JP2019124547A - 干渉画像取得装置および干渉画像取得方法 - Google Patents
干渉画像取得装置および干渉画像取得方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019124547A JP2019124547A JP2018004681A JP2018004681A JP2019124547A JP 2019124547 A JP2019124547 A JP 2019124547A JP 2018004681 A JP2018004681 A JP 2018004681A JP 2018004681 A JP2018004681 A JP 2018004681A JP 2019124547 A JP2019124547 A JP 2019124547A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- interference
- light
- optical path
- reflection mirror
- path length
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 183
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 98
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims description 76
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 claims description 27
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 21
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 11
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 9
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 9
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 9
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005073 lymphatic endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000010363 phase shift Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01B—MEASURING LENGTH, THICKNESS OR SIMILAR LINEAR DIMENSIONS; MEASURING ANGLES; MEASURING AREAS; MEASURING IRREGULARITIES OF SURFACES OR CONTOURS
- G01B9/00—Measuring instruments characterised by the use of optical techniques
- G01B9/02—Interferometers
- G01B9/02041—Interferometers characterised by particular imaging or detection techniques
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/0056—Optical details of the image generation based on optical coherence, e.g. phase-contrast arrangements, interference arrangements
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/0088—Inverse microscopes
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/34—Microscope slides, e.g. mounting specimens on microscope slides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
- C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/335—Glucagon; Glucagon-like peptide [GLP]; Exendin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/90—Polysaccharides
- C12N2501/905—Hyaluronic acid
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1434—Optical arrangements
- G01N2015/1454—Optical arrangements using phase shift or interference, e.g. for improving contrast
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N2021/1765—Method using an image detector and processing of image signal
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/41—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
- G01N21/45—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length using interferometric methods; using Schlieren methods
-
- H—ELECTRICITY
- H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
- H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
- H04N25/00—Circuitry of solid-state image sensors [SSIS]; Control thereof
- H04N25/70—SSIS architectures; Circuits associated therewith
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Instruments For Measurement Of Length By Optical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
Abstract
【課題】反射ミラーと対象物とが互いに離間している場合に鮮明な干渉画像を取得することができる装置および方法を提供する。【解決手段】干渉画像取得装置1は、光源11、ビームスプリッタ12、対物レンズ13、対物レンズ14、第2反射ミラー15、チューブレンズ16、ビームスプリッタ17、撮像器18、第1反射ミラー20等を備える。透明材(容器70の底部)の一方側に細胞73が配置され、該透明材の他方側に第1反射ミラー20が配置されている。二光束干渉計において、第1反射ミラー20で反射される第1光束の光路長と、第2反射ミラー15で反射される第2光束の光路長との間の光路長差は、光源11から出力される光のコヒーレント長以下とされる。撮像器18は、撮像面と第1反射ミラー20との間の第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に細胞73を配置した状態で干渉画像を取得する。【選択図】図1
Description
本発明は、対象物の干渉画像を取得する装置および方法に関するものである。
