WO2019130796A1

WO2019130796A1 - 計数装置および計数方法

Info

Publication number: WO2019130796A1
Application number: PCT/JP2018/040391
Authority: WO
Inventors: 豊彦山内; 秀直山田
Original assignee: 浜松ホトニクス株式会社
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2019-07-04
Also published as: JP6884095B2; JP2019117490A

Abstract

計数装置１は、干渉画像取得部２および演算部３を備える。干渉画像取得部２は、二光束干渉計を有し、１または複数の対象物の干渉画像を取得する。演算部３は、干渉画像取得部２により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求める。さらに、演算部３は、その光学的厚さ画像のうちの関心領域内の光学的厚さの積分値と、対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、関心領域内の対象物の個数を求める。これにより、関心領域内の対象物の個数を正確に計数することができる計数装置および計数方法が実現される。

Description

計数装置および計数方法

　本開示は、関心領域内の対象物の個数を計数する装置および方法に関するものである。

　細胞の個数を計数する技術が非特許文献１～３に記載されている。これらの文献に記載された計数技術は、デジタルデータとして取得された画像において個々の細胞領域のセグメンテーションを行うことで、その画像または関心領域内にある細胞の個数を計数する。

国際公開第２０１６／１２１２５０号

K. Liimatainen et al., "Supervised method for cell counting from bright field focus stacks", 2016 IEEE 13th International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI), 2016, pp.391-394 H. A. Khan et al., "Counting Clustered Cells using Distance Mapping", International Conference on Informatics, Electronics & Vision (ICIEV), 2013, pp.1-6 C. F. Koyuncu et al., "Smart Markers for Watershed-Based Cell Segmentation", PLOS ONE 7(11), e48664, 2012, pp.1-11

　非特許文献１～３に記載された計数技術では、細胞領域のセグメンテーションに要する時間が長く、また、計数誤差が大きい。特に、細胞が上下に重なっている場合のように細胞が集合体となっている場合には、計数誤差が更に大きい。このような問題は、細胞の個数を計数する場合だけでなく、他の対象物の個数を計数する場合にも存在する。

　実施形態は、関心領域内の対象物の個数を正確に計数することができる計数装置および計数方法を提供することを目的とする。

　実施形態は、計数装置である。計数装置は、（１）１または複数の対象物を含む干渉画像を取得する干渉画像取得部と、（２）干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、光学的厚さ画像のうちの関心領域内の光学的厚さの積分値と、対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、関心領域内の対象物の個数を求める演算部と、を備える。

　実施形態は、計数方法である。計数方法は、（１）１または複数の対象物を含む干渉画像を干渉画像取得部により取得する画像取得ステップと、（２）干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、光学的厚さ画像のうちの関心領域内の光学的厚さの積分値と、対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、関心領域内の対象物の個数を求める演算ステップと、を備える。

　実施形態によれば、関心領域内の対象物の個数を正確に計数することができる。

図１は、第１実施形態の計数装置１の構成を示す図である。図２は、サンプルの構成を示す図である。図３は、干渉画像取得部２により取得された５つの干渉画像Ｉ１～Ｉ５を示す図である。図４は、図３の干渉画像Ｉ１～Ｉ５に基づいて演算部３により求められた光学的厚さ画像を示す図である。図５は、図３の干渉画像と同視野の細胞核染色画像を示す図である。図６は、９つの視野それぞれについて光学的厚さの積分値、推定細胞数、真の細胞数および誤差を纏めた表である。図７は、９つの視野それぞれについて推定細胞数および真の細胞数を示すグラフである。図８は、第１実施形態の計数装置１の動作および第１実施形態の計数方法を説明するフローチャートである。図９は、細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を取得する方法の第１の好適例を説明するための視野を示す図であり、（ａ）細胞が低密度で分布している視野、及び（ｂ）細胞が高密度で分布している視野を示す。図１０は、細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を取得する方法の第２の好適例を説明するための視野を示す図である。図１１は、解析対象領域の光学的厚さ画像の模式図である。図１２は、マルチウェルプレートの各ウェルを解析対象の関心領域とした場合の光学的厚さ画像の模式図である。図１３は、容器８０に入れられた培養液８２中の複数の細胞集団８３を示す図である。図１４は、容器９０のウェル９１に個々に分散されて入れられた細胞７３、および、容器９０のウェル９２に入れられた細胞集団８３を示す図である。図１５は、細胞集団に含まれる細胞の個数を計数する手順を説明するフローチャートである。図１６は、互いに異なる光学倍率で干渉画像取得部２により取得した干渉画像から得られる光学的厚さ画像を示す図であり、（ａ）関心領域ＲＯＩmainおよび領域ＲＯＩconの双方を含む低倍率の光学的厚さ画像、及び（ｂ）領域ＲＯＩconのみを含む高倍率の光学的厚さ画像を示す。図１７は、干渉画像取得部２の光学倍率を切り替えて細胞の個数を計数する手順を説明するフローチャートである。

　以下、添付図面を参照して、計数装置および計数方法の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではない。

　（第１実施形態）

　図１は、第１実施形態の計数装置１の構成を示す図である。計数装置１は、干渉画像取得部２および演算部３を備える。干渉画像取得部２は、光源１１、ビームスプリッタ１２、対物レンズ１３、対物レンズ１４、参照ミラー１５、チューブレンズ１６、ビームスプリッタ１７、撮像器１８、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を含む。

