的光束。
图6示出了检测图像82的另一示例性透射照明成像系统110，如在图3的成像系统80中那样，在图像82中，干涉条纹78存在但相对于图2的成像系统70被减弱。效率相对于漫射器84(例如，参见图3和图4)降低的局部漫射器84a位于光源74和样品54的细胞之间的光路中。漫射器84a降低但并非完全消除照射细胞的光的相干性。
II.使用衰减的干涉条纹透射照明成像的方法
该部分描述了使用减弱的干涉条纹来增加具有低阶条纹的对比度同时选择性地降低高阶条纹的可见度的透射照明成像方法；参见图7和图8。
图7示出了示例性成像方法120的流程图。在图7中呈现的和/或在本文中其他位置描述的步骤可以使用本公开的任何系统组合和特征以任何合适的顺序被执行。
如122处所示，可以产生光。可以使用一个或多个光源产生光。每个光源可以通过任何合适的机制(包括电致发光、受激发射、热辐射和/或光致发光等)产生光。因此，光源可以包括固态装置、激光器、弧光灯等。示例性固态装置包括半导体光源，诸如，发光二极管(LED)、超发光二极管和激光二极管等。由光源产生的光可以在时间上和空间上至少部分地相干。光可以具有至少约5μm、10μm、25μm、50μm或100μm等的相干长度。
如124处所示，可以降低产生的光的至少一部分的空间和/或时间相干性。可以使用至少一个漫射器(其为散射并混合光的任何光学元件)来降低相干性。例如，每个漫射器可以是反射光的反射漫射器、透过光的透射漫射器等。示例性的漫射器包括喷砂/磨砂玻璃漫射器、全息漫射器、乳白玻璃漫射器等。漫射器可以使光完全不相干或者可以降低但不完全消除光的相干性。
每个漫射器可以位于从光源到样品的光路中的任何合适的位置。漫射器可以仅位于从光源到样品的光路上，或者仅位于两个或更多个这样的光路中的一个上。因此，漫射器可以与仅由两个或更多个光源的子集产生的光相互作用，或者可以仅与分裂光束的一个分支相互作用等。
还可以通过对光进行光谱过滤(例如，使用带通滤波器)来增加至少一部分光的相干性。光可以在漫射器的上游和/或下游被过滤，或者在不包含漫射器的光路中被过滤(例如，如果光束被分裂或者使用了两个不同相干性的光源)。
如126处所示，可以使用降低了相干性的光照射样品。样品可以包括任何合适的组件、材料、物质、分离物、提取物、颗粒等。例如，样品可包括待成像的生物细胞。生物细胞可以是真核的或原核的，并且可以是活的或死的(例如，固定的)。示例性生物细胞包括已建立的细胞(细胞系)、原代细胞、组织样品的细胞、来自临床样品(例如，血液样品、液体抽吸物、组织切片等)的细胞、细菌细胞等。
样品可以由样品架保持，样品架是用于保持至少一个样品或任何在空间上隔离的样品阵列的任何装置。样品架可以提供具有至少一个水平的、面向上的表面区域的基片，样品的生物细胞可以搁置和/或附着在该表面区域上。样品架可以仅具有一个用于细胞附着的表面区域，或者具有彼此分开的多个表面区域或隔室。每个表面区域可包括涂层以促进细胞/组织附着，例如，涂层可以是例如聚赖氨酸、胶原等。涂层可以位于样品架的主体上，其可以由透明塑料或玻璃等形成。示例性样品架包括载玻片、培养皿、多孔板(例如，具有4、6、8、12、24、32、48或96个孔等)等。
如128处所示，可以检测包括减弱的干涉条纹的图像。(图像“检测”和图像“收集”在本公开中可互换使用。)可以通过使用漫射器降低样品上游的光的相干性、通过组合不同相干性的光束，或它们的组合等来使干涉条纹减弱。在一些实施例中，当收集图像时，较高阶的干涉条纹可能尚未被选择性地减弱，但是可以在收集之后通过对图像进行处理来衰减较高阶的干涉条纹，如下面进一步描述的。
可以使用成像检测器来检测图像，成像检测器是能够在整个检测区域检测光的空间变化(例如，强度变化)的任何装置。成像检测器可以是阵列检测器，诸如，电荷耦合器件(CCD)传感器、有源像素传感器(例如，互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器、N型金属氧化物半导体(NMOS)传感器等)等。成像检测器可以被配置为检测彩色图像、灰度(单色)图像或两者。
