WO2019135311A1 - 蛍光測定装置および蛍光測定方法 - Google Patents

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WO2019135311A1
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image acquisition
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豊彦 山内
秀直 山田
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浜松ホトニクス株式会社
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    • G01N21/41—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
    • G01N21/45—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length using interferometric methods; using Schlieren methods

Definitions

  • the present disclosure relates to a fluorescence measurement apparatus and a fluorescence measurement method.
  • Non-Patent Document 1 uses a digital camera to acquire a fluorescence image including positive and negative cells for immunostaining contained in a blood sample, and based on this fluorescence image, Statistical analysis is performed.
  • a positive cell strongly emitting fluorescence is distinguished from a non-fluorescent (or weakly fluorescent) negative cell.
  • Patent Document 1 describes a technique for discriminating cells or cell populations using such fluorescence intensity as an indicator.
  • the conventional discrimination technology has the following problems. That is, in the conventional discrimination technology, accurate discrimination is difficult because only the fluorescence intensity in the fluorescence image is used as an index. Since a cell or cell population with a large thickness is a negative cell with a low expression rate of the fluorescent dye, fluorescence is integrated and observed for the thickness along the optical axis of the observation optical system, so the fluorescence intensity May be misjudged as a large positive cell. Conversely, even if the cells or cell populations with small thickness are positive cells with a high expression rate of the fluorescent dye, the amount of integrated fluorescence along the optical axis of the observation optical system is small, and thus the fluorescence intensity is negative. It may be misjudged as a cell.
  • the optical axis of the observation optical system is The integrated amount of fluorescence of the positive cells 73p along the line may be small, and the integrated amount of fluorescence of the negative cells 73n along the optical axis of the observation optical system may be large.
  • Embodiments aim at providing a fluorescence measurement device and a fluorescence measurement method capable of accurately determining the fluorescence expression rate of an object in a region of interest.
  • An embodiment is a fluorescence measurement device.
  • the fluorescence measurement apparatus includes: (1) a fluorescence image acquisition unit that acquires a fluorescence image including an object; (2) an interference image acquisition unit that acquires an interference image including an object; and (3) acquisition by an interference image acquisition unit
  • the optical thickness image is determined based on the interference image, and the integrated value of the fluorescence intensity of the fluorescence image in the region of interest commonly set for both the fluorescence image and the optical thickness image acquired by the fluorescence image acquisition unit
  • a computing unit for determining the fluorescence expression rate of the object based on the and the integral value of the optical thickness of the optical thickness image.
  • An embodiment is a fluorescence measurement method.
  • the fluorescence measurement method includes (1) a fluorescence image acquisition step of acquiring a fluorescence image including an object by a fluorescence image acquisition unit, and (2) an interference image acquisition step of acquiring an interference image including an object by an interference image acquisition unit , (3) A region of interest obtained by obtaining an optical thickness image based on the interference image acquired by the interference image acquisition unit and commonly set to both the fluorescence image and the optical thickness image acquired by the fluorescence image acquisition unit And calculating the fluorescence expression rate of the object based on the integral value of the fluorescence intensity of the fluorescence image and the integral value of the optical thickness of the optical thickness image.
  • the fluorescence expression rate of the object in the region of interest can be accurately determined.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the thickness of cells and the integrated amount of fluorescence.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the number of cells, the accumulated fluorescence amount, and the mixing ratio.
  • FIG. 3 is a diagram showing the configuration of the fluorescence measurement apparatus 1A.
  • FIG. 4 is a diagram showing the configuration of a sample.
  • FIG. 5 is a diagram showing the configuration of a fluorescence measurement apparatus 1B of a first modification.
  • FIG. 6 is a diagram showing the configuration of a fluorescence measurement apparatus 1C of the second modification.
  • FIG. 7 is a diagram showing the configuration of a fluorescence measurement apparatus 1D of a third modification.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the thickness of cells and the integrated amount of fluorescence.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the number of cells, the accumulated fluorescence amount, and the mixing ratio.
  • FIG. 3 is a diagram showing the configuration of the fluorescence measurement apparatus 1A.
  • FIG. 4 is
  • FIG. 8 is a diagram showing an example of the relationship between the wavelength bands for interference observation light, excitation light and fluorescence, where (a) the wavelength band of interference observation light is longer than the fluorescence wavelength band, (b) When the wavelength band of the interference observation light partially overlaps with the fluorescence wavelength band, (c) the wavelength band of the interference observation light is shorter than the excitation light wavelength band, and (d) the wavelength band of the interference observation light Shows a case where the excitation light wavelength band partially overlaps.
  • FIG. 9 is a timing chart for explaining the operation of the fluorescence measurement apparatus of the present embodiment and the fluorescence measurement method of the present embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram showing five interference images I1 to I5 acquired by the interference image acquisition unit 2.
  • FIG. 11 is a diagram showing a phase image ⁇ obtained by the calculation unit 4 using equation (2) based on the interference images I1 to I5 of FIG.
  • FIG. 12 is a view showing an optical thickness image OT obtained by the calculation unit 4 by the equation (3) based on the phase image ⁇ of FIG.
  • FIG. 13 is a view showing a fluorescence image FL acquired by the fluorescence image acquisition unit 3.
  • FIG. 14 is a diagram showing an optical thickness image after segmentation processing for a cell area in the optical thickness image OT of FIG.
  • FIG. 15 is a table summarizing area, average optical thickness, average fluorescence intensity and “average fluorescence intensity / average optical thickness” for each cell (each ROI).
  • FIG. 16 is a graph showing the average fluorescence intensity of each ROI.
  • FIG. 17 is a graph showing “average fluorescence intensity / average optical thickness” of each ROI.
  • FIG. 18 shows in gray the ROI with 1000 ⁇ “average fluorescence intensity / average optical thickness” of 80 or more in the image after segmentation, and 1000 ⁇ “average fluorescence intensity / average optical thickness” is 80 or less Is a diagram showing in white the ROI.
  • FIG. 19 schematically shows optical thickness and fluorescence images of a cell population, showing (a) optical thickness image and (b) fluorescence image.
  • FIG. 20 schematically shows a cell population consisting only of positive cells 73p and a cell population consisting only of negative cells 73n.
  • FIG. 21 is a view schematically showing an image of a visual field in which positive cells and negative cells are mixed.
  • FIG. 22 is a flow chart for explaining the procedure for determining whether the cell is a positive cell or a negative cell.
  • FIG. 23 is a flow chart illustrating a procedure for evaluating the mixing ratio of positive cells and negative cells.
  • FIG. 24 is a diagram for explaining the ROI setting method of the first modified example.
  • FIG. 25 is a diagram for explaining the ROI setting method of the second modified example.
  • FIG. 26 is a diagram for explaining the ROI setting method of the third modified example.
  • FIG. 3 is a diagram showing the configuration of the fluorescence measurement apparatus 1A.
  • the fluorescence measurement apparatus 1A includes an interference image acquisition unit 2, a fluorescence image acquisition unit 3, a calculation unit 4, and a timing control circuit 5. Parts of the optical systems of the interference image acquisition unit 2 and the fluorescence image acquisition unit 3 are common.
  • the interference image acquisition unit 2 includes a light source 11, a beam splitter 12, an objective lens 13, an objective lens 14, a reference mirror 15, a tube lens 16, a beam splitter 17, an imaging device 18, a piezo element 21, a photodetector 22, and a phase control circuit. Including 23.
  • the fluorescence image acquisition unit 3 includes an excitation light source 31, a beam splitter 32, a tube lens 16, an excitation light cut filter 33, and an imager 18.
  • the interference image acquisition unit 2 includes a Michelson interferometer as a two-beam interferometer, and acquires an interference image of one or more objects.
  • the fluorescence image acquisition unit 3 acquires a fluorescence image of an object.
  • the calculation unit 4 obtains an optical thickness image based on the interference image acquired by the interference image acquisition unit 2. Furthermore, in the region of interest set in common to both the fluorescence image acquired by the fluorescence image acquisition unit 3 and the optical thickness image, the calculation unit 4 calculates the integral value of the fluorescence intensity of the fluorescence image and the optical thickness image.
  • the fluorescence expression rate of the object is determined based on the integral value of the optical thickness.
  • the timing control circuit 5 controls the light output timing of each of the light source 11 and the excitation light source 31 and the exposure timing of the imaging device 18 to obtain interference image acquisition by the interference image acquisition unit 2 and fluorescence image acquisition by the fluorescence image acquisition unit 3 respectively. Control the timing of
  • target cells include cultured cells, immortalized cells, primary cultured cells, cancer cells, adipocytes, liver cells, cardiomyocytes, nerve cells, glial cells, somatic stem cells, embryonic stem cells, pluripotent stem cells, iPS Cells, and cell clusters (colony or spheroid) produced from the cells, and the like can be mentioned.
  • the object is not limited to a living body, and examples include industrial samples such as metal surface, semiconductor surface, glass surface, inside of semiconductor element, resin material surface, liquid crystal, polymer compound and the like.
  • the object is a cell 73 in the culture solution 72 contained in the container 70, as shown in FIG.
  • a reflection enhancing coating 71 is provided inside the bottom of the container 70 .
  • the light source 11 outputs light for interference observation.
  • the light source 11 outputs incoherent light.
  • the light source 11 is, for example, a lamp based light source such as a halogen lamp, a light emitting diode (LED) light source, a super luminescent diode (SLD) light source, an amplified spontaneous emission (ASE) light source, or the like.
  • the beam splitter 12 is optically coupled to the light source 11 to constitute a Michelson interferometer which is a two-beam interferometer.
  • the beam splitter 12 may be, for example, a half mirror in which the ratio of reflectance to transmittance is 50:50.
  • the beam splitter 12 splits the light output from the light source 11 into two light fluxes to be a first split light and a second split light.
  • the beam splitter 12 outputs the first branched light to the objective lens 13 and outputs the second branched light to the objective lens 14.
  • the beam splitter 12 receives the first branched light reflected by the reflection enhancing coating 71 and passed through the objective lens 13, and receives the second branched light reflected by the reference mirror 15 and passed through the objective lens 14. Then, the beam splitter 12 combines the input first branched light and the input second branched light, and outputs interference light to the tube lens 16.
  • the objective lens 13 is optically coupled to the beam splitter 12, and focuses the first branched light output from the beam splitter 12 on the cells 73 in the container 70.
  • the objective lens 13 also receives the first branched light reflected by the reflection enhancing coating 71 and outputs the first branched light to the beam splitter 12.
  • a beam splitter 32 is inserted in the optical path of the first split light between the beam splitter 12 and the objective lens 13.
  • the beam splitter 32 is optically connected to the excitation light source 31.
  • the beam splitter 32 is a part of the excitation light output from the excitation light source 31, the first branched light of the light output from the light source 11, and the fluorescence generated in the cells 73 irradiated with the excitation light. Reflect and let the rest pass.
  • the objective lens 13 condenses the excitation light that has arrived from the beam splitter 32 on the cells 73 in the container 70. Further, the objective lens 13 inputs the fluorescence generated in the cell 73 and outputs the fluorescence to the beam splitter 12. The beam splitter 12 outputs this fluorescence to the tube lens 16.
  • the objective lens 14 is optically coupled to the beam splitter 12 and condenses the second branched light output from the beam splitter 12 on the reflection surface of the reference mirror 15.
  • the objective lens 14 also receives the second branched light reflected by the reflection surface of the reference mirror 15 and outputs the second branched light to the beam splitter 12.
  • the tube lens 16 is optically coupled to the beam splitter 12 constituting the interference optical system, and images the interference light and the fluorescence output from the beam splitter 12 on the imaging surface of the imager 18 through the beam splitter 17.
  • the beam splitter 17 reflects a part of each of the interference light and the fluorescence and transmits the remaining part.
  • the ratio of the reflectance to the transmittance of the beam splitter 17 is, for example, 20:80.
  • the imager 18 is optically coupled to the beam splitter 17, receives the interference light arriving from the beam splitter 17 to acquire an interference image, and receives the fluorescence arriving from the beam splitter 17 to acquire a fluorescence image Do.
  • the imager 18 is an image sensor such as, for example, a CCD area image sensor and a CMOS area image sensor.
  • the excitation light cut filter 33 provided in front of the light receiving surface of the imaging device 18 selectively transmits interference light and fluorescence, and selectively blocks excitation light.
  • the piezo element 21 moves the reflective surface in a direction perpendicular to the reflective surface of the reference mirror 15.
  • the piezoelectric element 21 can adjust the optical path length difference (that is, the phase difference) between the two light beams in the two light beam interferometer by the movement of the reflection surface.
  • the piezo element 21 can determine the position of the reflection surface of the reference mirror 15 with a resolution less than the wavelength. In the two-beam interferometer, the optical path length difference between the two beams is variable.
  • the optical path length between the two light beams in the two light beam interferometer The difference is 2 (L1-L2). If this optical path length difference is equal to or less than the coherent length of the output light of the light source 11, the imager 18 can acquire a clear interference image. Assuming that the central wavelength of the output light of the light source 11 is ⁇ 0, the phase difference ⁇ between the two light beams in the two light beam interferometer is represented by the following equation.
  • the light detector 22 is optically coupled to the beam splitter 17, receives the interference light arriving from the beam splitter 17, and outputs a detection signal.
  • the photodetector 22 is, for example, a photodiode, an avalanche photodiode, or a photomultiplier, and may be a line sensor (linear sensor), a CCD area image sensor, a CMOS area image sensor, or the like.
  • the phase control circuit 23 is electrically connected to the light detector 22, and receives a detection signal output from the light detector 22.
  • the phase control circuit 23 is electrically connected to the piezo element 21 and controls the adjustment operation of the optical path length difference by the piezo element 21.
  • the phase control circuit 23 detects an optical path length difference between the two light beams in the two light beam interferometer based on the input detection signal. Then, the phase control circuit 23 controls the adjustment operation of the optical path length difference by the piezo element 21 by feedback control based on the detection result. As a result, the optical path length difference between the two light beams in the two-beam interferometer can be stabilized at the set value (locked state).
  • the interference image acquisition unit 2 can capture and acquire an interference image of the object (cell 73) with the image pickup device 18 in the locked state.
  • the fluorescence image acquisition unit 3 can capture and acquire a fluorescence image of an object (cell 73) by the imaging device 18.
  • the calculation unit 4 obtains an optical thickness image of the object based on the interference image acquired by the imaging device 18 of the interference image acquisition unit 2, and based on the optical thickness image and the fluorescence image, the inside of the region of interest is obtained. Determine the fluorescence expression rate of the object.
