JP6798625B2 - 定量位相画像生成方法、定量位相画像生成装置およびプログラム - Google Patents

Description

本発明は、定量位相画像生成方法、定量位相画像生成装置およびプログラムに関する。

光が伝播する際の、光の強度と位相との関係を示す強度輸送方程式に基づいて、対象物における観測面の近傍の複数の光強度画像から、当該観測面等における位相分布を導出する位相計測方法が提案されている（特許文献１参照）。対象物の位相の計測においては、少ない撮像回数で精度の高い位相情報が得られることが望ましい。

日本国特開第２００７−１９２６６５号公報

本発明の第１の態様によると、定量位相画像生成方法は、顕微鏡による定量位相画像生成方法であって、対象物に照明光を照射することと、対物レンズの光軸に沿って互いに間隔Δｚ離れた複数の位置のそれぞれに前記対物レンズの焦点を配置して前記対象物からの光を検出することと、検出した前記光に基づいて、前記複数の位置のそれぞれに対応する光強度分布データを生成することと、前記光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成することと、を含み、前記間隔Δｚは、前記顕微鏡の設定情報に基づいて設定される。
本発明の第２の態様によると、定量位相画像生成方法は、対象物に照明光を照射することと、対物レンズの光軸に沿って互いに間隔Δｚ離れた複数の位置のそれぞれに前記対物レンズの焦点を配置して前記対象物からの光を検出することと、検出した前記光に基づいて、前記複数の位置のそれぞれに対応する光強度分布データを生成することと、前記光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成することと、を備え、前記間隔Δｚは、０．０７μｍ以上９０．３μｍ以下に設定される。
本発明の第３の態様によると、定量位相画像生成装置は、顕微鏡を備え、前記顕微鏡は、対象物に照明光を照射する照明光学系と、対物レンズと、前記対物レンズの光軸に沿って互いに間隔Δｚ離れた複数の位置に前記対物レンズの焦点が配置されるように前記焦点の位置を調整する装置制御部と、前記照明光学系からの照明光の照射により、前記対象物からの光を検出する検出器と、検出した前記光に基づいて、前記複数の位置に対応する光強度分布データを生成し、前記光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成する画像生成部と、を備え、前記装置制御部は、前記顕微鏡の設定情報に基づいて、前記間隔Δｚを設定する。
本発明の第４の態様によると、定量位相画像生成装置は、対象物に照明光を照射する照明光学系と、対物レンズと、前記対象物における前記対物レンズの焦点の、前記対物レンズの光軸に沿って互いに間隔Δｚ離れた複数の位置に前記対物レンズの焦点が配置されるように前記焦点の位置を調整する装置制御部と、前記照明光学系からの照明光の照射により、前記対象物からの光を検出する検出器と、検出した前記光に基づいて、前記複数の位置に対応する光強度分布データを生成し、前記光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成する画像生成部と、を備え、前記装置制御部は、前記間隔Δｚを、０．０７μｍ以上９０．３μｍ以下に設定する。
本発明の第５の態様によると、プログラムは、対象物に照明光を照射する照明光学系と、対物レンズと、前記対象物における前記対物レンズの焦点の、前記対物レンズの光軸に沿って互いに間隔Δｚ離れた複数の位置に前記対物レンズの焦点が配置されるように前記焦点の位置を調整する装置制御部と、前記照明光学系からの照明光の照射により、前記対象物からの光を検出する検出器と、検出した前記光に基づいて、前記複数の位置に対応する光強度分布データを生成し、前記光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成する画像生成部と、を備える顕微鏡を備える定量位相画像生成装置に入力または記憶された前記顕微鏡の設定情報に基づいて、前記間隔Δｚを設定する設定処理を前記定量位相画像生成装置の処理装置に行わせる。
本発明の第６の態様によると、プログラムは、対象物に照明光を照射する照明光学系と、対物レンズと、前記対象物における前記対物レンズの焦点の、前記対物レンズの光軸に沿って互いに間隔Δｚ離れた複数の位置に前記対物レンズの焦点が配置されるように前記焦点の位置を調整する装置制御部と、前記照明光学系からの照明光の照射により、前記対象物からの光を検出する検出器と、検出した前記光に基づいて、前記複数の位置に対応する光強度分布データを生成し、前記光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成する画像生成部と、を備える定量位相画像生成装置の処理装置に、前記間隔Δｚを０．０７μｍ以上９０．３μｍ以下に設定する設定処理を行わせる。

一実施形態の定量位相画像生成装置の構成を示す概念図である。 一実施形態の定量位相画像生成装置の情報処理部の構成を示す概念図である。 対象物による照明光の位相の変化により、計測される光の強度が変化することを示す概念図である。 計測面を説明するための概念図である。 焦点間隔を説明するための概念図である。 焦点間隔の設定方法を説明するための概念図である。 コントラスト伝達関数を示すグラフであり、（Ａ）は、焦点間隔が１．６μｍの場合のグラフであり、（Ｂ）は、焦点間隔が０．４μｍの場合のグラフである。 遮断空間周波数まで位相復元できる条件でのコントラスト伝達関数を示すグラフであり、（Ａ）は、開口数ＮＡが０．３の場合のグラフであり、（Ｂ）は、開口数ＮＡが０．７５の場合のグラフであり、（Ｃ）は、開口数ＮＡが０．９５の場合のグラフである。 遮断空間周波数の４分の１まで位相復元できる条件でのコントラスト伝達関数を示すグラフであり、（Ａ）は、開口数ＮＡが０．３の場合のグラフであり、（Ｂ）は、開口数ＮＡが０．７５の場合のグラフであり、（Ｃ）は、開口数ＮＡが０．９５の場合のグラフである。 サンプリング間隔を説明するための概念図である。 位相を復元する際の周波数利得を示すグラフであり、（Ａ）は、サンプリング間隔Δｘが異なり、画素数Ｎが同じである２つのデータを示すグラフであり、（Ｂ）は、サンプリング間隔Δｘが同じで、画素数Ｎが異なる２つのデータを示すグラフである。 サンプリング間隔の設定方法を示す概念図であり、（Ａ）は、像面上に投影される点像強度分布（ＰＳＦ）のエアリーディスクの直径が画素サイズＰと同じ場合を示す概念図である。（Ｂ）は、像面上に投影される点像強度分布（ＰＳＦ）のエアリーディスクの直径が画素サイズＰよりも大きい場合を示す概念図である。 Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法（ＳＧ法）を説明するための図であり、（Ａ）は、ＳＧ法を用いた場合とＳＧ法を用いない場合とを比較した具体例を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＳＧ法の概念を示す概念図である。 有効点像分布（ＥＰＳＦ）の一例を示すグラフである。 表示画面の一例を示す図である。 表示画面の一例を示す図である。 表示画面の一例を示す図である。 一実施形態の定量位相画像生成方法の流れを示すフローチャートである。 一実施形態の定量位相画像生成装置の構成を示す概念図である。 一実施形態の定量位相画像生成装置の構成を示す概念図である。 一実施形態の定量位相画像生成装置の構成を示す概念図である。 走査型顕微鏡における光学系の構成を示す概念図であり、（Ａ）は、従来の光学系の構成を示す概念図であり、（Ｂ）は、一実施形態の定量位相画像生成装置の光学系の構成を示す概念図である。 位相オフセットを説明するための概念図である。 プログラムを説明するための概念図である。 実施例の計測結果を示すグラフである。

以下では、適宜図面を参照しながら、一実施形態の定量位相画像生成装置、定量位相画像生成方法、およびプログラム等について説明する。本実施形態の定量位相画像生成装置は、対象物における間隔Δｚ離れた複数の位置のそれぞれに、対物レンズの焦点（つまり、合焦面）を配置しつつ照明光を照射し、焦点が配置されたそれぞれの領域（つまり、それぞれの合焦面）からの光を検出し、当該検出により取得したデータに基づいて定量位相画像を作成するものであり、当該間隔Δｚは、対物レンズの開口数、照明光の波長および対物レンズと対象物の間の屈折率などに基づいて設定する。
ここで、定量位相画像とは、対象物における厚さの変化と屈折率の変化を積とする位相を表す（画像化した）画像である。既存の位相差画像や微分干渉画像は、位相に振幅が混ざる干渉画像であるため、対象物の位相を完全に定量化することはできないが（振幅が無視でき、かつ位相が小さい条件のみ定量化できるが）、定量位相画像は、対象物の位相が２倍、３倍、４倍等の様々な値に変化しても、定量的な位相を表すことができるため、対象物の位相を定量化した画像と称することもできる。

図１は、本実施形態の定量位相画像生成装置の構成を示す概念図である。定量位相画像生成装置１は、顕微鏡、すなわち定量位相顕微鏡であり、顕微鏡本体部１００と、情報処理部４０とを備える。顕微鏡本体部１００は、対象物Ｓに照明光を照射する透過照明光学系１０と、ステージ８と、結像光学系７と、落射照明光学系１１０と、検出部９とを備える。結像光学系７は、対物光学系２０と、フィルターキューブ１２０と、リレー光学系３０とを備える。
なお、情報処理部４０の機能は顕微鏡本体部１００から物理的に離れた電子計算機等に配置してもよい。

透過照明光学系１０は、光源１１と、レンズ１２と、バンドパスフィルター１３と、視野絞り１４と、レンズ１５と、開口絞り１６と、集光レンズ１７とを備える。対物光学系２０は、対物レンズ２１を備える。対物レンズ２１としては、対物レンズ２１ａ，２１ｂ，および２１ｃの複数の対物レンズを選択して使用できる。リレー光学系３０は、結像レンズ３１と、ビームスプリッター３２と、ミラー３３ａ，３３ｂ，および３３ｃと、レンズ３４ａ，３４ｂ，３４ｃと、接眼レンズ３５とを備える。接眼レンズ３５は眼Ｅを近づけて覗き込むことができるように構成されている。
なお、交換可能な対物レンズ２１の数は特に限定されない。また、顕微鏡本体部１００に含まれる光学系の態様は、対象物Ｓの所望の面の画像を撮像により取得することができれば特に限定されない。

図１において、顕微鏡本体部１００の光学系の光軸を一点鎖線Ｌ１で示し、光源１１からの照明光（光束）を二点鎖線Ｌ２で模式的に示した。対物レンズ２１のうち、対象物Ｓに焦点を配置しているレンズを対物レンズ２１ａとすると、後に詳述する対物レンズ２１ａの光軸Ｌｏは、顕微鏡本体部１００の光軸Ｌ１と一致しているため、これを図１においてＬ１（Ｌｏ）と示した。検出部９で検出された光の検出信号の流れを実線矢印Ａ１で示し、情報処理部４０による顕微鏡本体部１００の制御を実線矢印Ａ２で模式的に示した。一点鎖線Ｌ１，Ｌ２、実線矢印Ａ１，Ａ２は以下の実施形態でも同様のものを示す。

光源１１は、ハロゲンランプ等の非コヒーレント光源装置を含み、対象物Ｓに照射する照明光Ｌ２を出射する。本実施形態では、光源１１は非コヒーレント光を出射し、出射された非コヒーレント光が、後述する開口絞り１６を含む透過照明光学系１０の各部により、位相復元が可能な光軸に略垂直な波面を有する光とされて対象物Ｓに照射される構成となっている。「位相復元」とは、後に詳述するが、計測した対象物Ｓからの光の強度から、強度輸送方程式を用いて対象物Ｓの位相値を算出することである。照明光Ｌ２は、対象物Ｓの位相計測が可能であればどのような波長の光でも構わないが、可視光で見えづらい対象物を位相計測により可視化できる観点では、そのまま可視光を使用することが簡素で好ましい。
なお、対象物Ｓに照射する照明光Ｌ２は、可視光でなくてもよく、紫外光や赤外光であってもよい。さらに、照明光Ｌ２の波面は光軸に略垂直でなくとも、波面の形状が既知であればよく、例えば、照明光Ｌ２の波面は略球面であってもよい。また、光源１１は、パルスレーザや連続発振（ＣＷ）レーザなどのコヒーレント光源を含み、照明光Ｌ２としてコヒーレント光を出射してもよい。

光源１１から出射した照明光Ｌ２は、レンズ１２に入射する。レンズ１２に入射した照明光Ｌ２は、レンズ１２により屈折され略平行な光となってレンズ１２を出射し、バンドパスフィルター１３に入射する。バンドパスフィルター１３に入射した照明光Ｌ２は、所望の波長範囲の波長成分の光のみがバンドパスフィルター１３により透過されて、視野絞り１４に入射する。ここで、バンドパスフィルター１３により透過される光の波長範囲は、軸上色収差によって発生する、位相を復元する際の、位相の実測値と実際の位相との誤差（後述の位相復元誤差）が大きくなり過ぎないように適宜設定される。バンドパスフィルター１３は適宜光路外の位置Ｐ１に退避可能に構成される。
なお、光源１１としてレーザ光等の波長範囲が狭い光源を用いる際は、バンドパスフィルター１３を光路に配置する必要は無い。また、バンドパスフィルター１３は用いずに、対象物Ｓに対して結像側に配置されたフィルターキューブ１２０のフィルターにより検出する波長範囲を制限してもよい。

視野絞り１４に入射した照明光Ｌ２は、その光束径が調節されて視野絞り１４を出射し、レンズ１５に入射する。レンズ１５に入射した照明光Ｌ２は、レンズ１５により収束されてレンズ１５を出射し、開口絞り１６に入射する。開口絞り１６に入射した照明光Ｌ２は、その波面が球面状になるように変換され、開口絞り１６を出射し、集光レンズ１７に入射する。集光レンズ１７に入射した照明光Ｌ２は、集光レンズ１７により屈折され、対象物Ｓに照射される際に光軸に略垂直な波面を有する光となり、対象物Ｓに照射される。

対象物Ｓは、対象物Ｓにおいて位相の計測を行う対象となる部分またはその近傍に対物レンズ２１ａの焦点位置が含まれるようにステージ８上に配置される。対象物Ｓは、特に限定されないが、照明光が対象物Ｓに照射され透過する際に、振幅の変化の割合は比較的小さく、一方、位相の変化の割合は大きい場合に、本実施形態に係る位相計測の効果がより顕著に得られるので好ましい。このような物体を位相物体と呼ぶ。対象物Ｓとしては、上記の観点から、特に培養細胞等の細胞のような位相物体が好ましい。