可以在样品充分散焦的情况下收集图像以产生干涉条纹。当焦点位置(例如，样品和物镜沿光轴相对彼此的位置(即，分离距离))从局部对比度最小值偏移时(诸如，位于局部对比度最大值处、与局部对比度最小值相比更接近局部对比度最大值、和/或处于局部对比度最大值和局部对比度最小值之间)，样品可以被散焦。这些拐点如图8所示。
图8示出了针对使用成像系统收集的透射照明图像将焦点度量(对比度)绘制为焦点位置的函数的曲线图，其中，成像系统使用至少部分相干的光照射样品。针对相同样品和视野检测到的图像的对比度随焦点位置而变化。更具体地，对比度可以具有至少一个局部最大值，诸如，局部对比度最大值130a、130b，以及位于对比度最大值之间的局部对比度最小值132。在不同焦点位置处测量的对比度的变化可以由干涉条纹的间隔和强度的变化而产生。条纹的可检测性在局部对比度最小值处局部地下降到低点并且在从局部对比度最小值开始的两个焦点方向上增加，直到达到最大值130a、130b。然后，随着焦点位置与局部对比度最小值的差异越大，可检测性逐渐降低。局部对比度最小值与每个对比度最大值之间的距离通常由系统的物镜的数值孔径限定。因此，一旦针对系统的给定物镜确定了这些距离中的至少一个(例如，凭经验或仅通过计算)，则可以基于针对样品和视野测量的局部对比度最小值的焦点位置来计算针对该样品和视野的对比度最大值的位置。
可以在一个或多个焦点位置处自动收集样品的一个或多个图像。可以在图像检测步骤128之前执行这些图像的收集，或者图像的收集可以通过获得足够质量/对比度的图像来执行图像检测步骤128，以用于方法120的一个或多个后续步骤。更具体地，如果一个或多个图像中的任何图像超过对比度阈值和/或在小于偏移局部对比度最大值的阈值处检测到一个或多个图像中的任何图像，则可以处理一个或多个图像以选择最高对比度的图像用于方法120的后续步骤。(可以使用一个或多个图像确定局部对比度最大值的焦点位置，并且因此可以确定每个图像的焦点位置与该最大值的偏移。)可选地或附加地，可以处理一个或多个图像以确定成像系统应自动调整到的焦点位置，用于随后执行图像检测步骤128。
一个或多个图像可以是在成像系统的一系列不同焦点位置处收集的一组图像。焦点位置可以由从物镜到样品的距离来限定，并且可以例如通过在样品保持静止时移动物镜而被改变、通过在物镜保持静止时移动样品而被改变，或者通过有差异地移动样品和物镜两者而被改变。焦点位置可以覆盖跨越至少一个局部对比度最大值和/或局部对比度最小值的范围。可以从图像中获得焦点度量的值，诸如，对比度。随着适当地配置成像检测器，改变焦点位置来聚焦(和散焦)样品。不同的焦点位置可以彼此均匀地间隔开。
在其他情况下，可以基于已经从空间域变换到频域的一个或多个收集的图像来确定用于图像检测步骤128的合适焦点位置。用于找到合适的焦点位置(并因此聚焦)的该方法的其他方面在本文中其他位置进行描述，诸如，下面的第IV部分和第V部分的实施例2中。
返回图7中的方法120，可以对在步骤128检测的图像进行数字处理。可以从图像中选择性地消除诸如高阶条纹的高频空间信息，以简化图像并促进进一步处理。例如，可以在图像的傅立叶变换等之后使用滚球算法执行该消除步骤。在一些实施例中，可以将图像从空间域变换到频域，根据频率进行滤波，然后变换回空间域。
如134处所示，可选地，在进行数字处理之后，图像可以被选择性地分割以选择性地消除高频条纹。分割可以是将图像划分为多个片段(像素组)的任何分割。该多个片段的至少一个子集可以对应于单个细胞、细胞组、细胞器(例如，细胞核)等。
如136处所示，可以使用分割图像来列举样品的一个方面，以提供该方面的值。该方面可以是，例如，许多细胞、细胞器、具有给定特征的细胞等。
III.透射照明成像的示例性系统配置
该部分描述了第I部分的透射照明成像系统的另外的示例性方面；参见图9-11。该部分中描述的任何组件和方面可被包括在第I部分的任何系统中或可以在本文其他位置地方进行描述，并且可以用于执行本文描述的任何方法。