　干渉画像取得部２は、二光束干渉計としてマイケルソン干渉計を有し、１または複数の対象物の干渉画像を取得する。演算部３は、干渉画像取得部２により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求める。さらに、演算部３は、その光学的厚さ画像のうちの関心領域内の光学的厚さの積分値と、対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、関心領域内の対象物の個数を求める。

　対象物は、特定の細胞や生体サンプルに限定されるものではない。例えば、対象物として、培養細胞、不死化細胞、初代培養細胞、がん細胞、脂肪細胞、肝臓細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および前記細胞をもとに作られた細胞塊（コロニーまたはスフェロイド）などが挙げられる。また、対象物として、生体に限らず、工業サンプル、たとえば金属表面、半導体表面、ガラス表面、半導体素子の内部、樹脂素材表面、液晶、高分子化合物なども挙げられる。

　本実施形態の以下の説明では、図２にサンプルの構成例が示されるように、対象物は、容器７０に入れられた培養液７２中の細胞７３であるとする。容器７０の底部の内側には反射増強コーティング７１が設けられている。

　光源１１は光を出力する。好適には光源１１はインコヒーレント光を出力する。光源１１は、例えばハロゲンランプなどのランプ系光源、ＬＥＤ（Light emitting diode）光源、ＳＬＤ（Super luminescent diode）光源、ＡＳＥ（Amplified spontaneous emission）光源等である。

　ビームスプリッタ１２は、光源１１と光学的に結合され、二光束干渉計であるマイケルソン干渉計を構成する。ビームスプリッタ１２は、例えば、透過率と反射率との比が１：１であるハーフミラーであってもよい。ビームスプリッタ１２は、光源１１から出力された光を二光束に分岐して第１分岐光および第２分岐光とする。ビームスプリッタ１２は、第１分岐光を対物レンズ１３へ出力し、第２分岐光を対物レンズ１４へ出力する。

　また、ビームスプリッタ１２は、反射増強コーティング７１で反射されて対物レンズ１３を経た第１分岐光を入力するとともに、参照ミラー１５で反射されて対物レンズ１４を経た第２分岐光を入力する。そして、ビームスプリッタ１２は、これら入力した第１分岐光と第２分岐光とを合波して、干渉光をチューブレンズ１６へ出力する。

　対物レンズ１３は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された第１分岐光を容器７０内の細胞７３に集光する。また、対物レンズ１３は、反射増強コーティング７１で反射された第１分岐光を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。

　対物レンズ１４は、ビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された第２分岐光を参照ミラー１５の反射面に集光する。また、対物レンズ１４は、参照ミラー１５の反射面で反射された第２分岐光を入力してビームスプリッタ１２へ出力する。

　チューブレンズ１６は、干渉光学系を構成するビームスプリッタ１２と光学的に結合され、ビームスプリッタ１２から出力された干渉光を、ビームスプリッタ１７を経て撮像器１８の撮像面に結像する。ビームスプリッタ１７は、チューブレンズ１６から到達した光を２分岐して、一方の分岐光を撮像器１８へ出力し、他方の分岐光を光検出器２２へ出力する。ビームスプリッタ１７は、例えばハーフミラーであってもよい。

　撮像器１８は、ビームスプリッタ１７と光学的に結合され、ビームスプリッタ１７から到達した干渉光を受光して干渉画像を取得する。撮像器１８は、例えば、ＣＣＤエリアイメージセンサおよびＣＭＯＳエリアイメージセンサなどのイメージセンサである。

　ピエゾ素子２１は、参照ミラー１５の反射面に垂直な方向に該反射面を移動させる。ピエゾ素子２１は、この反射面の移動により、二光束干渉計における二光束の間の光路長差（すなわち位相差）を調整することができる。ピエゾ素子２１は、波長未満の分解能で、参照ミラー１５の反射面の位置を決めることができる。二光束干渉計において二光束の間の光路長差は可変である。

　なお、ビームスプリッタ１２から反射増強コーティング７１までの光学的距離をＬ１とし、ビームスプリッタ１２から参照ミラー１５の反射面までの光学的距離をＬ２とすると、二光束干渉計における二光束の間の光路長差は２（Ｌ１－Ｌ２）である。この光路長差が光源１１の出力光のコヒーレント長以下であれば、撮像器１８は明瞭な干渉画像を取得することができる。光源１１の出力光の中心波長をλ０としたとき、二光束干渉計における二光束の間の位相差Δφは次式で表されるものとする。

　光検出器２２は、ビームスプリッタ１７と光学的に結合され、ビームスプリッタ１７から到達した干渉光を受光して検出信号を出力する。光検出器２２は、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管であり、また、ラインセンサ（リニアセンサ）、ＣＣＤエリアイメージセンサ、ＣＭＯＳエリアイメージセンサなどであってもよい。