ステージ８は、対物レンズ２１ａの光軸、および当該光軸に垂直な軸に沿って移動可能に構成されている。ここで、対物レンズ２１ａの光軸とは、対物レンズ２１ａの対象物Ｓ側のレンズ面の光学中心と対物レンズ２１ａの焦点を通る直線で示される軸Ｌｏ（図５参照）を指す。ステージ８は、モータ等の移動装置による電動駆動により、対象物Ｓを撮像する際に、対物レンズ２１ａの光軸Ｌｏに沿った移動が可能に構成されている。図５では、対物レンズ２１ａの光軸Ｌｏが、顕微鏡本体部１００の光軸Ｌ１と一致している点を、Ｌｏ（Ｌ１）と示した。以下の実施形態では、図１に座標軸９００として示すように、顕微鏡本体部１００の光軸Ｌ１、すなわち対物レンズ２１ａの光軸Ｌｏに平行にｚ軸をとり、ｚ軸に垂直であって紙面に平行にｘ軸を取り、ｘ軸及びｚ軸に垂直にｙ軸をとる。

対物光学系２０は、対物レンズ２１を含んで構成される。本実施形態では、対物レンズ２１としては、複数の対物レンズ２１ａ，２１ｂ，２１ｃを備える。後述するように、定量位相画像生成装置１では、開口数ＮＡ等の異なる対物レンズ２１ａ，２１ｂ，および２１ｃを交換して対象物Ｓを撮像して、それぞれの対物レンズ２１により得たデータに基づいて位相計測を行う際、得られる位相値のばらつきを抑制するように構成されている。対物レンズ２１を変更した際に計測される位相値の変化が大きいと、異なる対物レンズ２１を用いて取得したデータの間の比較が難しくなる。また、異なる対物レンズ２１を用いて取得したデータのうちどの対物レンズ２１を用いて取得したデータが位相を復元する際の精度が高いのか判断が難しい等の理由により、一連の測定に係る作業に負担が生じる。

落射照明光学系１１０は、水銀ランプ１１１等を含んで構成され、蛍光観察等のための励起光を出射する。落射照明光学系１１０から出射した光は、フィルターキューブ１２０に入射する。

フィルターキューブ１２０は、励起フィルター１２１と、ダイクロイックミラー１２２と、吸収フィルター１２３とを含んで構成され、落射照明光学系１１０から入射した光を対象物Ｓへと反射する一方、対象物Ｓからの蛍光をリレー光学系３０へと透過させる。フィルターキューブ１２０は、光路外の位置Ｐ２に適宜退避できるように構成されている。

励起フィルター１２１は、落射照明光学系１１０から入射した励起光の波長範囲を、ダイクロイックフィルター１２２の反射波長領域にするように透過波長域が設定されており、これにより、励起光の一部の波長範囲の励起光を透過させる。ダイクロイックフィルター１２２は、励起フィルター１２１を透過した励起光を対象物Ｓに向けて反射し、対物レンズ２１ａから入射した対象物Ｓからの蛍光を吸収フィルター１２３へと透過する。吸収フィルター１２３は、ダイクロイックフィルター１２２から入射した光のうち、対象物Ｓや光学系からの不要な散乱光を吸収し、必要な光のみをリレー光学系３０の結像レンズ３１に出射する。

リレー光学系３０の結像レンズ３１は、フィルターキューブ１２０から入射した光を検出部９に結像するように屈折させてビームスプリッター３２に出射する。ビームスプリッター３２は、フィルターキューブ１２０から入射した光の一部を検出部９へと反射し、残りは透過させてミラー３３ａに出射する。ミラー３３ａで反射した光は、レンズ３４ａ、ミラー３３ｂ、レンズ３４ｂ、レンズ３４ｃおよびミラー３３ｃの順で、ミラーでの反射またはレンズでの屈折を経て接眼レンズ３５に入射する。接眼レンズ３５に入射した光は接眼レンズ３５により屈折されてユーザの眼Ｅに入射して知覚される。

検出部９は、ＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子の検出器を含んで構成され、リレー光学系３０のビームスプリッター３２により反射された光を検出する。検出した光に対応する検出信号は不図示のＡ／Ｄ変換器等により適宜Ａ／Ｄ変換されて情報処理部４０に出力される。言い換えると、検出部９は、対象物９の像を撮像する。
なお、定量位相画像生成装置１では、対象物Ｓの位相計測に際し、検出部９が、透過照明光学系１０からの照明光Ｌ２が照射された対象物Ｓの像を撮像する構成にしたが、落射照明光学系１１０からの照明光が照射された対象物Ｓの像を撮像する構成にしてもよい。この場合、落射照明光学系１１０からの照明光は、対物レンズ２１ａ（対物光学系２０）を介して対象物Ｓに照射され、対象物Ｓで反射した光に基づく対象物Ｓの像を検出部９で撮像する。

図２は、情報処理部４０の構成を示した図である。情報処理部４０は、入力部４１と、表示部４２と、通信部４３と、記憶部４４と、制御部５０とを備える。制御部５０は、装置制御部５１と、解析部５２とを備える。装置制御部５１は、最適条件計算部５１１を備える。解析部５２は、位相復元処理部５２１と、画像構築部５２２と、画像解析部５２３とを備える。

入力部４１は、キーボード、マウスおよび／またはタッチパネル等の入力装置により構成され、顕微鏡本体部１００による対象物Ｓの撮像や解析部５２による当該撮像により得られたデータの解析に必要な情報等を含む入力データを受け付ける。入力部４１は、受け付けた入力データを、後述の記憶部４４に適宜記憶させる。
なお、入力データは、後述の通信部４３を介して取得してもよい。

表示部４２は、液晶モニタ等の表示装置により構成され、顕微鏡本体部１００による撮像の条件、当該撮像により得られたデータに基づいて解析部５２が生成した解析結果および定量位相画像等を表示する。

通信部４３は、インターネット等の通信網を利用して通信を行う通信装置により構成され、顕微鏡本体部１００による撮像の条件、当該撮像により得られたデータに基づいて解析部５２が生成した解析結果および定量位相画像等を送信したり、適宜必要なデータを送受信したりする。

記憶部４４は、不揮発性メモリ等の記憶装置により構成され、制御部５０に処理を行わせるプログラム、顕微鏡本体部１００による撮像に必要なデータ、当該撮像により得られたデータおよび当該データに基づいて解析部５２が生成した解析結果および定量位相画像等を記憶する。

制御部５０は、ＣＰＵ等のマイクロプロセッサ等を含むプロセッサにより構成され、定量位相画像生成装置１を制御する動作の主体として機能する。すなわち、記憶部４４等に搭載されているプログラムを実行することにより、顕微鏡本体部１００による対象物Ｓの撮像を行う装置制御処理、当該撮像により得られたデータの位相復元処理等の解析処理、および出力処理等の各種処理を行う。

制御部５０の装置制御部５１は、ユーザにより入力された入力データに基づいて顕微鏡本体部１００による対象物Ｓの撮像に必要なパラメータを適宜算出するとともに、取得した当該パラメータおよび入力データ等に基づいて顕微鏡本体部１００の各部の動作を制御する。

最適条件計算部５１１は、顕微鏡本体部１００が対象物Ｓにおける複数の位置のそれぞれに対物レンズ２１ａの焦点を順次配置して検出部９により対象物Ｓからの光を検出する際に設定するための、当該複数の位置の間隔Δｚを算出する。この間隔Δｚを焦点間隔と呼ぶ。焦点間隔Δｚは、精度よく位相計測を行うために重要なパラメータである。以下、この点に関し、強度輸送方程式を利用した位相計測の方法に基づいて説明する。

図３は、位相物体を透過した光の強度分布が変化する点を説明するための概念図である。対象物Ｓは、細胞等の位相物体であり、対象物Ｓには、波面Ｗ１，Ｗ２，Ｗ３により模式的に示されているように、互いに平行で光軸に略垂直な波面を有する平面波が照射されている。平面波の進行方向は矢印Ａ３で示した。対象物Ｓを透過した光は、振幅は大きく変化しないものの、位相が変化することにより、等位相面、すなわち波面が変化する（波面Ｗ４）。ホイヘンス＝フレネルの原理で、曲線状の波面を構成する光は、実線矢印Ａ４で示されるように計測面ｉ１に到達する。ここで、後に詳述するように、一例として対物レンズ２１ａの焦点が配置される対象物Ｓにおける特定の面（言い換えると、対物レンズ２１ａの合焦面）を計測面ｉ１と称する。計測面ｉ１は、対物レンズ２１ａの光軸に実質的に垂直な面である。図３では、計測面ｉ１は平面波の波面Ｗ１〜Ｗ３と実質的に平行である。計測面ｉ１上では、上述のように対象物Ｓによる波面の変化に伴い所定の光の強度分布（以下、光強度分布と呼ぶ）が形成される。対象物Ｓによる透過光の位相の変化と光強度分布との関係に基づいて、透過光の強度を解析することにより、位相の変化を計測する方法が提案されている。本実施形態では、以下に説明する強度輸送方程式を用いた方法を利用する。

伝播する波動における、強度Ｉと位相φの関係は、強度輸送方程式により記述される。強度輸送方程式は、以下の式（１）および（２）による連立方程式である。詳細は、Paganin D and Nugent KA, “Noninterferometric Phase Imaging withPartially Coherent Light,” Physical Review Letters, Volume 88, pp.2586-2589を参照されたい。

…（１）

…（２）
ここで、∇の添字であるｘｙは、ＸＹ平面（光の伝搬方向に垂直な平面、すなわち本実施形態ではｚ軸に垂直な平面）を示す。すなわち、式（２）の左辺に現れる∇_ｘｙφは、ＸＹ平面における位相φの勾配（gradient）を示す。式（１）の左辺と式（２）の右辺に現れるΦは、式（１）をポアソン方程式の形にして計算しやすいように導入された関数であり、検出したＸＹ平面における強度Ｉのｚに関する微分係数の分布を得て、ポアソン方程式（１）を解くことにより導出できる。式（１）を解いて得た関数Φと光強度分布から、式（２）を解いて位相分布φを算出することができる。

図４は、位相分布φの算出のために行う対象物Ｓからの光の検出方法を説明するための図である。まず、対象物Ｓの計測面ｉ１における光強度分布および計測面ｉ１におけるｚに関する微分係数分布を得る必要がある。このため、装置制御部５１は、図４で示すように、対物レンズ２１ａの焦点が所望の計測面ｉ１に含まれるように設定して、結像光学系７により検出部９の検出面に対象物９の像を結像させて対象物Ｓからの光を検出部９に検出させる。検出部９の各画素からの検出信号は、制御部５０（図２）に入力され、位相復元処理部５２１により各画素の位置と検出信号に基づいた光強度とが対応付けられた光強度分布データが生成される。

光強度分布データは、ある座標ｚの値に対応する計測面上での座標（ｘ、ｙ）の位置に対応する、検出部９における各画素で検出された光の強度分布を表すデータである。光強度分布データは、当該座標ｘ、ｙ、ｚの値に対応する光強度を示すデータであり、ルックアップテーブルの形式で構築されている。例えば、あるｚの値に対応する計測面上での光強度分布を色または階調で区別して二次元にマッピングすることにより、当該ｚの位置における光の強度分布を示す画像（以下、光強度画像）を作成することができる。
なお、所定の座標ｘ、ｙ、ｚの値に対応する光強度の値を取り出すことができれば、光強度分布データのデータ構造は特に限定されず、他の既存のデータ構造であってもよい。

計測面ｉ１の位置（言い換えると、対物レンズ２１ａの焦点位置）は、検出部９により検出される対象物Ｓからの光の光強度のコントラストに基づいた位置に設定されることが好ましい。装置制御部５１は、事前に（本実施形態に係る位相計測の前に）取得した対象物Ｓの三次元の光強度分布データから算出したパラメータ（以下に示す分散ｖｚ等の対象物Ｓからの光の光強度のコントラストを示すパラメータ）に基づいて、計測面ｉ１の位置を設定することができる。上記三次元の光強度分布データを事前に撮像により取得する場合、この光強度分布データの取得のための撮像の際の対象物Ｓにおける焦点の位置は特に限定されず、適宜設定すればよい。

装置制御部５１は、事前に取得した三次元の光強度分布データについて、各ｚの値に対応した、ｘ方向およびｙ方向についての二次元の光強度分布をＩｚ（ｘ、ｙ）としたとき、各ｚの値に対応する光強度分布の分散値ｖｚを以下の式（１１）により算出する。

…（１１）
ここで、Ｎｘは事前に取得した光強度分布データのｘ方向のピクセル数、Ｎｙは事前に取得した光強度分布データのｙ方向のピクセル数、Ｉｚの上にバーが示されたものは各ｚの値に対応する、当該光強度分布データ上の全ての（ｘ，ｙ）についてのＩｚ（ｘ，ｙ）の算術平均等の平均値である。装置制御部５１は、算出した各ｚの値に対応する分散ｖｚに基づいて計測面ｉ１の位置、すなわち、対物レンズ２１ａの焦点位置を設定する。例えば、装置制御部５１は、算出した分散ｖｚのうち、極小となる分散ｖｚに対応するｚ方向の位置に計測面ｉ１の位置を設定する。言い換えると、装置制御部５１は、計測面ｉ１の位置をコントラストが低い光強度分布データに対応するｚの値に設置する。

装置制御部５１は、最適条件計算部５１１が算出した焦点間隔Δｚに基づいて、対物レンズ２１ａの焦点位置が、計測面ｉ１上の位置からｚ軸に沿って−Δｚおよび＋Δｚの距離ずれたそれぞれの位置となるように計測面ｉ２およびｉ３上に当該焦点位置を順次設定する。焦点間隔Δｚの具体的な値の決定方法は後述する。装置制御部５１は、これらの計測面ｉ２およびｉ３にそれぞれ対物レンズ２１ａの焦点を配置した際に、結像光学系７により検出部９の検出面に対象物Ｓの像を結像させて対象物Ｓからの光を検出部９に検出させる。計測面ｉ２およびｉ３に対物レンズ２１ａの焦点を配置したそれぞれの場合に対応する検出部９の各画素からの検出信号は、制御部５０（図２）に入力され、位相復元処理部５２１により各画素の位置と検出信号に基づいた光強度とが対応付けられた光強度分布データがそれぞれ生成される。
なお、計測面ｉ１〜ｉ３上に配置される、それぞれの対物レンズ２１ａの焦点の位置は、それぞれ計測面ｉ１〜ｉ３上に存在すれば、ＸＹ平面上の位置は特に限定されない

生成された計測面ｉ２と計測面ｉ３のそれぞれの計測面に対応するそれぞれの光強度分布データは、計測面ｉ１における光強度のｚに関する微分係数を算出するのに用いられる。位相復元処理部５２１は、計測面ｉ２上の点および計測面ｉ３上の点であって、ＸＹ平面上での座標が同じ位置等の互いに対応する位置にある２点の強度の値の差分を、計測面ｉ２およびｉ３の間の距離である２Δｚで割ることにより、計測面ｉ１における光強度のｚに関する微分係数に相当するｄＩ／ｄｚ＝（Ｉ３−Ｉ２）／２Δｚを算出する。位相復元処理部５２１は、算出された光強度のｚに関する微分係数分布に対応するデータ（以下、微分係数分布データと呼ぶ）を適宜記憶部４４等に記憶させる。微分係数分布データは、座標ｘ、ｙ、ｚの値に対応する光強度のｚに関する微分係数の分布を示すデータであり、ルックアップテーブルの形式で構築されている。
なお、所定の座標ｘ、ｙ、ｚの値に対応するｚに関する微分係数の値を取り出すことができれば、微分係数分布データのデータ構造は特に限定されず、他の既存のデータ構造であってもよい。

