JP2017102032A - 光計測方法および装置 - Google Patents
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Abstract
Description
下記特許文献1には、対物レンズを物理的に走査するとともに、信号光と干渉光の干渉を位相条件の異なる4つの検出器で受光することにより、タイムドメインOCTにおけるミラーの走査による参照光の位相調整を不要とする技術が開示されている。
下記特許文献2には、タンパク質試料の散乱角度分布と顕微鏡観察による粒子追跡を応用し、ブラウン運動による位置ゆらぎの測定結果を合わせて試料の粒径分布を計測する技術が開示されている。
本発明の理解を容易にするため、以下ではまず実施形態1の説明に先立ち境界反射光の影響により計測精度が低下することついて説明する。本発明の種々の効果を定量的に示すために光線追跡法に干渉効果を含めた計算法(以下、波動的光線追跡法)を用いるが、ここでは同時に、実験結果との対比によって波動的光線追跡法の精度について考察する。その後、本発明の実施形態1に係る構成について説明する。
図7は、本実施形態1における光計測方法を説明するフローチャートである。以下図7の各ステップについて説明する。
OCT装置の対物レンズの焦点位置zFP=z0にセットし、検出光をxy方向に走査することにより得られる信号強度を用いて、xy平面上における観察像である2次元データImage(x,y)を取得する。
Image(x,y)に対して例えば2次関数による最小2乗フィッティングを実施することにより、境界反射信号レベルLSF(x,y)を求める。LSF(x,y)は、図6における境界反射レベルを近似した関数に相当する。
下記式6を用いて補正信号強度Image2(x,y)を求める。補正信号強度Image2(x,y)を用いることにより、検出信号から境界反射の影響を除去し、細胞から反射された+値のピークを有する信号を得ることができる。
適当な閾値を用いて細胞を同定し、その数を計測する。例えば閾値以上の信号値を有する箇所に細胞が存在しているものとみなし、その個数をカウントすることにより、細胞個数を計測することができる。
(a)Image(x,y)、(b)Image2(x,y)、(c)計測された細胞数のうち1つ以上を適宜選択し、例えばディスプレイ上で表示する。
本実施形態1に係る光計測方法によれば、容器の境界から反射する信号の影響を低減することにより、細胞の数と大きさを高精度に計測することができる。
図10は、本発明の実施形態2に係る光計測方法を説明するフローチャートである。以下図10の各ステップについて説明する。
OCT装置の対物レンズの焦点位置zFP=z0にセットし、検出光をxy方向に走査することにより得られる信号強度を用いて、xy平面上における観察像である2次元データImage(x,y)を取得する。
下記式7を用いて補正信号強度Image2(x,y)を求める。式7は、点(x,y)の周辺領域(Δx,Δy)における検出信号の平均値をImage2から減算した後に絶対値を取得するものである。実施形態1とは異なり周辺領域における検出信号の平均値を減算するのみであるため、実施形態1と比較して少ない演算量で境界反射の影響を除去することができる。補正信号強度Image2(x,y)は、実施形態1と同様に細胞から反射された+値のピークを有する信号となる。ここでΔx,Δyの値としては概略、観測対象である細胞の大きさよりも大であって、観測対象の密度(濃度)より定まる平均的な細胞間の距離よりも小とすることが望ましい。
これらステップは、実施形態1のステップS014〜S015と同様である。
本実施形態2に係る光計測方法は、実施形態1に比較して最小2乗法などによる境界面のフィッティングを実施しないので、演算量を小さく抑えることができる。またコントラストの低い検出信号に対する改善量が大きい利点がある。
本発明の実施形態3では、検出光の光軸方向における焦点位置が異なる複数の検出結果を取得し、それら検出結果を組み合わせて用いることにより被検物を計測する手法について説明する。
OCT装置および測定条件を初期化するとともに補正信号強度Image2(x,y)をゼロクリアし、n=1に初期化する。nはループカウンタであり、各ループにおいてそれぞれ異なる焦点位置(z方向)をセットしてxy像を取得する。
OCT装置の対物レンズの焦点位置をn回目の指定値にセットし(zFP=zn)、xy走査により信号強度の2次元データImagen(x,y)を取得する。