  • the calculation unit 4 may be a computer including a processor (for example, a CPU) such as a personal computer and a tablet terminal and a storage unit (for example, a RAM or a storage). Further, the computing unit 4 may be a microcomputer or an FPGA. In addition, the calculation unit 4 includes an input unit (keyboard, mouse, tablet terminal, etc.) for receiving an input from the operator, and a display unit (display, tablet terminal, etc.) for displaying an interference image, an optical thickness image, etc. You may have. In addition, it is preferable that the calculation unit 4 has a function of displaying an image or the like on the screen and receiving specification of the area by the operator on the screen.
  • a processor for example, a CPU
  • a storage unit for example, a RAM or a storage
  • the computing unit 4 may be a microcomputer or an FPGA.
  • the calculation unit 4 includes an input unit (keyboard, mouse, tablet terminal, etc.) for receiving an input from the operator, and a display unit (display, tablet
  • the operation of the interference image acquisition unit 2 is as follows.
  • the light output from the light source 11 is split into two light beams by the beam splitter 12 to be the first split light and the second split light, and the beam splitter 12 outputs the first split light and the second split light.
  • the first branched light output from the beam splitter 12 passes through the beam splitter 32 and is focused on the cells 73 in the container 70 by the objective lens 13, and is reflected by the reflection enhancing coating 71 provided inside the bottom of the container 70. Be done.
  • the first branched light reflected by the reflection enhancing coating 71 is input to the beam splitter 12 through the objective lens 13 and the beam splitter 32.
  • the second branched light output from the beam splitter 12 is focused by the objective lens 14 on the reflection surface of the reference mirror 15, and is reflected by the reflection surface.
  • the second branched light reflected by the reflection surface of the reference mirror 15 is input to the beam splitter 12 through the objective lens 14.
  • the first split light input from the objective lens 13 to the beam splitter 12 and the second split light input from the objective lens 14 to the beam splitter 12 are multiplexed by the beam splitter 12 and interference light from the beam splitter 12 Is output.
  • the interference light passes through the tube lens 16 and is branched into two by the beam splitter 17 and is received by the imaging device 18 and the light detector 22 respectively.
  • a detection signal is output from the light detector 22 that has received the interference light, and the phase control circuit 23 detects the difference in optical path length between the two light beams in the two light beam interferometer based on the detection signal.
  • the optical path length difference between the two light beams in the two light beam interferometer is stabilized at the set value (locked state).
  • An interference image is acquired by the imaging device 18 that receives the interference light in the locked state, and the interference image is output to the calculation unit 4.
  • the arithmetic unit 4 obtains an optical thickness image of the object (cell 73) based on the interference image.
  • the operation unit 4 obtains an optical thickness image from the plurality of interference images by the phase shift method. That is, the interference image acquisition unit 2 acquires the interference image in each state in a state in which the optical path length difference of the two-beam interferometer is stabilized with each of a plurality of different setting values.
  • the calculation unit 4 can obtain a phase image based on the plurality of interference images acquired by the interference image acquisition unit 2 (see Patent Document 2). Furthermore, the calculation unit 4 can obtain an optical thickness image from this phase image.
  • the interference image acquisition unit 2 stabilizes the phase difference of the interference light at a certain initial phase by feedback control using the piezo element 21, the light detector 22, and the phase control circuit 23, and stabilizes the phase difference.
  • the interference image I1 is acquired by the imaging device 18 in the state as described above.
  • the interference image acquisition unit 2 stabilizes the phase difference of the interference light at “initial phase + ⁇ / 2” using the piezo element 21, the light detector 22, and the phase control circuit 23, and stabilizes the phase difference.
  • the interference image I2 is acquired by the imaging device 18 in the state as described above.
  • the interference image acquisition unit 2 acquires the interference image I3 with the imaging device 18 in a state in which the phase difference of the interference light is stabilized at “initial phase + ⁇ ”, and the phase difference of the interference light is “initial phase + 3 ⁇
  • the interference image I4 is acquired by the imaging device 18 in a stabilized state at 1/2 ′ ′
  • the interference image I5 is acquired by the imaging device 18 in a state where the phase difference of the interference light is stabilized at “initial phase + 2 ⁇ ”.
  • the calculation unit 4 calculates the phase image ⁇ by performing the calculation of the following equation (2) using the five interference images I1 to I5. arg is an operator for acquiring the argument of a complex number. i is an imaginary unit. After performing the phase unwrapping process and the background distortion correction process on the phase image ⁇ , the calculation unit 4 obtains the optical thickness image by obtaining the optical thickness OT by the following equation (3). Each parameter appearing in these formulas is a function of the pixel position (x, y), and the calculation of these formulas is performed for each pixel.
  • a good (flat) background can be obtained by using a polynomial function (for example, Zernike polynomials) having x and y as variables.
  • high pass filtering may be performed if the spatial frequency of the distortion component in the background is sufficiently lower than the spatial frequency of the individual samples.
  • the flatness in the background of the optical thickness image is preferably less than 5 nm in standard deviation of the optical thickness.
  • the optical thickness OT represents the amount of phase change given to the light transmitted through the sample.
  • the thickness of the cells 73 is d, an average refractive index of the cells 73 and n c, and the refractive index of the culture solution 72 and n m, the optical thickness OT is given by the following equation.
  • the operation of the fluorescence image acquisition unit 3 is as follows.
  • the excitation light output from the excitation light source 31 is reflected by the beam splitter 32 and focused and irradiated onto the cells 73 in the container 70 by the objective lens 13.
  • the fluorescence generated in the cells 73 by the irradiation of the excitation light passes through the objective lens 13, the beam splitter 32, the beam splitter 12, the tube lens 16, the beam splitter 17 and the excitation light cut filter 33, and is received by the imager 18.
  • the imaging device 18 that has received this fluorescence can acquire a fluorescence image.
  • the calculation unit 4 inputs this fluorescence image.
  • FIGS. 5 to 7 The configuration of the fluorescence measurement apparatus (in particular, the configuration of the interference image acquisition unit and the fluorescence image acquisition unit) can be modified in various manners. Note that, in FIGS. 5 to 7 showing the configuration of the modified example, the operation unit and the timing control circuit are not shown, and the beam splitter 17 of the interference image acquisition unit, the photodetector 22 and the phase control circuit 23 are not shown. Illustration is also omitted.
  • the fluorescence measurement device 1B of the first modification example shown in FIG. 5 has substantially the same configuration of each of the interference image acquisition unit 2 and the fluorescence image acquisition unit 3 However, they differ in the position where the beam splitter 32 is inserted.
  • the beam splitter 32 is provided in the two-beam interferometer in the fluorescence measuring apparatus 1A shown in FIG. 3, whereas in the fluorescence measuring apparatus 1B of the first modification shown in FIG. It is provided outside the interferometer and on the optical path between the beam splitter 12 and the tube lens 16.
  • the fluorescence measurement apparatus 1C of the second modification shown in FIG. 6 differs from the configuration of the fluorescence measurement apparatus 1A shown in FIG. 3 in that it further includes a dichroic mirror 34 and a fluorescence transmission filter 35, and an interference image
  • an imaging device 36 for acquiring a fluorescence image is further provided separately from the imaging device 18 for acquisition.
  • the dichroic mirror 34 is optically coupled to the beam splitter 12 and inputs the interference light and the fluorescence output from the beam splitter 12.
  • the dichroic mirror 34 selectively reflects the interference light among the input interference light and the fluorescence, and selectively transmits the fluorescence.
  • the imaging device 18 for acquiring an interference image receives the interference light reflected by the dichroic mirror 34 to acquire an interference image.
  • the imaging device 36 for acquiring a fluorescence image receives fluorescence transmitted by the dichroic mirror 34 to acquire a fluorescence image.
  • a fluorescence transmission filter 35 provided in front of the light receiving surface of the imaging device 36 selectively transmits the fluorescence.
  • the fluorescence measurement apparatus 1D of the third modification shown in FIG. 7 is different in that it has a Mach-Zehnder interferometer as a two-beam interferometer as compared with the configurations of the fluorescence measurement apparatuses 1A to 1C so far.
  • the light for interference observation output from the light source 11 is split into two light beams by the beam splitter 12 to be a first split light and a second split light.
  • One branch light and second branch light are output.
  • the first branched light output from the beam splitter 12 is reflected by the mirror 41, passes through the cell 73, passes through the objective lens 13, and is input to the beam splitter 42.
  • the second branched light output from the beam splitter 12 is reflected by the reference mirror 15, passes through the objective lens 14, and is input to the beam splitter 42.
  • the first split light input from the objective lens 13 to the beam splitter 42 and the second split light input from the objective lens 14 to the beam splitter 42 are multiplexed by the beam splitter 42 and interference light from the beam splitter 42 Is output.
  • the interference light passes through the tube lens 16 and is received by the imaging device 18.
  • An interference image is obtained by the imaging device 18 that receives the interference light in a state (locked state) in which the optical path length difference between the two light beams in the two light beam interferometer is stabilized with the set value, and the interference image is output to the calculation unit 4 Ru.
  • the arithmetic unit 4 obtains an optical thickness image of the object (cell 73) based on the interference image.
  • the excitation light output from the excitation light source 31 is reflected by the beam splitter 42, and the cells 73 are focused and irradiated by the objective lens 13.
  • the fluorescence generated in the cells 73 by the irradiation of the excitation light passes through the objective lens 13, the beam splitter 42, the tube lens 16 and the excitation light cut filter 33, and is received by the imaging device 18.
  • the imaging device 18 that has received this fluorescence can acquire a fluorescence image.
  • the calculation unit 4 inputs this fluorescence image.
  • the ratio of reflectance to transmittance is, for example, 20:80.
  • the light for interference observation output from the light source 11 passes through a two-beam interferometer (Michelson interferometer or Mach-Zehnder interferometer), and Through the placed cells, an interference image is formed on the light receiving surface of the imaging device. Further, the fluorescence generated in the cells by the irradiation of the excitation light output from the excitation light source 31 forms a fluorescence image on the light receiving surface of the imaging device.
  • a two-beam interferometer Michelson interferometer or Mach-Zehnder interferometer
  • a part of the optical system of each of the interference image acquisition unit 2 and the fluorescence image acquisition unit 3 (especially the objective lens 13) is common, and an interference image and a fluorescence image are acquired for substantially the same field of view. can do.
  • the fluorescence measurement apparatus 1C according to the second modification includes the imaging device 18 for acquiring an interference image and the imaging device 36 for acquiring a fluorescence image separately from each other, so that an interference image and a fluorescence image can be simultaneously acquired.
  • the fluorescence measurement apparatus 1C of the second modification may not include the timing control circuit.
  • Each of the fluorescence measurement apparatuses 1A, 1B, and 1D can alternately acquire an interference image and a fluorescence image by time division using one image pickup device 18. Since the exposure time for capturing each of the interference image and the fluorescence image is short, each of the fluorometric devices 1A, 1B, and 1D can acquire the interference image and the fluorescence image substantially simultaneously. For example, while the exposure time required for fluorescence imaging is about several hundred milliseconds to several seconds, the exposure time required for interference imaging can be less than 100 milliseconds.
  • interference imaging is performed immediately after fluorescence imaging or fluorescence imaging is performed immediately after interference imaging, it is considered that a large motion artifact does not occur compared to the exposure time of fluorescence, and even time-division imaging is substantial Can be regarded as substantially simultaneous imaging.
  • the fluorescence measurement apparatus of the present embodiment only needs to have a configuration that can obtain an interference image and a fluorescence image substantially simultaneously for substantially the same field of view.
  • the two-beam interferometer in the interference image acquisition unit 2 may be either a Michelson interferometer or a Mach-Zehnder interferometer.
  • the position at which the excitation light is introduced may be inside or outside of the two-beam interferometer.
  • the interference image and the fluorescence image may be alternately picked up by one image pickup device, or the image pickup device for interference image acquisition and the image pickup device for fluorescence image acquisition may be separately provided.
  • each of the interference image acquisition unit and the fluorescence image acquisition unit is common.
  • the unit and the fluorescence image acquisition unit may not have a common part of the optical system. Even if the interference image acquisition unit and the fluorescence image acquisition unit are separate optical systems, it is only necessary to be able to acquire an interference image and a fluorescence image for substantially the same field of view.
  • FIG. 8 is a diagram showing an example of the relationship between the wavelength bands for interference observation light, excitation light and fluorescence.
  • the fluorescence wavelength band is on the longer wavelength side than the excitation light wavelength band.
  • the wavelength band of the light for interference observation is longer than the fluorescence wavelength band, and is separated from the fluorescence wavelength band to such an extent that the light can be separated from the fluorescence by the spectral method.
  • the wavelength band of the interference observation light partially overlaps the fluorescence wavelength band.
  • an interference image and a fluorescence image can be alternately acquired in time division using one imaging device. It is preferable because the chromatic aberration between the interference image and the fluorescence image can be minimized.
  • two imagers can not be used to simultaneously acquire an interference image and a fluorescence image.
  • the wavelength band of the interference observation light is shorter than the excitation light wavelength band, and is separated from the excitation light wavelength band to such an extent that it can be separated from the excitation light by the spectral method.
  • an interference image and a fluorescence image can be alternately acquired by time division using one imaging device, or an interference image and a fluorescence image can be simultaneously acquired using two imaging devices.
  • chromatic aberration between the interference image and the fluorescence image may be a problem, and in such a case, it is desirable to use an optical system in which the chromatic aberration is corrected with high accuracy.
  • the wavelength band of the interference observation light partially overlaps with the excitation light wavelength band.
  • an interference image and a fluorescence image can be alternately acquired by time division using one imaging device, an interference image and a fluorescence image can not be simultaneously acquired using two imaging devices.
  • FIG. 9 is a timing chart for explaining the operation of the fluorescence measurement apparatus of the present embodiment and the fluorescence measurement method of the present embodiment.
  • This figure shows the time change of the light output period of the light source 11, the excitation light output period of the excitation light source 31, the exposure period of the imager, and the phase difference of the interference light (phase difference between two light beams in the two light beam interferometer) An example is shown.
  • the fluorescence measurement method comprises an interference image acquisition step, a fluorescence image acquisition step and an operation step.
  • This figure shows an operation example in which an interference image acquisition step and a fluorescence image acquisition step are alternately performed in time division using one image pickup device.
  • the light source 11 outputs light for interference observation, and the excitation light source 31 does not output excitation light.
  • the interference image acquisition unit 2 sets the phase difference of the interference light in steps of ⁇ / 2 from the initial phase by feedback control using the piezo element 21, the light detector 22, and the phase control circuit 23, and
  • the interference images I1 to I5 are imaged by the imaging device 18 in a state in which the phase difference is stabilized to the set value.
  • the light source 11 does not output light for interference observation, and the excitation light source 31 outputs excitation light.
  • the phase difference during this period is in the unstable state free.
  • the fluorescence image acquisition unit 3 picks up the fluorescence image FL by the imaging device 18.
  • the interference images I1 to I5 and the fluorescence image FL can be acquired one after another.