図５は、対象物Ｓを撮像する際の対物レンズ２１ａの焦点と計測面ｉ１〜ｉ３の配置例を示す。図５では、ステージ８上に対象物Ｓが載置されている。図５では、対物レンズ２１ａの光軸Ｌｏに平行にｚ軸が設定され、対象物Ｓから対物レンズ２１ａへ向かう向きをｚ軸の+の向きとしている。また、焦点位置Ｆから対物レンズ２１ａに入射する光の光束を二点鎖線Ｌ２００で模式的に示した。図５では、対物レンズ２１ａの焦点位置Ｆをｚ＝ｚ０とし、ｚ＝ｚ０の点を含んでｚ軸に垂直な面を計測面ｉ１として示している。

装置制御部５１は、モータ等の移動装置を介して電動駆動することによりステージ８を移動させ、計測面ｉ１，ｉ２，ｉ３上にそれぞれ対物レンズ２１ａの焦点位置を設定する。装置制御部５１は、対物レンズ２１ａの光軸Ｌｏに沿って互いに焦点間隔Δｚ離れた複数の位置のそれぞれに対物レンズ２１ａの焦点を順次配置する。ここで、「対物レンズ２１ａの光軸Ｌｏに沿って互いに焦点間隔Δｚ離れた複数の位置」とは、当該複数の位置を対物レンズ２１ａの光軸Ｌｏに射影した際に、互いにΔｚの距離離れる複数の位置を指す。また、対物レンズ２１ａは結像光学系７においてステージ８側にあるため、対物レンズ２１ａの焦点位置Ｆは対物光学系２０または結像光学系７の焦点位置と言い換えることもできる。

装置制御部５１の最適条件計算部５１１は、本実施形態における顕微鏡本体部１００の設定情報と後に詳述するパラメータｋを用い、焦点間隔Δｚを以下の式（１００）により算出する。ここで、顕微鏡本体部１００の設定情報とは、定量位相画像の生成のために顕微鏡本体部１００に設定される情報であり、例えば、対物レンズ２１ａの開口数、照明光Ｌ２の波長、対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率の情報である。

…（１００）
ここで、λは照明光Ｌ２の波長であり、入力部４１へのユーザの入力等に基づいて装置制御部５１が設定する。ｎは対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率であり、入力部４１へのユーザの入力等に基づいて装置制御部５１が設定する。装置制御部５１は、対物レンズ２１ａが乾燥対物レンズの場合、対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の雰囲気は空気であるため、空気の屈折率として例えばｎ＝１．００に設定する。一方、対物レンズ２１ａが液浸対物レンズの場合、装置制御部５１は、対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間に満たされる浸液の屈折率を屈折率ｎとして設定する。ＮＡは対物レンズ２１ａの開口数であり、入力部４１へのユーザの入力等に基づいて装置制御部５１が設定する。そして、最適条件計算部５１１は、顕微鏡本体部１００の設定情報に基づいて、焦点間隔Δｚを算出する。具体的には、最適条件計算部５１１は、式（１００）に示されたように、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、照明光Ｌ２の波長λ、および対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎの情報に基づいて焦点間隔Δｚを算出する。

また、パラメータｋは１以上の値であり、式（１００）において、ｋ＝１の場合には、対物レンズ２１ａの性能を最大限に生かす遮断空間周波数まで、強度輸送方程式により位相復元を行うことができる。ｋの値が１より大きくなるに従って、強度輸送方程式により位相復元を行うことができる空間周波数は低くなる。以下では、パラメータｋを位相復元パラメータと呼ぶ。

なお、対象物Ｓの実際の位相値と測定した位相値との差を位相復元誤差と称する。高い空間周波数で位相を復元すると、基本的に位相復元誤差が小さくなる。位相復元誤差が小さい場合には、実際の位相値により近い位相を（つまり、より高精度に位相を）復元することになるので、位相を復元する際の精度（位相復元精度と称する）が高いと言うことができる。

最適条件計算部５１１は、位相復元パラメータｋを、２５以下に設定することが好ましく、１６以下に設定することがより好ましい。位相復元パラメータｋが大きくなると、上記の通り、位相復元可能な空間周波数が低くなる。ｋ＝２５の場合における焦点間隔Δｚを採用した場合では、対物レンズ２１ａの遮断空間周波数の５分の１の空間周波数まで復元することに相当する性能となる。また、ｋ＝１６の場合における焦点間隔Δｚを採用した場合では、対物レンズ２１ａの遮断空間周波数の４分の１の空間周波数まで復元することに相当する性能となる。可視光での数μｍ〜数百μｍ程度の大きさの細胞等の対象物Ｓ（位相物体）の観察では、位相復元パラメータｋは２５以下の比較的大きい値に設定すると細胞全体を検出する上で好ましく、パラメータｋが１６以下だと、核等の細胞内の比較的大きい構造物を検出しやすくなるためさらに好ましい。
なお、上記の例においては、対物レンズ２１ａの遮断空間周波数の５分の１や４分の１の空間周波数まで復元することに相当するようにパラメータｋの値を決定したが、パラメータｋの値はこれらの値に限られることはなく、対象物Ｓの位相計測に必要な分解能に応じて設定すればよい。

最適条件計算部５１１が、照明光Ｌ２の波長λが３４０ｎｍ、４００ｎｍ、５５０ｎｍ、７００ｎｍおよび１３００ｎｍにおける焦点間隔Δｚを、位相復元パラメータｋを１〜１６の範囲として式（１００）に基づいて設定する場合の数値範囲の例を以下の表１に示す。

最適条件計算部５１１は、特に可視光を照明光とした位相の計測に際し、各種の対物レンズ２１に対し、位相復元パラメータｋを１〜１６の範囲として焦点間隔Δｚを算出した表１の結果に基づき、焦点間隔Δｚを０．０７μｍ以上９０．３μｍ以下に設定することが好ましい。焦点間隔Δｚを０．０７μｍ以上９０．３μｍ以下に設定すると、開口数ＮＡが０．３〜１．４０等の範囲におけるいずれかの対物レンズ２１を用いて、遮断空間周波数の４分の１から遮断空間周波数の全体までを精度よく位相復元することができる。つまり、多くの種類の対物レンズ２１について、対物レンズ２１の遮断空間周波数の大部分を精度よく（言い換えると、対物レンズ２１の性能を活かして）位相復元することができる。なお、対物レンズ２１の開口数ＮＡを０．３〜１．４０の範囲としたが、この範囲に限られず、任意の開口数ＮＡを有する対物レンズ２１を用いてもよい。また、照明光Ｌ２の波長を、可視光を中心に３４０ｎｍ、４００ｎｍ、５５０ｎｍ、７００ｎｍおよび１３００ｎｍとしたが、この範囲に限られず、可視域の他の波長を含んでもよいし、紫外域や赤外域の波長を含んでもよい。

ここで、焦点間隔Δｚが短すぎると（つまり、パラメータｋが小さすぎると）、強度輸送方程式（式（１）、（２））によって位相復元する際のバックグラウンドノイズなどのノイズや、焦点位置の移動の際の駆動誤差などの外乱要因により、かえって位相復元誤差が増加するため好ましくない。一方、焦点間隔Δｚが大きすぎると（つまり、パラメータｋが大きすぎると）、位相復元可能な空間周波数が低下する。したがって、例えば、焦点間隔Δｚを０．０９μｍ以上１２．３μｍ以下に設定すると、開口数ＮＡが０．７５〜１．２０等の比較的広範囲のいずれかの対物レンズ２１を用いて、対物レンズ２１の遮断空間周波数の大部分をより精度よく位相復元することができる。さらに、焦点間隔Δｚを０．１０μｍ以上６．０μｍ以下に設定すると、開口数ＮＡがおおよそ０．９５等の対物レンズ２１を用いて、対物レンズ２１の遮断空間周波数の大部分をさらに精度よく位相復元することができる。

なお、上述の表１では遮断空間周波数の４分の１まで位相復元できる条件であるｋ＝１６を上限値として、式（１００）におけるｋの範囲を設定したが、最適条件計算部５１１は、対物レンズ２１ａによる点像強度分布（Ｐｏｉｎｔ Ｓｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ＰＳＦ）に基づいて焦点間隔Δｚを設定してもよい。最適条件計算部５１１は、一例として、当該点像強度分布（ＰＳＦ）の第一暗環の位置を基準とした場合のｋの値であるｋ＝５の条件に基づき、ｋが５以下の範囲として式（１００）に基づいて焦点間隔Δｚを設定することができる。一例として、最適条件計算部５１１は、上述したように、対物レンズ２１ａの遮断空間周波数まで位相復元が可能となる条件（ｋ＝１）を加え、ｋが１以上５以下の範囲として式（１００）に基づいて焦点間隔Δｚを設定してもよい。

図６は、点像強度分布とデフォーカス距離との関係を示す図である。図６において点像強度分布（ＰＳＦ）を得るための対物レンズの条件は、倍率が２０倍、開口数ＮＡが０．７５の乾燥タイプであり、光の波長は５５０ｎｍである。横軸は、対物レンズ２１ａの光軸（ｚ軸）上にとった焦点位置Ｆからの距離（デフォーカス距離）を示す。縦軸は、各デフォーカス距離に対応するｚ軸上の点像強度分布ＰＳＦの強度を示す。位相復元パラメータｋ＝５に相当する第一暗環の位置は、点像強度分布ＰＳＦの強度が０となるｚ軸上の位置であって、絶対値の最も小さい位置となる。最適条件計算部５１１は、焦点間隔Δｚを焦点位置Ｆと第一暗環の位置との間の距離に基づいて設定することで、高い空間周波数まで精度よく位相復元を行うことができる。

図７（Ａ）は、照明光の波長λを５５０ｎｍ、対物レンズ２１ａの倍率を２０倍、開口数ＮＡを０．７５の乾燥タイプ（ｎ＝１．００）とし、焦点間隔Δｚを第一暗環がｚ軸に沿って延びる距離（Δｚ＝１．６μｍ）として、空間周波数と位相復元する利得との関係を示したものである。位相復元する利得は、対象物Ｓ（位相物体）を透過した波面が距離ｚの面にもたらす光強度分布に関するフレネル・キルヒホッフの積分から導出される、焦点間隔Δｚに基づいて変化するコントラスト伝達関数（Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ＣＴＦ，実線）により示した。

また、図中「Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｅｑｕａｔｉｏｎ：ＴＩＥ」で示されている破線は、強度輸送方程式に基づいた位相復元する利得曲線であり、強度輸送方程式がＣＴＦの関数を近似した関数であるため、２つの利得曲線（ＣＴＦとＴＩＥ）は、高周波数域で解離する。図中、「ＣＴＦ」と「ＴＩＥ」で示された２つの曲線が略一致している周波数領域においては、強度輸送方程式に基づいて正確な位相値を復元することができる（つまり、高精度な）。なお、開口数ＮＡを照明光Ｌ２の波長λで割った値で得られる遮断空間周波数は、縦軸に平行な二重線で対応する空間周波数の位置に示した。

図７（Ｂ）は、照明光Ｌ２の波長λ、対物レンズ２１ａの倍率、開口数ＮＡについては図７（Ａ）と同様の条件で、焦点間隔Δｚを０．４μｍとして、空間周波数と位相復元する利得との関係を示したものである。図７（Ａ）と図７（Ｂ）とを比較すると、焦点間隔Δｚが短い図７（Ｂ）の場合の方が、ＣＴＦとＴＩＥとが略一致する周波数域が広く、より遮断空間周波数に近い周波数域まで位相復元することができることがわかる。

焦点間隔Δｚを導出する上述の式（１００）において、位相復元パラメータｋを一定にすると、位相復元精度を維持しながら、対物レンズ２１を交換する等、対物レンズ２１の諸元を変化させることができる。ここで、位相復元精度を維持するとは、対物レンズ２１を交換する際に、得られる位相の値のばらつきが抑えられることを指す。

図８（Ａ）〜（Ｃ）には、遮断空間周波数まで位相復元できる条件で、位相復元パラメータｋを一定に保ちながら、式（１００）に従い、開口数ＮＡ等に基づいて焦点間隔Δｚを変化させた場合のコントラスト伝達関数を示した。図８（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、開口数ＮＡがそれぞれ０．３、０．７５および０．９５の場合を示している。図８（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のいずれにおいても、コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）が強度輸送方程式に基づく伝達関数（ＴＩＥ）から解離し始める利得（縦軸）の値は同様である。また、図８（Ａ）でＣＴＦとＴＩＥが一致している周波数領域は、図８（Ｂ）、（Ｃ）においてＣＴＦとＴＩＥが一致している周波数領域に含まれる。従って、対物レンズ２１を交換する場合に、式（１００）に基づいて、位相復元パラメータｋを一定にしながら、対物レンズ２１の開口数ＮＡ等に合わせて焦点間隔Δｚを変更することで、位相復元する際の位相値を略一定に保つことができる。例えば対物レンズ２１の開口数ＮＡが０．３のときに位相復元できる周波数領域に対応する大きさの細胞構造等は、式（１００）に基づいて開口数ＮＡが０．７５または０．９５である対物レンズ２１へと交換する際にも、同じ位相値として算出される。従って、同じ対象物Ｓに対して対物レンズ２１を切り替えても位相復元した結果得られた位相のばらつきは小さくなり、対象物Ｓの定量的な解析が可能となる。

図９（Ａ）〜（Ｃ）は、遮断空間周波数の４分の１まで位相復元できる条件で、位相復元パラメータｋを一定に保ちながら、式（１００）に従い、開口数ＮＡ等に基づいて焦点間隔Δｚを変化させた場合のコントラスト伝達関数を示した。なお、縦軸に平行な二重線で示す遮断空間周波数は、図８（Ａ）〜（Ｃ）で示す遮断空間周波数（図８（Ａ）〜（Ｃ）の縦軸に平行な二重線に対応する周波数）の４分の１である。この場合でも、コントラスト伝達関数が強度輸送方程式に基づく伝達関数から解離し始める利得の値は略同様である。従って、この場合においても、図８（Ａ）〜（Ｃ）を用いて説明した場合と同様に、対物レンズ２１を交換する場合に、式（１００）に基づいて焦点間隔Δｚを変更することで、位相復元した結果得られた位相のばらつきを小さくすることができる。