　位相制御回路２３は、光検出器２２と電気的に接続され、光検出器２２から出力される検出信号を入力する。また、位相制御回路２３は、ピエゾ素子２１と電気的に接続され、ピエゾ素子２１による光路長差の調整動作を制御する。位相制御回路２３は、入力した検出信号に基づいて、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を検出する。そして、位相制御回路２３は、この検出結果に基づくフィードバック制御により、ピエゾ素子２１による光路長差の調整動作を制御する。これにより、二光束干渉計における二光束の間の光路長差を設定値で安定化した状態（ロック状態）とすることができる。

　干渉画像取得部２は、ロック状態において対象物（細胞７３）の干渉画像を撮像器１８により撮像して取得することができる。演算部３は、干渉画像取得部２の撮像器１８により取得された干渉画像に基づいて対象物の光学的厚さ画像を求める。演算部３は、パーソナルコンピュータおよびタブレット端末などのプロセッサ（例えばＣＰＵ）と記憶部（例えばＲＡＭやストレージ）を備えるコンピュータであってもよい。また、演算部３は、マイコンやＦＰＧＡであってもよい。また、演算部３は、操作者からの入力を受け付ける入力部（キーボード、マウス、タブレット端末など）、ならびに、干渉画像および光学的厚さ画像等を表示する表示部（ディスプレイ、タブレット端末など）を備えていてもよい。また、演算部３は、画面に画像等を表示するとともに、その画面において操作者による領域の指定を受け付ける機能を有するのが好適である。

　光源１１から出力された光はビームスプリッタ１２により二光束に分岐されて第１分岐光および第２分岐光とされ、ビームスプリッタ１２から第１分岐光および第２分岐光が出力される。ビームスプリッタ１２から出力された第１分岐光は、対物レンズ１３により容器７０内の細胞７３に集光され、容器７０の底部の内側に設けられた反射増強コーティング７１で反射される。反射増強コーティング７１で反射された第１分岐光は、対物レンズ１３を経てビームスプリッタ１２に入力される。ビームスプリッタ１２から出力された第２分岐光は、対物レンズ１４により参照ミラー１５の反射面に集光され、その反射面で反射される。参照ミラー１５の反射面で反射された第２分岐光は、対物レンズ１４を経てビームスプリッタ１２に入力される。

　対物レンズ１３からビームスプリッタ１２に入力された第１分岐光、および、対物レンズ１４からビームスプリッタ１２に入力された第２分岐光は、ビームスプリッタ１２により合波されて、ビームスプリッタ１２から干渉光が出力される。この干渉光は、チューブレンズ１６を経た後にビームスプリッタ１７により２分岐されて、撮像器１８および光検出器２２それぞれにより受光される。干渉光を受光した光検出器２２から検出信号が出力され、この検出信号に基づいて位相制御回路２３により二光束干渉計における二光束の間の光路長差が検出される。そして、位相制御回路２３によるピエゾ素子２１に対するフィードバック制御により、二光束干渉計における二光束の間の光路長差が設定値で安定化した状態（ロック状態）とされる。ロック状態において干渉光を受光した撮像器１８により干渉画像が取得され、その干渉画像は演算部３へ出力される。そして、演算部３により、干渉画像に基づいて対象物（細胞７３）の光学的厚さ画像が求められる。

　計数装置１は、位相シフト法により、複数の干渉画像から光学的厚さ画像を求める。すなわち、干渉画像取得部２は、二光束干渉計の光路長差を互いに異なる複数の設定値それぞれで安定化した状態とし各状態において干渉画像を取得する。演算部３は、干渉画像取得部２により取得された複数の干渉画像に基づいて位相画像を求めることができる（特許文献１参照）。更に、演算部３は、この位相画像から光学的厚さ画像を求めることができる。

　例えば、干渉画像取得部２は、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を用いたフィードバック制御により干渉光の位相差を或る初期位相で安定化させて、位相差を安定化させた状態で干渉画像Ｉ１を撮像器１８により取得する。次に、干渉画像取得部２は、ピエゾ素子２１、光検出器２２および位相制御回路２３を用いて干渉光の位相差を“初期位相＋π／２”で安定化させ、位相差を安定化させた状態で干渉画像Ｉ２を撮像器１８により取得する。同様にして、干渉画像取得部２は、干渉光の位相差を“初期位相＋π”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ３を撮像器１８により取得し、干渉光の位相差を“初期位相＋３π／２”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ４を撮像器１８により取得し、干渉光の位相差を“初期位相＋２π”で安定化させた状態で干渉画像Ｉ５を撮像器１８により取得する。

　演算部３は、これら５つの干渉画像Ｉ１～Ｉ５を用いて、下記（２）式の演算を行って位相画像Φを求める。argは複素数の偏角を取得する演算子である。ｉは虚数単位である。演算部３は、この位相画像Φに対して位相アンラップ処理および背景歪み補正処理をした後、光学的厚さＯＴを下記（３）式で求めて光学的厚さ画像を求める。なお、これらの式に現れる各パラメータは画素位置（ｘ，ｙ）の関数であり、これらの式の演算は画素毎に行われる。

　背景補正については、ｘ，ｙを変数とする多項式関数（たとえばゼルニケ多項式）を用いることで良好な（フラットな）バックグラウンドを得ることができる。また、背景における歪み成分の空間周波数が個々のサンプルの空間周波数よりも十分に低い場合には、ハイパスフィルタリング処理をすることもできる。光学的厚さ画像の背景における平坦性は、光学的厚さの標準偏差にして５ｎｍ未満であるのが好ましい。