图9示出了图3的透射照明成像系统80的示例性的、更详细的配置。成像系统80可以包括载物台140、照明子系统142、检测子系统144和控制/处理子系统146等。子系统142、144、146协同工作以实现样品54的透射照明成像。
载物台140被配置为支撑样品架148，样品架148又包含一个或多个样品54或以其他方式保持一个或多个样品54。样品可由载物台140和样品架148支撑在样品平面152(也称为样本平面)的检查区域150中，样品平面152可以平行于并选择性地靠近由系统(例如，由载物台)限定的xy平面(水平面)。载物台可以在检查区域150的正下方限定光学透明区域(例如，开口)，以允许使用位于样品平面152的相对侧的照明子系统142和检测子系统144来照射和检测样品。在其他实施例中，检测子系统144可以位于样品平面152上方，并且照明子系统142位于样品平面下方。
分别从光源74行进到样品54和从样品54行进到成像检测器56的光学辐射所遵循的示例光路以虚线箭头表示。术语“光学辐射”和“光”在本文中可互换使用，并且术语“光辐射”可以包括可见辐射、紫外辐射、红外辐射或其任何组合。
照明子系统142可以仅包括一个光源74或者可以包括具有多个光源的源组件以(通过可操作的关联光学器件的可选辅助)照射样品54。术语“照射”和“照亮”及其相应的形式具有相同的含义并且在本公开中可互换使用。在一些实施例中，两个或更多个光源可以使用不同相干性的光同时照射检查区域中的样品(也参见图4和5)。两个或更多个光源可以产生不同相干性的光并且/或者来自至少一个光源的光的相干性可以通过位于样品上游的一个或多个光学元件被修改。可选地或附加地，两个或更多个光源可以使用光谱不同的光照射样品。两个或更多个光源可以产生具有不同光谱的光和/或来自至少一个光源的光的光谱可以使用光谱滤光器在样品的上游被修改。
照明子系统142可以包括设置在光源74和检查区域150之间的光路中的一个或多个光学元件。光学元件可以是收集、引导和/或聚焦光和/或至少部分阻挡光的任何装置或结构。光学元件可以通过任何合适的机制起作用，诸如，反射、折射、散射、衍射、吸收和/或过滤等。示例性光学元件包括透镜、反光镜、漫射器、光栅、棱镜、滤光器、光圈、掩模、分束器、透射纤维(光纤)等。
照明子系统142可以使用分束器154将来自光源74的光辐射分裂为两部分或一对光束86、88。光束86被反射到反射漫射器84，其散射和混合光束86的光以减少其空间和时间相干性。漫射器84将光束86的至少一部分反射到分束器154，通过分束器154，光束的一部分穿过镜156、158的上游。光束86穿过光路上的样品54上游的透镜到达样品。与光束86相反，光束88穿过分束器154和透镜160，并被反光镜162反射回分束器。光束88的一部分被分束器154反射到透镜156、158，因此光束86的光(具有降低的相干性)与光束88的光组合，以产生照射样品54的具有中间相干性的组合光束。
检测子系统144包括成像检测器56和物镜164，物镜设置在从检查区域150到检测器的光路中。物镜164可包括收集来自样品的光并聚焦光以产生待检测的图像的任何光学元件或光学元件的组合以及任何相关联的支撑结构。物镜可以例如包括单个透镜、两个或更多个透镜、单个反光镜、两个或更多个反光镜等。物镜164可以提供任何合适的放大倍数，诸如，至少4X、10X、20X、50X或100X等。
控制/处理子系统146可以与系统80的装置的任何合适组合(诸如，光源74和成像检测器56)通信和/或可以控制系统80的装置的任何合适组合(诸如，光源74和成像检测器56)的操作。子系统146可以包括处理器166，其可以接收并处理来自成像检测器56的图像数据，并且可以控制成像检测器的操作，诸如，图像检测的定时。处理器166还可以控制聚焦机构168，其通过使物镜164和载物台140相对于彼此移动(例如，沿着z轴)改变物镜和载物台之间的距离来改变系统的焦点。处理器还可以控制载物台驱动机构，其在平行于样品平面152的两个维度上移动载物台。控制这些机构中的一个或两个可以允许系统自动化样品聚焦、对多个样品成像和/或对同一样品的多个视场成像。