本実施形態3においては、焦点位置が異なる複数の検出信号を組み合わせて用いる。しかし図13に例示するように、焦点位置が観測対象からz方向に向かってずれるのにともない、信号ピークが減少する。そこで本ステップにおいては、各焦点位置の信号ピークを互いに揃えるため、計測データを規格化したNormImagen(x,y)を求める。規格化方法としては、(a)検出信号の強度の最大値を所定値に揃える方法、(b)検出信号の強度の平均値を所定値に揃える方法、などを用いることができる。図14においては最大値を用いる方法を例示した。
最小2乗フィッティングなどを用いて、容器境界から反射された検出信号NormLSFn(x,y)を求める(S144)。式6を用いて補正信号強度NormImage2n(x,y)を求める(S145)。
z方向における焦点位置が細胞の位置に合っているとき、検出信号は最大になると考えられる。そこで本ステップにおいて、各焦点位置の検出信号のなかで最大値を残す。具体的には、Image2(x,y)とNormImage2n(x,y)を比較して値の大きい方をImage2(x,y)に格納する。
ループカウンタの最大値Nに到達していない場合はステップS142に戻る(S147)。到達した場合は、実施形態1のステップS014〜S015と同様の処理を実施する(S148〜S149)。
本実施形態3に係る光計測方法は、対物レンズの焦点位置が異なる2つ以上の検出信号データセットを取得することにより、容器境界の傾斜量と傾斜の向きを検出することができる。容器境界の傾斜量は一定であるので、2つ以上の焦点位置による計測結果を組み合わせて用いることにより、例えば図1に示したxy像の最小2乗フィッティングの精度を向上することができる。
本発明の実施形態4では、実施形態3と同様に検出光の光軸方向における焦点位置が異なる複数の検出結果を取得し、それら検出結果を用いて被検物のサイズを計測する手法について説明する。
ステップS181〜S182は、図14のステップS141〜S142と同様である。ループカウンタの最大値Nに到達していない場合はステップS182を繰り返し、到達した場合はステップS184へ進む(S183)。
観測対象である細胞は、必ずしも静止している訳ではなく、ブラウン運動等により常に微小量の移動を乱雑に繰り返している。そこで、いわゆる物体認識アルゴリズムを用いて観測対象を追跡し(S184)、個々の細胞ごとに焦点ずれと検出信号の大きさの変化に基づき検出信号の最大値を抽出する(S185)。
検出信号の最大値を求める方法としては、(a)機械的な最大値を求める方法、(b)多項式近似と最小2乗法用いてブラウン運動による位置揺らぎを織り込んだ最尤的なフィッティングを実施して最大値を求める方法、を用いることができる。前者は簡便さに優れるが、z方向の焦点移動ステップ量を式2で定まる焦点深度(概ね波長程度)よりも十分に小さくする必要がある。後者は、観測データを全て有効に用いるため、演算は煩雑になるがz方向の焦点移動ステップ量が前者に比較して大きくても構わない点が優れている。
検出信号の最大値を用いて、図17で例示した校正テーブルを参照することにより、細胞サイズを同定する。検出信号の最大値は主としてその屈折率に応じて変化するので、あらかじめ既知のサイズの細胞試料から求めた検出信号に基づいて校正テーブルを作成しておくとよい。校正テーブルの別の作成方法としては、例えば比重測定、元素分析、光散乱特性等の従来の評価方法に基づいてマクロな屈折率を求め、前述の計算方法、もしくは従来のFDTD(Finite Deferential Time Domain)法等の計算方法を用いて数値的に求めた結果を利用することもできる。
画像化した検出信号と計測した細胞サイズおよびサイズ分布を適宜選択して、ディスプレイなどに表示する。
これらステップは、図18で説明したステップS181〜S184と同様である。
個々の細胞ごとに焦点ずれと検出信号の大きさの変化を抽出する(S215)。取得した検出信号の減衰率と焦点ずれ量を用いて、図20(c)に例示した校正データを参照することにより、細胞のサイズを同定する(S216)。
画像化した検出信号と計測した細胞サイズを適宜選択して、ディスプレイなどに表示する。
本実施形態4に係る光計測方法により、細胞へ蛍光分子を付着する処理を実施することなく、非侵襲的に直接細胞の大きさや分布を測定することができる。
図22は、本発明の実施形態5に係る光計測装置の構成を示す模式図である。光源501から出射されたレーザ光はコリメートレンズ502によって平行光に変換され、光学軸方向を調整可能なλ/2板503によって偏光を回転させられた後、偏光ビームスプリッタ504によって信号光と参照光に2分岐される。偏光ビームスプリッタ504によって反射された信号光は光学軸方向が水平方向に対して約22.5に設定されたλ/4板505を透過して偏光状態をs偏光から円偏光に変換された後、対物レンズ506によって観測対象508に集光して照射される。対物レンズ506は対物レンズアクチュエータ507によってxz方向に走査が可能であり、観測対象508は図示しない可動ステージによりy方向に移動可能である。こうした構成によって観測対象に対して対物レンズの焦点位置がxyz方向への走査がなされる。
