JP6649379B2 - 生物学的粒子の位置の決定を含む分析方法 - Google Patents
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Description
試料の第1境界面上、又は光学システムの光学軸に平行な軸に沿った第1境界面から既知の距離にある基準点を定義するステップと、
第1の光源を使用して、照明領域と呼ばれる関心粒子を収容する領域を照明するステップと、
光学システムの像平面内にあるセンサを使用して、基準像と呼ばれる照明領域の画像を取得するステップであって、関心粒子が、光学システムの対物面の外側にあり、光学システムの光学軸に平行な軸に沿った前記対物面と基準点間の距離が、有効距離と呼ばれる既知の距離であるステップと、
基準像を使用して、前記光学システムの光学軸に沿った対物面の所定のオフセットとそれぞれ関連付けられた一連の再生像をデジタル構成するステップと、
一連の再生像を使用して、光学システムの光学軸に平行な軸に沿った関心粒子と前記対物面間の距離を決定するステップとを含む。
前記光学システムによって集束されるレーザビームにより基準点を照明するサブステップと、
試料の境界面上でのレーザビームの反射を表わすセンサ上の画像を取得するサブステップと、
センサ上に形成された画像の輝度に従って、光学システムの光学軸に平行な軸に沿った試料と光学システム間の有効距離を調整するサブステップとを含む。
対物面のオフセットの第1ステップと関連付けられた第1の一連の再生像を使用して、関心粒子と前記対物面間の概略距離を決定するサブステップと、
第1ステップより細かい対物面のオフセットの第2ステップと関連付けられた第2の一連の再生像を使用して、関心粒子と前記対物面間の正確な距離を決定するサブステップとを含む。
第1の光源と、
光学システムとセンサを備え、センサが、光学システムの像平面内にあり、前記像平面が、光学システムによって対物面の共役である撮像ユニットと、
第1の光源と撮像ユニット間に配置された試料を収容するように構成された支持体と、
支持体を撮像手段に対して、光学システムの光学軸に平行な軸に沿って移動させるように構成された並進手段と、
計算手段と、
を備える。
計算手段は、
試料の第1境界面上又は光学システムの光学軸に沿った第1境界面から既知の距離に位置された基準点に関する情報を記憶するメモリに接続され、
前記対物面が前記基準点に対してオフセットされたときに、センサによって取得された、基準像と呼ばれる画像を入力として受け取り、
基準像を使用して、前記光学システムの光学軸に沿った対物面の所定のオフセットとそれぞれ関連付けられた一連の再生像をデジタル構成するように構成され、
光学システムの光学軸に平行な軸に沿った関心粒子と対物面間の距離を出力として供給する。
基準像上で、前記関心粒子と関連付けられたホログラムを識別するステップと、
対物面133に対する複数の所定のオフセットDi1,Di2,…Din,Di−1,…Di−nに関して、各オフセットにそれぞれ対応する再生像を取得するように、射影演算子を、前記基準像、又は前記ホログラムを構成する基準像の関心領域に適用することによって画像をデジタル再構成するステップと、
各再生像で、有効パラメータと呼ばれる画像の各点の複素数値を表わすパラメータを抽出するステップと、
この有効パラメータの変化を前記オフセットに従って分析し、この有効パラメータの注目値を識別するステップと、
この有効パラメータの前記注目値に対応するオフセットを決定し、関心粒子112Aと対物面133間の距離Drefがこのオフセットと等しいと見なされるステップとにより決定される。
最大値:光学軸135に沿って、虚部の自乗、モジュラス、又は画像のモジュラスの自乗の変化が見られるとき。
ゼロ通過:例えば、光学軸135に沿って、画像又はその自乗の実部の変化が見られるとき。
・Δpは、対物面内で定義されたサンプリングステップのサイズ(したがって、センサ132の画素ピッチ及び光学システム131の拡大率に関連する)、
・NxとNyは、画像U0内のそれぞれx,yによる画素数、
・λは、第1の光源の中心波長である。
・寒天培地、寒天培地の上側面に広がる生物学的粒子、又は
・試料を覆うスライド上に自然に付着する生物学的粒子。前記スライドは試料の上に配置される。
・あまり明るくない大きいスポット。
・第1の狭くきわめて高輝度のスポット。このスポットは、上側スライド314の、試料と反対側の面315上に光学システム331によって集束されたレーザビーム363の反射に対応する。このスポットは最大輝度を示す。