  • an interference image acquisition step and a fluorescence image acquisition step are performed on a certain field of view to acquire an interference image and a fluorescence image, and then the sample is moved by, for example, a motorized stage to another field of view.
  • the interference image acquisition step and the fluorescence image acquisition step may be performed to acquire an interference image and a fluorescence image. By doing this, it is possible to acquire an interference image and a fluorescence image for each of a plurality of fields of view.
  • the calculation unit 4 obtains an optical thickness image by the above-described method based on the interference images I1 to I5 acquired by the interference image acquisition unit 2. Then, in the region of interest commonly set for both the fluorescence image and the optical thickness image, the calculation unit 4 calculates the integral value of the fluorescence intensity of the fluorescence image and the integral value of the optical thickness of the optical thickness image. Based on the expression rate of fluorescence of cells.
  • the calculation unit 4 uses the interference image acquisition step and the fluorescence image acquisition step subsequent thereto, using the interference image and the fluorescence image acquired, or the fluorescence image acquisition step and the interference image acquisition step subsequent thereto
  • the calculated fluorescence image and the interference image are used to calculate an optical thickness image, set a region of interest, and calculate a fluorescence expression rate.
  • the calculation step may be performed in parallel with either or both of the interference image acquisition step and the fluorescence image acquisition step.
  • the thing of the structure of the fluorescence measurement apparatus 1A shown by FIG. 3 was used.
  • An LED having a central wavelength of 525 nm was used as the light source 11.
  • the excitation light source 31 a configuration in which an LED with a central wavelength of 475 nm and an optical filter with a central wavelength of 475 nm and a full width at half maximum of 25 nm were combined was used.
  • the ratio of the reflectance to the transmittance of the beam splitter 12 was 50:50.
  • the ratio of the reflectance to the transmittance of the beam splitter 17 was 20:80.
  • the ratio of the reflectance to the transmittance of the beam splitter 32 was 20:80.
  • As the excitation light cut filter 33 a long wavelength transmission filter with a cutoff wavelength of 500 nm was used.
  • the focal length of each of the objective lens 13 and the objective lens 14 was 9 mm.
  • the focal length of the tube lens 16 was 125 mm.
  • the image pickup device size of the image pickup device 18 was 4.8 mm ⁇ 3.6 mm.
  • the field size at the sample surface was 345.6 ⁇ m ⁇ 259.2 ⁇ m.
  • As the cells 73 of the sample cultured cells derived from cervical cancer fluorescently stained with green fluorescent protein (GFP) were used by seeding.
  • the time interval for acquiring the interference images I1 to I5 was 67 milliseconds.
  • the exposure time at the time of acquiring each interference image was 0.5 milliseconds.
  • the exposure time at the time of acquiring the fluorescence image FL was 1500 milliseconds.
  • FIG. 10 is a diagram showing five interference images I1 to I5 acquired by the interference image acquisition unit 2.
  • FIG. 11 is a diagram showing a phase image ⁇ obtained by the calculation unit 4 using equation (2) based on the interference images I1 to I5 of FIG.
  • FIG. 12 is a view showing an optical thickness image OT obtained by the calculation unit 4 by the equation (3) based on the phase image ⁇ of FIG.
  • FIG. 13 is a view showing a fluorescence image FL acquired by the fluorescence image acquisition unit 3.
  • FIG. 14 is a diagram showing an optical thickness image after segmentation processing for a cell area in the optical thickness image OT of FIG. These images are of the same field of view. From the optical thickness image after the segmentation process in FIG. 14, the regions of individual cells can be clearly identified, and the presence of 26 cells can be recognized in the field of view of this image. In FIG. 14, individual cells are numbered (# 1 to # 26).
  • the operation unit 4 sets the region of each object as a region of interest (ROI).
  • the calculation unit 4 calculates the integrated value of the fluorescence intensity of the fluorescence image and the integrated value of the optical thickness of the optical thickness image in each of the ROIs commonly set for both the optical thickness image and the fluorescence image. Determine the fluorescence expression rate of the object.
  • the average optical thickness in the ROI is a value obtained by dividing the optical thickness integral value in the ROI by the number of pixels of the ROI, and is expressed by the following equation (5).
  • the average fluorescence intensity in the ROI is a value obtained by dividing the fluorescence intensity integral value in the ROI by the number of pixels of the ROI, and is expressed by the following equation (6).
  • “Average fluorescence intensity / average optical thickness” in the ROI is expressed by the following equation (7).
  • the "mean fluorescence intensity / mean optical thickness" in the ROI is expressed as the ratio of the fluorescence intensity integral value in the ROI to the optical thickness integral value.
  • the calculation unit 4 obtains a value obtained by dividing the fluorescence intensity integral value in the ROI represented by the equation (7) by the optical thickness integral value as an index of the fluorescence expression rate of the object in the ROI.
  • FIG. 15 is a table summarizing area, average optical thickness, average fluorescence intensity and “average fluorescence intensity / average optical thickness” for each cell (each ROI).
  • FIG. 16 is a graph showing the average fluorescence intensity of each ROI.
  • FIG. 17 is a graph showing “average fluorescence intensity / average optical thickness” of each ROI. In FIG. 16 and FIG. 17, the horizontal axis is the cell number.
  • # 17 cell is the second highest in 26 cells among the 26 cells, and that the expression of GFP is large, as assessed by the simple average fluorescence intensity.
  • # 17 cells are only the 12th size among 26 cells in the "average fluorescence intensity / average optical thickness" evaluation.
  • the optical thickness of cells is roughly proportional to the thickness of cells, it is suggested that cells with larger optical thickness are physically thicker. In thick cells, the amount of fluorescent photons is integrated by the amount of the thickness, so a mere average fluorescence intensity may estimate an expression rate relatively higher than the actual expression rate of the fluorescent dye. is there. On the other hand, if the “average fluorescence intensity / average optical thickness” is evaluated, it is possible to more accurately estimate the expression rate of the fluorescent dye by normalizing the fluorescence intensity by the optical thickness. Become.
  • FIG. 18 shows in gray the ROI with 1000 ⁇ “average fluorescence intensity / average optical thickness” of 80 or more in the image after segmentation, and 1000 ⁇ “average fluorescence intensity / average optical thickness” is 80 or less Is a diagram showing in white the ROI.
  • a cell population is a collection of multiple cells in a colony-like or spheroid-like manner.
  • a colony is typically one in which a plurality of cells form a spatially integrated group.
  • a spheroid is a cell population in which cells are stacked, typically in a thickness of 100 ⁇ m or more, and formed into a sphere. One spheroid typically contains 1000 to several tens of thousands of cells.
  • each cell included in the cell population of each ROI is either positive cell 73 p or negative cell 73 n Can be determined (FIG. 20), and the mixing ratio of positive cells and negative cells in the cell population of each ROI can be evaluated.
  • the fluorescence intensity may not be proportional to the thickness due to attenuation of excitation light or fluorescence in the object. In such a case, it is preferable to correct the fluorescence intensity by the thickness.
  • the container is determined based on the “average fluorescence intensity / average optical thickness” of the ROI.
  • the total fluorescence expression rate of the cells in the cells can be accurately determined. For example, if individual wells of a multi-well plate are taken as ROIs, the fluorescence expression rate is determined based on the “average fluorescence intensity / average optical thickness” of each ROI regardless of the number of cells present in each well. Then, it can be determined whether the cells of each ROI are positive cells or negative cells, and the mixing ratio of positive cells and negative cells in each ROI can be evaluated. In order to obtain an optical thickness image and a fluorescence image for a plurality of wells of a multiwell plate, tiling imaging is preferable.
  • the mixing ratio of positive cells and negative cells is not necessarily proportional to the fluorescence intensity.
  • the mixing ratio of positive cells and negative cells can be determined as follows.
  • FIG. 21 is a view schematically showing an image of a visual field in which positive cells and negative cells are mixed.
  • positive cells are shown in gray area and negative cells are shown in white area.
  • Each of the positive cells and the negative cells may be individually separated or stacked.
  • only positive cells 73p are present in ROI1.
  • Only negative cells 73 n are present in ROI2.
  • ROI3 is a mixture of positive cells and negative cells, and cells are stacked.
  • the ROI0 containing all of the ROI1 to ROI3 contains a mixture of positive cells and negative cells.
  • Optical thickness and fluorescence images are acquired for such fields of view. Note that this field of view may be a composite field of view in which the fields of view of a plurality of imaging regions are tiled and connected.
  • a first region of interest (ROI1) including only a first object (positive cell) having a fluorescence expression rate equal to or higher than a first threshold is set, and the integral value of the fluorescence intensity in this ROI1 is the integral value of the optical thickness
  • the value Rp divided by is obtained (the following equation (8)).
  • a plurality of positive cells are included in ROI1.
  • a second region of interest (ROI 2) including only the second object (negative cell) having a fluorescence expression rate equal to or lower than the second threshold is set, and the integral value of the fluorescence intensity in this ROI 2 is set to the optical thickness
  • a value Rn divided by the integral value is obtained (the following equation (9)).
  • a plurality of negative cells are included in the ROI2. Even in the negative cell group, Rn may have some non-zero value due to the influence of autofluorescence etc. However, the effect of autofluorescence etc can be corrected by the method described below So it doesn't matter.
  • a region of interest (ROI0) to be measured is set, and a value Rmix obtained by dividing the integral FLtotal of the fluorescence intensity in the ROI0 by the integral OTtotal of the optical thickness is determined (the following equation (10)).
  • the mixing ratio of positive cells and negative cells in ROI 0 is x: (1-x) 2
  • the integrated value FLtotal of the fluorescence intensity in ROI 0 is expressed by the following equation (11).
  • x is expressed by the following equation (12).
  • the mixing ratio of positive cells and negative cells in the region of interest (ROI 0) to be measured includes Rp representing "average fluorescence intensity / average optical thickness" of ROI 1 including only positive cells, and only negative cells. It is determined from Rn, which represents “average fluorescence intensity / average optical thickness” of ROI2, and Rmix, which represents "average fluorescence intensity / average optical thickness" of ROI0.
  • the necessary Rmix value is expressed by equation (10), and the denominator of equation (10) and the value of equation (10) can be obtained regardless of whether the ROI is strictly taken out of the actual cell population. This is because there is only a difference in whether or not zero is added to both numerators.
  • the “average fluorescence intensity / average optical thickness” per cell be clearly different between positive cells and negative cells. Therefore, application to an experimental system in which the fluorescence intensity changes temporally during the reaction is not desirable. Conversely, in the present embodiment, for a sample in which a cell group that emits autofluorescence despite not expressing a fluorescent dye and a cell group expressing a fluorescent dye are mixed, It can be applied usefully.
  • optical volume average value OVp of positive cells is represented by the following equation (13).
  • optical volume average value OVn of the negative cells is represented by the following equation (14).
  • the integrated value FLtotal of the fluorescence intensity in ROI0 is represented by the following equation (15) as the sum of the integrated fluorescence intensity by positive cells and the integrated fluorescence intensity by negative cells. Be done. Further, the integral value OTtotal of the optical thickness in the ROI 0 is represented by the following equation (16) as the sum of the optical volume by the positive cells and the optical volume by the negative cells.
  • the ratio of the optical volume average value OVp of positive cells to the optical volume average value OVn of negative cells is represented by ⁇ (the following equation (17)).
  • Rmix is expressed by the following equation (18).
  • x is expressed by the following equation (19).
  • ⁇ 1, this equation (19) matches the equation (12).
  • FIG. 22 is a flow chart for explaining the procedure for determining whether the cell is a positive cell or a negative cell.
  • step S11 an optical thickness image is acquired based on the interference image acquired by the interference image acquisition unit.
  • step S12 a fluorescence image acquisition unit acquires a fluorescence image. If necessary, in step S13, multiple fields of view may be tiled for each of the optical thickness image and the fluorescence image.
  • an ROI is set.
  • the setting of the ROI may be performed manually or may be performed automatically by the calculation unit 4.
  • the shape of the ROI may be arbitrary.
  • the setting of the ROI may be any of the whole field of view, each well of the multiwell plate, individual cells, and cell populations.
  • the optical thickness integral value of each ROI is determined
  • the fluorescence intensity integral value of each ROI is determined.
  • “average fluorescence intensity / average optical thickness” is determined for each ROI, and it is determined whether the cell is a positive cell or a negative cell, using this as an indicator of the fluorescence expression rate.
  • “average fluorescence intensity / average optical thickness” may be displayed as numerical values for each ROI, or an image color-coded by “average fluorescence intensity / average optical thickness” is displayed May be
  • FIG. 23 is a flow chart illustrating a procedure for evaluating the mixing ratio of positive cells and negative cells.
  • step S21 an optical thickness image is acquired based on the interference image acquired by the interference image acquisition unit.
  • step S22 a fluorescence image acquisition unit acquires a fluorescence image. If necessary, in step S23, multiple fields of view may be tiled for each of the optical thickness image and the fluorescence image.
  • step S24 an ROI 1 including only positive cells is set, an ROI 2 including only negative cells is set, and a region of interest (ROI 0) to be measured is set.
  • step S25 Rp (equation (8)) is calculated for ROI1.
  • step S26 Rn (equation (9)) is calculated for ROI2.
  • step S27 Rmix (equation (10)) is calculated for ROI0.
  • step S28 the mixing ratio x (equation (12)) is calculated.
  • the mixing ratio may be displayed as a numerical value, or the image may be displayed in a pseudo color according to the mixing ratio.
  • FIG. 24 is a diagram for explaining the ROI setting method of the first modified example.
  • cells are placed in each of six wells of the multiwell plate, and an ROI is set in each well. Only the negative cells 73 n are placed in the well of ROI 1. Only positive cells 73p are placed in the well of ROI2. In each well of ROIs 3-1 to 4 to be measured, both negative cells and positive cells are placed.
  • the mixing ratio of negative cells and positive cells may be individually determined for each of the four ROIs 3-1 to 4 or may be determined for one ROI integrated with the four ROIs 3-1 to 4.
  • FIG. 25 is a diagram for explaining the ROI setting method of the second modified example.
  • cells are placed in six containers (Dish1 to 6) independent of one another, and an ROI is set in each container. Only the negative cells 73 n are contained in the container of ROI 1 (Dish 1). Only positive cells 73p are contained in the container (Dish 2) of ROI2.
  • each container (Dish 3 to 6) of each of the ROIs 3-1 to 4 to be measured both negative cells and positive cells are placed.
  • the mixing ratio of negative cells and positive cells may be determined individually for each of the four ROIs 3-1 to 4 or for one ROI integrated with the four ROIs 3-1 to 4. May be
  • FIG. 26 is a diagram for explaining the ROI setting method of the third modified example.
  • cells are placed in each of the 12 wells of the multiwell plate, and an ROI is set in each well.
  • Only the negative cells 73n are put in the wells of the three ROIs 1-1 to 1-3, and Rn may be determined for one ROI obtained by integrating these ROIs 1-1 to 3.