なお、空間周波数の低下に伴い伝達関数の値は０へと漸近する。このような空間周波数が０近傍の低周波数領域では、微分演算子∇xyによる演算の際、０による除算によって、計算値が発散する場合がある。図７（Ａ）および（Ｂ）を比較すると、図７（Ｂ）では、空間周波数の０からの増加に伴う伝達関数の増加が緩やかであるため、上記のように計算値が発散し位相の計測結果に影響し得る。このような影響を避けるため、位相計測により得られた、例えば伝達関数が０．２、０．１等の所定の値以下の低周波数領域での位相の値を、より高い周波数領域での位相の値よりも低く重み付けして計算したり、ウェイティング・ハイパス・フィルターにより光強度分布データにおいて、実座標空間から周波数空間にフーリエ変換した場合に低周波数領域に対応する部分のノイズを除去したりすることができる。

また、光強度分布データの、実座標空間から周波数空間にフーリエ変換した場合に遮断空間周波数より高い周波数領域に対応する部分のノイズについても、ローパスフィルターで適宜除去することが好ましい。ユーザが入力等して設定した対物レンズ２１ａの開口数ＮＡおよび照明光Ｌ２の波長λから、装置制御部５１が遮断空間周波数ＮＡ／λを算出し、算出された遮断空間周波数に基づいて、光強度分布データの、実座標空間から周波数空間にフーリエ変換した場合に高周波数領域に対応する部分のノイズをウェイティング・フィルターにより除去してもよい。また、特に図７（Ａ）に示すように、コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）と強度輸送方程式に基づく伝達関数（ＴＩＥ）で示された２つの曲線が略一致している周波数領域以外の周波数領域（すなわち、位相復元されない周波数領域）に対応する光強度分布データの成分についても、位相復元する際のノイズになり得るため、ローパスフィルターで除去することが好ましい。

上述のように、焦点間隔Δｚの値を調節することにより位相を復元する際の精度を高くすることができるが、位相を復元する際の精度は、焦点間隔Δｚの他、対象物Ｓ上のサンプリング間隔を調節することによって高くすることができる。

図１０は、サンプリング間隔を説明するための図である。図３について上述した通り、対象物Ｓを透過して非平面となった波面Ｗ４は、計測面ｉ１〜ｉ３（以下、計測面ｉ１〜ｉ３を総称して計測面ｉと呼ぶ）に位相の変化に基づいた光強度分布を形成する。図１０の右側の図は、計測面ｉを対物レンズ２１ａの光学中心から見た概念図で、検出部９の個々の画素に対応する部分Ｇを示した。個々の画素に対応する部分Ｇは、対象物Ｓに対応する領域を格子状に覆うように配列される。以下の実施形態で、サンプリング間隔Δｘ、Δｙは、このように対物レンズ２１ａの焦点位置が設定された計測面ｉにおける個々の画素に対応する部分Ｇの幅である。

サンプリング間隔Δｘ、Δｙは、検出部９の画素サイズをＰ、結像光学系７の横倍率をβとしたとき、Δｘ＝Δｙ＝Ｐ／βとなる。ここで、検出部９の画素サイズとは、ＣＣＤ等の場合、各画素の幅を示し、変形例６で後述するレーザ走査型蛍光観察ユニットを用いた走査型顕微鏡の場合、画素サイズＰは、視野数（対角）をスキャン倍率で割ったサイズである。以下では、サンプリング間隔をΔｘとして記述する。結像光学系７の横倍率βは、対物レンズ２１ａの倍率β１とリレー光学系３０の倍率β２との積となる。

図１１（Ａ）は、サンプリング間隔Δｘが互いに異なり、画素数Ｎが互いに同じ２つの計測条件における、位相復元した場合の周波数利得を示す図である。図中、サンプリング間隔Δｘがより大きいΔｘ＝１．６μｍのデータ（破線）では、周波数０付近にも大きな周波数利得を示す。サンプリング間隔Δｘが大きくなると、低周波数領域をより良好に復元するために周波数サンプリングが多くなる為、光強度分布Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３（図４）に含まれるノイズにより位相を復元する際の精度が低下する。反対にサンプリング間隔Δｘが小さくなると、光強度分布Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３に含まれるノイズによる位相を復元する際の精度の低下が抑制される。

図１１（Ａ）より、サンプリング間隔Δｘが大きい方が、光強度分布Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３に含まれるノイズにより位相を復元する際の精度が低下し、また、サンプリング間隔Δｘが倍率βに依存してΔｘ＝Ｐ／βによって求まることから、高倍率の対物レンズ２１ａでは、低倍率の対物レンズ２１ａと比較して、光強度分布Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３に含まれるノイズによる位相を復元する際の精度の低下が抑制される。

図１１（Ｂ）は、サンプリング間隔Δｘは互いに同じで、画素数Ｎが互いに異なる２つの計測条件における、位相復元した場合の周波数利得を示す図である。図中、画素数Ｎがより大きいＮ＝４０９６のデータ（破線）では、周波数０付近にも大きな周波数利得を示す。画素数Ｎが多いと、低周波数成分の位相物体、すなわち大きい構造体を、より厳密に復元する事ができる。一方、画素数が多いと、光強度分布Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３に含まれるノイズにより位相を復元する精度が低下する。

図１２（Ａ）は、サンプリング間隔Δｘの設定方法を示す概念図である。最適条件計算部５１１は、点像強度分布（ＰＳＦ）のエアリーディスクの大きさに基づいて結像光学系７の倍率βを設定する。図１２（Ａ）では、検出部９の検出面上に投影される点像強度分布（ＰＳＦ）のエアリーディスクの直径幅が、画素サイズＰの幅と等しい場合の図を模式的に示した。最適条件計算部５１１は、検出部９の検出面上に投影される点像強度分布（ＰＳＦ）のエアリーディスクの直径が、画素サイズＰの幅よりも大きくなるように結像光学系７の倍率βを設定することが好ましい。あるいは、最適条件計算部５１１は、検出部９の検出面上に投影される点像強度分布（ＰＳＦ）のエアリーディスクの面積が、画素サイズＰの面積よりも大きくなるように結像光学系７の倍率βを設定することが好ましい。この場合、サンプリング間隔Δｘ＝Ｐ／βは以下の式（３）を満たすように照明光の波長λおよび対物レンズ２１ａの開口数ＮＡに基づいて設定されることになる。

…（３）
式（３）を満たすようにサンプリング間隔Δｘが設定されると、点像強度分布よりも１画素の面積が大きいアンダーサンプリングを避けることができるため、アンダーサンプリングによる画質の低下を避けることができる。

最適条件計算部５１１（図２）は、照明光Ｌ２の波長λ、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、画素サイズＰ、結像光学系７の横倍率βが式（３）を満たす場合、一例として計測面ｉの数、すなわち対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数を３に設定する。式（３）を満たす条件は、サンプリング間隔Δｘが十分小さい条件であり、前述するように、光強度分布Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３に含まれるノイズによる位相を復元する際の精度の低下が抑制されるため、少ない撮像回数での位相復元が可能となる。一方、式（３）を満たさない場合、上記対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数を３を超える数値に設定する。式（３）を満たさない場合、サンプリング間隔Δｘが大きくなり、画像処理でノイズの影響を抑えるため、位相復元のために多くの光強度画像を撮像により取得することが好ましい。なお、対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数は、適宜、光強度画像の枚数、光強度分布データの数、又は検出部９による撮像回数等と言い換えることもできる。

図１２（Ｂ）は、サンプリング間隔Δｘの設定方法を示す概念図である。最適条件計算部５１１は、検出部９の検出面上に投影される点像強度分布（ＰＳＦ）のエアリーディスクの面積が、画素サイズＰの面積の４倍〜５倍になるように結像光学系７の倍率βを設定することが特に好ましい。これにより、光強度分布Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３のノイズによる位相を復元する際の精度の低下をより一層抑制することができる。

最適条件計算部５１１が、上述のように対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数および焦点間隔Δｚを設定したら、装置制御部５１は、設定された対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数および焦点間隔Δｚに基づいて対象物Ｓの撮像を行う。対象物Ｓからの光を検出部９が検出して得られた検出信号は、解析部５２の位相復元処理部５２１（図２）に入力される。

解析部５２は、検出部９から入力された検出信号を処理する。解析部５２は、当該検出信号から光強度分布データを生成し、この光強度分布データに基づいて定量位相画像を生成する画像生成部として機能する。また、解析部５２は、光強度分布データに基づいて復元した対象物Ｓの位相に基づいて解析を行う。

解析部５２の位相復元処理部５２１は、検出部９の各画素の位置と、入力された検出信号に基づいた光強度とが対応付けられた光強度分布データを生成し、適宜、記憶部４４等に記憶させる。位相復元処理部５２１は、強度輸送方程式（１）（２）および最適条件計算部５１１が設定した焦点間隔Δｚ等に基づいて、生成した光強度分布データから計測面ｉ１等を含む対象物Ｓにおける位相分布φに対応するデータ（以下、位相分布データと呼ぶ）を生成し、適宜記憶部４４等に記憶させる。位相分布データは、座標ｘ、ｙ、ｚの値に位相が対応付けられているデータであり、ルックアップテーブルの形式で構築されている。
なお、所定の座標ｘ、ｙ、ｚの値に対応する位相値を取り出すことができれば、位相分布データのデータ構造は特に限定されず、他の既存のデータ構造であってもよい。

式（３）に基づいて、最適条件計算部５１１が対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数を３を超える値に設定した場合は、位相復元処理部５２１は、以下に詳述するようにＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法（以下、ＳＧ法と呼ぶ）を用いて光強度分布データから位相を復元することが好ましい。

図１３は、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法（ＳＧ法）を説明するための図である。図１３（Ａ）の「元データ」のプロットは、横軸に、特定の一画素（特定画素）における、複数の計測面ｉに対応する光強度分布データのＺ方向座標位置を示し、縦軸に、各Ｚ方向座標位置に対応する、当該特定画素の光強度分布データの画素値を示す図である。図１３（Ａ）の例では、ノイズによる１次差分への影響を説明する便宜のため、元データはガウシアンノイズを含む正弦関数としている。破線および実線のグラフは、元データであるガウシアンノイズを加えた正弦関数に対し、それぞれＳＧ法を用いないで直接引き算した１次差分のデータと、ＳＧ法を用いて１次差分を計算したデータを示すものである。任意の関数から差分を計算する際、計測したデータから隣り合う関数値を直接引き算すると、図１３（Ａ）の「Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法を用いない１次差分」のデータ（破線）のようにばらつきの大きいデータとなってしまう。

図１３（Ｂ）は、ＳＧ法を説明するための概念図である。ＳＧ法では、隣り合う２点から差分を計算することをせず、周辺のデータ点も含め３以上の点から多項式近似曲線を算出して差分を計算する。これにより、図１３（Ａ）に示した「Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法を用いた１次差分」のデータ（実線）のようにＳＧ法を用いない場合と比べてノイズによる影響の少ない１次差分のデータを取得することができる。

画像構築部５２２（図２）は、位相復元処理部５２１が生成した位相分布データに基づいて、２次元または３次元の定量位相画像を構築し、記憶部４４等に記憶させる。ここで、定量位相画像とは、対象物における厚さの変化と屈折率の変化を積とする位相を表す（画像化）した画像である。具体的には、一例として、定量位相画像は、強度輸送方程式（式（１）、（２））で算出した位相値に応じて階調値を設定した画像である。定量位相画像は、一例として、位相値の大きさに比例した階調のグレースケールを設定した画像である。この場合、定量位相画像では、階調値（位相値の大小）から対象物Ｓのｚ方向の厚さ（高さ）についての高低情報を視認することができる。さらに、画像構築部５２２は、当該位相分布データまたは定量位相画像、および光強度分布Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３に基づいて、位相差画像、微分干渉画像、暗視野画像、コントラスト観察画像等の各画像を構築する。以下では、画像構築部５２２による計算処理によって得られる位相差画像、微分干渉画像、暗視野画像、コントラスト観察画像を、それぞれ計算位相差画像、計算微分干渉画像、計算暗視野画像、計算コントラスト観察画像と呼ぶ。なお、定量位相画像は、強度輸送方程式（式（１）、（２））で算出された位相値に応じて階調値を設定した画像に限られず、既存の他の方法で算出した位相値に応じて階調値を設定した画像であってもよい。

細胞等の、ｚ方向に垂直な方向の幅に比べてｚ方向の厚みの薄い試料を低コントラスト物体と呼ぶ。以下では、対象物Ｓが低コントラスト物体として、計算位相差画像、計算微分干渉画像、計算暗視野画像、計算コントラスト観察画像の構築の方法を説明する。低コントラスト物体における結像の式は以下の式（４）で表される。

…（４）
ここで、○の内側にｘが記された記号は折りたたみ積分を示す。ＥＰＳＦ（有効点像分布、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ＰｏｉｎｔＳｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）とは、以下の式（５）で定義される量である。

…（５）
ここで、Ｓは光源強度分布、Ｇは瞳関数、φは対象物Ｓを低コントラスト物体として位相復元処理部５２１が生成した対象物Ｓの位相分布、Ｐ（ｘ，ｙ）は対象物Ｓの振幅分布を表す。位相分布φは定量位相画像または位相分布データ、振幅分布は光強度分布データからそれぞれ得ることが出来、光源強度分布や瞳関数は顕微鏡本体部１００の諸元に応じて設定される。例えば、位相差観察の場合にはＳはリング絞りにおける光強度分布に相当し、Ｇは位相差観察用対物レンズの瞳関数に相当するため、これらの値を用いてＥＰＳＦを計算することができる。

図１４は、ＥＰＳＰの一例を示す図であり、具体的な数値は本発明を限定するものではない。式（５）により得られたＥＰＳＦは複素量であり、実部（Ｒｅ［ＥＰＳＦ］）と虚部（Ｉｍ［ＥＰＳＦ］）に分離することができる。縦軸の値はＥＰＳＦの虚部（Ｉｍ［ＥＰＳＦ］）の最大値で規格化した。

画像構築部５２２は、各々のＥＰＳＦを式（４）の物体の振幅分布および位相分布φに折り畳み積分することで計算位相差画像を構築する。位相差観察の場合にはＥＰＳＦを計算すると実部（ＥＰＳＦ）は非常に小さく、虚部（Ｉｍ［ＥＰＳＦ］）の寄与が大きいことから式（４）の第２項の寄与が大きくなり、それにより位相差観察特有の「ハロ」と呼ばれる現象が生じる。また、式（４）の第１項は画像の背景強度を表すが、位相差観察の場合には位相膜の透過率によって直接光の強度が弱められることで背景強度を抑えている。

画像構築部５２２は、以下のように計算微分干渉画像を構築する。微分干渉画像の場合、光源強度分布Ｓおよび瞳関数Ｇは所望の条件に合わせて任意に設定することができるがＥＰＳＦの導出方法では式（５）を用いることができない。計算微分干渉画像の構築においては、ＥＰＳＦをフーリエ変換した物理量であるＯＴＦを以下の式（６）のように定義する。