　この光学的厚さＯＴは、サンプルを透過した光に与えられた位相変化量を表したものである。細胞７３の厚さをｄとし、細胞７３の平均的な屈折率をｎ_ｃとし、培養液７２の屈折率をｎ_ｍとすると、光学的厚さＯＴは次式で与えられる。

　以下では、具体的な実施例の構成および画像例を示しつつ、より詳細に実施形態について説明する。光源１１として中心波長７３０ｎｍのＬＥＤを用いた。対物レンズ１３および対物レンズ１４それぞれの焦点距離は１８ｍｍであった。チューブレンズ１６の焦点距離は１２５ｍｍであった。撮像器１８の撮像素子サイズは４.８ｍｍ×３.６ｍｍであった。撮像器１８の画素数は１２８０ピクセル×９６０ピクセルであった。サンプル面での視野サイズは６９１.２μｍ×５１８.４μｍであった。サンプルの細胞７３としてメラノーマ由来培養細胞ＳＫ-ＭＥＬ-２８を用いた。

　図３は、干渉画像取得部２により取得された５つの干渉画像Ｉ１～Ｉ５を示す図である。図４は、図３の干渉画像Ｉ１～Ｉ５に基づいて演算部３により求められた光学的厚さ画像を示す図である。図４の光学的厚さ画像から、光学的厚さの積分値を細胞数で除算することにより、細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求めることができる。

　この光学的厚さ画像には５３個の細胞が含まれている。ここで、視野の端にあって一部が視野外に出ている細胞については０.５個と数えた。この光学的厚さ画像における細胞数の真値は、図５の細胞核染色画像において目視で計数することで求めた。図５は、図３の干渉画像と同視野の細胞核染色画像を示す図である。

　光学的厚さの積分値は、全画素の光学的厚さＯＴの総和に１画素当たりのサンプル面積（０.５４μｍ×０.５４μｍ）を乗算することで求めた。その結果、光学的厚さの積分値は１.１２×１０^７（ｎｍ×μｍ^２）であった。したがって、細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値は２.１２×１０^５（ｎｍ×μｍ^２／cell）と見積もられた。

　図３の干渉画像とは異なる９つの視野の光学的厚さ画像を取得し、各視野の光学的厚さの積分値を、細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値（２.１２×１０^５（ｎｍ×μｍ^２／cell））で除算することで、各視野に存在する細胞の個数を推定した。図６は、９つの視野（ＦＯＶ＃１～９）それぞれについて光学的厚さの積分値、推定細胞数、真の細胞数および誤差を纏めた表である。図７は、９つの視野それぞれについて推定細胞数および真の細胞数を示すグラフである。なお、真の細胞数は、別途同視野の細胞核染色画像を取得して、該画像において目視で計数することで求めた。図６は、推定細胞数と真の細胞数との間の誤差をも示している。誤差の絶対値の平均は４.５％であった。本実施形態の計数手法により短時間に精度よく細胞数を計数できることが確認された。

　なお、上記の実施例では、細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求めるに際して、細胞数を正確に計数するために細胞核染色画像を用いた。また、細胞数の推定結果を検証するために、計数対象の関心領域についても核染色画像を用いた。細胞核の染色は、検証を確実に行うためであり、必須ではない。

　次に、図８を用いて、本実施形態の計数装置１の動作および本実施形態の計数方法の手順について説明する。図８は、第１実施形態の計数装置１の動作および第１実施形態の計数方法を説明するフローチャートである。

　ステップＳ１（画像取得ステップ）において、干渉画像取得部２により干渉画像を取得することができるように二光束干渉計に対して光学調整を行い、複数の干渉画像を干渉画像取得部２により取得する。ステップＳ２～Ｓ６（演算ステップ）において、演算部３により、干渉画像取得部２により取得された複数の干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、この光学的厚さ画像のうちの関心領域内の光学的厚さの積分値と、細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、関心領域内の細胞の個数を求める。

　より詳細には、ステップＳ２において、干渉画像取得部２により取得された複数の干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、この画像に対して背景補正を行う。ステップＳ３において、必要に応じて、複数の光学的厚さ画像を接合する。ステップＳ４において、複数の細胞を含む関心領域（Region　of　Interest、ＲＯＩ）を設定する。関心領域は、１つであってもよいし、複数であってもよい。ステップＳ５において、光学的厚さ画像のうちの関心領域内の光学的厚さの積分値を求め、これを細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値で除算することで、関心領域内の細胞の個数を推定する。

　次に、細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を取得する方法の好適例について説明する。

　図９は、細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を取得する方法の第１の好適例を説明するための視野を示す図である。この方法では、演算部３は、干渉画像取得部２により取得された干渉画像のうち、関心領域（図９（ｂ））内の細胞の分布密度より低い密度で細胞が分布する領域（図９（ａ））に基づいて、光学的厚さ画像を求めて細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求める。図９（ａ）は、関心領域内の細胞の分布密度より低い密度の細胞の分布を示す。図９（ｂ）は、関心領域内の細胞の分布を示す。細胞の分布密度が低い領域（図９（ａ））では、個々の細胞が互いに離間して分布しているのが好ましい。