・第2の狭くて高輝度のスポット。このスポットは、上側スライド314の面317上に光学システム331によって集束されたレーザビーム363の反射に対応する。この面は試料に隣接し、したがってその境界面の1つを構成し、このスポットは第2の最大輝度を有する。
・試料311内のレーザビームの後方散乱に対応するあまり明るくない大きいスポット。
・試料の領域を照明するステップ。
・基準像を取得するステップ。
・一連の再生像をデジタル構成するステップ。
・関心粒子と基準点間の距離を決定しかつ/又は基準像又は関心粒子の1つ又は幾つかの再生像を使用して数と位置を検出するステップ。
H(u,v,z) = exp[-|z|*Im(p(u,v)) + i*z*Re(p(u,v))]
第1の一連の再生像の再生像ごとに、虚部の自乗の計算が行われる。第1の一連のいわゆる有効再生像が得られる。したがって、再生像の虚部の自乗は、対応する有効再生像の輝度を定義する。
各有効再生像は、同じ画素マトリクスに対応する。有効再生像によって各画素と関連付けられた輝度が異なる。
軸(Oz)に沿った強い輝度勾配を有する画素が選択される。これらの画素と関連付けられた平均勾配が定義される。この平均勾配の最大値の位置は、軸(Oz)に沿った生物学的粒子の位置を大雑把に定義する。
第1の一連の有効再生像の画像から、サブステップ73で計算された軸(Oz)に沿った位置と関連付けられた画像が選択される。
このステップは、各有効再生像内で、前に定義されたような関心領域に対応する領域を選択することによって、第1の一連の有効再生像を使用して実行される。
関心粒子の正確な位置が、軸(Oz)に直角の平面内で計算される。
基準点が上側境界面117より上にある場合と、
基準像と関連付けられた対物面が、上側境界面117より上にある場合は、
関心粒子が、基準像と関連付けられた対物面の下にあることが分かる。
・一連の再生像を使用して、一連の第2の画像を決定するステップ。各第2の画像が、対応する再生像の実部によって構成される。
・図7に示されたサブステップ72と同じように、一連の第2の画像(三次元を有するマトリクス)を二次元を有するマトリクスに変換し、そのうち1つの次元が画素に対応し、他の次元が軸(Oz)に沿ったオフセットに対応するステップ。
・二次元を有する前記マトリクスで、軸(Oz)に沿った強い輝度勾配を有する画素を選択するステップ。これにより、そのような画素と関連付けられた平均勾配が定義される。この勾配は、図8に示される。横座標の軸は、軸(Oz)に沿ったオフセット、詳細には、基準像と関連付けられた対物面の位置に対する対物面のオフセットである。縦座標の軸は、第2の画像の実部に関する。
・プロファイルの形により、関心粒子と、基準像と関連付けられた対物面との間で、軸135に平行な軸による距離の符号が決定されるステップ。
・増分横座標に関して、正最大から負最小に移動する場合(図8の場合)、基準像は、対物面より上にある(光の伝搬方向で)。
・増分横座標に関して、負最小値から正最大値に移動する場合(図8の場合)、基準像は、対物面より下にある(光の伝搬方向で)。
111,311:試料
112:生物学的粒子
112A:関心粒子
116,117,316,317:第1境界面
118,318:基準点
119:照明領域
120,320:光源
131,331:光学システム
132,332:センサ
133,333:対物面
135,335:光学軸
Claims (17)
- 生物学的粒子(112)、特に関心粒子(112A)を収容する試料(111;311)を分析する方法であって、前記試料は、第1の光源(120;320)と光学システム(131;331)間に配置され、前記光学システム(131;133)は、対物面(133;333)と、イメージセンサ(132;332)が位置する像平面との間の光学結合を行い、前記試料は、上側スライド(114;314)によって前記イメージセンサの側で範囲が定められた流体チャンバ内に位置し、
前記方法は、
前記上側スライド(114;314)の面(117;317;315)上に位置する基準点(118;318)を定義すると共に、前記光学システム(131;331)によって集束されたレーザビーム(363)によって前記基準点(118;318)を照明するステップと、ここで、前記レーザビーム(363)は、前記イメージセンサ(132;332)が前記上側スライド(114;314)上の前記レーザビーム(363)の鏡面反射によって形成されたスポットの画像を受けるように調整され、前記レーザビームと、前記イメージセンサと、前記光学システムは、前記レーザビームの集束点が前記対物面内にあるように配置され、