处理器166可以由计算机提供。计算机可以包括显示器170、用户界面172、用于存储算法和数据的存储器等。
成像系统还具有驱动成像系统的每个装置(例如，每个光源、成像检测器、处理器、驱动机构等)的操作的电源。例如，功率可以是线路功率、电池功率或其组合。
图10和图11示出了图6的透射照明成像系统110的仅照明子系统142的示例性更详细的配置。照明子系统具有一对光源74a、74b，以经由不同的、部分重叠的光路照射样品，该不同的、部分重叠的光路分别用于较低数值孔径照射(图10)(用于使用具有较低数值孔径的物镜进行较低放大倍数成像)和较高数值孔径照射(图11)(用于使用具有较高数值孔径的物镜进行较高放大倍数成像)。
对光源74a通电产生至少部分相干的光，其穿过透射漫射器84a-1，以减少但不完全消除相干性。然后，上述光穿过透镜180，并被反光镜182反射到分束器184。部分光在到达样品之前穿过分束器和一对透镜186、188。
对光源74b通电产生至少部分相干的光，其穿过一对透射漫射器84-2和84a-3，以减少但不完全消除相干性。该一对漫射器可以比图10的光路中使用的单个漫射器更多地降低相干性。然后，光沿着光路穿过一对透镜190、192、被分束器184部分地反射，并在到达样品之前穿过透镜186、188。
IV.使用变换后的图像进行自动聚焦成像的方法
该部分描述了基于在频域中分析的干涉条纹进行自动聚焦成像的示例性方法200；参见图12。可以使用本文描述的任何系统组件和特征以任何合适的顺序和组合来执行图12中呈现的和/或本文其他位置描述的步骤。
如202处所示，可以照射样品。可以使用空间上和时间上至少部分相干的光照射样品，如上面第I部分和第II部分所述。
如204处所示，可以收集样品的至少一个图像。可以在样品充分散焦的情况下收集图像，使得干涉条纹存在于图像中。可以基于通过对不同样品(或同一样品的不同视场)进行成像或通过检测样品架上的参考标记等确定的焦点位置来为步骤204选择合适焦点位置或一系列焦点位置。
如206处所示，每个图像可以从空间域变换到频域。变换产生变换后的图像并且变换可以通过傅里叶变换算法来执行。
如208处所示，可以从每个变换后的图像获得一个或多个值。可以从整个变换后的图像或仅其一部分(例如，从图像中心径向延伸的部分)获得一个或多个值。在一些实施例中，当变换后的图像从图像的中心延伸到周边时，上述值中的一个可以与像素强度的变化率对应。在一些实施例中，上述值中的一个可以与从变换后的图像的中心径向地向外间隔开的第一局部强度最大值与位于中心和第一局部强度最大值中间的第一局部强度最小值之间的强度差对应。在任何情况下，一个或多个值可以将图像的焦点位置与对比度曲线(例如，对于示例性对比度曲线，参见图8)上的特定位置相关联。
如210处所示，可以测试每个值，以确定该值是否满足至少一个条件，如212处所示。例如，可以将该值与阈值或与从至少一个其他图像确定的至少一个值进行比较。如果该值不满足条件，则如214处所示，可以按需要基于该值调整系统的焦点。然后该方法可以循环回到步骤204，以收集在调整的焦点处的另一图像。可选地，如果该值满足条件，则如216处所示，可以选择图像用于进一步处理，以便从图像中确定样品的方面(例如，如上面针对图7所述)。
在其他实施例中，可以使用算法处理一个或多个值，该算法基于一个或多个值确定图像的焦点位置与用于透射照明成像的目标焦点位置如何不同。例如，如果目标焦点位置与局部对比度最大值130a(参见图8)对应，则可以在系统校准之后基于一个或多个值计算图像焦点位置和目标焦点位置之间的差。然后，系统可以通过相对于彼此移动载物台和物镜来自动地将焦点调整到目标焦点位置。方法200的其他方面在下面的第V部分的示例2中描述。
V.示例