  • Only positive cells 73p are placed in the wells of three ROIs 2-1 to 3, and Rp may be determined for one ROI integrated with these ROIs 2-1 to 3.
  • the wells of each of the other six ROIs to be measured contain both negative cells and positive cells.
  • the mixing ratio of negative cells and positive cells may be individually determined for each of these six ROIs, or may be determined for one ROI obtained by integrating these six ROIs.
  • the light source 11 used to acquire an interference image in the interference image acquisition unit may be a laser light source, but is preferably an incoherent light source.
  • a laser light source is used as the light source 11
  • irregular speckle noise may be generated in the background of the obtained optical thickness image due to the high coherence of the laser light, and the optical thickness within the ROI may be generated. It may be the cause of the error of the integral value.
  • an incoherent light source is used as the light source 11
  • generation of speckle noise is suppressed and an error in the optical thickness integral value in the ROI is small, which is preferable.
  • the background fluorescence as observed in the region where no cell is present is as zero as possible.
  • the region where the optical thickness is almost zero in the optical thickness image is the region of the background of fluorescence in the fluorescence image It is desirable that background correction and shading correction be performed.
  • the correction using the integral value of the fluorescence intensity may be performed.
  • a region of interest ROI0 where no cells exist is provided, and the shape, area, and conditions at the time of imaging of ROI0 are to be measured ROI1 to ROIn (in this ROI, positive cells 73p and negative cells).
  • the integral value of the fluorescence intensity in the ROI 0 is obtained in advance after making it identical to either one of 73n or both may be mixed.
  • ROI0 does not contain cells, it is desirable to add the medium and reagents as well as the ROI to be measured.
  • the integral value within the ROI of the fluorescence intensity calculated in the ROI1 to ROIn to be measured is subtracted as a background fluorescence, When used, it is possible to correct background fluorescence.
  • the ROI integral value of the fluorescence intensity in the case where the size of the ROI substantially corresponds to the entire light receiving area of the imaging device 18 shared for interference imaging and fluorescence imaging or the imaging device 36 exclusively for fluorescence imaging Obtained similarly to a single-element light receiver in which all pixels of the image pickup device 18 or the image pickup device 36 are binned in an analog or digital manner at the time of fluorescence imaging in an analog or digital manner,
  • These values may be used as the ROI integral value of the fluorescence intensity.
  • background correction and shading correction based on an image can not be performed, it is desirable to perform background fluorescence correction using the above-mentioned ROI 0 as a cell-free ROI.
  • a fluorescence image plane separately provided from the imaging device 18 for interference image acquisition may be replaced with a single-element light receiver. It is desirable that the position and size of the light receiving surface in the single-element light receiver be approximately the same as the position and size of the ROI projected on the fluorescence imaging surface.
  • the single-element light receiver is, for example, a photodiode, an avalanche photodiode, or a photomultiplier.
  • a reduction optical system is provided between the sample surface and the fluorescence imaging surface
  • a magnifying optical system may be provided to appropriately adjust the magnification or demagnification between the sample surface and the fluorescence imaging surface.
  • the position and size of the light receiving surface of the single element light receiver can be substantially projected onto the fluorescence imaging surface It may be made to substantially correspond to the position and size of.
  • the fluorescence measurement apparatus and the fluorescence measurement method are not limited to the above embodiment and configuration example, and various modifications are possible.
  • the fluorescence measurement apparatus includes (1) a fluorescence image acquisition unit that acquires a fluorescence image including an object, (2) an interference image acquisition unit that acquires an interference image including an object, and (3) an interference image An optical thickness image is obtained based on the interference image acquired by the acquisition unit, and the fluorescence image of the fluorescence image is obtained in the region of interest commonly set for both the fluorescence image acquired by the fluorescence image acquisition unit and the optical thickness image. And a calculation unit for obtaining the fluorescence expression rate of the object based on the integral value of the intensity and the integral value of the optical thickness of the optical thickness image.
  • the computing unit is configured to obtain a value obtained by dividing the integral value of the fluorescence intensity in the region of interest by the integral value of the optical thickness as an indicator of the fluorescence expression rate of the object in the region of interest. Also good.
  • the operation unit divides the integral value of the fluorescence intensity in the first region of interest including only the first object having the fluorescence expression rate equal to or more than the first threshold value by the integral value of the optical thickness.
  • the mixing ratio of the first object and the second object in the region of interest to be measured may be determined based on a value obtained by dividing the integral value of the fluorescence intensity in the region of interest by the integral value of the optical thickness.
  • the computing unit may be configured to set the region of interest based on the optical thickness image.
  • the calculation unit performs background correction and shading correction on the fluorescence image using the information of the optical thickness image, and obtains the integral value of the fluorescence intensity of the fluorescence image after the correction. Also good.
  • the interference image acquisition unit may be configured to acquire an interference image using incoherent light.
  • At least a part of the optical systems of the interference image acquisition unit and the fluorescence image acquisition unit may be common.
  • the fluorescence image acquisition unit acquires a fluorescence image including a collection of objects
  • the interference image acquisition unit acquires an interference image including the collection
  • the calculation unit is a fluorescence image acquisition unit Integration of the fluorescence intensity of the assembly among the fluorescence images acquired by the above and the integration of the optical thickness of the assembly among the optical thickness images obtained from the interference image acquired by the interference image acquisition unit
  • the configuration may be such that the fluorescence expression rate of the aggregate is obtained based on the value.
  • an operation step of obtaining the fluorescence expression rate of the object based on the integral value of the fluorescence intensity of the fluorescence image and the integral value of the optical thickness of the optical thickness image.
  • the calculation step is performed to obtain a value obtained by dividing the integral value of the fluorescence intensity in the region of interest by the integral value of the optical thickness as an indicator of the fluorescence expression rate of the object in the region of interest. Also good.
  • the integral value of the fluorescence intensity in the first region of interest including only the first object having the fluorescence expression rate equal to or more than the first threshold is divided by the integral value of the optical thickness.
  • the mixing ratio of the first object and the second object in the region of interest to be measured may be determined based on a value obtained by dividing the integral value of the fluorescence intensity in the region of interest by the integral value of the optical thickness.
  • the region of interest may be set based on the optical thickness image in the calculation step.
  • the interference image acquisition unit may acquire the interference image using incoherent light in the interference image acquisition step.
  • At least a part of the optical systems of the interference image acquisition unit and the fluorescence image acquisition unit may be common.