一般に2次元データImage(x,y)の取得は光学システムを用いて式1に示した信号をAD変換器によりデジタル値として取得する。実施形態1〜5においては、2次元データImage(x,y)の取得は1回であるので、AD変換器の出力が飽和しないようにゲインを設定すると、信号強度が小さい部位において十分な分解能が得られない場合がある。こうした場合には、2次元データImage(x,y)を複数回取得しながら、積算することによって、実効的にAD変換器の分解能とSNRを向上する方法が有効である。例えば、AD変換器が8ビット(256レベル)の場合、64回取得によって積算された2次元データImage(x,y)は実効的に14ビット(16384レベル)とすることができ、十分な分解能とSNRを確保することが可能になる。ただし、64回連続で2次元データを取得するためには計測時間が長くなり、この間に観測対象である細胞がブラウン運動等によって大きく移動すると、積算された2次元データImage(x,y)の信頼性が失われる。そこで本発明の実施形態6では、主としてAD変換器の実効的な分解能を向上する方法について示す。
OCT装置の信号のゲインを標準値に設定する。これは図23に示したゲイン切替器701に対して標準のゲインを選択することに相当する。
(図24:ステップS242)
OCT装置の対物レンズの焦点位置zFP=z0にセットし、検出光をxy方向に走査することにより得られる信号強度を用いて、xy平面上における観察像である2次元データImageN(x,y)を取得する。
OCT装置の信号のゲインを標準値のG倍に設定する。これは図23に示したゲイン切替器701に対して標準ゲインのG倍を選択することに相当する。
OCT装置の対物レンズの焦点位置を同様にzFP=z0にセットし、検出光をxy方向に走査することにより得られる信号強度を用いて、xy平面上における観察像である2次元データImageH(x,y)を取得する。
取得したImageN(x,y)およびImageH(x,y)から信号強度が小さい部位の分解能を向上したImage(x,y)を合成する。AD変換器の出力の最大値をMAX_VALとすると、例えばAD変換器が8ビットの場合にはMAX_VAL=255である。本ステップにおいては、ImageH(x,y)<MAX_VAL、すなわち高ゲインで取得したデータが飽和していない場合には、Image(x,y)=1/G×ImageH(x,y)として、高ゲイン条件で取得したデータをゲイン補正して採用する。一方、高ゲインで取得したデータが飽和している場合(ImageH(x,y)≧MAX_VAL)には、標準ゲインの取得データを採用し、Image(x,y)=ImageN(x,y)とする。以上により信号が小さい領域において分解能を向上した2次元データImage(x,y)を2回の測定で取得することができる。
本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
501:光源
502:コリメートレンズ
503、513:λ/2板
504:偏光ビームスプリッタ
505、509、514:λ/4板
506:対物レンズ
507:対物レンズアクチュエータ
508:観測対象
510:ミラー
511:干渉光学系
512:ハーフビームスプリッタ
515、516:検出レンズ
517、518:ウォラストンプリズム
519、520:電流差動型の光検出器
523:信号処理部
525:表示部
Claims (13)
- 光を集光して光スポットを生成し、前記光スポットのサイズの略3倍以下の被検物を計測する光計測方法であって、
少なくとも前記光の焦点位置を光軸方向に動かしながら前記被検物に対して照射することにより前記被検物から反射される反射光を検出する信号取得ステップ、
前記反射光の強度と前記被検物のサイズとの間の対応関係を記述した対応関係データを取得するステップ、
前記反射光の強度を用いて前記対応関係データを照会することにより前記被検物のサイズを取得するサイズ算出ステップ、
を有することを特徴とする光計測方法。 - 前記信号取得ステップにおいては、各前記焦点位置における前記反射光の強度のうち最も大きい最大信号値を取得し、
前記サイズ算出ステップにおいては、前記最大信号値を用いて前記対応関係データを照会することにより前記被検物のサイズを取得する
ことを特徴とする請求項1記載の光計測方法。 - 前記対応関係データは、前記焦点位置が前記被検物の中心からずれている量を表すずれ量、前記ずれ量に応じて前記反射光の強度が減衰する量、および前記被検物のサイズの間の対応関係を記述しており、