前記光学システムの光学軸に平行な軸に沿った、前記流体チャンバ内にある前記試料と前記光学システムとの間の距離を、前記鏡面反射の検出によって調整することで、前記基準点を前記光学システムの前記対物面内に位置決めするステップと、
前記光学システムの前記光学軸に平行な軸に沿って、前記光学システムの前記対物面(133;333)を前記基準点(118;318)に対して有効距離(D1)と呼ばれる既知の距離だけオフセットして、前記関心粒子(112A)を前記光学システムの前記対物面(133;333)の外側に配置するようにするステップと、
前記第1の光源を用いて、照明領域(119)と呼ばれる前記関心粒子を収容する領域を照明するステップと、
前記イメージセンサ(132;332)を用いて、基準像又はデフォーカス像と呼ばれる前記照明領域のホログラム画像を取得するステップと、
前記基準像を用いて、前記光学システムの前記光学軸に沿った前記対物面の所定のオフセット(Di1,Di2,Din,Di−1,Di−n)のシミュレーションと各々が関連付けられた一連の再生像をデジタル構成するステップと、
前記一連の再生像を用いて、前記光学システムの前記光学軸に平行な軸に沿った、前記関心粒子と前記対物面間の距離(Dref)を決定するステップと、を含む分析方法。 - 前記光学システムの前記対物面(133;333)を前記基準点(118;318)に対してオフセットするステップは、前記試料を前記流体チャンバ内に収容する支持体(110)を、前記光学システム(131;331)に対して並進させることによって実行される、請求項1に記載の分析方法。
- 前記関心粒子(112A)と前記対物面(133;333)間の前記距離(Dref)ならびに前記有効距離(D1)を用いて、前記関心粒子と前記基準点(118;318)との間の距離(DF)を決定するステップを含む、請求項1又は2に記載の分析方法。
- 前記関心粒子と前記対物面間の距離(Dref)を用いて、前記試料中の前記関心粒子の存在を決定するステップを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の分析方法。
- 前記生物学的粒子(112)は、前記試料の下側(116;316)又は上側(117;317)境界面からなる前記試料の境界面(116,117;316,317)に付着する、請求項1〜4のうちいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記光学システムの前記光学軸に平行な軸に沿った、前記基準像と関連付けられた前記対物面の位置と、当該軸に沿い上側境界面(116,117;316,317)上の基準点(118;318)の投射との間の距離は、+5μmから+2000μmの範囲、又は−5μmから−2000μmの範囲であって、
前記上側境界面(117;317)は、前記上側スライド(114)と前記試料(111)の境界によって定義されている、請求項1〜5のうちいずれか一項に記載の分析方法。 - 前記照明領域(119)は、複数の生物学的粒子(112)を含む、請求項1〜6のうちいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記第1の光源(120;320)は、200nm未満のスペクトル幅を有する、請求項1〜7のうちいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記一連の再生像を用いて、前記光学システムの前記光学軸に直交する平面内における前記関心粒子(112A;312A)の位置を決定するステップをさらに含む、請求項1〜8のうちいずれか一項に記載の分析方法。
- 各再生像は、実部と虚部によって構成され、
前記実部と虚部のうち前記再生像の前記虚部のみが、前記光学システムの前記光学軸と平行な軸に沿った、前記関心粒子(112A;312A)と前記基準点(118;318)間の距離(DF)を決定するために使用される、請求項3に記載の分析方法。 - 各再生像は、前記光学システムの前記光学軸(135;335)に沿ったオフセット及び有効パラメータの値と関連付けられて、前記オフセットによる前記有効パラメータの変化を示す関数を構成し、
前記関心粒子(112A、312A)と前記対物面(133,333)間の距離(Dref)を決定するステップは、注目値、詳細には、前記関数の極値、変曲点又はゼロ通過を調べる、請求項1〜10のうちいずれか一項に記載の分析方法。 - 前記関心粒子(112A;312A)と前記対物面(133;333)との間の距離(Dref)を決定するステップは、