…（６）
ここで対象物Ｓを撮像して光強度分布データを得る際のＯＴＦと区別するために対象物Ｓを撮像して光強度分布データを得る際のＯＴＦをＯＴＦ＿ｂｆ、微分干渉観察のＯＴＦをＯＴＦ＿ｄｉｃとすると、ＯＴＦ＿ｄｉｃは以下の式（７）で表される。

…（７）
ここでΔは微分干渉プリズム（ウォラストンプリズムまたはノマルスキープリズム等）において入射光が２つに分離される量（シャー量（Ｓｈｅａｒ ａｍｏｕｎｔ））を表し、νｉ（ｉ；シャー方向の座標）はシャーが生じる方向の空間周波数、θは微分干渉プリズムをスライドさせる（プリズムスライド方式）またはポラライザの角度を変える（セナルモン方式）ことで生じる位相変化量（以下、バイアス（Ｂｉａｓ）と呼ぶ）を指す。ユーザが定めたシャー量、バイアスに応じてＯＴＦ＿ｄｉｃを求め、それを式（６）に従って逆フーリエ変換することでＥＰＳＦが求まる。求めたＥＰＳＦの実部（Ｒｅ［ＥＰＳＦ］）と虚部（Ｉｍ［ＥＰＳＦ］）を式（４）に代入すれば計算微分干渉画像が得られる。

画像構築部５２２は、以下のように計算コントラスト観察画像を構築する。コントラスト観察画像に関しては、特開２０１７−６８２０３号公報に光源強度分布Ｓおよび瞳関数Ｇが記載されており、この光源強度分布Ｓおよび瞳関数Ｇに基づいて式（４）（５）を実行すれば計算コントラスト観察画像を構築できる。

画像構築部５２２は、以下のように計算暗視野画像を構築する。画像構築部５２２は、計算暗視野画像の構築においては、上述の式（４）（５）を用いず、以下の式（８）等に基づいて、部分コヒーレント計算を実行することにより、計算暗視野画像を構築することができる。

…（８）
ここでｏは物体振幅分布、ＲはＴＣＣ（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｎ Ｃｒｏｓｓ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ：相互透過係数）、ξおよびηは回折光（または直接光）の方向余弦を表す。また物体複素振幅分布ｏは式（９）で表される。

…（９）
また、Ｒで示されるＴＣＣは以下の式（１０）で表される。

…（１０）
画像構築部５２２は、式（８）（９）（１０）に光源強度分布Ｓ、瞳関数Ｇ、低コントラスト物体の位相分布φ、低コントラスト物体の振幅分布Ｐ（ｘ，ｙ）等を適宜代入することにより、計算暗視野画像を構築する。

なお、画像構築部５２２は、式（８）（９）（１０）を用いて計算位相差画像、計算微分干渉画像、計算コントラスト観察画像を構築してもよい。画像構築部５２２が、必要に応じて式（４）（５）に基づいた低コントラスト近似を用いるか、式（８）（９）（１０）に基づいた部分コヒーレント結像計算を用いるか選択する構成にしてもよい。計測した位相分布φに基づいて計算位相差画像、計算微分干渉画像、計算暗視野画像、計算コントラスト観察画像等を構築することができれば、その方法は特に限定されない。

画像構築部５２２は、得られた定量位相画像、計算位相差画像、計算微分干渉画像、計算コントラスト観察画像、計算暗視野画像を適宜つなぎ合わせて、より広い一枚の画像（ステッチング画像）として構成することもできる。本実施形態の定量位相画像の生成方法では、対象物Ｓがメニスカス形状を有する液面下にある場合でも精度よく位相計測を行うことができるため、メニスカス形状を有する液面が存在する容器側面近傍も含め、対象物Ｓの配置されている容器全体の位相分布データを精度よく得ることができる。

以上のように計算上で位相差画像、微分干渉画像、暗視野画像、コントラスト観察画像等を構築すると、照明形状、対物レンズ２１ａの瞳面上での波面形状等の計測条件を任意に変化させた画像を、実際に当該計測条件下（つまり、実際の位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡）で対象物Ｓの撮像を行うことなく取得でき、場合によっては実際の顕微鏡等による撮像では実現が難しい画像も取得できる。

例えば、撮像により微分干渉画像を得る場合にはシャー方向を変える際にステージを回転させたり、対象物Ｓを回転させる必要があるが、本手法の場合には上式（７）等の周波数座標の取り方を工夫することで所望のシャー方向で計算微分干渉画像を構築可能である。またプラスチックディッシュ標本など通常、微分干渉観察が出来ないとされるサンプルに対しても定量位相画像から計算微分干渉画像を構築することで解決できる。さらに位相差観察の場合にはしばしば液面の縁に生じるメニスカスの影響で像が正しく得られない問題に直面するが、同じく定量位相画像から計算位相差画像を構築することで解決可能である。また、顕微鏡観察では観察手法ごとに定められた照明形状、対物レンズ２１ａの瞳面上での波面形状等の計測条件下で観察するが、これによって得られる観察画像は画像処理等の後処理をしなければ当該計測条件により実際に得られた画像のみであり、実際に計測した際とは異なる照明形状、対物レンズ２１ａの瞳面上での波面形状等の計測条件に対応する画像を得ることはできない。しかし、本手法を用いれば光源強度分布、瞳関数を自在に変えて所望の画像を構築することが可能である。

解析部５２の画像解析部５２３（図２）は、取得した定量位相画像、計算位相差画像、計算微分干渉画像、計算コントラスト観察画像、計算暗視野画像等を解析する。画像解析部５２３は、取得した定量位相画像から、対象物Ｓの面積および体積を算出する。

対象物Ｓの面積は、平面上の対象物Ｓに対応する領域を、計測した位相分布データに基づいて抽出して二値化により表した後、当該対象物Ｓに対応する領域の画素数に標本面換算での画素面積すなわちΔｘΔｙ（図１０）を掛けることによって算出することができる。

対象物Ｓの厚さ平均値（すなわち、平均高さ）は、上記対象物Ｓに対応する領域における各画素に対応する対象物Ｓの高さを総和して、当該対象物Ｓに対応する領域の画素数で除算することにより得た値を用いることができる。

対象物Ｓの体積は、上記で求めた対象物Ｓの面積と、対象物Ｓの厚さ平均値との積を対象物Ｓの体積とする。
なお、対象物Ｓの面積、厚さ、体積等の計算方法は、上述の方法に特に限定されない。

図１５は、画像解析部５２３が解析した解析結果が表示された表示部４２の表示画面の一例を示す図である。図１５〜図１７の例では、対象物Ｓとしての細胞の位相分布φを位相復元処理部５２１が算出した場合を示す。解析結果表示画面Ｄ１は、解析パラメータ選択画面Ｄ１１と、散布図表示画面Ｄ１２と、定量位相画像表示画面Ｄ１３とを備える。

解析パラメータ選択画面Ｄ１１は、画像解析部５２３が算出した細胞の厚さ平均値や、細胞の面積、細胞の体積等のパラメータ（以下、解析パラメータと呼ぶ）を表示する。解析パラメータ選択画面Ｄ１１では、各解析パラメータの左に選択ボタンＤ１１０が配置されており、ユーザはこの選択ボタンＤ１１０をオン状態とオフ状態とに切り替えることにより、散布図表示画面Ｄ１２の縦軸または横軸に設定される解析パラメータを指定することができる。

散布図表示画面Ｄ１２は、解析パラメータ選択画面Ｄ１１で選択された２つの解析パラメータを散布図の横軸および縦軸にとり、位相計測を行った各細胞を当該細胞の解析パラメータに基づいた座標位置にプロットしたグラフを表示している。散布図表示画面Ｄ１２は、適宜異なる細胞集団を区別して表示するように構成することができる。このグラフにより、複数の細胞の形状を定量化した情報が得られるが、このような解析は、多数の細胞における大量の位相値を自動解析することにおいて特に効果的である。例えば、培養細胞の形状の比較において、異なる培養条件で培養した多くの細胞同士の形状を定量的に比較することができる。また、散布図表示画面Ｄ１２には、過去に取得したデータの散布図を参照のため表示してもよい。
なお、散布図表示画面Ｄ１２は２次元の散布図に限らず、適宜３次元の散布図を立体的に示してもよい。

定量位相画像表示画面Ｄ１３は、顕微鏡本体部１００が計測した定量位相画像を表示する。定量位相画像の表示方法は特に限定されず、対象物Ｓの任意の断面を示してもよいし、任意の方向から見た図を示してもよい。定量位相画像表示画面Ｄ１３では、位相値を階調や色等により区別して表示することが好ましい。

図１６は、画像構築部５２２が構築した各種計算画像が表示された表示部４２の表示画面の一例である。計算画像表示画面Ｄ２は、計算画像選択画面Ｄ２１と、光強度画像表示画面Ｄ２２と、定量位相画像表示画面Ｄ２３と、各種計算画像表示画面Ｄ２４とを備える。

計算画像選択画面Ｄ２１には、位相差画像、微分干渉画像、暗視野画像、コントラスト観察画像等の計算画像名が、それぞれに対応する選択ボタンＤ２１０と共に表示されている。ユーザは各選択ボタンＤ２１０をオン状態またはオフ状態に切り替えることにより、各種計算画像表示画面Ｄ２４に表示される計算画像を選択することができる。

光強度画像表示画面Ｄ２２および定量位相画像表示画面Ｄ２３は、それぞれ光強度画像として光強度分布Ｉ１，Ｉ２および／またはＩ３に基づく画像、ならびに定量位相画像を表示する。各種計算画像表示画面Ｄ２４は、計算画像選択画面Ｄ２１で選択された計算画像を表示する。図１６の例では、各種計算画像表示画面Ｄ２４には計算位相差画像Ｄ２４１と、計算微分干渉画像Ｄ２４２と、計算暗視野画像Ｄ２４３と、計算コントラスト観察画像Ｄ２４４とが表示されている。

図１７は、画像構築部５２２が構築した、様々な条件下の各種計算微分干渉画像が表示された表示部４２の表示画面の一例である。計算微分干渉画像表示画面Ｄ３は、デフォルト画像表示画面Ｄ３１と、各種計算微分干渉画像表示画面Ｄ３２と、パラメータ変更画面Ｄ３３とを備える。

デフォルト画像表示画面Ｄ３１は、デフォルト画像として微分干渉画像の陰影方向（シャー方向）と陰影度合（シャー量）およびコントラスト調整量（バイアス量）が予め設定された画像を表示する。

各種計算微分干渉画像表示画面Ｄ３２は、様々なシャー方向、シャー量、バイアス量が設定された計算微分干渉画像が表示される。図１７の例では、図面右方向を０°として、それぞれ０°，４５°，９０°，１３５°，１８０°，２２５°，２７０°および３１５°のシャー方向の計算微分干渉画像Ｄ０，Ｄ４５，Ｄ９０，Ｄ１３５，Ｄ１８０，Ｄ２２５，Ｄ２７０およびＤ３１５が各種計算微分干渉画像表示画面Ｄ３２に表示されている。

パラメータ変更画面Ｄ３３は、ユーザが上述のシャー方向、シャー量、バイアス量等の各種パラメータを設定変更するための画面である。図１７の例では、シャー方向については０°〜３１５°の角度範囲、シャー量については１〜５、バイアス量については１〜５の段階で調節できるようになっているが、設定可能なシャー方向、シャー量およびバイアス量は特に限定されない。図１７の例では、「全表示」に対応する選択ボタンＤ３３１がオン状態になっているため、４５°おきに０°〜３１５°までのシャー方向の各計算微分干渉画像Ｄ０、Ｄ４５，Ｄ９０，Ｄ１３５，Ｄ１８０，Ｄ２２５，Ｄ２７０およびＤ３１５が各種計算微分干渉画像表示画面Ｄ３２に表示されている。

パラメータ変更画面Ｄ３３では、シャー方向、シャー量およびバイアス量に関してそれぞれスクロールバーＤ３３２，Ｄ３３３およびＤ３３４が配置されており、スクロールバーＤ３３２〜Ｄ３３４上の所望の数値に対応する位置に矢印Ｄ３３５、Ｄ３３６をユーザが選択して動かすことにより、シャー方向、シャー量およびバイアス量の値を変更できるようになっている。図１７の例では、シャー方向に関しては「全表示」が選択されているため、スクロールバーＤ３３２上には数値を選択するための矢印は表示されていない。
なお、上述の解析結果表示画面Ｄ１、計算画像表示画面Ｄ２および計算微分干渉画像表示画面Ｄ３の表示の態様は一例であり、示された数値や画像等の例は本発明を限定するものではない。

（定量位相画像生成方法の流れ）
図１８は、本実施形態の定量位相画像生成装置に関する定量位相画像生成方法の流れを示すフローチャートである。

ステップＳ１００１において、ユーザ等により、定量位相画像生成装置１のステージ８上に対象物Ｓが載置される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。ステップＳ１００３において、ユーザが位相計測の計測条件に関する情報を入力する。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５に進む。

ステップＳ１００５において、最適条件計算部５１１は、ユーザが入力した情報に基づいて、（Ｉ）照明光の波長λ、（ＩＩ）対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、（ＩＩＩ）対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎ、（ＩＶ）結像光学系７の横倍率β、（Ｖ）検出部９の画素サイズＰ、および（ＶＩ）位相復元パラメータｋを取得する。結像光学系７の横倍率βは、上述の式（３）を満たすように適宜（Ｉ）（ＩＩ）（Ｖ）のパラメータから算出してもよい。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７に進む。ステップＳ１００７において、最適条件計算部５１１は、ステップＳ１００５で取得したパラメータ（顕微鏡本体部１００の設定情報）に基づいて、焦点間隔Δｚを算出する。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９に進む。

ステップＳ１００９において、最適条件計算部５１１は、上述の式（３）に基づいて、対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数を算出する。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１０に進む。ステップＳ１０１０において、装置制御部５１は、事前に取得した三次元の光強度分布データに対応する光強度のコントラスト等に基づいて計測面ｉ１の位置を設定する。ステップＳ１０１０が終了したら、ステップＳ１０１１に進む。

ステップＳ１０１１において、顕微鏡本体部１００は、取得した（Ｉ）〜（ＶＩ）のパラメータ、算出した焦点間隔Δｚおよび対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数、ならびに設定した計測面ｉ１の位置に基づいて対象物Ｓの撮像を行い、位相復元処理部５２１は対象物Ｓの計測面ｉにおける光強度分布データをそれぞれ生成する。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３に進む。

ステップＳ１０１３において、位相復元処理部５２１は、撮像により取得した光強度分布データを前処理する。位相復元処理部５２１は、必要に応じて遮断空間周波数より高い周波数領域のノイズをローパスフィルターで除去する等のフィルター処理等を行ったりして、位相復元を行う前の光強度分布データを加工する。ステップＳ１０１３が終了したら、ステップＳ１０１５に進む。ステップＳ１０１５において、位相復元処理部５２１は、前処理を施した光強度分布データから計測面ｉ１における光強度のｚに関する微分係数分布データを生成する。ステップＳ１０１５が終了したら、ステップＳ１０１７に進む。