特許文献1に、対象物の干渉画像を取得することができる装置および方法の発明が開示されている。この文献に記載された干渉画像取得装置は、光源と、この光源から出力された光を二光束に分岐した後に該二光束を合波して干渉光を出力する二光束干渉計と、この二光束干渉計から出力された干渉光を受光する撮像器とを備える。また、この干渉画像取得装置は、位相シフト法を用いて対象物の位相画像等を取得することもできる。すなわち、この干渉画像取得装置は、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を互いに異なる複数の設定値それぞれで安定化した状態とし、各状態において対象物の干渉画像を撮像器により取得し、これら取得した複数の干渉画像に基づいて位相画像等を求める。
Taewoo Kim, et. al, "White-lightdiffraction tomography of unlabelled live cells," Nature Photonics 8,256-263 (2014).
従来では、対象物を入れる容器の底部の内側に反射増強コーティングが設けられており、その反射増強コーティングの上に対象物が配置されていた。そして、二光束干渉計における二光束のうちの一方の第1光束は、対象物を透過した後に反射増強コーティングで反射されて再び対象物を透過して、他方の第2光束と合波されていた。しかし、例えば対象物が細胞である場合、容器の底部の内側に設けられた反射増強コーティングの上で細胞が培養されることとなり、その培養環境は細胞にとって好ましくない場合がある。
細胞の培養に適した環境で細胞を培養した後に、その細胞の干渉画像を取得したり位相画像等を取得したりする場合には、第1光束を反射させる反射ミラーを細胞に対して離間して配置する必要がある。従来技術では、このように反射ミラーと対象物とが互いに離間している場合には、鮮明な干渉画像等を取得することは困難である。
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、反射ミラーと対象物とが互いに離間している場合に鮮明な干渉画像を取得することができる装置および方法を提供することを目的とする。
本発明の干渉画像取得装置は、(1) インコヒーレントな光を出力する光源と、(2) 光源から出力された光を第1光束と第2光束とに分岐し、第1光束の光路上に配置された対象物を透過するとともに第1反射ミラーで反射された第1光束と、第2反射ミラーで反射された第2光束とを合波して、干渉光を出力する二光束干渉計と、(3) 二光束干渉計から出力された干渉光を受光する撮像面を有し、対象物の干渉画像を取得する撮像器と、を備える。二光束干渉計は、対象物に対して第1反射ミラーが離間して配置されており、第1反射ミラーで反射される第1光束の光路長と、第2反射ミラーで反射される第2光束の光路長との間の光路長差が、光源から出力される光のコヒーレント長以下である。撮像器は、撮像面と第1反射ミラーとの間の第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に対象物を配置した状態で干渉画像を取得する。
本発明の一側面による干渉画像取得装置では、二光束干渉計において、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置と第1反射ミラーの反射面との間の光路長と、撮像面と第2反射ミラーとの間の第2光学系において撮像面に対して共役となる位置と第2反射ミラーの反射面との間の光路長と、が互いに等しい。二光束干渉計は、第2反射ミラーの反射面の上に設けられた透明層を有するのが好適である。
本発明の他の一側面による干渉画像取得装置では、二光束干渉計において、第1光束の光路長および第2光束の光路長それぞれが可変であり、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に第1反射ミラーの反射面を配置するとともに光路長差をコヒーレント長以下とした後に、第1光束の光路長および第2光束の光路長を調整することにより、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に対象物を配置する調整部を更に備える。
本発明の更に他の一側面による干渉画像取得装置では、二光束干渉計における合波時の第1光束と第2光束との間の位相差の検出結果に基づいて該位相差をフィードバック制御する位相制御部を更に備え、調整部は、第1光束の光路長および第2光束の光路長を調整する際に位相制御部により位相差を一定に維持する。
本発明の更に他の一側面による干渉画像取得装置では、撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて対象物の位相画像を求める演算部を更に備える。
本発明の更に他の一側面による干渉画像取得装置では、演算部は、撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて対象物の位相画像および強度画像を求める。
本発明の更に他の一側面による干渉画像取得装置では、二光束干渉計において、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置を第1光学系の光軸に沿って走査し、撮像器は、走査の各位置において干渉画像を取得し、演算部は、走査の各位置について位相画像および強度画像を求め、これら位相画像および強度画像に基づいて対象物の3次元像を求める。
本発明の干渉画像取得方法は、(1) 二光束干渉計において、光源から出力されたインコヒーレントな光を第1光束と第2光束とに分岐し、第1光束の光路上に配置された対象物を透過するとともに第1反射ミラーで反射された第1光束と、第2反射ミラーで反射された第2光束とを合波して、干渉光を出力する干渉ステップと、(2) 二光束干渉計から出力された干渉光を受光する撮像面を有する撮像器により対象物の干渉画像を取得する撮像ステップと、を備える。干渉ステップは、二光束干渉計において、対象物に対して第1反射ミラーが離間して配置されており、第1反射ミラーで反射される第1光束の光路長と、第2反射ミラーで反射される第2光束の光路長との間の光路長差を、光源から出力される光のコヒーレント長以下とする。撮像ステップは、撮像面と第1反射ミラーとの間の第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に対象物を配置した状態で撮像器により干渉画像を取得する。
本発明の一側面による干渉画像取得方法では、干渉ステップは、二光束干渉計において、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置と第1反射ミラーの反射面との間の光路長と、撮像面と第2反射ミラーとの間の第2光学系において撮像面に対して共役となる位置と第2反射ミラーの反射面との間の光路長と、を互いに等しくする。二光束干渉計において、第2反射ミラーの反射面の上に透明層が設けられているのが好適である。
本発明の他の一側面による干渉画像取得方法では、二光束干渉計において、第1光束の光路長および第2光束の光路長それぞれが可変であり、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に第1反射ミラーの反射面を配置するとともに光路長差をコヒーレント長以下とした後に、第1光束の光路長および第2光束の光路長を調整することにより、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に対象物を配置する調整ステップを更に備える。
本発明の他の一側面による干渉画像取得方法では、調整ステップは、二光束干渉計における合波時の第1光束と第2光束との間の位相差の検出結果に基づいて該位相差をフィードバック制御する位相制御部により、第1光束の光路長および第2光束の光路長を調整する際に位相差を一定に維持する。
本発明の他の一側面による干渉画像取得方法では、撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて対象物の位相画像を求める演算ステップを更に備える。
本発明の他の一側面による干渉画像取得方法では、演算ステップは、撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて対象物の位相画像および強度画像を求める。