以下示例描述了本公开的与透射照明成像系统和使用干涉条纹来增强对比度或找到焦点的方法相关的所选方面和实施例。这些系统和方法的任何合适的方面可以彼此组合并可以与本文其他位置描述的系统和方法组合(例如，在第I到第IV部分中)。包括这些实施例是为了说明，而不是为了限制或限定本公开的整个范围。
实施例1.生物细胞的示例性图像
该示例描述了使用第III部分的透射照明成像系统收集的示例性图像；见图13到图20(也见图9到图11)。
图13和14示出了使用图9的成像系统80的工作模型检测到的相同生物细胞场的图像。图13中的图像是在这种情况下检测到的：其中反光镜162被移除(参见图9)，使得仅使用不相干的光照射细胞。在图像中，细胞相对于背景被洗掉。由于对比度差，细胞边缘(其中细胞彼此接触)难以区分。图14中的图像是在这种情况下检测到的：其中反光镜162被可操作性地定位(参见图9)，使得使用非相干光和部分相干光的混合光照射细胞。在图像中，细胞与背景的对比度远高于图13，并且每个细胞的边界被更清楚地描绘。
图15和图16示出了使用成像系统110的工作模型(参见图10)(但是其中漫射器被移除使得干涉条纹未被减弱)检测到的CHO细胞的图像。图15的图像表示较低的放大倍数，并且由于透射照明光和在样品平面上投射阴影的板密封材料的衍射效应而表现出不均匀性。由于物镜的数值孔径限制和透射照明光在样品平面上方的位置处的折射，在图像的顶部存在空间分辨率的损失。图16的图像表示更高的放大倍数。图像中物体周围的环非常明显。特别是，从样品平面偏移的散焦物体在大量衍射条纹下是可见的。
图17和图18示出了使用成像系统110的工作模型(其与图16中相同，除了其中漫射器被可操作地定位使得干涉条纹被减弱但未完全消除)检测的CHO细胞的图像。图像质量明显好于没有条纹衰减的情况(与图16相比)。
图19是使用成像系统110的工作模型(其与图17和图18中相同，除了放大倍数较低)检测的CHO细胞的另一图像。使用低数值孔径照射产生的散焦图像具有增加的景深。细胞中可见的亮点是由于细胞核周围的优先衍射、折射和散射造成的。
图20示出了图19的图像的处理形式。应用了10像素半径的滚球算法，随后应用4-20像素的快速傅里叶变换带通滤波器。该处理选择性地从图像中去除高频干涉条纹，因此降低了图像的分辨率。然后使用标准阈值，因为快速傅里叶变换将通过空间频率对对象进行归一化。使用ImageJ软件计数细胞以确定具有散焦的核的近似大小的颗粒。
实施例2.校准自动聚焦的透射照明成像系统
该示例描述了具有基于图像到频域的变换的自动聚焦机制的透射照明成像系统的示例性校准数据；参见图21到图23。
图21示出了在不同焦点位置处检测到的生物细胞的相同场的一系列频率图像(衍射图案)，其中，使用至少部分相干的光照射细胞使得形成干涉条纹。使用成像检测器检测空间图像，然后使用快速傅立叶变换(FFT)算法将空间图形变换为频域中的频率图像。列出检测每个图像的、相对于透射成像的局部对比度最小值(0μm)的焦点位置。因此，图像A和图像B是在距离局部对比度最小值负焦点偏移的情况下被收集的，图像C是在局部对比度最小值处被收集，并且图像D是在距离局部对比度最小值正焦点偏移的情况下被收集。空间图像中的每个阶的干涉条纹在衍射图案中产生中心点(零阶)或对应的环(第一阶和更高阶)。
图22示出了通过针对图21的每个图像的对应区域将归一化强度绘制为到每个图像的中心的像素距离的函数而生成的曲线图。该区域由从每个图像的中心延伸的径向取向的矩形220界定。
图23示出了由图22的曲线图限定的并且被绘制为焦点位置的函数的两个不同参数的值的曲线图。参数中的一个是斜率，通常由图22中的线222表示。另一个参数是在一对拐点(即，局部最大值224和局部最小值226)之间的像素位置的差(“dx”)。在图23中，针对干涉条纹的可检测性处于局部最小值的焦点位置(0微米)，斜率接近于零，并且沿从该焦点位置开始的两个焦点方向变得更负。此外，像素位置的差dx在该焦点位置处显示局部最小值，并沿从该焦点位置开始的两个焦点方向增加。因此，可以操作算法以逐渐调整焦点(参见图12)，以使拐点之间的间隔最小化和/或使斜率最小化。