ステップＳ１０１７において、位相復元処理部５２１は、強度輸送方程式に基づいて、生成した計測面ｉ１における光強度のｚに関する微分係数分布データから位相分布データを生成する。ステップＳ１０１７が終了したら、ステップＳ１０１９に進む。ステップＳ１０１９において、画像構築部５２２は、生成した位相分布データに基づいて、対象物Ｓの定量位相画像を生成する。ステップＳ１０１９が終了したら、ステップＳ１０２１に進む。

ステップＳ１０２１において、画像構築部５２２は、生成した位相分布データおよび／または定量位相画像、ならびに光強度分布データに基づいて、計算位相差画像、計算微分干渉画像、計算暗視野画像および計算コントラスト観察画像等を生成する。ステップＳ１０２１が終了したら、ステップＳ１０２３に進む。ステップＳ１０２１において、画像解析部５２３は、定量位相画像を含む生成した画像を解析し、解析結果を表示する。ステップＳ１０２３が終了したら、処理を終了する。

なお、最適条件計算部５１１は、顕微鏡本体部１００の設定情報として、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、照明光Ｌ２の波長λ、および対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎの情報に基づいて焦点間隔Δｚを算出することとしたが、ユーザの要求に応じて、顕微鏡本体部１００の設定情報のうち、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、照明光Ｌ２の波長λ、および対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎの少なくとも１つの情報に基づいて焦点間隔Δｚを算出してもよい。具体的には、例えば、対物レンズ２１ａに乾燥対物レンズを用いる場合、対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎを固定値とした上で（式（１００）にｎ＝１を代入した上で）、最適条件計算部５１１は、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡと照明光Ｌ２の波長λの情報に基づいて焦点間隔Δｚを算出する。さらに、例えば、対物レンズ２１ａに水を浸液とする特定の対物レンズを用い（例えば、ｎ＝１.３３の固定値として）、照明光Ｌ２の波長λを固定値（例えば、λ＝４００ｎｍ）とする場合、それらの値を式（１００）に代入した上で、最適条件計算部５１１は、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡの情報に基づいて焦点間隔Δｚを算出する。また、照明光Ｌ２の波長λのみを固定値（例えば、λ＝５５０ｎｍ）とする場合、最適条件計算部５１１は、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡと対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎの情報に基づいて焦点間隔Δｚを算出する。

同様に、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡを固定値（例えば、ＮＡ＝０．９５）として、最適条件計算部５１１は、照明光Ｌ２の波長λと、対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎに基づいて焦点間隔Δｚを算出してもよいし、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡを固定値と、照明光Ｌ２の波長λ又は対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎを固定値として、最適条件計算部５１１は、対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎ又は照明光Ｌ２の波長λの情報に基づいて焦点間隔Δｚを算出してもよい。また、同様に、位相復元パラメータｋを固定値とした上で、最適条件計算部５１１は、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、照明光Ｌ２の波長λ、および対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎの少なくとも１つの情報に基づいて焦点間隔Δｚを算出してもよいし、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、照明光Ｌ２の波長λ、および対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎの少なくとも１つを固定値として、最適条件計算部５１１は、少なくとも位相復元パラメータｋに基づいて焦点間隔Δｚを算出してもよい。

なお、透過照明光学系１０からの照明光Ｌ２が対象物Ｓの少なくとも一部を透過した後に検出されて取得された１つの光強度分布データさえあれば、光強度分布データは、対象物Ｓの外部に焦点を配置して撮像した結果取得されたものでもよい。また、計測面ｉ１，ｉ２，ｉ３のうち少なくとも一つの計測面が対象物Ｓの一部を含めば、他の計測面は対象物Ｓを含まなくともよい。ここで、上記対象物Ｓの一部を含む計測面においても、対物レンズ２１ａの焦点が対象物Ｓの外部に配置されていてもよい。つまり、それぞれの計測面ｉの撮像において、対物レンズ２１ａの焦点は対象物Ｓの内部に配置されていてもよいし、外部に配置されていてもよい。

なお、それぞれの計測面ｉ１，ｉ２，ｉ３に対応してそれぞれ１つの光強度分布Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３を取得すれば、本実施形態に係る位相計測を行うことができる（図４）が、一部または全部の計測面ｉ１，ｉ２，ｉ３について、１つの計測面に対して複数の光強度分布が対応していてもよい。

なお、対象物Ｓからの光の光強度のコントラストに基づいて計測面ｉ１の位置を設定する際、装置制御部５１は、対象物Ｓからの光の光強度のコントラストを示すパラメータであれば、上記の分散ｖｚ以外のパラメータを算出してもよい。例えば、装置制御部５１は、以下の式（１２）で示される、各ｚの値に対応する光強度分布Ｉｚ（ｘ，ｙ）のＸＹ平面上での勾配の大きさを足し合わせた値ｇｚ（以下、勾配加算値と呼ぶ）や、以下の式（１３）で示される、各ｚの値に対応する、ＸＹ平面上の光強度のラプラシアンの二乗和Ｌｚを算出してもよい。装置制御部５１は、実際には、式（１２）（１３）に関し以下の積分に対応する値を離散的な数値に基づいた計算により算出する。

…（１２）

…（１３）
この場合、装置制御部５１は、上記に示された勾配加算値ｇｚまたはラプラシアンの二乗和Ｌｚが極小となるｚ方向の位置に計測面ｉ１の位置を設定することができる。

なお、対象物Ｓからの光の光強度のコントラストに基づいて計測面ｉ１を設定できれば計測面ｉ１の位置の設定方法は特に限定されない。例えば、装置制御部５１は、勾配加算値ｇｚ、ラプラシアンの二乗和Ｌｚまたは上述の分散ｖｚが極小となるｚ方向の位置の他、これらの値が極大や最大、最小等となるｚ方向の位置に基づいて計測面ｉ１の位置を設定してもよい。また、事前に取得された三次元の光強度分布データの各ｚの値に対応する光強度画像をユーザが視認し、当該光強度画像のコントラストに基づいて計測面ｉ１の位置を設定してもよい。さらに、ユーザが接眼レンズ３５（図１）を介して対象物Ｓを観察し、観察視野のコントラストに基づいて計測面ｉ１の位置を設定してもよい。

なお、対象物Ｓからの光の光強度のコントラストに基づいて計測面ｉ１の位置を設定する際、当該光強度のコントラストを算出するために用いる三次元の光強度分布データは、事前に取得するものとしたが、この場合の「事前に」とは、計測面ｉの位置の設定（上述のフローチャート（図１８）のステップＳ１０１０）よりも前であれば、特に限定されない。

なお、対物レンズ２１ａの光軸Ｌｏに沿って、対象物Ｓにおける対物レンズ２１ａの焦点を所望の間隔Δｚ移動させ、対象物Ｓの所望の計測面ｉからの光を検出できれば、装置制御部５１によるステージ８の駆動方法等は特に限定されない。また、対物レンズ２１ａの焦点と対象物Ｓとの相対位置を変更できれば、装置制御部５１は、ステージ８を対物レンズ２１ａの光軸Ｌｏ（ｚ軸）またはｚ軸に垂直な軸（ｘ軸若しくはｙ軸）等の任意の軸に沿って移動可能に構成することができ、またステージ８を三次元空間上の任意の経路に沿って移動させてもよい。また、装置制御部５１により、対物レンズ２１ａが対物レンズ２１ａの光軸Ｌｏに沿って移動することにより、対象物Ｓにおける対物レンズ２１ａの焦点を移動させてもよい。この場合も、対物レンズ２１ａの焦点と対象物Ｓとの相対位置を変更できれば、装置制御部５１は、対物レンズ２１ａを対物レンズ２１ａの光軸Ｌｏ（ｚ軸）またはｚ軸に垂直な軸（ｘ軸若しくはｙ軸）等の任意の軸に沿って移動可能に構成することができ、また対物レンズ２１ａを三次元空間上の任意の経路に沿って移動させてもよい。さらに、装置制御部５１は、ステージ８と対物レンズ２１ａのどちらか一方を移動可能に構成するだけでなく、ステージ８と対物レンズ２１ａの両方を移動可能に構成することにより、対物レンズ２１ａの焦点と対象物Ｓとの相対位置を変更してもよい。

なお、上述のフローチャートのステップＳ１００３，Ｓ１００５において、ユーザが位相計測の計測条件に関する情報を入力し、最適条件計算部５１１がユーザが入力した情報に基づいて（Ｉ）〜（ＶＩ）の各パラメータを取得する構成としたが、記憶部４４に記憶された情報に基づいて設定してもよい。例えば、複数の対象物Ｓに対してそれぞれ複数の定量位相画像を撮像して取得する際、当該複数の対象物Ｓが、同じ種類の細胞や、形態等の観点から類似する細胞に分類される場合等、同じ又は類似する位相物体の場合には、記憶部４４に記憶された前回または過去の撮像の際における（Ｉ）〜（ＶＩ）のパラメータを適宜用いるようにしてもよい。なお、対象物Ｓは細胞に限られない。また、記憶部４４に記憶された情報に基づく数値の中から入力部４１を介してユーザが選択する等、ユーザの入力と記憶部４４に記憶された情報との両方に基づいて（Ｉ）〜（ＶＩ）の各パラメータを設定してもよい。さらに、最適条件計算部５１１は、（ＶＩ）位相復元パラメータｋを必ずしも設定することなく、式（１００）等に基づいて算出した焦点間隔Δｚを設定してもよい。

上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の定量位相画像生成方法は、対象物Ｓにおける対物レンズ２１ａの光軸に沿って互いに焦点間隔Δｚ離れた複数の位置のそれぞれに対物レンズ２１ａの焦点を配置し、対象物Ｓからの光を検出することと、上記複数の位置のそれぞれに対応する複数の光強度分布データを生成することと、複数の光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成することを備え、焦点間隔Δｚは、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、照明光の波長λおよび対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎに基づいて設定される。これにより、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、照明光の波長λおよび対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎに合わせ、少ない撮像回数で、精度よく対象物Ｓの位相を計測することができる。
また、従来の位相計測では、予め計測された光強度画像に関するノイズ量に基づいて焦点間隔Δｚを設定する方法が提案されていたが、本実施形態の方法では、このような事前のノイズ量などの計測の必要は無い。

（２）本実施形態の定量位相画像生成方法または定量位相画像生成装置において、焦点間隔Δｚは、生成する定量位相画像において位相を復元する空間周波数を示すパラメータｋを用いて設定される。これにより、対物レンズ２１ａの遮断空間周波数の大部分を利用し少ない撮像回数で、精度よく対象物Ｓの位相を計測することができる。

（３）本実施形態の定量位相画像生成方法または定量位相画像生成装置において、対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数は、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、対物レンズ２１ａを含む結像光学系７による横倍率β、および検出部９の画素サイズＰに基づいて設定される。これにより、結像光学系７による横倍率βおよび検出部９の画素サイズＰに合わせ、少ない撮像回数で、精度よく対象物Ｓの位相を計測することができる。

（４）本実施形態の定量位相画像生成方法または定量位相画像生成装置において、検出部９の検出面における点像強度分布のエアリーディスクの大きさおよび画素サイズＰに基づいて、対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数が設定される。これにより、当該点像強度分布のエアリーディスクの大きさと画素サイズＰとの関係に基づいて、少ない撮像回数で、精度よく対象物Ｓの位相を計測することができる。

（５）本実施形態の定量位相画像生成方法または定量位相画像生成装置において、点像強度分布のエアリーディスクの直径よりも画素サイズＰが大きい場合、対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数を３を超える値に設定する。これにより、当該点像強度分布のエアリーディスクの大きさに対して画素サイズＰが適しているか否かに基づいて、少ない撮像回数で、精度よく対象物Ｓの位相を計測することができる。

（６）本実施形態の定量位相画像生成装置は、対象物Ｓにおける対物レンズ２１ａの焦点の、対物レンズ２１ａの光軸に沿った位置を調整する装置制御部５１と、対象物Ｓからの光を検出する検出部９と、解析部（画像生成部）５２と、を備え、対物レンズ２１ａの光軸に沿って互いに焦点間隔Δｚ離れた複数の位置のそれぞれに対物レンズ２１ａの焦点を配置した対象物Ｓからの光を、検出部９が検出し、検出した光に基づいて、解析部５２が、上記複数の位置に対応する複数の光強度分布データを生成し、複数の光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成する場合に、装置制御部５１は、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、照明光の波長λ、および対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎに基づいて、焦点間隔Δｚを設定する。これにより、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、照明光の波長λ、および対物レンズ２１ａと対象物Ｓとの間の屈折率ｎに合わせ、少ない撮像回数で、精度よく対象物Ｓの位相を計測することができる。

次のような変形も本発明の範囲内であり、上述の実施形態と組み合わせることが可能である。上述の実施形態と同一の部分は、同一の符号により参照し適宜説明を省略する。
（変形例１）
上述の実施形態では、最適条件計算部５１１が予め設定した焦点間隔Δｚの値に基づいて、位相復元処理部５２１が位相分布φを算出したが、焦点位置Ｆの調節後、エンコーダーにより実際に移動した焦点間隔Δｚを測定し、測定した値に基づいて位相復元処理部５２１が位相分布φを算出してもよい。これにより、実際の焦点間隔Δｚに基づいて位相の復元を行うため、より正確に位相を復元することができる。エンコーダーは、例えば、ステージ８を電動駆動によりｚ方向に移動させるモータ等の移動装置に設置される。
なお、対物レンズ２１ａの移動により対物レンズ２１ａの焦点位置Ｆが調節される場合には、エンコーダーは、対物レンズ２１ａを電動駆動によりｚ方向に移動させるモータ等の移動装置に設置すればよい。対物レンズ２１ａとステージ８との両方が移動可能に構成されている場合、対物レンズ２１ａおよびステージ８を電動駆動によりｚ方向に移動させる複数のモータ等の移動装置のそれぞれに設置された複数のエンコーダーが測定した対物レンズ２１ａおよびステージ８の移動量に基づいて、位相復元処理部５２１が焦点間隔Δｚを算出してもよい。実際に位相計測のための撮像を行う際の焦点間隔Δｚを測定することができれば、その方法は特に限定されない。
本変形例の内容は、上述の実施形態の内容と適宜組み合わせることができる。

（変形例２）
上述の実施形態では、図１で示されたように倒立顕微鏡として定量位相画像生成装置１を構成したが、正立顕微鏡または実体顕微鏡として定量位相画像生成装置を構成してもよい。

実体顕微鏡として定量位相画像生成装置を構成した場合、結像光学系７にズーム機構が備わっており、ズーム倍率β２によって対物レンズ２１ａの開口数ＮＡも変化する構成にすることができる。以下では、開口数ＮＡが倍率βの関数であることをＮＡ（β）と記述する。結像光学系７の倍率βを、対物レンズ２１ａの倍率β１とズーム倍率β２の積の関係式β＝β１×β２としたとき、装置制御部５１は、ズーム倍率β２によって変化する開口数ＮＡ(β)に応じた点像強度分布のエアリーディスクの直径１．２２λ／ＮＡ（β）と、サンプリング間隔Δｘ＝Ｐ／βとを比較して、対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数を、３枚と設定して位相復元するかどうかを決定しても良い。これにより、ズーム倍率β２に合わせ、少ない撮像回数で、精度よく対象物Ｓの位相を計測することができる。
本変形例の内容は、上述の実施形態および上述の変形例の内容と適宜組み合わせることができる。

（変形例３）
上述の実施形態では、計測面ｉ１に対し２つの計測面ｉ２，ｉ３を共に焦点間隔Δｚ離れた位置に設定したが、複数の計測面ｉを計測面ｉ１に対し互いに異なる焦点間隔Δｚ隔てて配置してもよい。最適条件計算部５１１は、複数の計測面ｉにおける、隣接する計測面ｉとの焦点間隔Δｚを、計測面ｉ１と計測面ｉとの距離に基づいて異ならせることができる。これにより、計測面ｉの計測面ｉ１からの距離に合わせ、少ない撮像回数で、精度よく対象物Ｓの位相を計測することができる。
本変形例の内容は、上述の実施形態および上述の変形例の内容と適宜組み合わせることができる。

（変形例４）
上述の実施形態では、定量位相画像生成装置１に検出部９を１つ設けたが、複数の検出部を設けてもよい。これにより、蛍光画像と定量位相画像を同時に記録すること等ができる。

図１９は、本変形例の定量位相画像生成装置２の構成を示す概念図である。定量位相画像生成装置２は、定量位相画像生成装置１と類似した構成を有しているが、接眼レンズ３５（図１）の代わりに、結像レンズ３６ａ，３６ｂおよび検出部９０を備える点が異なっている。

対象物Ｓからの蛍光と位相計測のための光の光路の分岐となるビームスプリッター３２として、透過：反射=５０:５０〜透過：反射=２０:８０等のハーフプリズムまたはハーフミラーを配置することができる。光源１１としてハロゲン光源を利用した場合、位相の復元に必要な光強度分布データの取得のための光については、透過光のハロゲン光源出力に余裕がある為、蛍光観察用の光と比較して暗く分配しても問題なく、これにより効率よく対象物Ｓからの光を検出部９，９０の検出面に結像させることができる。

本変形例では、落射蛍光光学系１１０の励起光を標本に照らすために、検出部９および９０の検出面に結像する光のそれぞれに共通な光路にダイクロイック・フィルター１２２を配置するため、位相計測用の照明光Ｌ２の波長は、蛍光観察用の光の波長帯域よりも、長波長側に設定することになる。検出部９に蛍光、検出部９０に透過照明光が結像するように、それぞれの検出部９，９０の直前に波長選択用の不図示のバリアフィルターを配置してもよい。
なお、検出部９のみだけを使用して、蛍光フィルターキューブ１２０を挿脱することにより蛍光観察と位相計測とを順次行ってもよい。
本変形例の内容は、上述の実施形態および上述の変形例の内容と適宜組み合わせることができる。

（変形例５）
上述の実施形態では、計測面ｉ１，ｉ２，ｉ３に対物レンズ２１ａの焦点を順次配置して複数の光強度分布データを順次撮像により取得したが、一度の撮像、すなわちシングルショットで同時に複数の焦点位置Ｆに対応する光強度分布データを取得してもよい。

図２０は本変形例の定量位相画像生成装置３の構成を示す概念図である。定量位相画像生成装置３は、定量位相画像生成装置１と類似した構成を有しているが、ビームスルリッター３２の検出部Ｓ側の光路に、光路分岐部９２および結像レンズ９１が配置されており、光路分岐部９２で分岐した３つの光路に対応して、３つに分割された検出面を備える検出部９３を備える点が異なっている。

光路分岐部９２は、三連プリズム等の、対象物Ｓからの光路を互いに異なる光路長を備える複数の光路に分岐させる光学素子を備え、光路分岐部９２で分岐した３つの光路では、それぞれ対物レンズ２１ａを介して、対物レンズ２１ａの光軸に沿って対象物Ｓ中の異なる位置を焦点位置Ｆとしているため、これらの焦点位置Ｆの間隔を焦点間隔Δｚに対応させることができる。光路分岐部９２で分岐した複数の光路によってそれぞれ実現される対物レンズ２１ａの焦点位置Ｆの数が、上述の実施形態における「対物レンズ２１ａの焦点を配置する位置の数」に対応する。光路分岐部９２を三連プリズムとした際、三連プリズムでの対象物Ｓからの光の透過成分と反射成分の割合については、第一反射面を透過：反射＝６７：３３、第二反射面を透過：反射＝５０：５０、第三反射面を透過：反射＝０：１００に設計した場合、同時に取得する３つの光強度分布データの平均的な光強度（光強度画像における明るさ）を等しくできるが、光路分岐部９２での対象物Ｓからの光の透過成分と反射成分の割合については適宜設定することができる。
また、光路分岐部９２には、ＭＦＧ：Ｍｕｌｔｉ−Ｆｏｃｕｓ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅ Ｇｒａｔｉｎｇなどの回折光学素子を用いても良い。回折光学素子を用いる事で、対象物Ｓの３面以上の異なる合焦面の像を、検出部９３で同時に検出する事が可能となる。この場合、結像レンズ９１を用いて対物瞳面をリレーして、対物瞳と共役位置に回折光学素子を配置する。そして回折光学素子の後に別途結像レンズを用意して、検出部９３に結像させればよい。

本変形例の定量位相画像生成方法は、対象物Ｓにおける対物レンズ２１ａの光軸に沿って互いに焦点間隔Δｚ離れた複数の位置のそれぞれに対物レンズ２１ａの焦点を同時に配置し、対象物Ｓからの光を検出することと、検出した光に基づいて、複数の位置の光強度分布データを生成することと、複数の光強度分布データに基づいて、対象物Ｓを含む位相分布データを生成することと、位相分布データに基づいて定量位相画像を生成することとを備える。これにより、各ｚ位置に対物レンズ２１ａの焦点位置を合わせて順次撮像している間に、対象物Ｓの形態（つまり、位相分布）が変化する場合であっても、一度の撮像で精度よく対象物Ｓの位相を計測することができる。

本変形例の定量位相画像生成装置は、対物レンズ２１ａの光軸に沿って互いに焦点間隔Δｚ離れた複数の位置のそれぞれに対物レンズ２１ａの焦点を同時に配置した対象物Ｓからの光を、検出部９３が対物レンズ２１ａを通して検出し、検出した光に基づいて、制御部５０が、上記複数の位置に対応する複数の光強度分布データを生成する。これにより、各ｚ位置に対物レンズ２１ａの焦点位置を合わせて順次撮像している間に、対象物Ｓの形態（つまり、位相分布）が変化する場合であっても、一度の撮像で精度よく対象物Ｓの位相を計測することができる。
本変形例の内容は、上述の実施形態および上述の変形例の内容と適宜組み合わせることができる。

（変形例６）
上述の実施形態では対象物Ｓの各計測面ｉをそれぞれ一度の撮像をすることにより光強度分布データを取得したが、レーザ走査型蛍光観察ユニットを用い、走査型顕微鏡として定量位相画像生成装置を構成してもよい。
本変形例の内容は、上述の実施形態および上述の変形例の内容と適宜組み合わせることができる。

図２１は、本変形例の定量位相画像生成装置４の構成を示す概念図である。図２１ではリレー光学系３０の記載を省略し、レーザ走査型蛍光観察ユニット３００を用いて対象物Ｓの光強度分布データを撮像により取得する際の光路を二点鎖線Ｌ２により模式的に示した。定量位相画像生成装置４は、光路中と光路外の位置Ｐ３に移動可能なミラー２０１と、結像レンズ２０２と、検出部９４と、レーザ走査型蛍光観察ユニット３００と、を備える。検出部９４は、光電子増倍管等の光検出器を含んで構成される。レーザ走査型蛍光観察ユニット３００は、対象物Ｓからの蛍光を検出する蛍光観察用検出器３０１と、ピンホール３０２と、結像レンズ３０３と、ダイクロイックミラー３０４と、コリメータレンズ３０５と、レーザ光源３０６と、ＸＹスキャナ３０７と、レンズ３０８とを備える。

装置制御部５１は、レーザ走査型蛍光観察ユニット３００のレーザ光源３０６からレーザ光を出射させる。レーザ光源３０６から出射したレーザ光はコリメータレンズ３０５により波面が光軸に略垂直な光等に調整されて出射される。コリメータレンズ３０５から出射したレーザ光はダイクロイックミラー３０４で反射されて光軸Ｌ２０に沿って進み、ＸＹスキャナ３０７に入射する。ＸＹスキャナ３０７で進行方向を調整された光はレンズ３０８で屈折されてビームスプリッター３２に入射する。装置制御部５１は、レーザ走査型蛍光観察ユニット３００からの照明光をビームスプリッター３２、結像レンズ３１、フィルターキューブ１２０および対物レンズ２１ａを介して対象物Ｓに照射する。光強度分布データの取得には、当該照明光の集光位置を対象物Ｓの計測面ｉにおいてＸＹスキャナ３０７により二次元的に走査させて各位置からの光を検出する。対象物Ｓからの蛍光は、対物レンズ２１ａ、フィルターキューブ１２０、結像レンズ３１、ビームスプリッター３２、レンズ３０８およびＸＹスキャナ３０７を介してダイクロイックミラー３０４に入射する。ダイクロイックミラー３０４に入射した蛍光は、ダイクロイックミラー３０４を透過して光軸Ｌ３０に沿って進み結像レンズ３０３で屈折されてピンホール３０２を通過した後、蛍光観察用検出器３０１により検出される。
なお、ステージ８を移動させること等により、対象物Ｓを光軸Ｌ１と垂直な方向（ｘｙ方向）等に移動させて対象物Ｓの各位置からの光を検出してもよい。

図２２（Ａ）は、従来の透過照明の明視野観察による位相復元方法における光学系の模式図である。従来の光学系では、光源から、コンデンサレンズ４１７、物体面、対物レンズ４２１、結像レンズ４１２および像面の順で並んでいた。図２２（Ｂ）は、本変形例の定量位相画像生成装置４における、走査型顕微鏡の検出部９４の検出面を含む光学系の模式図である。本変形例の光学系では、光源から対物レンズ２１ａ、物体面、コンデンサレンズ１７、結像レンズ２０２、検出部９４の検出面の順で並んでおり、このような場合でも、従来の光学系と等価な構成を実現でき、計測面ｉにおける光強度分布Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３を計測できる。

従来、検出部９４に対応する走査型顕微鏡の検出部により、微分干渉画像を計測していた。しかし、プラスチック培養容器等の標本を撮像すると、当該容器等により偏光が変化してしまうため、微分干渉画像の撮像による取得が難しかった。本変形例の定量位相画像生成装置４により、従来９６ウェルプレート等のメニスカスによる液面の変化が大きい容器で、良好なコントラストが得られていなかった微分干渉画像も、生成した定量位相画像を介して微分干渉画像に変換させる事で、精度の高い微分干渉画像を構築することができる。
本変形例の内容は、上述の実施形態および上述の変形例の内容と適宜組み合わせることができる。

（変形例７）
対象物Ｓが緩衝液中等に載置された細胞等であった場合、複数の計測面ｉを計測する間に、緩衝液中を浮遊する死んだ細胞（浮遊死細胞）が、光強度分布に影響を与え、光強度分布データにおけるノイズとなって位相復元精度を低下させる問題があった。特に、浮遊死細胞が、計測した一部の計測面ｉまたはその近傍に存在して位相復元精度を低下させる場合があった。このような位相復元精度の低下を回避するため、位相復元処理部５２１は、上述のＳＧ法を用いて位相復元することができる。

位相復元処理部５２１は、ＳＧ法により、ｚの関数として計測面ｉ上の各位置の光強度を多項式近似する。これにより、一部の計測面ｉに対応する光強度分布データで極端な値が存在しても復元される位相値に大きな影響が出ることを防ぐことができる。

ＳＧ法による計算量の増加を防ぐため、位相復元処理部５２１は、まずＳＧ法を適用せずに位相復元を行い、位相復元誤差が所定の閾値を超える画素が有るか否かを判定し、位相復元誤差が所定の閾値を超える画素があった場合にＳＧ法を適用して位相復元処理を行うことが好ましい。
本変形例の内容は、上述の実施形態および上述の変形例の内容と適宜組み合わせることができる。

（変形例８）
従来の位相復元方法によると、定量位相画像の最も外側の画素近傍の画像辺縁部で、位相復元精度が低下し、実際には位相物体が存在しないにも関わらず、位相値が高く算出されてしまう問題があった。この問題は、画像辺縁部に位相値が大きい(例えば厚い細胞)対象物Ｓが存在すると、発生しやすい。画像辺縁部またはその近傍に位相物体が存在すると、強度輸送方程式のコントラスト伝達関数に従うフィルター処理により、位相を復元する際、存在しない空間周波数成分に由来する位相成分が生じるため、本来は存在しない輪郭が発生するからである。特に、従来技術では、観察視野の区画に沿って画像辺縁部で位相復元精度が低下するため、当該区画で区切られた定量位相画像をつなぎ合わせたステッチング画像の生成場面では、画像同士を重ね合わせる領域で位相が不自然に変化することなくつなぎ合わせる事が出来なかった。本変形例は、位相復元処理部５２１が、光強度分布データに前処理を行うことで画像辺縁部の位相復元精度の低下を抑制するものである。

位相復元処理部５２１は、位相復元する光強度分布データに対応する光強度画像をバックグラウンドと略同じレベルの光強度が分布する画像で囲んだ画像（前処理画像と呼ぶ）に対応するデータ（前処理画像データ）を生成し、前処理画像データに位相復元処理を行う。これにより、前処理画像中の位相復元する光強度画像に対応する部分は、画像の輪郭から離れた位置となるため、当該部分の位相復元精度の低下を抑制させることができる。位相復元処理部５２１は、前処理画像データの位相復元処理が終わった後、位相復元処理した画像データを元の光強度画像のサイズに戻す。

例えば、強度輸送方程式を、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を用いて処理する場合、データ数が２のべき乗画像（１０２４×１０２４ピクセル、２０４８×２０４８ピクセル、４０９６×４０９６ピクセル等）に対して好適に計算処理できるため、仮に検出部９の縦横の画素数が１６００×１２００ピクセルの場合、位相復元処理部５２１は、２０４８×２０４８ピクセルの大きさのバックグラウンドと略同じレベルの強度が分布した光強度分布データを生成して、光強度分布Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３に対応する光強度分布データを埋め込む前処理をすることができる。
なお、位相復元処理部５２１は、光強度が飽和している画素または光強度が閾値よりも大きい画素に対応する位置が、光強度画像の画像辺縁部に含まれるか否かに基づいて、本変形例の前処理を省略するかどうかを判定してもよい。これにより、画像辺縁部で大きい位相復元誤差が発生するリスクがない、光強度画像に対応する光強度分布データの前処理を省略することにより、計算量を減少させて、スループットを向上させる事ができる。
本変形例の内容は、上述の実施形態および上述の変形例の内容と適宜組み合わせることができる。

（変形例９）
対象物Ｓが緩衝液中に配置された細胞等の場合、緩衝液の液面が表面張力で湾曲しメニスカス形状となり、メニスカス形状の液面の勾配がバックグラウンドの位相値となり、位相復元誤差を増加させてしまう点が従来の定量位相画像の計測では問題となっていた。本変形例では、位相復元処理部５２１が画像処理を行うことにより、液面のメニスカス形状による位相計測への影響を少なくする。

図２３は、液面のメニスカス形状の位相計測への影響を模式的に示す図である。対象物Ｓを配置する容器にメニスカス形状８１があると、定量位相画像においては、対象物Ｓのバックグラウンドの位相値となって影響する。このバックグラウンドの位相値を位相オフセットと呼ぶ。

位相復元処理部５２１は、モーフォロジー画像処理により、対象物Ｓを除くバックグラウンドの位相値を抽出し、定量位相画像から差し引くことで、位相オフセットによる影響を減らす。この方法は、メニスカス形状だけでなく、プラスチック容器の局所的な厚み変化に対しても補正できる。また、位相オフセットを除去した定量位相画像は、ステッチング画像生成で画像同士を重ねる場合でも、正確につなぎ合わせる事ができる。
本変形例の内容は、上述の実施形態および上述の変形例の内容と適宜組み合わせることができる。

（変形例１０）
本実施形態の情報処理部４０の情報処理機能を実現するためのプログラムをコンピュータにより読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録された、上述した装置制御部５１が行う処理および解析部５２が行う処理等の制御部５０が行う処理等に関するプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行させてもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）や周辺機器のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、光ディスク、メモリカード等の可搬型記録媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持するものを含んでもよい。また上記のプログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよく、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせにより実現するものであってもよい。

また、パーソナルコンピュータ（以下、ＰＣと呼ぶ）等に適用する場合、上述した制御に関するプログラムは、ＣＤ−ＲＯＭやＤＶＤ−ＲＯＭなどの記録媒体やインターネット等のデータ信号を通じて提供することができる。図２４はその様子を示す図である。ＰＣ９５０は、記録媒体９５３を介してプログラムの提供を受ける。また、ＰＣ９５０は通信回線９５１との接続機能を有する。コンピュータ９５２は上記プログラムを提供するサーバーコンピュータであり、ハードディスク等の記録媒体にプログラムを格納する。通信回線９５１は、インターネット、ＰＣ通信などの通信回線、あるいは専用通信回線などである。コンピュータ９５２はハードディスクを使用してプログラムを読み出し、通信回線９５１を介してプログラムをＰＣ９５０に送信する。すなわち、プログラムをデータ信号として搬送波により搬送して、通信回線９５１を介して送信する。このように、プログラムは、記録媒体や搬送波などの種々の形態のコンピュータ読み込み可能なコンピュータプログラム製品として供給できる。

本変形例のプログラムは、対象物Ｓに照明光を照射する透過照明光学系１０と、対物レンズ２１と、対象物Ｓにおける対物レンズ２１ａの焦点を対物レンズ２１ａの光軸に沿って調節する装置制御部５１と、対象物Ｓからの光を検出する検出器と、解析（画像生成部）部５２と、を備える定量位相画像生成装置１が、対物レンズ２１ａの光軸に沿って互いに焦点間隔Δｚ離れた複数の位置のそれぞれに対物レンズ２１ａの焦点を配置した対象物Ｓからの光を、検出部９が検出し、検出した光に基づいて解析部５２が複数の光強度分布データを生成し、複数の光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成する場合に、定量位相画像生成装置１に入力または記憶された顕微鏡本体部１００の設定情報である、対物レンズ２１ａの開口数ＮＡ、照明光の波長λ、および対物レンズ２１ａと対象物Ｓの間の屈折率ｎに基づいて、焦点間隔Δｚを設定する設定処理を定量位相画像生成装置１の処理装置に行わせる。これにより、少ない撮像回数で、精度よく対象物Ｓの位相を計測することができる。
本変形例の内容は、上述の実施形態および上述の変形例の内容と適宜組み合わせることができる。

本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。

（実施例）
図１に示された定量位相画像生成装置１と同様の構成の顕微鏡により、異なる対物レンズ（乾式）を用いてＨｅｌａ細胞の位相分布を計測した。計測条件は以下の通りである。「撮像回数」は、光強度分布データを取得するための撮像の回数を示し、異なる３カ所の焦点位置でそれぞれ１回ずつ撮像した。
照明光の波長λ ５５０ｎｍ（５００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲に分布）
撮像素子の画素サイズＰ ６．４５μｍ

対物レンズ番号 倍率 開口数ＮＡ 焦点間隔 撮像回数
１ １０ ０．４５ Δｚ＝５．１μｍ ３
２ ２０ ０．７５ Δｚ＝１．６μｍ ３
３ ４０ ０．６ Δｚ＝２．８μｍ ３

図２５は、対物レンズ１〜３のそれぞれを用いてＨｅｌａ細胞を撮像して取得した光強度分布データから得た、Ｈｅｌａ細胞の同一の縦断面（ＸＺ断面）の位相分布を示すグラフである。対物レンズを切り替えても位相のプロファイルが略同一となっている。

１，２，３，４…定量位相画像生成装置、７…結像光学系、８…ステージ、９，９０，９３，９４…検出部、１０…透過照明光学系、２０…対物光学系、２１，２１ａ，２１ｂ，２１ｃ…対物レンズ、３０…リレー光学系、４０…情報処理部、５０…制御部、５１…装置制御部、５２…解析部、９２…光路分岐部、１００…顕微鏡本体部、５１１…最適条件計算部、５２１…位相復元処理部、５２２…画像構築部、５２３…画像解析部、ｉ，ｉ１，ｉ２，ｉ３…計測面、Ｆ…焦点位置、ＰＳＦ…点像強度分布、Ｓ…対象物、Δｘ，Δｙ…サンプリング間隔、Δｚ…焦点間隔。

Claims (22)

1. 顕微鏡による定量位相画像生成方法であって、
   対象物に照明光を照射することと、
   対物レンズの光軸に沿って互いに間隔Δｚ離れた複数の位置のそれぞれに前記対物レンズの焦点を配置して前記対象物からの光を検出することと、
   検出した前記光に基づいて、前記複数の位置のそれぞれに対応する光強度分布データを生成することと、
   前記光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成することと、を含み、
   前記間隔Δｚは、前記顕微鏡の設定情報に基づいて設定される、定量位相画像生成方法。
2. 請求項１に記載の定量位相画像生成方法において、
   前記設定情報は、前記対物レンズの開口数ＮＡと、前記照明光の波長λと、前記対物レンズと前記対象物との間の屈折率ｎとの少なくとも１つの情報を含む、定量位相画像生成方法。
3. 請求項１又は２に記載の定量位相画像生成方法において、
   前記間隔Δｚは、生成する前記定量位相画像において位相を復元する空間周波数を示すパラメータｋを用いて設定される、定量位相画像生成方法。
4. 請求項３に記載の定量位相画像生成方法において、
   前記間隔Δｚは、前記パラメータｋを用いて以下の式（１００）により設定され、
   
   
   

   

   
   …（１００）
   前記パラメータｋの値は１以上２５以下である、定量位相画像生成方法。
5. 請求項４に記載の定量位相画像生成方法において、
   前記パラメータｋは、１以上１６以下である、定量位相画像生成方法。
6. 請求項１から５までのいずれか一項に記載の定量位相画像生成方法において、
   前記対物レンズの焦点を配置する前記複数の位置の数は、前記対物レンズの開口数ＮＡ、前記対物レンズを含む結像光学系による横倍率β、および前記対象物からの前記光を検出する検出器の画素サイズＰに基づいて設定する、定量位相画像生成方法。
7. 請求項６に記載の定量位相画像生成方法において、
   前記検出器の検出面における点像強度分布のエアリーディスクの大きさおよび前記画素サイズＰに基づいて、前記対物レンズの焦点を配置する前記複数の位置の数を設定する、定量位相画像生成方法。
8. 請求項７に記載の定量位相画像生成方法において、
   前記点像強度分布のエアリーディスクの直径よりも前記画素サイズＰが大きい場合、前記対物レンズの焦点を配置する前記複数の位置の数を３を超える値に設定する、定量位相画像生成方法。
9. 対象物に照明光を照射することと、
   対物レンズの光軸に沿って互いに間隔Δｚ離れた複数の位置のそれぞれに前記対物レンズの焦点を配置して前記対象物からの光を検出することと、
   検出した前記光に基づいて、前記複数の位置のそれぞれに対応する光強度分布データを生成することと、
   前記光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成することと、を備え、
   前記間隔Δｚは、０．０７μｍ以上９０．３μｍ以下に設定される定量位相画像生成方法。
10. 顕微鏡を備える定量位相画像生成装置であって、
    前記顕微鏡は、
    対象物に照明光を照射する照明光学系と、
    対物レンズと、
    前記対物レンズの光軸に沿って互いに間隔Δｚ離れた複数の位置に前記対物レンズの焦点が配置されるように前記焦点の位置を調整する装置制御部と、
    前記照明光学系からの照明光の照射により、前記対象物からの光を検出する検出器と、
    検出した前記光に基づいて、前記複数の位置に対応する光強度分布データを生成し、前記光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成する画像生成部と、を備え、
    前記装置制御部は、前記顕微鏡の設定情報に基づいて、前記間隔Δｚを設定する、定量位相画像生成装置。
11. 請求項１０に記載の定量位相画像生成装置において、
    前記設定情報は、前記対物レンズの開口数ＮＡと、前記照明光の波長λと、前記対物レンズと前記対象物との間の屈折率ｎとの少なくとも１つの情報を含む、定量位相画像生成装置。
12. 請求項１０又は１１に記載の定量位相画像生成装置において、
    前記装置制御部は、前記間隔Δｚを、生成する前記定量位相画像において位相を復元する空間周波数を示すパラメータｋを用いて設定する、定量位相画像生成装置。
13. 請求項１２に記載の定量位相画像生成装置において、
    前記装置制御部は、前記間隔Δｚを、前記パラメータｋを用いて以下の式（１００）により設定し、
    

    

    
    …（１００）
    前記パラメータｋの値は１以上２５以下である、定量位相画像生成装置。
14. 請求項１３に記載の定量位相画像生成装置において、
    前記パラメータｋは、１以上１６以下である、定量位相画像生成装置。
15. 請求項１０から１４までのいずれか一項に記載の定量位相画像生成装置において、
    前記装置制御部は、前記対物レンズの焦点を配置する前記複数の位置の数を、前記対物レンズの開口数ＮＡ、前記対物レンズを含む結像光学系による横倍率β、および前記検出器の画素サイズＰを少なくとも用いて設定する、定量位相画像生成装置。
16. 請求項１５に記載の定量位相画像生成装置において、
    前記装置制御部は、前記検出器の検出面における点像強度分布のエアリーディスクの大きさおよび前記画素サイズＰの大きさに基づいて、前記対物レンズの焦点を配置する前記複数の位置の数を設定する、定量位相画像生成装置。
17. 請求項１６に記載の定量位相画像生成装置において、
    前記装置制御部は、前記点像強度分布のエアリーディスクの直径よりも前記画素サイズＰが大きい場合、前記対物レンズの焦点を配置する前記複数の位置の数を３を超える値に設定する、定量位相画像生成装置。
18. 請求項１０から１７までのいずれか一項に記載の定量位相画像生成装置において、
    前記対象物が載置されるステージを備え、
    前記ステージを前記対物レンズの前記光軸に沿って移動させる移動装置をさらに有し、
    前記移動装置は、前記装置制御部が設定した前記間隔Δｚに基づいて、前記ステージを移動させる、定量位相画像生成装置。
19. 対象物に照明光を照射する照明光学系と、
    対物レンズと、
    前記対象物における前記対物レンズの焦点の、前記対物レンズの光軸に沿って互いに間隔Δｚ離れた複数の位置に前記対物レンズの焦点が配置されるように前記焦点の位置を調整する装置制御部と、
    前記照明光学系からの照明光の照射により、前記対象物からの光を検出する検出器と、
    検出した前記光に基づいて、前記複数の位置に対応する光強度分布データを生成し、前記光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成する画像生成部と、を備え、
    前記装置制御部は、前記間隔Δｚを、０．０７μｍ以上９０．３μｍ以下に設定する定量位相画像生成装置。
20. 対象物に照明光を照射する照明光学系と、
    対物レンズと、
    前記対象物における前記対物レンズの焦点の、前記対物レンズの光軸に沿って互いに間隔Δｚ離れた複数の位置に前記対物レンズの焦点が配置されるように前記焦点の位置を調整する装置制御部と、
    前記照明光学系からの照明光の照射により、前記対象物からの光を検出する検出器と、
    検出した前記光に基づいて、前記複数の位置に対応する光強度分布データを生成し、前記光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成する画像生成部と、を備える顕微鏡を備える定量位相画像生成装置に入力または記憶された前記顕微鏡の設定情報に基づいて、前記間隔Δｚを設定する設定処理を前記定量位相画像生成装置の処理装置に行わせるプログラム。
21. 請求項２０に記載のプログラムにおいて、
    前記設定情報は、前記対物レンズの開口数ＮＡと、前記照明光の波長λと、前記対物レンズと前記対象物との間の屈折率ｎとの少なくとも１つの情報を含む、プログラム。
22. 対象物に照明光を照射する照明光学系と、
    対物レンズと、
    前記対象物における前記対物レンズの焦点の、前記対物レンズの光軸に沿って互いに間隔Δｚ離れた複数の位置に前記対物レンズの焦点が配置されるように前記焦点の位置を調整する装置制御部と、
    前記照明光学系からの照明光の照射により、前記対象物からの光を検出する検出器と、
    検出した前記光に基づいて、前記複数の位置に対応する光強度分布データを生成し、前記光強度分布データに基づいて、定量位相画像を生成する画像生成部と、を備える定量位相画像生成装置の処理装置に、
    前記間隔Δｚを０．０７μｍ以上９０．３μｍ以下に設定する設定処理を行わせるプログラム。

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