本発明の他の一側面による干渉画像取得方法では、干渉ステップは、二光束干渉計において、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置を第1光学系の光軸に沿って走査し、撮像ステップは、走査の各位置において干渉画像を撮像器により取得し、演算ステップは、走査の各位置について位相画像および強度画像を求め、これら位相画像および強度画像に基づいて対象物の3次元像を求める。
本発明の他の一側面による干渉画像取得方法では、透明材の一方側に対象物が配置され、透明材の他方側に第1反射ミラーが配置されており、干渉ステップは、対象物および透明材を順に経た後の第1光束を第1反射ミラーで反射させる。或いは、透明材の一方側に対象物が配置され、透明材の一方側において対象物と離間して第1反射ミラーが配置されており、干渉ステップは、透明材および対象物を順に経た後の第1光束を第1反射ミラーで反射させる。或いは、第1反射ミラーの反射面上に透明物質が配置され、透明物質の上または中に対象物が配置されており、干渉ステップは、対象物および透明物質を経た後の第1光束を第1反射ミラーで反射させる。或いは、対象物が細胞であり、透明物質がジェル状物質である。或いは、対象物が複数の細胞であり、これら複数の細胞のうちの少なくとも1個の細胞は透明物質の中に配置されており、これら複数の細胞は3次元的に密接していてもよい。或いは、対象物が種類の異なる複数の細胞であり、これら種類の異なる複数の細胞は透明物質の内部または表面で層を形成していてもよい。
本発明によれば、反射ミラーと対象物とが互いに離間している場合に鮮明な干渉画像を取得することができる。
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
図1は、干渉画像取得装置1の構成を示す図である。干渉画像取得装置1は、光源11、ビームスプリッタ12、対物レンズ13、対物レンズ14、第2反射ミラー15、チューブレンズ16、ビームスプリッタ17、撮像器18、第1反射ミラー20、ピエゾ素子21、光検出器22、位相制御部23、演算部30、フォーカス調整機構60および光路長差調整機構61を備える。干渉画像取得装置1は、二光束干渉計としてマイケルソン干渉計を有し、対象物の干渉画像を取得する。
対象物は、特定の細胞や生体サンプルに限定されるものではない。例えば、対象物として、培養細胞、不死化細胞、初代培養細胞、がん細胞、脂肪細胞、肝臓細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、iPS細胞、および前記細胞をもとに作られた細胞塊(コロニーまたはスフェロイド)などが挙げられる。また、対象物として、生体に限らず、工業サンプル、たとえばガラスの内部、半導体素子の内部、樹脂素材の内部、液晶、高分子化合物なども挙げられる。
本実施形態の以下の説明では、図2にサンプルの構成例が示されるように、対象物は、容器70に入れられた培養液72中の細胞73であるとする。容器70の内部は蓋71により密閉されている。容器70の底部(透明材)の外側に第1反射ミラー20が配置されている。
光源11はインコヒーレントな光を出力する。光源11は、例えばハロゲンランプなどのランプ系光源、LED(Light emitting diode)光源、SLD(Superluminescent diode)光源、ASE(Amplified spontaneous emission)光源等である。
ビームスプリッタ12は、光源11と光学的に結合され、二光束干渉計であるマイケルソン干渉計を構成する。ビームスプリッタ12は、例えば、透過率と反射率との比が1:1であるハーフミラーであってもよい。ビームスプリッタ12は、光源11から出力された光を二光束に分岐して第1光束および第2光束とする。ビームスプリッタ12は、第1光束を対物レンズ13へ出力し、第2光束を対物レンズ14へ出力する。
また、ビームスプリッタ12は、第1反射ミラー20で反射されて対物レンズ13を経た第1光束を入力するとともに、第2反射ミラー15で反射されて対物レンズ14を経た第2光束を入力する。そして、ビームスプリッタ12は、これら入力した第1光束と第2光束とを合波して、干渉光をチューブレンズ16へ出力する。
対物レンズ13は、ビームスプリッタ12と光学的に結合され、ビームスプリッタ12から出力された第1光束を容器70内の細胞73に集光する。また、対物レンズ13は、第1反射ミラー20で反射された第1光束を入力してビームスプリッタ12へ出力する。
対物レンズ14は、ビームスプリッタ12と光学的に結合され、ビームスプリッタ12から出力された第2光束を第2反射ミラー15へ出力する。また、対物レンズ14は、第2反射ミラー15の反射面で反射された第2光束を入力してビームスプリッタ12へ出力する。フォーカス調整機構60は、第2反射ミラー15に対して相対的に対物レンズ14を光軸方向に沿って移動させることで、対物レンズ14と第2反射ミラー15との間の距離を調整することができる。光路長差調整機構61は、対物レンズ14、第2反射ミラー15およびフォーカス調整機構60を光軸方向に沿って移動させることで、第1光束と第2光束との間の光路長差を調整することができる。
チューブレンズ16は、二光束干渉計を構成するビームスプリッタ12と光学的に結合され、ビームスプリッタ12から出力された干渉光を、ビームスプリッタ17を経て撮像器18の撮像面に結像する。ビームスプリッタ17は、チューブレンズ16から到達した光を2分岐して、一方の光束を撮像器18へ出力し、他方の光束を光検出器22へ出力する。ビームスプリッタ17は、例えばハーフミラーであってもよい。
撮像器18は、ビームスプリッタ17と光学的に結合され、ビームスプリッタ17から到達した干渉光を受光して干渉画像を取得する。撮像器18は、例えば、CCDエリアイメージセンサおよびCMOSエリアイメージセンサなどのイメージセンサである。
ピエゾ素子21は、第2反射ミラー15の反射面に垂直な方向に該反射面を移動させる。ピエゾ素子21は、この反射面の移動により、二光束干渉計における二光束の間の光路長差(すなわち位相差)を調整することができる。ピエゾ素子21は、波長未満の分解能で、第2反射ミラー15の反射面の位置を決めることができる。二光束干渉計において二光束の間の光路長差は可変である。
なお、ビームスプリッタ12から第1反射ミラー20までの光学的距離をL1とし、ビームスプリッタ12から第2反射ミラー15の反射面までの光学的距離をL2とすると、二光束干渉計における二光束の間の光路長差は2(L1−L2)である。この光路長差が光源11の出力光のコヒーレント長以下であれば、撮像器18は明瞭な干渉画像を取得することができる。この光路長差の調整に際して、必要とされる光路長差の調整幅がピエゾ素子21の可動距離よりも大きい場合は、光路長差調整機構61を用いてもよい。光源11の出力光のコヒーレント長は光源11の波長帯域幅に反比例する。例えば光源11がハロゲンランプであればコヒーレント長はおよそ1μmであり、光源11がLED光源であればコヒーレント長はおよそ3μmであり、光源11がSLD光源またはASE光源であればコヒーレント長はおよそ10〜50μmである。光源11の出力光の中心波長をλ0としたとき、二光束干渉計における二光束の間の位相差Δφは次式で表されるものとする。
光検出器22は、ビームスプリッタ17と光学的に結合され、ビームスプリッタ17から到達した干渉光を受光して検出信号を出力する。光検出器22は、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管であり、また、ラインセンサ(リニアセンサ)、CCDエリアイメージセンサ、CMOSエリアイメージセンサなどであってもよい。
位相制御部23は、光検出器22と電気的に接続され、光検出器22から出力される検出信号を入力する。また、位相制御部23は、ピエゾ素子21と電気的に接続され、ピエゾ素子21による光路長差の調整動作を制御する。位相制御部23は、入力した検出信号に基づいて、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を検出する。そして、位相制御部23は、この検出結果に基づくフィードバック制御により、ピエゾ素子21による光路長差の調整動作を制御する。これにより、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を設定値で安定化した状態(ロック状態)とすることができる。