示例3.选择的实施例
该示例将本公开的所选实施例描述为一系列索引段落。
段落A1。一种透射照明成像方法，该方法包括：通过散射和混合样品上游的光的至少一部分来降低所述光的相干性；使用降低相干性的光照射所述样品；以及检测所述样品的图像，所述图像是随着降低相干性的光的至少一部分穿过由所述样品限定的平面产生的；其中，在所述样品被充分散焦以在所述图像中形成干涉条纹的情况下，执行所述检测的步骤，以及其中，降低的步骤减小所述干涉条纹的强度。
段落A2。段落A1的方法，使用光源产生所述光的至少一部分的步骤，其中，使用在所述光源和所述样品之间的光路中设置的漫射器至少部分地执行所述降低的步骤。
段落A3。段落A2的方法，其中所述降低的步骤包括使光通过所述漫射器的步骤和/或用所述漫射器反射光的步骤。
第A4段。段落A2或A3的方法，还包括以下步骤：形成光束；在所述漫射器的上游将所述光束分裂成一对光束，其中，所述一对光束中的仅一个光束入射在所述漫射器上；以及在所述漫射器的下游并在所述样品的上游将所述一对光束彼此组合。
段落A5。段落A1至A4中任一段的方法，其中，所述降低的步骤包括将彼此具有不同相干性的一对光束进行组合的步骤。
段落A6。段落A5的方法，其中，所述一对光束由至少两个光源产生。
段落A7。段落A5的方法，其中，所述一对光束是使用同一光源产生的。
段落A8。段落A1至A7中任一段的方法，还包括以下步骤：使用成像检测器收集所述样品的多个图像，并且其中所述样品和物镜相对于彼此设置在对应的多个不同焦点位置；计算所述多个图像中每一个的对比度；确定所述对比度具有局部最大值或局部最小值的焦点位置处的焦点位置；以及基于确定的焦点位置调整所述样品在所述图像检测器上的焦点，使得所述样品被充分散焦以在所述图像中形成干涉条纹；其中，使用调整后的焦点执行所述检测的步骤。
段落A9。段落A8的方法，其中，所述调整的步骤包括将所述焦点调整到所述局部对比度最大值的步骤。
段落A10。段落A8或A9的方法，其中，所述收集多个图像的步骤包括在所述样品保持静止时移动所述物镜以产生所述对应的多个不同焦点位置中的每一个的步骤。
段落A11。段落A1至A10中任一段的方法，其中，使用至少一个固态光源产生所述光。
段落A12。段落A11的方法，其中，仅使用一个固态光源产生所述光。
段落A13。段落A1至A12中任一段的方法，还包括：基于检测到的图像列举所述样品的样貌(aspect)的步骤。
段落A14。段落A13的方法，还包括：处理所述图像使得所述图像的分辨率被降低的步骤，其中，所述列举的步骤基于处理后的图像。
段落A15。段落A14的方法，其中，述干涉条纹包括一阶条纹和高阶条纹，其中，处理所述图像的步骤选择性地相对于所述一阶条纹消除所述高阶条纹。
段落A16。段落A14或A15的方法，其中，处理所述图像的步骤包括：将所述图像变换到频域的步骤、从变换后的图像中移除高频信息的步骤，以及将变换后的图像从频域逆变换到空间域的步骤。
段落A17。段落A14至A16中任一段的方法，还包括：分割处理后的图像的步骤，其中，列举的步骤基于分割后的图像。
段落A18。段落A1至A17中任一段的方法，其中，所述样品包括生物细胞。
段落A19。段落A1至A7或A11至A18中任一段的方法，还包括以下步骤：使用成像检测器收集所述样品的多个图像，所述样品和物镜相对于彼此设置在对应的多个不同焦点位置，其中，所述收集的步骤包括检测的步骤；计算所述多个图像中的每一个的对比度的步骤；基于所述图像中的一个图像的对比度选择所述一个图像的步骤；以及基于选择的图像列举所述样品的样貌。