　このように、細胞の分布密度が低い領域（図９（ａ））の光学的厚さ画像を用いれば、その領域内の細胞の個数を正確に計数することができるので、細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を正確に取得することができる。なお、細胞の分布密度が低い領域（図９（ａ））および関心領域（図９（ｂ））は、同一視野内の互いに異なる領域であってもよいし、互いに異なる視野に含まれるものであってもよい。

　図１０は、細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を取得する方法の第２の好適例を説明するための視野を示す図である。この図に示されるように、細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を取得するための領域Ａは、関心領域Ｂの一部であって、細胞の分布密度が低い領域であってもよい。領域Ａでは、個々の細胞が互いに離間して分布しているのが好ましい。この場合にも、細胞の分布密度が低い領域Ａの光学的厚さ画像を用いれば、その領域内の細胞の個数を正確に計数することができるので、細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を正確に取得することができる。

　また、細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求めるに際して、関心領域内の細胞の個数を求める度に求めてもよいし、或いは、それ以前に同種の細胞について求めた値を演算部３の記憶部に記憶しておき、その記憶していた値を用いてもよい。演算部３は、複数種類それぞれの細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を記憶しておき、そのうちの何れかの種類の細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を選択して用いるのも好適である。

　また、株化された細胞（セルライン）を用いる場合は、演算部３は、予め測定した幾つかの細胞株についての１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を記憶部により記録しておくことが可能である。この場合、操作者は、細胞種を指定するだけの操作により、視野の光学的厚さの面内積分値を、指定された細胞種の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値で除算することにより、細胞数を求めることができる。細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値は、演算部３の記憶部により記憶されていてもよいし、通信ネットワーク経由でダウンロードすることで短期的に演算部３の記憶部に記憶されたものを用いてもよい。なお、生物学分野で頻繁に使われる株化された細胞種としては、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＭＣＦ７などが挙げられる。

　（第２実施形態）

　第２実施形態は、対象物の集合体としての細胞集団に含まれる細胞の個数を計数するものである。第２実施形態の計数装置は、図１に示された構成と同様の構成を有する。

　本実施形態では、解析対象の関心領域は、細胞同士が重なり合った細胞集団を含む。従来の細胞数カウンティング法では、細胞集団に含まれる細胞の個数を計数することは困難であった。細胞集団は、コロニー様またはスフェロイド様に複数の細胞の集合したものである。コロニーとは、典型的には複数個の細胞が空間的にひとまとまりの集団を形成したものである。スフェロイドとは、典型的には厚さ１００μm以上に細胞が積み重なり、球体状になった細胞集団である。１個のスフェロイドには典型的には１０００個～数万個の細胞が含まれる。

　図１１は、解析対象領域の光学的厚さ画像の模式図である。この図では、３つの関心領域ＲＯＩ１，ＲＯＩ２およびＲＯＩ３が設定され、各関心領域内に１つの細胞集団８３が含まれている。干渉画像取得部２は、これら３つの関心領域を視野に含む干渉画像を取得する。演算部３は、干渉画像取得部２により取得された干渉画像から光学的厚さ画像を求め、この光学的厚さ画像のうちの各関心領域内の細胞集団の光学的厚さの積分値を求める。そして、演算部３は、各細胞集団の光学的厚さの積分値を、細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値で除算することで、各細胞集団に含まれる対象物の個数を求めることができる。ここで用いる細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値は、別途測定してもよいし、予め求めたおいた典型的な値を用いてもよい。

　図１２は、マルチウェルプレートの各ウェルを解析対象の関心領域とした場合の光学的厚さ画像の模式図である。この図では、６つのウェルのうち、５つのウェルに関心領域ＲＯＩ-１～ＲＯＩ-５が設定され、各ウェルに１つの細胞集団８３が含まれている。残りの１つのウェルには、個々に分離された複数の細胞７３を含む領域ＲＯＩconが設定されている。この場合、領域ＲＯＩconの光学的厚さ画像から、細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求めることができる。そして、これを用いて、関心領域ＲＯＩ-１～ＲＯＩ-５それぞれの細胞集団８３に含まれる対象物の個数を求めることができる。

　また、細胞集団を対象とした解析に際して、細胞１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値が未知である場合には、以下に述べる手法を用いることができる。図１３～図１５を用いて説明する。図１３は、容器８０に入れられた培養液８２中の複数の細胞集団８３を示す図である。図１４は、容器９０のウェル９１に個々に分散されて入れられた細胞７３、および、容器９０のウェル９２に入れられた細胞集団８３を示す図である。図１５は、細胞集団に含まれる細胞の個数を計数する手順を説明するフローチャートである。

　まず、複数の細胞集団からなる母集団を用意する（ステップＳ１０）。その母集団のうちの１または複数の細胞集団８３を無作為に取り出し（ステップＳ１１）、ピペッティング等の操作により一個一個の細胞７３に分散させて、図１４に示される容器９０のウェル９１に入れる（ステップＳ１２）。分散させる細胞集団の個数は、総個数の半数を超えないのが好ましい。一個一個の細胞７３に分散させたサンプルは、十分均一になるまでピペッティングして細胞懸濁液とし、個々の弁別が容易な低密度でウェル９１に播種する。これをコントロール群とする。一方、分散化を行わず細胞集団としての形態を保っている残りの細胞集団８３を、そのまま、図１４に示される容器９０のウェル９２に入れる（ステップＳ１３）。これを細胞数計測群とする。