撮像器18は、ロック状態において対象物(細胞73)の干渉画像を撮像して取得することができる。演算部30は、撮像器18により取得された干渉画像に基づいて対象物の複素振幅画像、位相画像および強度画像を求めることができる。演算部30は、パーソナルコンピュータおよびタブレット端末などのコンピュータであってもよい。また、演算部30は、操作者からの入力を受け付ける入力部(キーボード、マウス、タブレット端末など)、ならびに、干渉画像および位相画像等を表示する表示部(ディスプレイ、タブレット端末など)を備えていてもよい。また、演算部30は、画面に画像等を表示するとともに、その画面において操作者による領域の指定を受け付ける機能を有するのが好適である。
本実施形態では、図2に示されるとおり、透明材(容器70の底部)の一方側に細胞73が配置され、該透明材の他方側に第1反射ミラー20が配置されている。すなわち、対象物である細胞73に対して第1反射ミラー20が離間して配置されている。そして、二光束干渉計において、第1反射ミラー20で反射される第1光束の光路長と、第2反射ミラー15で反射される第2光束の光路長との間の光路長差は、光源11から出力される光のコヒーレント長以下とされる(干渉ステップ)。この光路長差の調整に際しては、ピエゾ素子21の伸長または収縮を用いてもよいし、光路長差調整機構61を用いてもよい。また、撮像器18は、撮像面と第1反射ミラー20との間の第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に細胞73を配置した状態で干渉画像を取得する(撮像ステップ)。第1光学系は、対物レンズ13およびチューブレンズ16を含む。このようにすることで、鮮明な干渉画像を取得することができる。
また、二光束干渉計において、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置と第1反射ミラー20の反射面との間の光路長と、撮像面と第2反射ミラー15との間の第2光学系において撮像面に対して共役となる位置と第2反射ミラー15の反射面との間の光路長と、を互いに等しくするのが好適である(干渉ステップ)。第2光学系は、対物レンズ14およびチューブレンズ16を含む。第2光学系において撮像面に対して共役となる位置と第2反射ミラー15の反射面との間の光路長を調整するにあたっては、フォーカス調整機構60を用いるのが好適である。このようにすることで、更に鮮明な干渉画像を取得することができる。
光源11から出力された光はビームスプリッタ12により二光束に分岐されて第1光束および第2光束とされ、ビームスプリッタ12から第1光束および第2光束が出力される。ビームスプリッタ12から出力された第1光束は、対物レンズ13により容器70内の細胞73に集光され、細胞73および容器70の底部を透過し、容器70の底部の外側に設けられた第1反射ミラー20で反射される。第1反射ミラー20で反射された第1光束は、対物レンズ13を経てビームスプリッタ12に入力される。ビームスプリッタ12から出力された第2光束は、対物レンズ14により第2反射ミラー15の反射面に入射され、その反射面で反射される。第2反射ミラー15の反射面で反射された第2光束は、対物レンズ14を経てビームスプリッタ12に入力される。
対物レンズ13からビームスプリッタ12に入力された第1光束、および、対物レンズ14からビームスプリッタ12に入力された第2光束は、ビームスプリッタ12により合波されて、ビームスプリッタ12から干渉光が出力される。この干渉光は、チューブレンズ16を経た後にビームスプリッタ17により2分岐されて、撮像器18および光検出器22それぞれにより受光される。干渉光を受光した光検出器22から検出信号が出力され、この検出信号に基づいて位相制御部23により二光束干渉計における二光束の間の光路長差が検出される。そして、位相制御部23によるピエゾ素子21に対するフィードバック制御により、二光束干渉計における二光束の間の光路長差が設定値で安定化した状態(ロック状態)とされる。ロック状態において干渉光を受光した撮像器18により干渉画像が取得され、その干渉画像は演算部30へ出力される。そして、演算部30により、干渉画像に基づいて対象物(細胞73)の位相画像等が求められる。
例えば、ピエゾ素子21、光検出器22および位相制御部23を用いたフィードバック制御により干渉光の位相差を或る初期位相で安定化させて、位相差を安定化させた状態で干渉画像I1を撮像器18により取得する。次に、ピエゾ素子21、光検出器22および位相制御部23を用いて干渉光の位相差を“初期位相+π/2”で安定化させ、位相差を安定化させた状態で干渉画像I2を撮像器18により取得する。同様にして、干渉光の位相差を“初期位相+π”で安定化させた状態で干渉画像I3を撮像器18により取得し、干渉光の位相差を“初期位相+3π/2”で安定化させた状態で干渉画像I4を撮像器18により取得する。
演算部30は、これら4つの干渉画像I1〜I4を用いて、次式の演算を行って位相画像φを求める(演算ステップ)。なお、I1〜I4およびφは画素位置(x,y)の関数であり、次式の演算は画素毎に行われる。argは複素数の偏角を取得する演算子である。iは虚数単位である。
図3は、干渉画像取得装置1の第1変形例の構成を示す図である。図1に示された干渉画像取得装置1の構成と比較すると、図3に示される第1変形例の干渉画像取得装置1Aは、反射ミラー19およびステージ41を備える点で相違する。
反射ミラー19は、ビームスプリッタ12と対物レンズ14との間の第2光束の光路上に設けられており、第2光束を反射させる。この反射ミラー19が設けられることにより、対物レンズ13および対物レンズ14それぞれの光軸を互いに平行にすることができ、また、第1反射ミラー20および第2反射ミラー15それぞれの反射面を互いに平行にすることができる。
ステージ41は、対物レンズ13および対物レンズ14それぞれの光軸に沿った方向に、容器70、第1反射ミラー20、ピエゾ素子21および第2反射ミラー15を移動させることができる。すなわち、第1光束の光路長および第2光束の光路長それぞれを可変とすることができる。
ステージ41は、対象物である細胞73を配置する位置を調整する調整部として用いられる。すなわち、先ず、ステージ41により、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に第1反射ミラー20の反射面を配置し、フォーカス調整機構60を用いて第2光学系において第2反射ミラー15の反射面と撮像面とを互いに共役な位置関係にし、かつ第1光学系と第2光学系との間の光路長差をコヒーレント長以下とする(干渉ステップ)。
その後に、ステージ41により、第1光束の光路長および第2光束の光路長を調整することにより、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に対象物を配置する(調整ステップ)。この状態では、自動的に、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置と第1反射ミラー20の反射面との間の光路長と、撮像面と第2反射ミラー15との間の第2光学系において撮像面に対して共役となる位置と第2反射ミラー15の反射面との間の光路長と、が概ね互いに等しくなる。このようにすることで、対象物の配置を容易に調整することができ、また、第1光学系および第2光学系それぞれにおける撮像面に対する共役位置を容易に調整することができる。
上記干渉ステップにおいて、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に第1反射ミラー20の反射面を配置し、第2光学系において第2反射ミラー15の反射面と撮像面とを共役な位置とするにあたっては、フォーカス調整を容易にするために、第1反射ミラー20および第2反射ミラー15の一方または両方の反射面に色素または微小なキズ等により目印を付けて用いてもよい。この目印は、対象物の撮像時にはステージ41により第1光束および第2光束の光路長が調整されることによりデフォーカスするため、対象物の画像撮像時においては画像に影響を与えない。
なお、ステージ41による第1反射ミラー20および第2反射ミラー15それぞれの位置調整量が互いに同じであっても、第1光学系と第2光学系との間で光学条件が相違することにより、第1光束および第2光束それぞれの光路長調整量が互いに異なる場合がある。したがって、第1光束の光路長および第2光束の光路長を調整する際に、位相制御部23によるフィードバック制御により、ピエゾ素子21を駆動して位相差を一定に維持するのが好適である。