段落B1。一种用于透射照明成像的系统，包括：光源，用于产生至少部分相干的光；载物台，用于支撑样品；漫射器，可操作性地设置在所述光源和所述载物台之间的光路中，所述漫射器被配置为通过散射和混合光来降低入射在所述样品上的光的相干性；物镜，用于收集穿过由所述样品限定的平面的光；聚焦机构，用于调整所述载物台和所述物镜之间的距离；成像检测器，被配置为检测从所述物镜接收的光；以及处理器，被配置为使所述聚焦机构对所述样品充分散焦，使得在由所述成像检测器收集的图像中形成干涉条纹；其中，所述漫射器被配置为减小但不完全消除所述干涉条纹的形成。
段落B2。段落B1的系统，其中，所述处理器被配置为降低所述图像的分辨率、分割降低分辨率的图像，以及使用分割后的图像列举所述样品的样貌。
段落B3。段落B1或B2的系统，其中处理器被配置为(a)使所述成像检测器收集多个图像，所述样品和物镜相对于彼此设置在对应的多个不同焦点位置；(b)计算所述多个图像中的每一个的对比度；(c)确定所述对比度具有局部最大值或局部最小值处的焦点位置；以及(d)基于确定的焦点位置调整所述样品在所述图像上的焦点，使得所述样品被充分散焦以在所述图像中形成干涉条纹。
段落C1。一种聚焦成像系统的方法，该方法包括：检测样品的一个或多个图像，其中，所述图像包括干涉条纹并使用成像传感器被检测；将所述一个或多个图像中的每一个变换到频域；从每一个变换后的图像中确定一个或多个值；基于来自每一个变换后的图像的所述一个或多个值调整所述样品在所述成像传感器上的焦点；以及在调整后的焦点处检测所述样品的图像。
段落C2。段落C1的方法，其中，所述变换步骤是使用傅立叶变换算法执行的。
段落C3。段落C1或C2的方法，其中，确定一个或多个值的步骤包括确定由每个变换后图像的至少一部分限定的斜率和/或至少一个拐点的步骤。
上述公开内容可涵盖具有独立效用的多个不同发明。尽管已经以其优选形式公开了这些发明中的每一个，但是如本文所公开和说明的本发明的具体实施例不应被视为具有限制意义，因为许多变化是可能的。本发明的主题包括本文公开的各种元件、特征、功能和/或性质的所有新颖和非显而易见的组合和子组合。以下权利要求特别指出了被视为新颖和非显而易见的某些组合和子组合。在要求来自该应用或相关申请的优先权的申请中可以要求保护在特征、功能、元件和/或属性的其他组合和子组合中体现的发明。这些权利要求，无论是针对不同的发明还是针对相同的发明，以及与原始权利要求的范围是否更宽、更窄、相同或不同，也被认为包括在本公开的发明的主题内。此外，除非另有具体说明，否则诸如第一、第二或第三的序数指示符用于区分元素，并且不指示这些元素的特定位置或顺序。

Claims (18)

1.一种用于对未染色的生物细胞进行透射照明成像的方法，所述方法包括：
通过散射和混合未染色的生物细胞的样品上游的光的至少一部分来降低所述光的相干性；
使用降低相干性的光照射所述样品；
检测所述样品的图像，所述图像是通过所述降低相干性的光的至少一部分穿过由所述样品限定的平面产生的，
其中，在所述样品被充分散焦以在所述图像中形成干涉条纹的情况下，执行所述检测的步骤，当所述样品和物镜沿光轴相对彼此的位置从局部对比度最大值偏移时，所述样品被散焦，以及
其中，降低的步骤减小所述干涉条纹的强度；
使用光源产生作为光束的所述光的至少一部分，其中，使用在所述光源和所述样品之间的光路中设置的漫射器至少部分地执行所述降低的步骤；
在所述漫射器的上游将所述光束分裂成一对光束，其中，所述一对光束中的仅一个光束入射在所述漫射器上；以及
在所述漫射器的下游并在所述样品的上游将所述一对光束彼此组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述降低的步骤包括光通过所述漫射器的步骤和/或所述漫射器反射光的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述降低的步骤包括将彼此具有不同相干性的一对光束进行组合的步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述一对光束由至少两个光源产生。
5.如权利要求3所述的方法，其中，所述一对光束是使用来自同一光源的光产生的。