  • a fluorescence image including an aggregate of objects is acquired by the fluorescence image acquisition unit
  • an interference image including the aggregation is acquired by the interference image acquisition unit
  • the integral value of the fluorescence intensity of the assembly among the fluorescence images acquired by the fluorescence image acquisition unit and the optical thickness image obtained from the interference image acquired by the interference image acquisition unit The fluorescence expression rate of the assembly may be determined based on the integral value of the optical thickness of the assembly.
  • the target may be a cell.
  • a multi-well plate in which cells as an object are placed in each well is tiled by the fluorescence image acquisition unit to acquire a fluorescence image
  • the multiwell plate may be tiled by the interference image acquisition unit to acquire an interference image
  • the region of interest may be set in each well of the multiwell plate in each of the fluorescence image and the optical thickness image.
  • the embodiment can be used as a fluorescence measurement apparatus and a fluorescence measurement method capable of accurately determining the fluorescence expression rate of an object in a region of interest.
  • 1A to 1D fluorescence measuring apparatus
  • 2 interference image acquiring unit
  • 3 fluorescence image acquiring unit
  • 4 arithmetic unit
  • 5 timing control circuit
  • 11 light source
  • 12 beam splitter
  • 13 objective lens
  • 15 ... reference mirror
  • 16 ... tube lens
  • 17 ... beam splitter
  • 18 ... imager
  • 21 ... piezo element
  • 22 ... photodetector
  • 23 ... phase control circuit
  • 34 dichroic mirror
  • 35 fluorescence transmission filter
  • 36 image pickup device
  • 41 mirror
  • 42 beam splitter
  • 70 container
  • 71 reflection enhancing coating
  • 72 culture solution
  • 73 cell.

Abstract

蛍光測定装置１Ａは、対象物を含む蛍光画像を取得する蛍光画像取得部３、対象物を含む干渉画像を取得する干渉画像取得部２、および、演算部４を備える。演算部４は、干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、蛍光画像取得部により取得された蛍光画像および光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて対象物の蛍光発現率を求める。これにより、関心領域内の対象物の蛍光発現率を正確に求めることができる蛍光測定装置および蛍光測定方法が実現される。

Description

蛍光測定装置および蛍光測定方法
　本開示は、蛍光測定装置および蛍光測定方法に関するものである。
　蛍光顕微鏡により取得した細胞集団の蛍光画像において蛍光輝度が高い細胞と蛍光輝度が低い細胞とを分類して統計解析する手法が知られている。例えば、非特許文献１に記載された技術は、血液サンプル中に含まれる免疫染色に対しポジティブな細胞とネガティブな細胞とを含む蛍光画像をデジタルカメラにより取得し、この蛍光画像に基づいて分類・統計解析を行っている。この従来技術では、蛍光画像における蛍光強度に基づいて、蛍光を強く発しているポジティブ細胞と、蛍光を発していない（または蛍光が弱い）ネガティブ細胞とを弁別する。
　すなわち、免疫染色等の手法により細胞集団を染色した際に、蛍光強度が閾値以上である細胞（ポジティブ細胞）は所望の抗原抗体反応を呈示していると判定し、蛍光強度が閾値以下である細胞（ネガティブ細胞）は所望の抗原抗体反応を呈示していないと判定する。この判定結果に基づいて、細胞集団のうち所望の抗原抗体反応を呈示した細胞の割合を計算することができる。このような蛍光強度を指標として細胞または細胞集団を弁別する技術が特許文献１に記載されている。
特開２００７－２０４２２号公報 国際公開第２０１６／１２１２５０号
Benjamin R. Lee et al., "A Digital Image Microscopy System for Rare-Event Detection Using Fluorescent Probes", Cytometry 10, 1989, pp.256-262
　本発明者は、従来の弁別技術が次のような問題を有していることを見出した。すなわち、従来の弁別技術では、蛍光画像における蛍光強度のみを指標としていることから、正確な弁別が困難である。厚さが大きい細胞または細胞集団は、蛍光色素の発現率が低いネガティブ細胞であっても、観察光学系の光軸に沿った厚さ分だけ蛍光が積算されて観察されることから、蛍光強度が大きいポジティブ細胞であると誤判定される場合がある。逆に、厚さが小さい細胞または細胞集団は、蛍光色素の発現率が高いポジティブ細胞であっても、観察光学系の光軸に沿った蛍光の積算量が少ないことから、蛍光強度が小さいネガティブ細胞であると誤判定される場合がある。
　例えば、図１に示されるように、蛍光色素の発現率が高いポジティブ細胞７３ｐの厚さが小さく、蛍光色素の発現率が低いネガティブ細胞７３ｎの厚さが大きいと、観察光学系の光軸に沿ったポジティブ細胞７３ｐの蛍光の積算量が少なく、観察光学系の光軸に沿ったネガティブ細胞７３ｎの蛍光の積算量が多い場合があり、このような場合に誤判定となる。
　また、図２に示されるように、マルチウェルプレートの或るウェルに多数のネガティブ細胞７３ｎのみが存在し、他のウェルに少数のポジティブ細胞７３ｐのみが存在し、更に他のウェルにネガティブ細胞７３ｎおよびポジティブ細胞７３ｐが混在する場合も、誤判定となる。すなわち、各ウェルの蛍光積算量のみからは、該ウェルにおけるネガティブ細胞７３ｎおよびポジティブ細胞７３ｐの混合割合を判定することはできない。
　このような問題は、蛍光強度により細胞を弁別する場合だけでなく、蛍光強度により他の対象物を弁別する場合にも存在する。
　実施形態は、関心領域内の対象物の蛍光発現率を正確に求めることができる蛍光測定装置および蛍光測定方法を提供することを目的とする。
　実施形態は、蛍光測定装置である。蛍光測定装置は、（１）対象物を含む蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、（２）対象物を含む干渉画像を取得する干渉画像取得部と、（３）干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、蛍光画像取得部により取得された蛍光画像および光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて対象物の蛍光発現率を求める演算部と、を備える。
　実施形態は、蛍光測定方法である。蛍光測定方法は、（１）対象物を含む蛍光画像を蛍光画像取得部により取得する蛍光画像取得ステップと、（２）対象物を含む干渉画像を干渉画像取得部により取得する干渉画像取得ステップと、（３）干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、蛍光画像取得部により取得された蛍光画像および光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて対象物の蛍光発現率を求める演算ステップと、を備える。
　実施形態によれば、関心領域内の対象物の蛍光発現率を正確に求めることができる。
図１は、細胞の厚さ及び蛍光積算量について説明する図である。 図２は、細胞の個数、蛍光積算量および混合割合について説明する図である。 図３は、蛍光測定装置１Ａの構成を示す図である。 図４は、サンプルの構成を示す図である。 図５は、第１変形例の蛍光測定装置１Ｂの構成を示す図である。 図６は、第２変形例の蛍光測定装置１Ｃの構成を示す図である。 図７は、第３変形例の蛍光測定装置１Ｄの構成を示す図である。 図８は、干渉観察用光、励起光および蛍光それぞれの波長帯域の間の関係の例を示す図であり、（ａ）干渉観察用光の波長帯域が蛍光波長帯域より長い場合、（ｂ）干渉観察用光の波長帯域が蛍光波長帯域と一部が重なっている場合、（ｃ）干渉観察用光の波長帯域が励起光波長帯域より短い場合、及び（ｄ）干渉観察用光の波長帯域が励起光波長帯域と一部が重なっている場合を示す。 図９は、本実施形態の蛍光測定装置の動作および本実施形態の蛍光測定方法を説明するタイミングチャートである。 図１０は、干渉画像取得部２により取得された５つの干渉画像Ｉ１～Ｉ５を示す図である。 図１１は、図１０の干渉画像Ｉ１～Ｉ５に基づいて演算部４により（２）式で求められた位相画像Φを示す図である。 図１２は、図１１の位相画像Φに基づいて演算部４により（３）式で求められた光学的厚さ画像ＯＴを示す図である。 図１３は、蛍光画像取得部３により取得された蛍光画像ＦＬを示す図である。 図１４は、図１２の光学的厚さ画像ＯＴにおいて細胞領域についてセグメンテーション処理した後の光学的厚さ画像を示す図である。 図１５は、各細胞（各ＲＯＩ）について、面積、平均光学的厚さ、平均蛍光強度および“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を纏めた表である。 図１６は、各ＲＯＩの平均蛍光強度を示すグラフである。 図１７は、各ＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を示すグラフである。 図１８は、セグメンテーション後の画像において、１０００ד平均蛍光強度／平均光学的厚さ”が８０以上であるＲＯＩを灰色で示し、１０００ד平均蛍光強度／平均光学的厚さ”が８０以下であるＲＯＩを白色で示した図である。 図１９は、細胞集団について光学的厚さ画像および蛍光画像を模式的に示す図であり、（ａ）光学的厚さ画像、及び（ｂ）蛍光画像を示す。 図２０は、ポジティブ細胞７３ｐのみからなる細胞集団およびネガティブ細胞７３ｎのみからなる細胞集団を模式的に示す図である。 図２１は、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞が混在する視野の像を模式的に示す図である。 図２２は、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の何れであるかを判定する手順を説明するフローチャートである。 図２３は、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を評価する手順を説明するフローチャートである。 図２４は、第１変形例のＲＯＩ設定方法について説明する図である。 図２５は、第２変形例のＲＯＩ設定方法について説明する図である。 図２６は、第３変形例のＲＯＩ設定方法について説明する図である。
　以下、添付図面を参照して、蛍光測定装置および蛍光測定方法の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではない。
　図３は、蛍光測定装置１Ａの構成を示す図である。蛍光測定装置１Ａは、干渉画像取得部２、蛍光画像取得部３、演算部４およびタイミング制御回路５を備える。干渉画像取得部２および蛍光画像取得部３それぞれの光学系の一部は共通である。干渉画像取得部２は、光源１１、ビームスプリッタ１２、対物レンズ１３、対物レンズ１４、参照ミラー１５、チューブレンズ１６、ビームスプリッタ１７、撮像器１８、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を含む。蛍光画像取得部３は、励起光源３１、ビームスプリッタ３２、チューブレンズ１６、励起光カットフィルタ３３および撮像器１８を含む。
　干渉画像取得部２は、二光束干渉計としてマイケルソン干渉計を有し、１または複数の対象物の干渉画像を取得する。蛍光画像取得部３は、対象物の蛍光画像を取得する。演算部４は、干渉画像取得部２により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求める。さらに、演算部４は、蛍光画像取得部３により取得された蛍光画像および光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて対象物の蛍光発現率を求める。タイミング制御回路５は、光源１１および励起光源３１それぞれの光出力タイミングならびに撮像器１８の露光タイミングを制御することで、干渉画像取得部２による干渉画像取得および蛍光画像取得部３による蛍光画像取得それぞれのタイミングを制御する。
　対象物は、特定の細胞や生体サンプルに限定されるものではない。例えば、対象物として、培養細胞、不死化細胞、初代培養細胞、がん細胞、脂肪細胞、肝臓細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および前記細胞をもとに作られた細胞塊（コロニーまたはスフェロイド）などが挙げられる。また、対象物として、生体に限らず、工業サンプル、たとえば金属表面、半導体表面、ガラス表面、半導体素子の内部、樹脂素材表面、液晶、高分子化合物なども挙げられる。
　本実施形態の以下の説明では、図４にサンプルの構成例が示されるように、対象物は、容器７０に入れられた培養液７２中の細胞７３であるとする。容器７０の底部の内側には反射増強コーティング７１が設けられている。
　光源１１は干渉観察用の光を出力する。好適には光源１１はインコヒーレント光を出力する。光源１１は、例えばハロゲンランプなどのランプ系光源、ＬＥＤ（Light emitting diode）光源、ＳＬＤ（Super luminescent diode）光源、ＡＳＥ（Amplified spontaneous emission）光源等である。
　ビームスプリッタ１２は、光源１１と光学的に結合され、二光束干渉計であるマイケルソン干渉計を構成する。ビームスプリッタ１２は、例えば、反射率と透過率との比が５０：５０であるハーフミラーであってもよい。ビームスプリッタ１２は、光源１１から出力された光を二光束に分岐して第１分岐光および第２分岐光とする。ビームスプリッタ１２は、第１分岐光を対物レンズ１３へ出力し、第２分岐光を対物レンズ１４へ出力する。
　また、ビームスプリッタ１２は、反射増強コーティング７１で反射されて対物レンズ１３を経た第１分岐光を入力するとともに、参照ミラー１５で反射されて対物レンズ１４を経た第２分岐光を入力する。そして、ビームスプリッタ１２は、これら入力した第１分岐光と第２分岐光とを合波して、干渉光をチューブレンズ１６へ出力する。
　対物レンズ１３は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された第１分岐光を容器７０内の細胞７３に集光する。また、対物レンズ１３は、反射増強コーティング７１で反射された第１分岐光を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。
　ビームスプリッタ１２と対物レンズ１３との間の第１分岐光の光路上にビームスプリッタ３２が挿入されている。ビームスプリッタ３２は、励起光源３１と光学的に接続されている。ビームスプリッタ３２は、励起光源３１から出力された励起光、光源１１から出力された光のうちの第１分岐光、および、励起光が照射された細胞７３で発生した蛍光のうち、一部を反射させ、残部を透過させる。
　対物レンズ１３は、ビームスプリッタ３２から到達した励起光を容器７０内の細胞７３に集光する。また、対物レンズ１３は、細胞７３で発生した蛍光を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。ビームスプリッタ１２は、この蛍光をチューブレンズ１６へ出力する。
　対物レンズ１４は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された第２分岐光を参照ミラー１５の反射面に集光する。また、対物レンズ１４は、参照ミラー１５の反射面で反射された第２分岐光を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。
　チューブレンズ１６は、干渉光学系を構成するビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された干渉光および蛍光を、ビームスプリッタ１７を経て撮像器１８の撮像面に結像する。ビームスプリッタ１７は、干渉光および蛍光それぞれの一部を反射させ残部を透過させる。ビームスプリッタ１７の反射率と透過率との比は例えば２０：８０である。
　撮像器１８は、ビームスプリッタ１７と光学的に結合され、ビームスプリッタ１７から到達した干渉光を受光して干渉画像を取得し、また、ビームスプリッタ１７から到達した蛍光を受光して蛍光画像を取得する。撮像器１８は、例えば、ＣＣＤエリアイメージセンサおよびＣＭＯＳエリアイメージセンサなどのイメージセンサである。撮像器１８の受光面の前に設けられている励起光カットフィルタ３３は、干渉光および蛍光を選択的に透過させ、励起光を選択的に遮断する。
　ピエゾ素子２１は、参照ミラー１５の反射面に垂直な方向に該反射面を移動させる。ピエゾ素子２１は、この反射面の移動により、二光束干渉計における二光束の間の光路長差（すなわち位相差）を調整することができる。ピエゾ素子２１は、波長未満の分解能で、参照ミラー１５の反射面の位置を決めることができる。二光束干渉計において二光束の間の光路長差は可変である。
　なお、ビームスプリッタ１２から反射増強コーティング７１までの光学的距離をＬ１とし、ビームスプリッタ１２から参照ミラー１５の反射面までの光学的距離をＬ２とすると、二光束干渉計における二光束の間の光路長差は２（Ｌ１－Ｌ２）である。この光路長差が光源１１の出力光のコヒーレント長以下であれば、撮像器１８は明瞭な干渉画像を取得することができる。光源１１の出力光の中心波長をλ０としたとき、二光束干渉計における二光束の間の位相差Δφは次式で表されるものとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　光検出器２２は、ビームスプリッタ１７と光学的に結合され、ビームスプリッタ１７から到達した干渉光を受光して検出信号を出力する。光検出器２２は、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管であり、また、ラインセンサ（リニアセンサ）、ＣＣＤエリアイメージセンサ、ＣＭＯＳエリアイメージセンサなどであってもよい。
　位相制御回路２３は、光検出器２２と電気的に接続され、光検出器２２から出力される検出信号を入力する。また、位相制御回路２３は、ピエゾ素子２１と電気的に接続され、ピエゾ素子２１による光路長差の調整動作を制御する。位相制御回路２３は、入力した検出信号に基づいて、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を検出する。そして、位相制御回路２３は、この検出結果に基づくフィードバック制御により、ピエゾ素子２１による光路長差の調整動作を制御する。これにより、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を設定値で安定化した状態（ロック状態）とすることができる。
　干渉画像取得部２は、ロック状態において対象物（細胞７３）の干渉画像を撮像器１８により撮像して取得することができる。蛍光画像取得部３は、対象物（細胞７３）の蛍光画像を撮像器１８により撮像して取得することができる。演算部４は、干渉画像取得部２の撮像器１８により取得された干渉画像に基づいて対象物の光学的厚さ画像を求め、この光学的厚さ画像および蛍光画像に基づいて関心領域内の対象物の蛍光発現率を求める。
　演算部４は、パーソナルコンピュータおよびタブレット端末などのプロセッサ（例えばＣＰＵ）と記憶部（例えばＲＡＭやストレージ）を備えるコンピュータであってもよい。また、演算部４は、マイコンやＦＰＧＡであってもよい。また、演算部４は、操作者からの入力を受け付ける入力部（キーボード、マウス、タブレット端末など）、ならびに、干渉画像および光学的厚さ画像等を表示する表示部（ディスプレイ、タブレット端末など）を備えていてもよい。また、演算部４は、画面に画像等を表示するとともに、その画面において操作者による領域の指定を受け付ける機能を有するのが好適である。
　干渉画像取得部２の動作は次のとおりである。光源１１から出力された光はビームスプリッタ１２により二光束に分岐されて第１分岐光および第２分岐光とされ、ビームスプリッタ１２から第１分岐光および第２分岐光が出力される。ビームスプリッタ１２から出力された第１分岐光は、ビームスプリッタ３２を経て、対物レンズ１３により容器７０内の細胞７３に集光され、容器７０の底部の内側に設けられた反射増強コーティング７１で反射される。反射増強コーティング７１で反射された第１分岐光は、対物レンズ１３およびビームスプリッタ３２を経て、ビームスプリッタ１２に入力される。ビームスプリッタ１２から出力された第２分岐光は、対物レンズ１４により参照ミラー１５の反射面に集光され、その反射面で反射される。参照ミラー１５の反射面で反射された第２分岐光は、対物レンズ１４を経てビームスプリッタ１２に入力される。
　対物レンズ１３からビームスプリッタ１２に入力された第１分岐光、および、対物レンズ１４からビームスプリッタ１２に入力された第２分岐光は、ビームスプリッタ１２により合波されて、ビームスプリッタ１２から干渉光が出力される。この干渉光は、チューブレンズ１６を経た後にビームスプリッタ１７により２分岐されて、撮像器１８および光検出器２２それぞれにより受光される。干渉光を受光した光検出器２２から検出信号が出力され、この検出信号に基づいて位相制御回路２３により二光束干渉計における二光束の間の光路長差が検出される。そして、位相制御回路２３によるピエゾ素子２１に対するフィードバック制御により、二光束干渉計における二光束の間の光路長差が設定値で安定化した状態（ロック状態）とされる。ロック状態において干渉光を受光した撮像器１８により干渉画像が取得され、その干渉画像は演算部４へ出力される。そして、演算部４により、干渉画像に基づいて対象物（細胞７３）の光学的厚さ画像が求められる。
　演算部４は、位相シフト法により、複数の干渉画像から光学的厚さ画像を求める。すなわち、干渉画像取得部２は、二光束干渉計の光路長差を互いに異なる複数の設定値それぞれで安定化した状態とし各状態において干渉画像を取得する。演算部４は、干渉画像取得部２により取得された複数の干渉画像に基づいて位相画像を求めることができる（特許文献２参照）。更に、演算部４は、この位相画像から光学的厚さ画像を求めることができる。
　例えば、干渉画像取得部２は、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を用いたフィードバック制御により干渉光の位相差を或る初期位相で安定化させて、位相差を安定化させた状態で干渉画像Ｉ１を撮像器１８により取得する。次に、干渉画像取得部２は、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を用いて干渉光の位相差を“初期位相＋π／２”で安定化させ、位相差を安定化させた状態で干渉画像Ｉ２を撮像器１８により取得する。同様にして、干渉画像取得部２は、干渉光の位相差を“初期位相＋π”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ３を撮像器１８により取得し、干渉光の位相差を“初期位相＋３π／２”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ４を撮像器１８により取得し、干渉光の位相差を“初期位相＋２π”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ５を撮像器１８により取得する。
　演算部４は、これら５つの干渉画像Ｉ１～Ｉ５を用いて、下記（２）式の演算を行って位相画像Φを求める。argは複素数の偏角を取得する演算子である。ｉは虚数単位である。演算部４は、この位相画像Φに対して位相アンラップ処理および背景歪み補正処理をした後、光学的厚さＯＴを下記（３）式で求めて光学的厚さ画像を求める。なお、これらの式に現れる各パラメータは画素位置（ｘ，ｙ）の関数であり、これらの式の演算は画素毎に行われる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　背景補正については、ｘ，ｙを変数とする多項式関数（たとえばゼルニケ多項式）を用いることで良好な（フラットな）バックグラウンドを得ることができる。また、背景における歪み成分の空間周波数が個々のサンプルの空間周波数よりも十分に低い場合には、ハイパスフィルタリング処理をすることもできる。光学的厚さ画像の背景における平坦性は、光学的厚さの標準偏差にして５ｎｍ未満であるのが好ましい。
　この光学的厚さＯＴは、サンプルを透過した光に与えられた位相変化量を表したものである。細胞７３の厚さをｄとし、細胞７３の平均的な屈折率をｎｃとし、培養液７２の屈折率をｎｍとすると、光学的厚さＯＴは次式で与えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　蛍光画像取得部３の動作は次のとおりである。励起光源３１から出力された励起光は、ビームスプリッタ３２で反射され、対物レンズ１３により容器７０内の細胞７３に集光照射される。この励起光の照射により細胞７３で発生した蛍光は、対物レンズ１３、ビームスプリッタ３２、ビームスプリッタ１２、チューブレンズ１６、ビームスプリッタ１７および励起光カットフィルタ３３を経て、撮像器１８により受光される。この蛍光を受光した撮像器１８は蛍光画像を取得することができる。演算部４は、この蛍光画像を入力する。
　次に、図５～図７を用いて、蛍光測定装置の変形例の構成について説明する。蛍光測定装置の構成（特に干渉画像取得部および蛍光画像取得部の構成）は、他に様々な態様が可能である。なお、変形例の構成を示す図５～図７では、演算部およびタイミング制御回路の図示が省略されており、また、干渉画像取得部のビームスプリッタ１７、光検出器２２および位相制御回路２３の図示も省略されている。
　図５に示される第１変形例の蛍光測定装置１Ｂは、図３に示された蛍光測定装置１Ａの構成と比較すると、干渉画像取得部２および蛍光画像取得部３の各構成については略同様であるが、ビームスプリッタ３２が挿入されている位置の点で相違する。ビームスプリッタ３２は、図３に示された蛍光測定装置１Ａでは二光束干渉計の中に設けられていたのに対して、図５に示される第１変形例の蛍光測定装置１Ｂでは、二光束干渉計の外であって、ビームスプリッタ１２とチューブレンズ１６との間の光路上に設けられている。
　図６に示される第２変形例の蛍光測定装置１Ｃは、図３に示された蛍光測定装置１Ａの構成と比較すると、ダイクロイックミラー３４および蛍光透過フィルタ３５を更に備える点で相違し、干渉画像取得用の撮像器１８とは別に蛍光画像取得用の撮像器３６を更に備える点で相違する。ダイクロイックミラー３４は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合されており、ビームスプリッタ１２から出力した干渉光および蛍光を入力する。ダイクロイックミラー３４は、入力した干渉光および蛍光のうち、干渉光を選択的に反射させ、蛍光を選択的に透過させる。干渉画像取得用の撮像器１８は、ダイクロイックミラー３４で反射された干渉光を受光して干渉画像を取得する。蛍光画像取得用の撮像器３６は、ダイクロイックミラー３４で透過した蛍光を受光して蛍光画像を取得する。撮像器３６の受光面の前に設けられている蛍光透過フィルタ３５は、蛍光を選択的に透過させる。
　図７に示される第３変形例の蛍光測定装置１Ｄは、これまでの蛍光測定装置１Ａ～１Ｃの構成と比較すると、二光束干渉計としてマッハツェンダ干渉計を有する点で相違する。第３変形例の蛍光測定装置１Ｄでは、光源１１から出力された干渉観察用の光はビームスプリッタ１２により二光束に分岐されて第１分岐光および第２分岐光とされ、ビームスプリッタ１２から第１分岐光および第２分岐光が出力される。ビームスプリッタ１２から出力された第１分岐光は、ミラー４１で反射され、細胞７３を透過し、対物レンズ１３を経て、ビームスプリッタ４２に入力される。ビームスプリッタ１２から出力された第２分岐光は、参照ミラー１５で反射され、対物レンズ１４を経て、ビームスプリッタ４２に入力される。
　対物レンズ１３からビームスプリッタ４２に入力された第１分岐光、および、対物レンズ１４からビームスプリッタ４２に入力された第２分岐光は、ビームスプリッタ４２により合波されて、ビームスプリッタ４２から干渉光が出力される。この干渉光は、チューブレンズ１６を経て、撮像器１８により受光される。二光束干渉計における二光束の間の光路長差が設定値で安定化した状態（ロック状態）において干渉光を受光した撮像器１８により干渉画像が取得され、その干渉画像は演算部４へ出力される。そして、演算部４により、干渉画像に基づいて対象物（細胞７３）の光学的厚さ画像が求められる。
　励起光源３１から出力された励起光は、ビームスプリッタ４２で反射され、対物レンズ１３により細胞７３に集光照射される。この励起光の照射により細胞７３で発生した蛍光は、対物レンズ１３、ビームスプリッタ４２、チューブレンズ１６および励起光カットフィルタ３３を経て、撮像器１８により受光される。この蛍光を受光した撮像器１８は蛍光画像を取得することができる。演算部４は、この蛍光画像を入力する。
　なお、図３，図５，図６および図７の構成例において、ダイクロイックミラーに替えてビームスプリッタを用いることができる場合があり、逆に、ビームスプリッタに替えてダイクロイックミラー用いることができる場合がある。ビームスプリッタの場合、反射率と透過率との比は例えば２０：８０である。
　これら蛍光測定装置１Ａ～１Ｄの何れの構成においても、光源１１から出力された干渉観察用の光は、二光束干渉計（マイケルソン干渉計またはマッハツェンダ干渉計）を経るとともに、二光束干渉計の途中に置かれた細胞をも経て、撮像器の受光面上に干渉画像を形成する。また、励起光源３１から出力された励起光の照射によって細胞で発生した蛍光は、撮像器の受光面上に蛍光画像を形成する。蛍光測定装置１Ａ～１Ｄでは、干渉画像取得部２および蛍光画像取得部３それぞれの光学系の一部（特に対物レンズ１３）は共通であり、略同一視野に対して干渉画像および蛍光画像を取得することができる。
　蛍光測定装置１Ａ～１Ｄそれぞれは、干渉画像および蛍光画像を略同時に取得することができる。第２変形例の蛍光測定装置１Ｃは、干渉画像取得用の撮像器１８と蛍光画像取得用の撮像器３６とを互いに別個に備えているので、干渉画像および蛍光画像を同時に取得することができる。第２変形例の蛍光測定装置１Ｃは、タイミング制御回路を備えていなくてもよい。
　蛍光測定装置１Ａ，１Ｂ，１Ｄそれぞれは、１つの撮像器１８を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することができる。干渉画像および蛍光画像それぞれの撮像の為の露光時間が短いので、蛍光測定装置１Ａ，１Ｂ，１Ｄそれぞれは、干渉画像および蛍光画像を略同時に取得することができる。例えば、蛍光撮像に要する露光時間は数百ミリ秒～数秒程度であるのに対し、干渉撮像に要する露光時間は１００ミリ秒未満とすることが可能である。蛍光撮像直後に干渉撮像を行う又は干渉撮像直後に蛍光撮像を行うとすれば、蛍光の露光時間と比べて大きなモーションアーチファクトが発生することはないと考えられ、時分割撮像であっても実質的には略同時撮像と見なしうる。
　本実施形態の蛍光測定装置は、略同一視野に対して干渉画像および蛍光画像を略同時に取得することができる構成であればよい。すなわち、干渉画像取得部２における二光束干渉計は、マイケルソン干渉計およびマッハツェンダ干渉計の何れであってもよい。励起光を導入する位置は、二光束干渉計の中であってもよいし外であってもよい。１つの撮像器により干渉画像および蛍光画像を交互に撮像してもよいし、干渉画像取得用の撮像器と蛍光画像取得用の撮像器とが互いに別個に備えられていてもよい。
　また、略同一視野に対して干渉画像および蛍光画像を取得するためには、干渉画像取得部および蛍光画像取得部それぞれの光学系の一部が共通であるのが好適であるが、干渉画像取得部と蛍光画像取得部とは光学系の共通部分を備えていなくてもよい。干渉画像取得部と蛍光画像取得部とが別個の光学系であっても、略同一視野に対して干渉画像および蛍光画像を取得することができればよい。
　次に、図８を用いて、光源１１から出力される干渉観察用の光の波長帯域、励起光源３１から出力される励起光の波長帯域、および、励起光照射により細胞７３で発生する蛍光の波長帯域の間の関係について説明する。図８は、干渉観察用光、励起光および蛍光それぞれの波長帯域の間の関係の例を示す図である。一般に、蛍光波長帯域は励起光波長帯域より長波長側にある。
　図８（ａ）に示される例では、干渉観察用光の波長帯域は、蛍光波長帯域より長く、分光的手法により蛍光と分離し得る程度に蛍光波長帯域から離れている。この場合、１つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することもできるし、２つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を同時に取得するのも好適である。
　図８（ｂ）に示される例では、干渉観察用光の波長帯域は、蛍光波長帯域と一部が重なっている。この場合、１つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することはできる。干渉画像と蛍光画像との間の色収差を最小にすることができるので好ましい。ただし、２つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を同時に取得することはできない。
　図８（ｃ）に示される例では、干渉観察用光の波長帯域は、励起光波長帯域より短く、分光的手法により励起光と分離し得る程度に励起光波長帯域から離れている。この場合、１つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することもできるし、２つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を同時に取得することもできる。ただし、干渉画像と蛍光画像との間の色収差が問題となる場合があり、その場合には、高精度に色収差を補正した光学系を用いることが望ましい。
　図８（ｄ）に示される例では、干渉観察用光の波長帯域は、励起光波長帯域と一部が重なっている。この場合、１つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を時分割で交互に取得することはできるが、２つの撮像器を用いて干渉画像および蛍光画像を同時に取得することはできない。
　次に、図９を用いて、本実施形態の蛍光測定装置の動作および本実施形態の蛍光測定方法の手順について説明する。図９は、本実施形態の蛍光測定装置の動作および本実施形態の蛍光測定方法を説明するタイミングチャートである。この図は、光源１１の光出力期間、励起光源３１の励起光出力期間、撮像器の露光期間、および、干渉光の位相差（二光束干渉計における二光束の間の位相差）の時間変化の例を示している。蛍光測定方法は、干渉画像取得ステップ、蛍光画像取得ステップおよび演算ステップを有する。この図は、１つの撮像器を用いて干渉画像取得ステップおよび蛍光画像取得ステップを時分割で交互に行う場合の動作例を示している。
　干渉画像取得ステップにおいては、光源１１は干渉観察用の光を出力し、励起光源３１は励起光を出力しない。干渉画像取得部２は、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を用いたフィードバック制御により干渉光の位相差を初期位相からπ／２ずつ段階的に設定し、各々の段階において位相差を設定値に安定化させた状態で干渉画像Ｉ１～Ｉ５を撮像器１８により撮像する。
　蛍光画像取得ステップにおいては、光源１１は干渉観察用の光を出力せず、励起光源３１は励起光を出力する。この期間の位相差は、安定してないフリー状態にある。蛍光画像取得部３は蛍光画像ＦＬを撮像器１８により撮像する。
　干渉画像取得ステップと蛍光画像取得ステップとを交互に繰り返すことで、干渉画像Ｉ１～Ｉ５および蛍光画像ＦＬを次々と取得することができる。また、必要に応じて、或る視野に対して干渉画像取得ステップおよび蛍光画像取得ステップを行って干渉画像および蛍光画像を取得した後、例えば電動ステージによりサンプルを移動させて、他の視野に対して干渉画像取得ステップおよび蛍光画像取得ステップを行って干渉画像および蛍光画像を取得してもよい。このようにすることで、複数の視野それぞれに対して干渉画像および蛍光画像を取得することができる。
　演算ステップにおいて、演算部４は、干渉画像取得部２により取得された干渉画像Ｉ１～Ｉ５に基づいて、前述した手法により光学的厚さ画像を求める。そして、演算部４は、蛍光画像および光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて細胞の蛍光発現率を求める。
　演算ステップにおいて、演算部４は、干渉画像取得ステップおよびこれに続く蛍光画像取得ステップで取得された干渉画像および蛍光画像を用いて、または、蛍光画像取得ステップおよびこれに続く干渉画像取得ステップで取得された蛍光画像および干渉画像を用いて、光学的厚さ画像の算出、関心領域の設定および蛍光発現率の算出の各処理を行う。演算ステップは、干渉画像取得ステップおよび蛍光画像取得ステップの双方または何れか一方と並列的に行ってもよい。
　以下では、具体的な実施例の構成および画像例を示しつつ、より詳細に実施形態について説明する。図３に示された蛍光測定装置１Ａの構成のものを用いた。光源１１として中心波長５２５ｎｍのＬＥＤを用いた。励起光源３１として、中心波長４７５ｎｍのＬＥＤと中心波長４７５ｎｍで半値全幅２５ｎｍの光学フィルタとを組み合わせた構成を用い、出力光に対して帯域制限した。ビームスプリッタ１２の反射率と透過率との比は５０：５０であった。ビームスプリッタ１７の反射率と透過率との比は２０：８０であった。ビームスプリッタ３２の反射率と透過率との比は２０：８０であった。励起光カットフィルタ３３として、カットオフ波長５００ｎｍの長波長透過フィルタを用いた。
　対物レンズ１３および対物レンズ１４それぞれの焦点距離は９ｍｍであった。チューブレンズ１６の焦点距離は１２５ｍｍであった。撮像器１８の撮像素子サイズは４.８ｍｍ×３.６ｍｍであった。サンプル面での視野サイズは３４５.６μｍ×２５９.２μｍであった。サンプルの細胞７３として、緑色蛍光色素（green　fluorescent　protein、ＧＦＰ）によって蛍光染色した子宮頚部がん由来の培養細胞を播種して用いた。干渉画像Ｉ１～Ｉ５を取得する際の時間間隔は６７ミリ秒であった。各干渉画像を取得する際の露光時間は０.５ミリ秒であった。蛍光画像ＦＬを取得する際の露光時間は１５００ミリ秒であった。
　図１０は、干渉画像取得部２により取得された５つの干渉画像Ｉ１～Ｉ５を示す図である。図１１は、図１０の干渉画像Ｉ１～Ｉ５に基づいて演算部４により（２）式で求められた位相画像Φを示す図である。図１２は、図１１の位相画像Φに基づいて演算部４により（３）式で求められた光学的厚さ画像ＯＴを示す図である。図１３は、蛍光画像取得部３により取得された蛍光画像ＦＬを示す図である。図１４は、図１２の光学的厚さ画像ＯＴにおいて細胞領域についてセグメンテーション処理した後の光学的厚さ画像を示す図である。これらの画像は同一視野のものである。図１４のセグメンテーション処理後の光学的厚さ画像から、個々の細胞の領域を明確に識別することができ、この画像の視野内に２６個の細胞の存在が認められる。図１４では、個々の細胞に番号（＃１～＃２６）を付している。
　演算部４は、個々の対象物の領域を関心領域（Region　of　Interest、ＲＯＩ）とする。演算部４は、光学的厚さ画像および蛍光画像の双方に共通に設定した各ＲＯＩにおいて、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて対象物の蛍光発現率を求める。
　ＲＯＩ内の平均光学的厚さは、ＲＯＩ内の光学的厚さ積分値をＲＯＩのピクセル数で除算した値であり、下記（５）式で表される。ＲＯＩ内の平均蛍光強度は、ＲＯＩ内の蛍光強度積分値をＲＯＩのピクセル数で除算した値であり、下記（６）式で表される。ＲＯＩ内の“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”は下記（７）式で表される。ＲＯＩ内の“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”は、ＲＯＩ内の蛍光強度積分値と光学的厚さ積分値との比として表される。演算部４は、この（７）式で表されるＲＯＩ内の蛍光強度積分値を光学的厚さ積分値で除算した値を、ＲＯＩ内の対象物の蛍光発現率の指標として求める。
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　図１５は、各細胞（各ＲＯＩ）について、面積、平均光学的厚さ、平均蛍光強度および“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を纏めた表である。図１６は、各ＲＯＩの平均蛍光強度を示すグラフである。図１７は、各ＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を示すグラフである。図１６および図１７において、横軸は細胞の番号である。
　ここで、例えば、＃１７の細胞は、単なる平均蛍光強度による評価では、２６個の細胞の中で２番目に蛍光が強く、ＧＦＰの発現が大きいと判定される。しかし、＃１７の細胞は、“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”の評価では、２６個の細胞の中で１２番目の大きさでしかない。
　細胞の光学的厚さは細胞の厚さに概ね比例するので、光学的厚さが大きい細胞は物理的にも厚いことが示唆される。厚い細胞では、その厚みの分だけ蛍光フォトンの量が積算されるため、単なる平均蛍光強度による評価では、実際の蛍光色素の発現率よりも相対的に高い発現率が見積もられてしまうおそれがある。これに対して、“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”による評価を行えば、光学的厚さによって蛍光強度を規格化することで、より正確に蛍光色素の発現率を見積もることが可能となる。
　図１８は、セグメンテーション後の画像において、１０００ד平均蛍光強度／平均光学的厚さ”が８０以上であるＲＯＩを灰色で示し、１０００ד平均蛍光強度／平均光学的厚さ”が８０以下であるＲＯＩを白色で示した図である。このように、適切な閾値を設定して、各ＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”と閾値との大小比較をすることで、そのＲＯＩがポジティブ細胞およびネガティブ細胞の何れであるかを高精度に判定することができる。
　本実施形態の蛍光測定装置および蛍光測定方法は、個々に分離している細胞だけでなく、複数の細胞の集合体である細胞集団をＲＯＩとすれば、そのＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”に基づいて細胞集団の蛍光発現率を正確に求めることができる。細胞集団は、コロニー様またはスフェロイド様に複数の細胞の集合したものである。コロニーとは、典型的には複数個の細胞が空間的にひとまとまりの集団を形成したものである。スフェロイドとは、典型的には厚さ１００μm以上に細胞が積み重なり、球体状になった細胞集団である。１個のスフェロイドには典型的には１０００個～数万個の細胞が含まれる。
　細胞集団において細胞が積み重なっていても、同一視野について光学的厚さ画像（図１９（ａ））および蛍光画像（図１９（ｂ））を取得し、これらの画像において細胞集団の領域にＲＯＩ１～ＲＯＩ３を設定する。そして、各ＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”に基づいて蛍光発現率を求めることで、各ＲＯＩの細胞集団に含まれる各細胞がポジティブ細胞７３ｐおよびネガティブ細胞７３ｎの何れであるかを判定することができ（図２０）、また、各ＲＯＩの細胞集団におけるポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を評価することができる。
　なお、スフェロイド様の細胞集団のように厚みのある対象物では、その対象物内において励起光または蛍光が減衰することにより、蛍光強度が厚さに比例しない場合がある。そのような場合には、厚さによって蛍光強度を補正するのが好適である。
　また、本実施形態の蛍光測定装置および蛍光測定方法は、容器内の細胞の全体を含むようにＲＯＩを設定すれば、そのＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”に基づいて該容器内の細胞の全体の蛍光発現率を正確に求めることができる。例えば、マルチウェルプレートの個々のウェルをＲＯＩとすれば、各ウェルに存在する細胞の個数に拘わらず、各ＲＯＩの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”に基づいて蛍光発現率を求めることで、各ＲＯＩの細胞がポジティブ細胞およびネガティブ細胞の何れであるかを判定することができ、また、各ＲＯＩにおけるポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を評価することができる。なお、マルチウェルプレートの複数のウェルについて光学的厚さ画像および蛍光画像を取得するには、タイリング撮影するのが好適である。
　次に、ＲＯＩにおけるポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を評価する手法について説明する。本実施形態では、例えば抗原抗体反応などの所望の反応について陽性（ポジティブ）の細胞および陰性（ネガティブ）の細胞が混在していても、細胞を個々にセグメンテーションすることなく、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を評価することができる。
　所望の反応を呈示していないネガティブ細胞であっても、自家蛍光やまたは特異的な蛍光色素の局在の影響により、ある程度の蛍光が観察されることがある。この自家蛍光または非特異的な蛍光色素の局在の影響により、たとえ視野内の細胞が全てネガティブ細胞であっても、蛍光によるフォトンが観測されてしまう。したがって、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合は蛍光強度に必ずしも比例しない。しかし、本実施形態では、次のようにして、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を求めることができる。
　図２１は、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞が混在する視野の像を模式的に示す図である。この図では、ポジティブ細胞は灰色領域で示され、ネガティブ細胞が白色領域で示されている。ポジティブ細胞およびネガティブ細胞それぞれは、個々に分離されていてもよいし、積み重ねられていてもよい。この図に示される例では、ＲＯＩ１にはポジティブ細胞７３ｐのみが存在する。ＲＯＩ２にはネガティブ細胞７３ｎのみが存在する。ＲＯＩ３には、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞が混在しており、また、細胞が積み重ねられている。ＲＯＩ１～ＲＯＩ３の全てを含むＲＯＩ０には、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞が混在している。このような視野について光学的厚さ画像および蛍光画像を取得する。なお、この視野は、複数の撮像領域の視野をタイリングしてつなぎ合わせた複合視野であっても構わない。
　第１閾値以上である蛍光発現率を有する第１対象物（ポジティブ細胞）のみを含む第１関心領域（ＲＯＩ１）を設定し、このＲＯＩ１内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値Ｒｐを求める（下記（８）式）。ＲＯＩ１内に複数のポジティブ細胞が含まれているのが好ましい。また、第２閾値以下である蛍光発現率を有する第２対象物（ネガティブ細胞）のみを含む第２関心領域（ＲＯＩ２）を設定し、このＲＯＩ２内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値Ｒｎを求める（下記（９）式）。ＲＯＩ２内に複数のネガティブ細胞が含まれているのが好ましい。なお、明確にネガティブ細胞群であっても、自家蛍光等の影響により、Ｒｎがゼロでない何らかの値を持つ可能性があるが、以下に示す方法によりこの自家蛍光等の影響を補正することができるので、問題にはならない。
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　測定対象の関心領域（ＲＯＩ０）を設定し、このＲＯＩ０内の蛍光強度の積分値ＦＬtotalを光学的厚さの積分値ＯＴtotalで除算した値Ｒmixを求める（下記（１０）式）。ＲＯＩ０内におけるポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合をｘ：(１－ｘ) とすると、ＲＯＩ０内の蛍光強度の積分値ＦＬtotalは下記（１１）式で表される。これらの式から、ｘは下記（１２）式で表される。この（１２）式から分かるように、ｘはＲmixに対して線形の関係を有する。ＲＯＩ０内の全ての細胞がポジティブ細胞であれば、Ｒmix＝Ｒｐであり、ｘ＝１である。ＲＯＩ０内の全ての細胞がネガティブ細胞であれば、Ｒmix＝Ｒｎであり、ｘ＝０である。
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Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
　このように、測定対象の関心領域（ＲＯＩ０）におけるポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合は、ポジティブ細胞のみを含むＲＯＩ１の“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を表すＲｐ、ネガティブ細胞のみを含むＲＯＩ２の“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を表すＲｎ、および、ＲＯＩ０の“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を表すＲmixから求められる。
　従来、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞が混合されているサンプルにおいて混合割合を求めるには、細胞を個々にセグメンテーションすることが必要であり、そのセグメンテーション処理での誤差が計数結果における大きな不確定要因となっていた。これに対して、本実施形態では、細胞を個々にセグメンテーションしなくとも、混合割合を見積もることが可能となる。このような利点は、特に、ＲＯＩ０（またはＲＯＩ３）のようにポジティブ細胞およびネガティブ細胞が混合して集合した細胞集団における混合割合を見積もる際に有用である。なぜなら、このように細胞が集合化した細胞集団においては、細胞同士が上下に重なり合っていることが多いので、細胞を個々にセグメンテーションすることが困難であるからである。
　本実施形態では、このような細胞集団について関心領域を設定するに際して、細胞集団を過不足なく囲むように設定する必要は無い。なぜなら、本実施形態では、必要なＲmixの値は（１０）式で表され、ＲＯＩを厳密に取ろうとも、また、ＲＯＩが実際の細胞集団からはみ出ていようとも、（１０）式の分母および分子ともにゼロが加算されるか否かの違いしかないからである。
　本実施形態において、混合割合の算出に際しては、細胞１個当たりの“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”が、ポジティブ細胞とネガティブ細胞との間で明確に異なっていることが好ましい。したがって、反応途中で蛍光強度が時間的に変化しているような実験系への適用は望ましくない。逆に、本実施形態は、蛍光色素を発現していないにも拘わらず自家蛍光を発している細胞群と、蛍光色素が発現している細胞群とが混合しているサンプルに対しては、有用に適用できる。
　また、本実施形態では、ポジティブ細胞とネガティブ細胞との間で光学的体積の差異が無視できない場合には、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞それぞれについて、１個当たりの光学的厚さの積分値である光学的体積を予め見積もっておいて、次のような演算をするのが好ましい。ポジティブ細胞の光学的体積平均値ＯＶｐは下記（１３）式で表される。ネガティブ細胞の光学的体積平均値ＯＶｎは下記（１４）式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000014
　ＲＯＩ０に含まれる細胞の個数をｎとすると、ＲＯＩ０内の蛍光強度の積分値ＦＬtotalは、ポジティブ細胞による蛍光強度積分値とネガティブ細胞による蛍光強度積分値との和として、下記（１５）式で表される。また、ＲＯＩ０内の光学的厚さの積分値ＯＴtotalは、ポジティブ細胞による光学的体積とネガティブ細胞による光学的体積との和として、下記（１６）式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000016
　ポジティブ細胞の光学的体積平均値ＯＶｐとネガティブ細胞の光学的体積平均値ＯＶｎとの比をαとする（下記（１７）式）。このとき、Ｒmixは下記（１８）式で表される。この式から、ｘは下記（１９）式で表される。ここで、α＝１とすると、この（１９）式は（１２）式と一致する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000019
　次に、図２２および図２３のフローチャートを用いて、本実施形態の蛍光測定装置の動作および蛍光測定方法の手順について説明する。
　図２２は、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の何れであるかを判定する手順を説明するフローチャートである。ステップＳ１１では、干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を取得する。ステップＳ１２では、蛍光画像取得部により蛍光画像を取得する。必要に応じて、ステップＳ１３では、光学的厚さ画像および蛍光画像それぞれについて、複数の視野をタイリングしてもよい。
　ステップＳ１４では、ＲＯＩを設定する。ＲＯＩの設定は、手動で行われてもよく、演算部４に自動的に行われてもよい。ＲＯＩの形状は任意でよい。ＲＯＩの設定は、視野全体、マルチウェルプレートの各ウェル、個々の細胞、および、細胞集団の何れであってもよい。ステップＳ１５では各ＲＯＩの光学的厚さ積分値を求め、ステップＳ１６では各ＲＯＩの蛍光強度積分値を求める。ステップＳ１７では、各ＲＯＩについて、“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を求め、これを蛍光発現率の指標として、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の何れであるかを判定する。そして、ステップＳ１８では、各ＲＯＩについて、“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”を数値として表示してもよいし、“平均蛍光強度／平均光学的厚さ”によって色分けされた画像を表示してもよい。
　図２３は、ポジティブ細胞およびネガティブ細胞の混合割合を評価する手順を説明するフローチャートである。ステップＳ２１では、干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を取得する。ステップＳ２２では、蛍光画像取得部により蛍光画像を取得する。必要に応じて、ステップＳ２３では、光学的厚さ画像および蛍光画像それぞれについて、複数の視野をタイリングしてもよい。
　ステップＳ２４では、ポジティブ細胞のみを含むＲＯＩ１を設定し、ネガティブ細胞のみを含むＲＯＩ２を設定し、また、測定対象の関心領域（ＲＯＩ０）を設定する。ステップＳ２５では、ＲＯＩ１についてＲｐ（（８）式）を計算する。ステップＳ２６では、ＲＯＩ２についてＲｎ（（９）式）を計算する。ステップＳ２７では、ＲＯＩ０についてＲmix（（１０）式）を計算する。そいて、ステップＳ２８では、混合割合ｘ（（１２）式）を計算する。この混合割合を数値として表示してもよいし、混合割合に応じた擬似カラーで画像を表示してもよい。
　次に様々な変形例について説明する。本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。
　図２４は、第１変形例のＲＯＩ設定方法について説明する図である。この例では、マルチウェルプレートの６個のウェルそれぞれに細胞が入れられており、各ウェルにＲＯＩが設定される。ＲＯＩ１のウェルには、ネガティブ細胞７３ｎのみが入れられている。ＲＯＩ２のウェルには、ポジティブ細胞７３ｐのみが入れられている。測定対象のＲＯＩ３-１～４それぞれのウェルには、ネガティブ細胞およびポジティブ細胞の双方が入れられている。ネガティブ細胞およびポジティブ細胞の混合割合は、４個のＲＯＩ３-１～４それぞれについて個別に求められてもよいし、４個のＲＯＩ３-１～４を統合した１つのＲＯＩについて求められてもよい。
　図２５は、第２変形例のＲＯＩ設定方法について説明する図である。この例では、互いに独立した６個の容器（Dish１～６）それぞれに細胞が入れられており、各容器にＲＯＩが設定される。ＲＯＩ１の容器（Dish１）には、ネガティブ細胞７３ｎのみが入れられている。ＲＯＩ２の容器（Dish２）には、ポジティブ細胞７３ｐのみが入れられている。測定対象のＲＯＩ３-１～４それぞれの容器（Disｈ３～６）には、ネガティブ細胞およびポジティブ細胞の双方が入れられている。この例でも、ネガティブ細胞およびポジティブ細胞の混合割合は、４個のＲＯＩ３-１～４それぞれについて個別に求められてもよいし、４個のＲＯＩ３-１～４を統合した１つのＲＯＩについて求められてもよい。
　図２６は、第３変形例のＲＯＩ設定方法について説明する図である。この例では、マルチウェルプレートの１２個のウェルそれぞれに細胞が入れられており、各ウェルにＲＯＩが設定される。３個のＲＯＩ１-１～３のウェルにはネガティブ細胞７３ｎのみが入れられており、これらのＲＯＩ１-１～３を統合した１つのＲＯＩについてＲｎが求められてもよい。３個のＲＯＩ２-１～３のウェルにはポジティブ細胞７３ｐのみが入れられており、これらのＲＯＩ２-１～３を統合した１つのＲＯＩについてＲｐが求められてもよい。その他の６個の測定対象のＲＯＩそれぞれのウェルには、ネガティブ細胞およびポジティブ細胞の双方が入れられている。ネガティブ細胞およびポジティブ細胞の混合割合は、これら６個のＲＯＩそれぞれについて個別に求められてもよいし、これら６個のＲＯＩを統合した１つのＲＯＩについて求められてもよい。
　干渉画像取得部において干渉画像を取得するために用いられる光源１１は、レーザ光源であってもよいが、インコヒーレント光源であることが望ましい。光源１１としてレーザ光源を用いた場合、レーザ光の高い干渉性によって、取得される光学的厚さ画像のバックグラウンドに不規則なスペックルノイズが発生する場合があり、ＲＯＩ内の光学的厚さ積分値の誤差の要因となる可能性がある。これに対して、光源１１としてインコヒーレント光源を用いた場合には、スペックルノイズの発生が抑制され、ＲＯＩ内の光学的厚さ積分値の誤差が小さいので、好ましい。
　また、そもそも細胞が存在しない領域で観察されるようなバックグラウンド蛍光については、できる限りゼロであることが望ましい。そのような条件を実現するために、光学的厚さ画像の情報を用いて、光学的厚さ画像において光学的厚さがほぼゼロである領域を、蛍光画像において蛍光のバックグラウンドの領域であるとみなして、背景補正やシェーディング補正を行うことが望ましい。
　バックグラウンド蛍光分の補正に関しては、画像に対するシェーディング補正に代えて、蛍光強度の積分値を用いた補正を行ってもよい。蛍光強度の積分値を用いる場合には、細胞が存在しない関心領域ＲＯＩ０を設け、ＲＯＩ０の形状、面積および撮像時の条件を計測対象のＲＯＩ１～ＲＯＩｎ（このＲＯＩには、ポジティブ細胞７３ｐおよびネガティブ細胞７３ｎの何れか一方のみが入っていてもよいし、双方が混在していてもよい）と同一にしたうえで、ＲＯＩ０における蛍光強度の積分値を予め求めておく。ＲＯＩ０には細胞を含まないが、培養液および試薬に関しては計測対象のＲＯＩと同様に添加することが望ましい。この条件において、計測対象のＲＯＩ１～ＲＯＩｎにおいて計算された蛍光強度のＲＯＩ内積分値に関しては、ＲＯＩ０において計算された蛍光強度のＲＯＩ内積分値をバックグラウンド蛍光として減算してから、後段の処理に用いるようにすれば、バックグラウンド蛍光の補正が可能となる。
　また、蛍光強度のＲＯＩ内積分値を求めるにあたって、ＲＯＩの大きさが干渉撮像と蛍光撮像とで共用する撮像器１８または蛍光撮像専用の撮像器３６の受光エリア全体に略対応している場合は、蛍光撮像時に撮像器１８または撮像器３６の画素全体をアナログ的またはデジタル的に予めビニングして、実質的に受光エリア全体を受光面とする単一素子の受光器と同様に用い、得られた値を蛍光強度のＲＯＩ内積分値としてもよい。この場合、画像を基にした背景補正やシェーディング補正ができないので、細胞が存在しないＲＯＩとしての前記ＲＯＩ０を用いたバックグラウンド蛍光補正を行うことが望ましい。
　また、蛍光強度のＲＯＩ内積分値を求めるにあたって、図６に示した第２変形例の蛍光測定装置１Ｃのように、干渉画像取得用の撮像器１８とは別に蛍光撮像面に設置された蛍光画像取得用の撮像器３６を更に備える場合は、蛍光画像取得用の撮像器３６を単一素子の受光器に置き換えてもよい。この単一素子の受光器における受光面の位置及び大きさは、蛍光撮像面に投影されたＲＯＩの位置及び大きさに略一致するようにすることが望ましい。この単一素子の受光器とは、例えばフォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、あるいは光電子増倍管等である。
　当該単一素子における受光器の受光面の位置及び大きさを、蛍光撮像面に投影されたＲＯＩの位置及び大きさに略一致させるにあたっては、サンプル面と蛍光撮像面との間に縮小光学系または拡大光学系を設けて、サンプル面と蛍光撮像面との間の拡大倍率または縮小倍率を適切に調整してもよい。また、ＲＯＩの形状と前記単一素子の受光器における受光面の形状が互いに異なる場合（例えばＲＯＩが円形であり、当該受光器の受光面が矩形であるような場合）は、物理的な遮光部を持つマスクを前記単一素子の受光器における受光面の前に設けることで、実質的に当該単一素子の受光器における受光面の位置及び大きさを、蛍光撮像面に投影されたＲＯＩの位置及び大きさに略一致させてもよい。
　蛍光測定装置および蛍光測定方法は、上記実施形態及び構成例に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。
　上記実施形態による蛍光測定装置は、（１）対象物を含む蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、（２）対象物を含む干渉画像を取得する干渉画像取得部と、（３）干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、蛍光画像取得部により取得された蛍光画像および光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて対象物の蛍光発現率を求める演算部と、を備える構成としている。
　上記の蛍光測定装置では、演算部は、関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値を、関心領域内の対象物の蛍光発現率の指標として求める構成としても良い。
　上記の蛍光測定装置では、演算部は、第１閾値以上である蛍光発現率を有する第１対象物のみを含む第１関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、第２閾値以下である蛍光発現率を有する第２対象物のみを含む第２関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、および、測定対象の関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値に基づいて、測定対象の関心領域内における第１対象物および第２対象物の混合割合を求める構成としても良い。
　上記の蛍光測定装置では、演算部は、光学的厚さ画像に基づいて関心領域を設定する構成としても良い。
　上記の蛍光測定装置では、演算部は、光学的厚さ画像の情報を用いて蛍光画像に対して背景補正およびシェーディング補正を行い、当該補正後の蛍光画像の蛍光強度の積分値を求める構成としても良い。
　上記の蛍光測定装置では、干渉画像取得部は、インコヒーレント光を用いて干渉画像を取得する構成としても良い。
　上記の蛍光測定装置では、干渉画像取得部および蛍光画像取得部それぞれの光学系の少なくとも一部が共通である構成としても良い。
　上記の蛍光測定装置では、蛍光画像取得部は、対象物の集合体を含む蛍光画像を取得し、干渉画像取得部は、集合体を含む干渉画像を取得し、演算部は、蛍光画像取得部により取得された蛍光画像のうちの集合体の蛍光強度の積分値と、干渉画像取得部により取得された干渉画像から求められた光学的厚さ画像のうちの集合体の光学的厚さの積分値とに基づいて、集合体の蛍光発現率を求める構成としても良い。
　上記実施形態による蛍光測定方法は、（１）対象物を含む蛍光画像を蛍光画像取得部により取得する蛍光画像取得ステップと、（２）対象物を含む干渉画像を干渉画像取得部により取得する干渉画像取得ステップと、（３）干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、蛍光画像取得部により取得された蛍光画像および光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、蛍光画像の蛍光強度の積分値と光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて対象物の蛍光発現率を求める演算ステップと、を備える構成としている。
　上記の蛍光測定方法では、演算ステップにおいて、関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値を、関心領域内の対象物の蛍光発現率の指標として求める構成としても良い。
　上記の蛍光測定方法では、演算ステップにおいて、第１閾値以上である蛍光発現率を有する第１対象物のみを含む第１関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、第２閾値以下である蛍光発現率を有する第２対象物のみを含む第２関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、および、測定対象の関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値に基づいて、測定対象の関心領域内における第１対象物および第２対象物の混合割合を求める構成としても良い。
　上記の蛍光測定方法では、演算ステップにおいて、光学的厚さ画像に基づいて関心領域を設定する構成としても良い。
　上記の蛍光測定方法では、演算ステップにおいて、光学的厚さ画像の情報を用いて蛍光画像に対して背景補正およびシェーディング補正を行い、当該補正後の蛍光画像の蛍光強度の積分値を求める構成としても良い。
　上記の蛍光測定方法では、干渉画像取得ステップにおいて、干渉画像取得部がインコヒーレント光を用いて干渉画像を取得する構成としても良い。
　上記の蛍光測定方法では、干渉画像取得部および蛍光画像取得部それぞれの光学系の少なくとも一部が共通である構成としても良い。
　上記の蛍光測定方法では、蛍光画像取得ステップにおいて、対象物の集合体を含む蛍光画像を蛍光画像取得部により取得し、干渉画像取得ステップにおいて、集合体を含む干渉画像を干渉画像取得部により取得し、演算ステップにおいて、蛍光画像取得部により取得された蛍光画像のうちの集合体の蛍光強度の積分値と、干渉画像取得部により取得された干渉画像から求められた光学的厚さ画像のうちの集合体の光学的厚さの積分値とに基づいて、集合体の蛍光発現率を求める構成としても良い。
　上記の蛍光測定方法では、対象物が細胞である構成としても良い。
　上記の蛍光測定方法では、蛍光画像取得ステップにおいて、対象物としての細胞を各ウェルに入れたマルチウェルプレートを蛍光画像取得部によりタイリング撮影して蛍光画像を取得し、干渉画像取得ステップにおいて、マルチウェルプレートを干渉画像取得部によりタイリング撮影して干渉画像を取得し、演算ステップにおいて、蛍光画像および光学的厚さ画像それぞれにおいてマルチウェルプレートの各ウェルに関心領域を設定する構成としても良い。
　実施形態は、関心領域内の対象物の蛍光発現率を正確に求めることができる蛍光測定装置および蛍光測定方法として利用可能である。
　１Ａ～１Ｄ…蛍光測定装置、２…干渉画像取得部、３…蛍光画像取得部、４…演算部、５…タイミング制御回路、１１…光源、１２…ビームスプリッタ、１３，１４…対物レンズ、１５…参照ミラー、１６…チューブレンズ、１７…ビームスプリッタ、１８…撮像器、２１…ピエゾ素子、２２…光検出器、２３…位相制御回路、３１…励起光源、３２…ビームスプリッタ、３３…励起光カットフィルタ、３４…ダイクロイックミラー、３５…蛍光透過フィルタ、３６…撮像器、４１…ミラー、４２…ビームスプリッタ、７０…容器、７１…反射増強コーティング、７２…培養液、７３…細胞。

Claims (18)

  1. 　対象物を含む蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、
    　前記対象物を含む干渉画像を取得する干渉画像取得部と、
    　前記干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、前記蛍光画像取得部により取得された蛍光画像および前記光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、前記蛍光画像の蛍光強度の積分値と前記光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて前記対象物の蛍光発現率を求める演算部と、
    を備える、蛍光測定装置。
  2. 　前記演算部は、前記関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値を、前記関心領域内の前記対象物の蛍光発現率の指標として求める、請求項１に記載の蛍光測定装置。
  3. 　前記演算部は、第１閾値以上である蛍光発現率を有する第１対象物のみを含む第１関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、第２閾値以下である蛍光発現率を有する第２対象物のみを含む第２関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、および、測定対象の関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値に基づいて、前記測定対象の関心領域内における前記第１対象物および前記第２対象物の混合割合を求める、請求項２に記載の蛍光測定装置。
  4. 　前記演算部は、前記光学的厚さ画像に基づいて関心領域を設定する、請求項１～３の何れか１項に記載の蛍光測定装置。
  5. 　前記演算部は、前記光学的厚さ画像の情報を用いて前記蛍光画像に対して背景補正およびシェーディング補正を行い、当該補正後の蛍光画像の蛍光強度の積分値を求める、請求項１～４の何れか１項に記載の蛍光測定装置。
  6. 　前記干渉画像取得部は、インコヒーレント光を用いて干渉画像を取得する、請求項１～５の何れか１項に記載の蛍光測定装置。
  7. 　前記干渉画像取得部および前記蛍光画像取得部それぞれの光学系の少なくとも一部が共通である、請求項１～６の何れか１項に記載の蛍光測定装置。
  8. 　前記蛍光画像取得部は、対象物の集合体を含む蛍光画像を取得し、
    　前記干渉画像取得部は、前記集合体を含む干渉画像を取得し、
    　前記演算部は、前記蛍光画像取得部により取得された蛍光画像のうちの前記集合体の蛍光強度の積分値と、前記干渉画像取得部により取得された干渉画像から求められた光学的厚さ画像のうちの前記集合体の光学的厚さの積分値とに基づいて、前記集合体の蛍光発現率を求める、請求項１～７の何れか１項に記載の蛍光測定装置。
  9. 　対象物を含む蛍光画像を蛍光画像取得部により取得する蛍光画像取得ステップと、
    　前記対象物を含む干渉画像を干渉画像取得部により取得する干渉画像取得ステップと、
    　前記干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、前記蛍光画像取得部により取得された蛍光画像および前記光学的厚さ画像の双方に共通に設定した関心領域において、前記蛍光画像の蛍光強度の積分値と前記光学的厚さ画像の光学的厚さの積分値とに基づいて前記対象物の蛍光発現率を求める演算ステップと、
    を備える、蛍光測定方法。
  10. 　前記演算ステップにおいて、前記関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値を、前記関心領域内の前記対象物の蛍光発現率の指標として求める、請求項９に記載の蛍光測定方法。
  11. 　前記演算ステップにおいて、第１閾値以上である蛍光発現率を有する第１対象物のみを含む第１関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、第２閾値以下である蛍光発現率を有する第２対象物のみを含む第２関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値、および、測定対象の関心領域内の蛍光強度の積分値を光学的厚さの積分値で除算した値に基づいて、前記測定対象の関心領域内における前記第１対象物および前記第２対象物の混合割合を求める、請求項１０に記載の蛍光測定方法。
  12. 　前記演算ステップにおいて、前記光学的厚さ画像に基づいて関心領域を設定する、請求項９～１１の何れか１項に記載の蛍光測定方法。
  13. 　前記演算ステップにおいて、前記光学的厚さ画像の情報を用いて前記蛍光画像に対して背景補正およびシェーディング補正を行い、当該補正後の蛍光画像の蛍光強度の積分値を求める、請求項９～１２の何れか１項に記載の蛍光測定方法。
  14. 　前記干渉画像取得ステップにおいて、前記干渉画像取得部がインコヒーレント光を用いて干渉画像を取得する、請求項９～１３の何れか１項に記載の蛍光測定方法。
  15. 　前記干渉画像取得部および前記蛍光画像取得部それぞれの光学系の少なくとも一部が共通である、請求項９～１４の何れか１項に記載の蛍光測定方法。
  16. 　前記蛍光画像取得ステップにおいて、対象物の集合体を含む蛍光画像を前記蛍光画像取得部により取得し、
    　前記干渉画像取得ステップにおいて、前記集合体を含む干渉画像を前記干渉画像取得部により取得し、
    　前記演算ステップにおいて、前記蛍光画像取得部により取得された蛍光画像のうちの前記集合体の蛍光強度の積分値と、前記干渉画像取得部により取得された干渉画像から求められた光学的厚さ画像のうちの前記集合体の光学的厚さの積分値とに基づいて、前記集合体の蛍光発現率を求める、請求項９～１５の何れか１項に記載の蛍光測定方法。
  17. 　前記対象物が細胞である、請求項９～１６の何れか１項に記載の蛍光測定方法。
  18. 　前記蛍光画像取得ステップにおいて、前記対象物としての細胞を各ウェルに入れたマルチウェルプレートを前記蛍光画像取得部によりタイリング撮影して蛍光画像を取得し、
    　前記干渉画像取得ステップにおいて、前記マルチウェルプレートを前記干渉画像取得部によりタイリング撮影して干渉画像を取得し、
    　前記演算ステップにおいて、前記蛍光画像および前記光学的厚さ画像それぞれにおいて前記マルチウェルプレートの各ウェルに関心領域を設定する、請求項１７に記載の蛍光測定方法。
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