また、図14に示すように、第1光学系と第2光学系との間での光学条件の相違を低減するために、第2反射ミラー15の反射面の上側に透明層24を設けてもよい。この透明層24の材質は、第1光学系において第1反射ミラー20と対象物との間にある容器70の底部(後述する図8では透明物質95)と同一または屈折率が概ね等しいものを用いるのが好ましい。例えば容器70がポリスチレン製の細胞培養容器底面部である場合は、透明層24もポリスチレンであるのが好ましい。この構成においては、前記調整ステップによって第1光束の実長および第2光束の実長を互いに同一距離だけ増加または減少させた際に、第1光束の光路長および第2光束の光路長の双方に関しても互いに同一距離だけ増加または減少するので都合が良い。
なお、容器70、第1反射ミラー20、ピエゾ素子21および第2反射ミラー15をステージ41により移動させることに替えて又は加えて、光源11、ビームスプリッタ12、対物レンズ13、対物レンズ14および反射ミラー19を含む光学系2を移動させてもよい。
図4は、干渉画像取得装置1の第2変形例の構成を示す図である。図3に示された第1変形例の干渉画像取得装置1Aの構成と比較すると、図4に示される第2変形例の干渉画像取得装置1Bは、ステージ41に替えて、ステージコントローラ50、第1ステージ51および第2ステージ52を備える点で相違する。
第1ステージ51は、対物レンズ13の光軸に沿った方向に、容器70および第1反射ミラー20を移動させることができる。第2ステージ52は、対物レンズ14の光軸に沿った方向に、ピエゾ素子21および第2反射ミラー15を移動させることができる。すなわち、第1光束の光路長および第2光束の光路長それぞれを互いに独立に可変とすることができる。ステージコントローラ50は、第1ステージ51および第2ステージ52それぞれの動作を制御する。
ステージコントローラ50、第1ステージ51および第2ステージ52は、対象物である細胞73を配置する位置を調整する調整部として用いられる。すなわち、先ず、第1ステージ51により、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に第1反射ミラー20の反射面を配置するとともに、第2ステージ52(およびピエゾ素子21)により光路長差をコヒーレント長以下とし、さらにフォーカス調整機構60を用いて第2光学系において第2反射ミラー15の反射面と撮像面とを共役な位置関係にする。その後に、第1ステージ51により第1光束の光路長を調整するとともに、第2ステージ52により第2光束の光路長を調整することにより、第1光学系において撮像面に対して共役となる位置に対象物を配置する(調整ステップ)。このようにすることで、対象物の配置を容易に調整することができ、また、第1光学系および第2光学系それぞれにおける撮像面に対する共役位置を容易に調整することができる。
第2変形例においても、第1光束の光路長および第2光束の光路長を調整する際に、位相制御部23によるフィードバック制御により、ピエゾ素子21を駆動して位相差を一定に維持するのが好適である。また、図14に示すように、第2反射ミラー15の反射面の上側に透明層24を設けてもよい。また、第1ステージ51による容器70および第1反射ミラー20の移動ならびに第2ステージ52によるピエゾ素子21および第2反射ミラー15の移動に替えて又は加えて、光源11、ビームスプリッタ12、対物レンズ13、対物レンズ14および反射ミラー19を含む光学系2を移動させてもよい。
図2に示されるサンプル構成例を用いた実施例について説明する。図5は、実施例で用いたサンプルの構成を示す図である。容器70として35mmΦのプラスチックディッシュを用いた。容器70の底部の厚さは1mmであった。蓋71の中央部の下面が培養液72に接することで、培養液72の液面が空気に触れないようにして、培養液72の液面が変動しないようにした。対象物としての細胞73としてHeLa細胞を用いた。対物レンズ13,14それぞれの倍率は10倍であった。光源11の出力光波長は633nmであり、出力光帯域幅は3nmであった。光源11のコヒーレント長はおよそ50μmであった。図6は、実施例で得られた複数の干渉画像に基づいて作成された位相画像を示す図である。本実施例では、鮮明な干渉画像が得られたことにより、この図に示されるような鮮明な位相画像が得られた。
図7は、サンプルの第1変形例の構成を示す図である。この図に示される第1変形例のサンプルは、対物レンズ13が倒立型顕微鏡の一部である場合に好適である。対象物は、容器80に入れられた培養液82中の細胞83である。第1反射ミラー20は、容器80の底部の内側に、スペーサ84により容器80の底部と離間して配置されている。第1反射ミラー20の少なくとも反射面は培養液82に接している。対象物としての細胞83は、容器80の底部、第1反射ミラー20およびスペーサ84により囲われた空間に存在する。容器80の上部は蓋81が被せられている。すなわち、このサンプル構成例では、容器80の底部(透明材)の一方側に細胞83が配置され、該透明材の該一方側において細胞83と離間して第1反射ミラー20が配置されている。対物レンズ13から出力された第1光束は、容器80の底部(透明材)および細胞83を順に経た後に第1反射ミラー20で反射される。
図8は、サンプルの第2変形例の構成を示す図である。この図に示される第2変形例のサンプルにおいては、対象物は、容器90に入れられた培養液92中の細胞93である。第1反射ミラー20は、容器90の底部の内側に配置されている。第1反射ミラー20は、容器90の底部の内側に形成された反射増強コーティングであってもよい。第1反射ミラー20の反射面上に透明物質95が配置され、この透明物質95の上または中に対象物としての細胞93が配置されている。容器90の内部は蓋91により密閉されている。対物レンズ13から出力された第1光束は、細胞93および透明物質95を経た後に第1反射ミラー20で反射される。対象物が細胞である場合、透明物質は、その細胞を培養するジェル状物質(例えば、マトリゲル、コラーゲンおよびゼラチン等)であってもよい。
図8に示されるサンプル構成例を用いた実施例について説明する。図9は、実施例で用いたサンプルの構成を示す図である。容器90として、底部の内側の面に反射増強コーティングを形成したガラスボトムディッシュを用いた。この反射増強コーティングを第1反射ミラー20として用いた。この第1反射ミラー20の上にマトリゲル層を透明物質95として配置した。マトリゲル層の厚さは凡そ百μmであった。蓋91の中央部の下面が培養液92に接することで、培養液92の液面が空気に触れないようにして、培養液92の液面が変動しないようにした。対象物としての細胞93として初代培養(primary culture)のリンパ管内皮細胞を用いた。対物レンズ13,14それぞれの倍率は10倍であった。光源11の出力光波長は633nmであった。図10は、実施例で得られた複数の干渉画像に基づいて作成された位相画像を示す図である。本実施例でも、鮮明な干渉画像が得られたことにより、この図に示されるような鮮明な位相画像が得られた。
図11は、図8に示されたサンプル構成例において対象物が3次元的に分布している様子を示す図である。例えば、細胞外マトリクスと呼ばれるジェル状物質(マトリゲル、コラーゲン、ゼラチン等)を透明物質95として用いて、ジェル状物質の上で培養した細胞は、培養を続けていく間にジェル状物質内に侵入してジェル状物質内を3次元的に遊走し、組織構造を形成することが知られている。また、ジェル状物質としてのマトリゲル上で培養した脈管内皮細胞は、当初は分散的に播種した場合であっても、培養を続けていく間に自己組織化によって血管様またはリンパ管様の構造を自発的に形成することが知られている。これはチューブフォーメーションと呼ばれる。チューブフォーメーションが適切に起こっているか否かを観察することによって細胞の性質を判断することが可能である。
本実施形態では、このように対象物が3次元的に分布している場合に、対象物の3次元像を求めることができる(非特許文献1参照)。すなわち、二光束干渉計において第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置を第1光学系の光軸に沿って走査し、撮像器18は、その走査の各位置において干渉画像を取得する。第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置を光軸に沿って走査するにあたっては、前記第1変形例または前記第2変形例の構成を用いるのが好ましい。演算部30は、共役位置の走査の各位置について対象物の位相画像および強度画像を求め、これらに基づいて対象物の3次元像を求める。