6.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：
使用成像检测器收集所述样品的多个图像，并且其中所述样品和物镜相对于彼此设置在对应的多个不同焦点位置；
计算所述多个图像中每一个的对比度；
确定所述对比度具有局部最大值或局部最小值处的焦点位置；以及
基于确定的焦点位置调整所述样品在所述图像检测器上的焦点，使得所述样品被充分散焦以在所述图像中形成干涉条纹；
其中，使用调整后的焦点执行所述检测的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其中，调整焦点的步骤包括将所述焦点调整到所述局部对比度最大值的步骤。
8.如权利要求6所述的方法，其中，收集多个图像的步骤包括在所述样品保持静止时移动所述物镜以产生所述对应的多个不同焦点位置中的每一个的步骤。
9.如权利要求1所述的方法，其中，使用至少一个固态光源产生所述光。
10.如权利要求1所述的方法，还包括：基于检测到的图像列举所述样品的样貌的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，还包括：处理所述图像使得所述图像的分辨率被降低的步骤，其中，所述列举的步骤基于处理后的图像。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述干涉条纹包括一阶条纹和高阶条纹，其中，处理所述图像的步骤选择性地相对于所述一阶条纹消除所述高阶条纹。
13.如权利要求11所述的方法，其中，处理所述图像的步骤包括：将所述图像变换到频域的步骤、从变换后的图像中移除高频信息的步骤、以及将变换后的图像从频域逆变换到空间域的步骤。
14.如权利要求11所述的方法，还包括：分割处理后的图像的步骤，其中，列举的步骤基于分割后的图像。
15.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：
使用成像检测器收集所述样品的多个图像，所述样品和物镜相对于彼此设置在对应的多个不同焦点位置，其中，收集的步骤包括所述检测图像的步骤；
计算所述多个图像中的每一个的对比度；
基于所述多个图像中的一个图像的对比度选择所述一个图像；以及
基于选择的图像列举所述样品的样貌。
16.一种用于对未染色的生物细胞进行透射照明成像的系统，包括：
光源，适用于产生至少部分相干的光束；
载物台，用于支撑未染色的生物细胞的样品；
漫射器，可操作性地设置在所述光源和所述载物台之间的光路中，所述漫射器被配置为通过散射和混合所述光源产生的光来降低入射在所述样品上的光的相干性；
物镜，用于收集穿过由所述样品限定的平面的光；
聚焦机构，用于调整所述载物台和所述物镜之间的距离；
成像检测器，被配置为检测从所述物镜接收的光；以及
处理器，被配置为使所述聚焦机构对所述样品散焦，使得在由所述成像检测器收集的图像中形成干涉条纹，
其中，当所述样品和物镜沿光轴相对彼此的位置从局部对比度最大值偏移时，所述样品被散焦，
其中，所述漫射器被配置为减小但不完全消除所述干涉条纹的形成，
其中，在所述漫射器的上游将所述光束分裂成一对光束，
其中，所述一对光束中的仅一个光束入射在所述漫射器上，以及
其中，在所述漫射器的下游并在所述样品的上游将所述一对光束彼此组合。
17.如权利要求16所述的系统，其中，所述处理器被配置为降低所述图像的分辨率、分割降低分辨率的图像，以及使用分割后的图像列举所述样品的样貌。
18.如权利要求16所述的系统，其中，处理器被配置为使所述成像检测器收集多个图像，所述样品和物镜相对于彼此设置在对应的多个不同焦点位置；计算所述多个图像中的每一个的对比度；确定所述对比度具有局部最大值或局部最小值处的焦点位置；以及基于确定的焦点位置调整所述样品在所述图像上的焦点，使得所述样品被充分散焦以在所述图像中形成干涉条纹。
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