前記対物面(133;333)のシミュレートされたオフセットの第1のステップと関連付けられた第1の一連の再生像を用いて、前記関心粒子と前記対物面との間の概略距離を決定するサブステップと、
前記対物面(333)のシミュレートされたオフセットの第2ステップと関連付けられた第2の一連の再生像を用いて、前記関心粒子と前記対物面との間の正確な距離を決定するサブステップと、を含み、
前記第2ステップは、前記第1のステップより細かい、
請求項1〜11のうちいずれか一項に記載の分析方法。 - 前記関心粒子(112A、312)と前記対物面(133,333)との間の距離(Dref)を用いて、前記光学システム(131,331)は、前記レーザビーム(363)を前記関心粒子(112A、312A)上に集束させるように、前記関心粒子(112A;312A)に対して移動される、請求項1〜12のうちいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記関心粒子(112A、312)と前記対物面(133,333)との間の前記距離(Dref)を用いて、前記光学システム(131,331)は、前記光学システムの前記画像面内に位置する前記イメージセンサ(132;332)の合焦を調整するように、前記関心粒子(112A、312A)に対して移動される、請求項1〜13のうちいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記試料(111;311)内に存在する生物学的粒子(112)の数を数えるステップをさらに含む、請求項1〜14のうちいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記生物学的粒子(112)は、細菌、胞子、細胞、酵母又は微生物からなる、請求項1〜15のうちいずれか一項に記載の分析方法。
- 生物学的粒子(112)、詳細には関心粒子(112A;312A)を収容する試料(111;311)を分析する装置(100;300)であって、
第1の光源(120;320)と、
光学システム(131,331)とイメージセンサ(132,332)を備え、前記イメージセンサは、前記光学システムの像平面内に位置し、前記像平面が、前記光学システムを通じた対物面(133,333)の共役である、撮像ユニット(130,330)と、
前記第1の光源と前記撮像ユニットの間に配置され、前記試料を収容する流体チャンバを収容するように構成された支持体(110)と、ここで、上側スライド(114;314)は前記流体チャンバの範囲を定め、
前記光学システム(131;331)によって集束されるレーザビーム(363)を出射するように配置されたレーザ(360)と、ここで、前記イメージセンサ(132;332)は、前記上側スライド(114;314)上の前記レーザビーム(363)の鏡面反射によって形成されたスポットの画像を受け取り、前記レーザビーム、前記イメージセンサ及び前記光学システムは、前記レーザビームの集束点が前記対物面内にあるように配置され、
前記光学システムの光学軸(135,335)に平行な軸に沿って前記光学システム(131;331)に対して前記支持体(110)を移動させるように構成された並進手段(140;340)と、
請求項1のステップを実行するように配置された計算手段(150;350)と、
を備え、
特に、前記計算手段(150;350)は、
前記上側スライド(114;314)の面(117;317;315)上に位置する基準点(118;318)に関する情報を記憶するメモリ(151;351)に接続され、
前記試料と前記光学システムの相対位置を特定するように構成され、前記イメージセンサ(132;332)が、前記基準点上に前記レーザビーム(363)の前記鏡面反射によって形成されたスポットの画像を受け取り、
前記対物面が前記基準点に対してオフセットされたときに、基準像と呼ばれる、前記イメージセンサによって取得されたホログラム画像を入力として受け取り、
前記基準像を用いて、前記光学システムの前記光学軸に沿った前記対物面の所定のオフセット(Di1,Di2,Din,Di−1,Di−n)のシミュレーションに各々が関連付けられた一連の再生像のデジタル構成を実行するように構成され、
前記光学システムの前記光学軸(135,335)に平行な軸に沿った、前記関心粒子(112A;312A)と前記対物面(133;333)との間の距離(Dref)を出力として供給する、装置(100;300)。
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