図12は、図8に示されたサンプル構成例において複数の対象物が3次元的に分布しており、複数の対象物の幾つかが3次元的に集合している様子を示す図である。対象物の3次元分布において対象物同士が3次元的に密接し、一部の対象物は他の対象物の直上に配置されている。例えば、細胞外マトリクスと呼ばれるジェル状物質(マトリゲル、コラーゲン、ゼラチン等)を透明物質95として用いて培養した細胞93は、培養期間が長くなるにつれて、細胞分裂または自己組織化により細胞同士が3次元的に密接した配置をとることがある。このような3次元的配置において、一部または全部の細部はジェル状物質内に埋没する。このようなサンプル構成においても同様に、二光束干渉計において第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置を第1光学系の光軸に沿って走査し、撮像器18がその走査の各位置において干渉画像を取得することにより、共役位置の走査の各位置について対象物の位相画像および強度画像を演算部30において求め、これらに基づいて対象物の3次元像を求めることが可能である。
図13は、図8に示されたサンプル構成例において複数の対象物が3次元的に分布しており、複数の対象物の幾つかが3次元的に集合していて、その集合体が複数種類の対象物を含んでいる様子を示す図である。例えば、細胞外マトリクスと呼ばれるジェル状物質(マトリゲル、コラーゲン、ゼラチン等)を透明物質95として用い、最初に透明物質95の内部に埋没させて第1種類の細胞93Aを培養し、次に透明物質95の表面に第2種類の細胞93Bを培養してもよい。このような培養条件では、第2種類の細胞93Bは、先に培養された第1種類の細胞93Aが放出する化学物質等の影響によって、第1種類の細胞93Aと3次元的に密接する位置に遊走し、3次元的構造を形成する。例えば、第1種類の細胞として線維芽細胞を用い、第2種類の細胞として血管またはリンパ管系の脈管内皮細胞を用いることで、生体内でのリンパ管または血管の構造を模したサンプルを構成することができる。
このようなサンプル構成においても同様に、二光束干渉計において第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置を第1光学系の光軸に沿って走査し、撮像器18がその走査の各位置において干渉画像を取得することにより、共役位置の走査の各位置について対象物の位相画像および強度画像を演算部30において求め、これらに基づいて対象物の3次元像を求めることが可能である。共役位置の走査においては、透明物質95の内部に埋没した第1種類の細胞93Aを観察するよう条件を設定してもよいし、第1種類の細胞の上に配置された第2種類の細胞93Bを観察するよう条件を設定してもよい。
以上のように本実施形態では、反射ミラーと対象物とが互いに離間している場合に、鮮明な干渉画像を取得することができ、さらに鮮明な位相画像を取得することができる。図2に示されるサンプル構成例では、容器の底部の内側に反射増強コーティングが施されていなくてもよいので、容器として安価な市販のディッシュを用いることができる。また、図2に示されるサンプル構成例では、例えば対象物が感染性のある細胞である等の理由により再利用ができない場合には、測定後に容器のみを廃棄すればよいので、ランニングコストが低く、廃棄物量も抑えられる。図7に示されるサンプル構成例でも、容器の底部の内側に反射増強コーティングが施されていなくてもよいので、容器として安価な市販のディッシュを用いることができる。図8に示されるサンプル構成例では、対象物について3次元的な観察を行うことができる。
1,1A,1B…干渉画像取得装置、11…光源、12…ビームスプリッタ、13,14…対物レンズ、15…第2反射ミラー、16…チューブレンズ、17…ビームスプリッタ、18…撮像器、19…反射ミラー、20…第1反射ミラー、21…ピエゾ素子、22…光検出器、23…位相制御部、24…透明層、30…演算部、41…ステージ、50…ステージコントローラ、51…第1ステージ、52…第2ステージ、60…フォーカス調整機構、61…光路長差調整機構、70…容器、71…蓋、72…培養液、73…細胞、80…容器、81…蓋、82…培養液、83…細胞、84…スペーサ、90…容器、91…蓋、92…培養液、93…細胞、93A…第1種類の細胞、93B…第2種類の細胞、95…透明物質。
Claims (22)
- インコヒーレントな光を出力する光源と、
前記光源から出力された光を第1光束と第2光束とに分岐し、前記第1光束の光路上に配置された対象物を透過するとともに第1反射ミラーで反射された前記第1光束と、第2反射ミラーで反射された前記第2光束とを合波して、干渉光を出力する二光束干渉計と、
前記二光束干渉計から出力された干渉光を受光する撮像面を有し、前記対象物の干渉画像を取得する撮像器と、
を備え、
前記二光束干渉計は、前記対象物に対して前記第1反射ミラーが離間して配置されており、前記第1反射ミラーで反射される前記第1光束の光路長と、前記第2反射ミラーで反射される前記第2光束の光路長との間の光路長差が、前記光源から出力される光のコヒーレント長以下であり、
前記撮像器は、前記撮像面と前記第1反射ミラーとの間の第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置に前記対象物を配置した状態で前記干渉画像を取得する、
干渉画像取得装置。 - 前記二光束干渉計において、前記第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置と前記第1反射ミラーの反射面との間の光路長と、前記撮像面と前記第2反射ミラーとの間の第2光学系において前記撮像面に対して共役となる位置と前記第2反射ミラーの反射面との間の光路長と、が互いに等しい、
請求項1に記載の干渉画像取得装置。 - 前記二光束干渉計は、前記第2反射ミラーの反射面の上に設けられた透明層を有する、
請求項1または2に記載の干渉画像取得装置。 - 前記二光束干渉計において、前記第1光束の光路長および前記第2光束の光路長それぞれが可変であり、
前記第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置に前記第1反射ミラーの反射面を配置するとともに前記光路長差をコヒーレント長以下とした後に、前記第1光束の光路長および前記第2光束の光路長を調整することにより、前記第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置に前記対象物を配置する調整部を更に備える、
請求項1〜3の何れか1項に記載の干渉画像取得装置。 - 前記二光束干渉計における合波時の前記第1光束と前記第2光束との間の位相差の検出結果に基づいて該位相差をフィードバック制御する位相制御部を更に備え、
前記調整部は、前記第1光束の光路長および前記第2光束の光路長を調整する際に前記位相制御部により前記位相差を一定に維持する、
請求項4に記載の干渉画像取得装置。 - 前記撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて前記対象物の位相画像を求める演算部を更に備える、
請求項1〜5の何れか1項に記載の干渉画像取得装置。 - 前記演算部は、前記撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて前記対象物の位相画像および強度画像を求める、
請求項6に記載の干渉画像取得装置。 - 前記二光束干渉計において、前記第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置を前記第1光学系の光軸に沿って走査し、
前記撮像器は、前記走査の各位置において干渉画像を取得し、
前記演算部は、前記走査の各位置について位相画像および強度画像を求め、これら位相画像および強度画像に基づいて前記対象物の3次元像を求める、