前記信号取得ステップにおいては、前記焦点位置を前記光軸方向においてずらすことにより前記反射光の強度が減衰する量を表す減衰量を取得し、
前記サイズ算出ステップにおいては、前記信号取得ステップにおいて前記減衰量を取得する際に前記焦点位置をずらした量と前記減衰量を用いて、前記対応関係データを照会することにより、前記被検物のサイズを取得する
ことを特徴とする請求項1記載の光計測方法。 - 前記信号取得ステップにおいては、容器上に載置された被検物に対して前記光を照射することにより前記容器と前記被検物からそれぞれ反射される反射光を検出し、
前記光計測方法はさらに、
前記反射光の強度を表す検出信号から、前記容器の傾きに起因する成分を減算することにより、前記容器の傾きを補正する補正ステップ、
前記容器の傾きを補正した後の前記検出信号を用いて前記被検物を計測する計測ステップ、
を有することを特徴とする請求項1記載の光計測方法。 - 光を用いて被検物を計測する光計測方法であって、
容器上に載置された被検物に対してレーザ光を照射することにより前記容器と前記被検物からそれぞれ反射される反射光を検出する信号取得ステップ、
前記反射光の強度を表す検出信号から、前記容器の傾きに起因する成分を減算することにより、前記容器の傾きを補正する補正ステップ、
前記容器の傾きを補正した後の前記検出信号を用いて前記被検物を計測する計測ステップ、
を有することを特徴とする光計測方法。 - 前記補正ステップにおいては、前記検出信号から、前記容器と前記被検物の境界部分において反射された反射光の成分を減算することにより、前記容器の傾きを補正する
ことを特徴とする請求項5記載の光計測方法。 - 前記信号取得ステップにおいては、光軸方向に対して直交する方向に照射位置を走査しながら前記レーザ光を前記被検物に対して照射することにより、前記照射位置と前記検出信号との間の対応関係を表す信号曲線を取得し、
前記補正ステップにおいては、前記信号曲線を近似する近似曲線を算出し、前記近似曲線を前記信号曲線から減算することにより、前記容器の傾きを補正する
ことを特徴とする請求項6記載の光計測方法。 - 前記信号取得ステップにおいては、光軸方向に対して直交する方向に照射位置を走査しながら前記レーザ光を前記被検物に対して照射することにより、前記照射位置と前記検出信号との間の対応関係を表す信号曲線を取得し、
前記補正ステップにおいては、第1照射位置から第2照射位置までにおける前記検出信号の平均値を前記検出信号から減算することにより、前記容器の傾きに起因する成分を前記検出信号から減算する
ことを特徴とする請求項5記載の光計測方法。 - 前記信号取得ステップにおいては、光軸方向における焦点位置がそれぞれ異なる複数の前記レーザ光を前記被検物に対して照射することにより前記被検物から反射される反射光をそれぞれ検出し、
前記補正ステップにおいては、各前記焦点位置における前記検出信号から前記容器の傾きに起因する成分を減算した値の絶対値を求めることにより、前記容器の傾きを補正し、
前記計測ステップにおいては、各前記焦点位置における前記絶対値のなかの最大値を用いて前記被検物を計測する
ことを特徴とする請求項5記載の光計測方法。 - 前記信号取得ステップにおいては、前記光軸方向に対して直交する方向に照射位置を走査しながら前記レーザ光を前記被検物に対して照射することにより、前記照射位置と前記検出信号との間の対応関係を表す信号曲線を取得し、
前記補正ステップにおいては、各前記焦点位置における前記信号曲線の最大値を規格化した後、前記信号曲線を近似する近似曲線を算出し、前記近似曲線を前記信号曲線から減算することにより、前記容器の傾きを補正する
ことを特徴とする請求項9記載の光計測方法。 - 前記計測ステップにおいては、前記検出信号が所定閾値以上であるか否かに基づき前記被検物の個数をカウントし、その結果を出力する
ことを特徴とする請求項5記載の光計測方法。 - 前記信号取得ステップは、
所定の標準ゲイン値を適用した上で前記反射光の強度を表す第1強度信号を取得するステップ、
前記標準ゲイン値よりも大きいゲイン値を適用した上で前記反射光の強度を表す第2強度信号を取得するステップ、
前記第2強度信号が所定の上限値を超えていない場合は前記第2強度信号を前記検出信号として採用し、超えている場合は前記第1強度信号を前記検出信号として採用するステップ、
を有することを特徴とする請求項5記載の光計測方法。 - 光を用いて被検物を計測する光計測装置であって、
レーザ光を被検物に対して照射する光源、
前記被検物から反射される反射光を検出する検出器、
請求項1から12のいずれか1項記載の光計測方法を実施するプロセッサ、
を備えることを特徴とする光計測装置。
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