　ウェル９１とウェル９２とは物理的に領域が隔離されている。ウェル９１の底部の内側には反射増強コーティング９３が設けられている。ウェル９２の底部の内側には反射増強コーティング９４が設けられている。ウェル９１およびウェル９２はカバーガラス９５で封止される。なお、細胞懸濁液用の観察容器と、スフェロイド観察用の観察容器は、サンプルを注入するためのウェル部分が隔離されていれば良く、容器の外装部が物理的に一体になっていても構わない。図１４に示される容器９０は、外装部分が一体となっているものの、サンプル注入部が隔離された２つのウェル９１，９２をもつ。一方のウェル９１に、低密度に播種した細胞７３を播種し、他方のウェル９２に細胞集団８３を播種する。

　このような前処理の後、干渉画像取得部２は、ウェル９１内の低密度播種された細胞７３の干渉画像を取得する。演算部３は、この干渉画像から光学的厚さ画像を求めて背景補正を行い（ステップＳ１４）、必要に応じて複数の光学的厚さ画像を接合し（ステップＳ１５）、この光学的厚さ画像において領域ＲＯＩconを設定して（ステップＳ１６）、領域ＲＯＩcon内の細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求める（ステップＳ１７）。

　また、干渉画像取得部２は、ウェル９２内の細胞集団８３の干渉画像を取得する。演算部３は、この干渉画像から光学的厚さ画像を求めて背景補正を行い（ステップＳ１８）、必要に応じて複数の光学的厚さ画像を接合し（ステップＳ１９）、この光学的厚さ画像において関心領域ＲＯＩを設定して（ステップＳ２０）、関心領域ＲＯＩ内の細胞集団８３の光学的厚さの積分値を求める（ステップＳ２１）。

　そして、演算部３は、細胞集団８３の光学的厚さの積分値と細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、細胞集団８３に含まれる細胞の個数を求める（ステップＳ２２）。

　ここで用いる容器９０は、観察の前に滅菌されたものであることが望ましい。この容器９０が滅菌されたものであれば、ウェル９２に播種された細胞集団８３は、細胞一個一個に分散されたものでなく、染色されたものでもないので、細胞数計数後も培養を続けることが可能となる。また、本手法による計測の過程で、もともとの母集団に含まれる細胞集団のうち何個かの細胞集団は、分散状態で低密度に播種されることで細胞集団としての機能を失ってしまうものの、母集団の他の殆どの細胞集団は、細胞数を全数検査した後も細胞集団としての機能を維持したままで残すことができる。

　なお、容器９０がマルチウェルプレートであるとして説明したが、低密度に播種した細胞７３が播種される容器と、細胞集団が播種される容器とは、物理的に分離されていてもよい。その場合、一方の容器として図１３に示された容器８０をそのまま用いてもよい。

　（第３実施形態）

　第３実施形態は、干渉画像取得部２が干渉画像を取得する際の光学倍率が可変であることを利用して、関心領域を含む干渉画像を干渉画像取得部２により取得する際と比べて、細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求めるための領域を含む干渉画像を干渉画像取得部２により取得する際の光学倍率を高くするものである。

　細胞の集合体である細胞集団を関心領域とする場合、細胞数を計数したい関心領域ＲＯＩmainの観察に際しては低倍率の光学系で広い面積を撮像することが望ましい。一方、細胞１個あたりの平均的な光学的厚さの積分値を求めるに際しては、低倍率の光学系で撮像した画像では細胞一個一個の弁別が困難になるので、高倍率の光学系で撮像することが望ましい。したがって、好ましくは、干渉画像取得部２の光学倍率を切り替えて、細胞１個あたりの平均的な光学的厚さの積分値を求めるための領域ＲＯＩconについては高倍率で観察し、その一方で、細胞数を計数したい関心領域ＲＯＩmainについては低倍率で観察を行うのがよい。

　図１６は、互いに異なる光学倍率で干渉画像取得部２により取得した干渉画像から得られる光学的厚さ画像を示す図である。図１６（ａ）は、細胞数を計数したい関心領域ＲＯＩmain、および、細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求めるための領域ＲＯＩconの双方を含む光学的厚さ画像を示す。図１６（ｂ）は、関心領域ＲＯＩmainを含まず領域ＲＯＩconのみを含む光学的厚さ画像を示す。図１６（ａ）の光学的厚さ画像を取得する際と比べて、図１６（ｂ）の光学的厚さ画像を取得する際の方が、光学倍率が高い。

　図１７は、干渉画像取得部２の光学倍率を切り替えて細胞の個数を計数する手順を説明するフローチャートである。

　まず、低密度領域および高密度領域の双方を含む細胞サンプルを用意する（ステップＳ３０）。高密度領域と比べて低密度領域では、低い密度で細胞が分散して存在している。干渉画像取得部２は、低密度領域について高倍率で干渉画像を取得する。演算部３は、この干渉画像から光学的厚さ画像を求めて背景補正を行い（ステップＳ３１）、必要に応じて複数の光学的厚さ画像を接合し（ステップＳ３２）、この光学的厚さ画像において領域ＲＯＩconを設定して（ステップＳ３３）、領域ＲＯＩcon内の細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求める（ステップＳ３４）。

　また、干渉画像取得部２は、高密度領域について低倍率で干渉画像を取得する。演算部３は、この干渉画像から光学的厚さ画像を求めて背景補正を行い（ステップＳ３５）、必要に応じて複数の光学的厚さ画像を接合し（ステップＳ３６）、この光学的厚さ画像において関心領域ＲＯＩを設定して（ステップＳ３７）、関心領域ＲＯＩ内の細胞の光学的厚さの積分値を求める（ステップＳ３８）。そして、演算部３は、高密度領域における光学的厚さの積分値と細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、高密度領域における細胞の個数を求める（ステップＳ３９）。

　干渉画像取得部２の光学倍率を切り替えることにより、高密度領域の光学的厚み画像と低密度領域の光学的厚み画像との間で、１つの細胞領域に対応する画素数が互いに異なることから、１つの細胞領域における光学的厚さの総和は互いに異なる。しかし、光学的厚さの積分値として、光学的厚さの総和に１画素当たりのサンプル面積を乗じた値を用いれば、１画素当たりのサンプル面積が光学倍率に反比例するので、光学倍率に拘わらず同じ領域における光学的厚さの積分値は同じである。なお、光学的厚さの積分値として光学的厚さの総和を用いる場合には、光学倍率の二乗の値を用いて校正すればよい。

　また、干渉画像取得部２の特徴として、光学的厚さはサンプルの屈折率および厚さにより決まる物理量であり、撮像系の倍率および照明光の強度に依らないという性質がある。したがって、高倍率で細胞１個あたりの平均的な光学的厚さの積分値を求めたうえで、低倍率領域の画像に対する計算を行っても問題は生じない。

　計数装置および計数方法は、上記実施形態及び構成例に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。

　上記実施形態による計数装置は、（１）１または複数の対象物を含む干渉画像を取得する干渉画像取得部と、（２）干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、光学的厚さ画像のうちの関心領域内の光学的厚さの積分値と、対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、関心領域内の対象物の個数を求める演算部と、を備える構成としている。

　上記の計数装置では、演算部は、干渉画像取得部により取得された干渉画像のうち、関心領域内の対象物の分布密度より低い密度で対象物が分布する領域に基づいて、光学的厚さ画像を求めて対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求める構成としても良い。

　上記の計数装置では、演算部は、対象物が複数種類ある場合に、複数種類それぞれの対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を記憶しておき、そのうちの何れかの種類の対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を選択して用いる構成としても良い。

　上記の計数装置では、干渉画像取得部は、関心領域を含む干渉画像を取得する際と比べて、対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求めるための領域を含む干渉画像を取得する際の光学倍率が高い構成としても良い。

　上記の計数装置では、干渉画像取得部は、対象物の集合体を含む干渉画像を取得し、演算部は、干渉画像取得部により取得された干渉画像から求められた光学的厚さ画像のうちの集合体の光学的厚さの積分値と、対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、集合体に含まれる対象物の個数を求める構成としても良い。

　上記実施形態による計数方法は、（１）１または複数の対象物を含む干渉画像を干渉画像取得部により取得する画像取得ステップと、（２）干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、光学的厚さ画像のうちの関心領域内の光学的厚さの積分値と、対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、関心領域内の対象物の個数を求める演算ステップと、を備える構成としている。

　上記の計数方法では、演算ステップにおいて、干渉画像取得部により取得された干渉画像のうち、関心領域内の対象物の分布密度より低い密度で対象物が分布する領域に基づいて、光学的厚さ画像を求めて対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求める構成としても良い。

　上記の計数方法では、演算ステップにおいて、対象物が複数種類ある場合に、複数種類それぞれの対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を記憶しておき、そのうちの何れかの種類の対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を選択して用いる構成としても良い。

　上記の計数方法では、画像取得ステップにおいて、関心領域を含む干渉画像を干渉画像取得部により取得する際と比べて、対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求めるための領域を含む干渉画像を干渉画像取得部により取得する際の光学倍率が高い構成としても良い。

　上記の計数方法では、画像取得ステップにおいて、対象物の集合体を含む干渉画像を干渉画像取得部により取得し、演算ステップにおいて、干渉画像取得部により取得された干渉画像から求められた光学的厚さ画像のうちの集合体の光学的厚さの積分値と、対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、集合体に含まれる対象物の個数を求める構成としても良い。

　上記の計数方法では、光学的厚さ画像の背景における平坦性が、光学的厚さの標準偏差にして５ｎｍ未満である構成としても良い。

　上記の計数方法では、対象物が細胞である構成としても良い。

　上記の計数方法では、画像取得ステップにおいて、対象物としての細胞の集合体を複数含む母集団のうちの１または複数の集合体を個々の細胞に分離したものについて第１干渉画像を干渉画像取得部により取得するとともに、母集団のうちの残りの１または複数の集合体について第２干渉画像を干渉画像取得部により取得し、演算ステップにおいて、第１干渉画像から求められた光学的厚さ画像に基づいて細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求め、第２干渉画像から求められた光学的厚さ画像に基づいて集合体の光学的厚さの積分値を求めて、集合体の光学的厚さの積分値と細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、集合体に含まれる細胞の個数を求める構成としても良い。

　上記の計数方法では、画像取得ステップにおいて、対象物としての細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求めるための領域を含む干渉画像を干渉画像取得部により取得する際に、細胞の核を染色して該干渉画像を取得する構成としても良い。

　実施形態は、関心領域内の対象物の個数を正確に計数することができる計数装置および計数方法として利用可能である。

　１…計数装置、２…干渉画像取得部、３…演算部、１１…光源、１２…ビームスプリッタ、１３，１４…対物レンズ、１５…参照ミラー、１６…チューブレンズ、１７…ビームスプリッタ、１８…撮像器、２１…ピエゾ素子、２２…光検出器、２３…位相制御回路、７０…容器、７１…反射増強コーティング、７２…培養液、７３…細胞、８０…容器、８２…培養液、８３…細胞集団、９０…容器、９１，９２…ウェル、９３，９４…反射増強コーティング、９５…カバーガラス。

Claims

　１または複数の対象物を含む干渉画像を取得する干渉画像取得部と、
　前記干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、前記光学的厚さ画像のうちの関心領域内の光学的厚さの積分値と、前記対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、前記関心領域内の前記対象物の個数を求める演算部と、
を備える、計数装置。
　前記演算部は、前記干渉画像取得部により取得された干渉画像のうち、前記関心領域内の前記対象物の分布密度より低い密度で前記対象物が分布する領域に基づいて、前記光学的厚さ画像を求めて前記対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求める、請求項１に記載の計数装置。
　前記演算部は、前記対象物が複数種類ある場合に、前記複数種類それぞれの対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を記憶しておき、そのうちの何れかの種類の対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を選択して用いる、請求項１または２に記載の計数装置。
　前記干渉画像取得部は、前記関心領域を含む干渉画像を取得する際と比べて、前記対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求めるための領域を含む干渉画像を取得する際の光学倍率が高い、請求項１～３の何れか１項に記載の計数装置。
　前記干渉画像取得部は、対象物の集合体を含む干渉画像を取得し、
　前記演算部は、前記干渉画像取得部により取得された干渉画像から求められた光学的厚さ画像のうちの前記集合体の光学的厚さの積分値と、前記対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、前記集合体に含まれる対象物の個数を求める、請求項１～４の何れか１項に記載の計数装置。
　１または複数の対象物を含む干渉画像を干渉画像取得部により取得する画像取得ステップと、
　前記干渉画像取得部により取得された干渉画像に基づいて光学的厚さ画像を求め、前記光学的厚さ画像のうちの関心領域内の光学的厚さの積分値と、前記対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、前記関心領域内の前記対象物の個数を求める演算ステップと、
を備える、計数方法。
　前記演算ステップにおいて、前記干渉画像取得部により取得された干渉画像のうち、前記関心領域内の前記対象物の分布密度より低い密度で前記対象物が分布する領域に基づいて、前記光学的厚さ画像を求めて前記対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求める、請求項６に記載の計数方法。
　前記演算ステップにおいて、前記対象物が複数種類ある場合に、前記複数種類それぞれの対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を記憶しておき、そのうちの何れかの種類の対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を選択して用いる、請求項６または７に記載の計数方法。
　前記画像取得ステップにおいて、前記関心領域を含む干渉画像を前記干渉画像取得部により取得する際と比べて、前記対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求めるための領域を含む干渉画像を前記干渉画像取得部により取得する際の光学倍率が高い、請求項６～８の何れか１項に記載の計数方法。
　前記画像取得ステップにおいて、対象物の集合体を含む干渉画像を前記干渉画像取得部により取得し、
　前記演算ステップにおいて、前記干渉画像取得部により取得された干渉画像から求められた光学的厚さ画像のうちの前記集合体の光学的厚さの積分値と、前記対象物の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、前記集合体に含まれる対象物の個数を求める、請求項６～９の何れか１項に記載の計数方法。
　前記光学的厚さ画像の背景における平坦性が、光学的厚さの標準偏差にして５ｎｍ未満である、請求項６～１０の何れか１項に記載の計数方法。
　前記対象物が細胞である、請求項６～１１の何れか１項に記載の計数方法。
　前記画像取得ステップにおいて、前記対象物としての細胞の集合体を複数含む母集団のうちの１または複数の集合体を個々の細胞に分離したものについて第１干渉画像を前記干渉画像取得部により取得するとともに、前記母集団のうちの残りの１または複数の集合体について第２干渉画像を前記干渉画像取得部により取得し、
　前記演算ステップにおいて、前記第１干渉画像から求められた光学的厚さ画像に基づいて前記細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求め、前記第２干渉画像から求められた光学的厚さ画像に基づいて前記集合体の光学的厚さの積分値を求めて、前記集合体の光学的厚さの積分値と前記細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値とに基づいて、前記集合体に含まれる細胞の個数を求める、請求項１２に記載の計数方法。
　前記画像取得ステップにおいて、前記対象物としての細胞の１個当たりの平均的な光学的厚さの積分値を求めるための領域を含む干渉画像を前記干渉画像取得部により取得する際に、前記細胞の核を染色して該干渉画像を取得する、請求項１２または１３に記載の計数方法。