請求項7に記載の干渉画像取得装置。 - 二光束干渉計において、光源から出力されたインコヒーレントな光を第1光束と第2光束とに分岐し、前記第1光束の光路上に配置された対象物を透過するとともに第1反射ミラーで反射された前記第1光束と、第2反射ミラーで反射された前記第2光束とを合波して、干渉光を出力する干渉ステップと、
前記二光束干渉計から出力された干渉光を受光する撮像面を有する撮像器により前記対象物の干渉画像を取得する撮像ステップと、
を備え、
前記干渉ステップは、前記二光束干渉計において、前記対象物に対して前記第1反射ミラーが離間して配置されており、前記第1反射ミラーで反射される前記第1光束の光路長と、前記第2反射ミラーで反射される前記第2光束の光路長との間の光路長差を、前記光源から出力される光のコヒーレント長以下とし、
前記撮像ステップは、前記撮像面と前記第1反射ミラーとの間の第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置に前記対象物を配置した状態で前記撮像器により前記干渉画像を取得する、
干渉画像取得方法。 - 前記干渉ステップは、前記二光束干渉計において、前記第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置と前記第1反射ミラーの反射面との間の光路長と、前記撮像面と前記第2反射ミラーとの間の第2光学系において前記撮像面に対して共役となる位置と前記第2反射ミラーの反射面との間の光路長と、を互いに等しくする、
請求項9に記載の干渉画像取得方法。 - 前記二光束干渉計において、前記第2反射ミラーの反射面の上に透明層が設けられている、
請求項9または10に記載の干渉画像取得方法。 - 前記二光束干渉計において、前記第1光束の光路長および前記第2光束の光路長それぞれが可変であり、
前記第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置に前記第1反射ミラーの反射面を配置するとともに前記光路長差をコヒーレント長以下とした後に、前記第1光束の光路長および前記第2光束の光路長を調整することにより、前記第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置に前記対象物を配置する調整ステップを更に備える、
請求項9〜11の何れか1項に記載の干渉画像取得方法。 - 前記調整ステップは、前記二光束干渉計における合波時の前記第1光束と前記第2光束との間の位相差の検出結果に基づいて該位相差をフィードバック制御する位相制御部により、前記第1光束の光路長および前記第2光束の光路長を調整する際に前記位相差を一定に維持する、
請求項12に記載の干渉画像取得方法。 - 前記撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて前記対象物の位相画像を求める演算ステップを更に備える、
請求項9〜13の何れか1項に記載の干渉画像取得方法。 - 前記演算ステップは、前記撮像器により取得された複数の干渉画像に基づいて前記対象物の位相画像および強度画像を求める、
請求項14に記載の干渉画像取得方法。 - 前記干渉ステップは、前記二光束干渉計において、前記第1光学系において前記撮像面に対して共役となる位置を前記第1光学系の光軸に沿って走査し、
前記撮像ステップは、前記走査の各位置において干渉画像を前記撮像器により取得し、
前記演算ステップは、前記走査の各位置について位相画像および強度画像を求め、これら位相画像および強度画像に基づいて前記対象物の3次元像を求める、
請求項15に記載の干渉画像取得方法。 - 透明材の一方側に前記対象物が配置され、前記透明材の他方側に前記第1反射ミラーが配置されており、
前記干渉ステップは、前記対象物および前記透明材を順に経た後の前記第1光束を前記第1反射ミラーで反射させる、
請求項9〜16の何れか1項に記載の干渉画像取得方法。 - 透明材の一方側に前記対象物が配置され、前記透明材の前記一方側において前記対象物と離間して前記第1反射ミラーが配置されており、
前記干渉ステップは、前記透明材および前記対象物を順に経た後の前記第1光束を前記第1反射ミラーで反射させる、
請求項9〜16の何れか1項に記載の干渉画像取得方法。 - 前記第1反射ミラーの反射面上に透明物質が配置され、前記透明物質の上または中に前記対象物が配置されており、
前記干渉ステップは、前記対象物および前記透明物質を経た後の前記第1光束を前記第1反射ミラーで反射させる、
請求項9〜16の何れか1項に記載の干渉画像取得方法。 - 前記対象物が細胞であり、前記透明物質がジェル状物質である、
請求項19に記載の干渉画像取得方法。 - 前記対象物が複数の細胞であり、前記複数の細胞のうちの少なくとも1個の細胞は前記透明物質の中に配置されており、前記複数の細胞は3次元的に密接している、
請求項19または20に記載の干渉画像取得方法。 - 前記対象物が種類の異なる複数の細胞であり、前記種類の異なる複数の細胞は前記透明物質の内部または表面で層を形成している、
請求項19〜21の何れか1項に記載の干渉画像取得方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018004681A JP6984822B2 (ja) | 2018-01-16 | 2018-01-16 | 干渉画像取得装置および干渉画像取得方法 |
US16/962,024 US11630059B2 (en) | 2018-01-16 | 2018-11-22 | Interference image acquiring device and method for acquiring interference image |
CN201880085772.6A CN111556951B (zh) | 2018-01-16 | 2018-11-22 | 干涉图像取得装置和干涉图像取得方法 |
PCT/JP2018/043207 WO2019142492A1 (ja) | 2018-01-16 | 2018-11-22 | 干渉画像取得装置および干渉画像取得方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018004681A JP6984822B2 (ja) | 2018-01-16 | 2018-01-16 | 干渉画像取得装置および干渉画像取得方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019124547A true JP2019124547A (ja) | 2019-07-25 |
JP6984822B2 JP6984822B2 (ja) | 2021-12-22 |
Family
ID=67301117
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018004681A Active JP6984822B2 (ja) | 2018-01-16 | 2018-01-16 | 干渉画像取得装置および干渉画像取得方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11630059B2 (ja) |
JP (1) | JP6984822B2 (ja) |
CN (1) | CN111556951B (ja) |
WO (1) | WO2019142492A1 (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57173704A (en) * | 1981-04-20 | 1982-10-26 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Highly stable interferometer |
US20130010283A1 (en) * | 2010-01-06 | 2013-01-10 | Martin Villiger | Dark field optical coherence microscopy |
JP2016519940A (ja) * | 2013-05-24 | 2016-07-11 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 質量応答における変化による望ましいtリンパ球の同定 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4124223C2 (de) * | 1991-07-22 | 2001-07-26 | Zeiss Carl | Verfahren zur Auswertung von Interferogrammen und Interferometer |
CN100498415C (zh) * | 2003-03-27 | 2009-06-10 | 株式会社Eci | 观察工具及使用该工具的观察方法 |
US10018818B2 (en) * | 2007-05-16 | 2018-07-10 | Photonanoscopy Corporation | Structured standing wave microscope |
CN201732057U (zh) * | 2009-05-06 | 2011-02-02 | 许忠保 | 微分干涉相衬层析显微镜 |
EP2498048A1 (de) * | 2011-03-10 | 2012-09-12 | Agfa HealthCare N.V. | System und Verfahren zur optischen Kohärenztomographie |
CN103842769B (zh) * | 2011-08-02 | 2017-12-15 | 加利福尼亚大学董事会 | 通过活细胞干涉测量法的快速、大量平行单细胞药物响应测量 |
US20130093871A1 (en) * | 2011-10-18 | 2013-04-18 | Andreas G. Nowatzyk | Omnidirectional super-resolution microscopy |
US9234814B1 (en) * | 2013-06-24 | 2016-01-12 | Bruker Nano Inc. | Automated re-focusing of interferometric reference mirror |
CN204388780U (zh) * | 2014-12-10 | 2015-06-10 | 佛山市南海区欧谱曼迪科技有限责任公司 | 一种多波长相移显微成像系统 |
CN107209001A (zh) * | 2015-01-30 | 2017-09-26 | 浜松光子学株式会社 | 干涉观察装置 |
CN107121092A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-09-01 | 西安交通大学 | 一种激光干涉检测轴承滚珠面型误差的系统及方法 |
WO2019224405A1 (es) * | 2018-05-23 | 2019-11-28 | Fundació Institut De Ciències Fotòniques | Aparato para explorar una propiedad óptica de una muestra |
US20200400503A1 (en) * | 2019-06-21 | 2020-12-24 | Shimadzu Corporation | Fixed mirror, interferometer, and fourier transform spectrophotometer |
-
2018
- 2018-01-16 JP JP2018004681A patent/JP6984822B2/ja active Active
- 2018-11-22 US US16/962,024 patent/US11630059B2/en active Active
- 2018-11-22 CN CN201880085772.6A patent/CN111556951B/zh active Active
- 2018-11-22 WO PCT/JP2018/043207 patent/WO2019142492A1/ja active Application Filing
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57173704A (en) * | 1981-04-20 | 1982-10-26 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Highly stable interferometer |
US20130010283A1 (en) * | 2010-01-06 | 2013-01-10 | Martin Villiger | Dark field optical coherence microscopy |
JP2016519940A (ja) * | 2013-05-24 | 2016-07-11 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 質量応答における変化による望ましいtリンパ球の同定 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US11630059B2 (en) | 2023-04-18 |
CN111556951B (zh) | 2022-05-03 |
CN111556951A (zh) | 2020-08-18 |
JP6984822B2 (ja) | 2021-12-22 |
US20200400562A1 (en) | 2020-12-24 |
WO2019142492A1 (ja) | 2019-07-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10302569B2 (en) | Microscope device and image acquisition method | |
WO2016121250A1 (ja) | 干渉観察装置および干渉観察方法 | |
US10578601B2 (en) | Photostimulation device and photostimulation method | |
JP6358577B2 (ja) | 走査型光学顕微鏡 | |
KR101356706B1 (ko) | 광량 변조와 스캐닝 시스템 기반의 구조 조명 현미경 | |
JP6243110B2 (ja) | レーザー走査顕微鏡装置 | |
JP6576369B2 (ja) | 干渉光学装置、干渉観察装置および干渉観察方法 | |
KR102490763B1 (ko) | 수차 보정 방법 및 광학 장치 | |
CN109459414A (zh) | 光图像计测装置 | |
WO2019142492A1 (ja) | 干渉画像取得装置および干渉画像取得方法 | |
JP6646426B2 (ja) | 干渉観察装置および干渉観察方法 | |
JP6539391B2 (ja) | 顕微鏡装置及び画像取得方法 | |
JP7174604B2 (ja) | 光画像計測装置、光画像計測方法 | |
US20150323304A1 (en) | Optical property measurement apparatus and optical property measurement method | |
JP2022089626A (ja) | 干渉画像取得装置および干渉画像取得方法 | |
JP6982198B2 (ja) | 観察装置および方法並びに観察装置制御プログラム | |
WO2019130796A1 (ja) | 計数装置および計数方法 | |
Fink et al. | Stray light rejection by structured illumination | |
JP2016133636A (ja) | 画像取得装置および画像取得方法 | |
EP2682800A1 (en) | Method and system for producing quantitative images in optical phase microscopy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20201222 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211026 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211111 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6984822 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |