JP6925774B2

JP6925774B2 - 顕微鏡

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Publication number: JP6925774B2
Application number: JP2015196833A
Authority: JP
Inventors: 範夫三宅
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2015-10-02
Filing date: 2015-10-02
Publication date: 2021-08-25
Anticipated expiration: 2035-10-02
Also published as: JP2017068203A

Description

本発明は、顕微鏡に関する。

卵細胞質内精子注入法（ICSI；intracytoplasmic sperm injection）に適した顕微鏡が提案されている（例えば、下記の特許文献１参照）。例えば、特許文献１の顕微鏡は、コンデンサレンズの前側焦点面あるいはその近傍に配置される第１の部分開口を有する開口部材と、対物レンズの後側焦点面あるいはその共役面またはそれらの近傍であって、開口部材と共役な面に配置される変調器とを備える。

米国特許出願公開第２０１０/０２８４０６７号明細書

卵細胞質内精子注入法（ICSI；intracytoplasmic sperm injection）などの人工受精（IVF: In Vitro Fertilization）に適した、簡易な構成の顕微鏡が求められている。

本発明の一態様に係る顕微鏡は、第１開口部を有する第１絞り部材を備えてよい。顕微鏡は、第１開口部を通った光を試料に照射するコンデンサレンズを備えてよい。顕微鏡は、対物レンズを備えてよい。顕微鏡は、対物レンズを通った光の一部が通る第２開口部を有する第２絞り部材を備えてよい。第１開口部は、コンデンサレンズの光軸を含まないように配置され、第１開口部を通った光が試料に偏斜照明されるように設けられてよい。顕微鏡は、第１開口部の開口数をＮＡ１とし、第２開口部の開口数をＮＡ２としたときに、０．６≦ＮＡ２／ＮＡ１≦１．０を満たしてよい。

第１実施形態に係る顕微鏡を示す図である。第１実施形態に係る第１絞り部材から像面までの光路を示す図である。卵細胞の説明図である。数値シミュレーションの条件およびコントラストの説明図である。位相物体に関するＮＲとコントラストとの関係を示す図である。振幅物体に関するＮＲと解像力との関係を示す図である。第２実施形態に係る第１絞り部材から像面までの光路を示す図である。第３実施形態に係る顕微鏡を示す図である。第３実施形態に係る第１絞り部材から像面までの光路を示す図である。第１偏光部材から第２偏光部材までの光路における偏光状態を示す説明図である。変形例に係る第１偏光部材から第２偏光部材までの光路における偏光状態を示す説明図である。第４実施形態に係る顕微鏡を示す図である。

［第１実施形態］
第１実施形態について説明する。図１は、第１実施形態に係る顕微鏡１を示す図であり、図２は第１絞り部材２から像面（２次像面３２、２次像面４２）までの光路を示す図である。顕微鏡１は、光源装置３、照明光学系４、第１観察光学系５、撮像部６、及び第２観察光学系７を備える。

顕微鏡１は、例えば、卵細胞質内精子注入法（ICSI；intracytoplasmic sperm injection）などに用いられる倒立顕微鏡である。顕微鏡１を用いた観察の対象となる試料Ｓは、例えば、人または人以外の動物（例、マウス）の卵細胞などを含み、数μｍのスケールの構造を区別できるレベルの解像度が要求される。顕微鏡１は、観察の対象となる試料Ｓの像のコントラストを、偏斜照明により高めることができる。ここでは、顕微鏡１が透過型であるものとするが、後に図１１などで説明するように反射型でもよい。また、顕微鏡１は、正立顕微鏡でもよいし、落射照明および透過照明を切り替え可能な顕微鏡でもよい。

光源装置３は、光（照明光）を発する光源を含む。この光源は、ＬＥＤ（発光ダイオード）あるいはＬＤ（レーザダイオード）などの固体光源でもよいし、ランプ光源などでもよい。顕微鏡１は、光源装置３を備えなくてもよく、例えば、光源装置３は、顕微鏡１に交換可能に設けられ、観察を行う際に顕微鏡１に取り付けられてもよい。照明光学系４は、光源装置３の光出射側に、レンズ９、ミラー１０、レンズ１１、第１絞り部材２、及びコンデンサレンズ１２を備える。光源装置３から出射した照明光は、レンズ９を透過してミラー１０で反射した後、レンズ１１を透過する。

第１絞り部材２は、例えば、コンデンサレンズ１２へ向かう光の光路に挿脱可能である。第１絞り部材２は、偏斜照明を用いる観察を行う際に、コンデンサレンズ１２へ向かう光の光路に挿入される（図１に実線で示す）。第１絞り部材２は、偏斜照明を用いない観察（例、明視野観察）を行う際に、コンデンサレンズ１２へ向かう光の光路から退避される（図１に２点鎖線で示す）。

第１絞り部材２は、コンデンサレンズ１２へ向かう光の光路から退避不能でもよく、例えば、顕微鏡１は、偏斜照明を用いる観察専用の（明視野観察に利用しない）顕微鏡でもよい。第１絞り部材２は、照明光学系４の開口数（ＮＡ）を規定する。第１絞り部材２は、例えば、コンデンサレンズ１２から出射する光に含まれる光線の角度の上限を規定する。第１絞り部材２は、例えば、レンズ１１とコンデンサレンズ１２との間の光路に、配置される。

図２に示すように、第１絞り部材２は、光（照明光）が通過可能な第１開口部１４を有する偏斜絞りである。第１開口部１４は、第１開口部１４を通った光が試料Ｓに偏斜照明されるように設けられる。例えば、第１開口部１４は、コンデンサレンズ１２の光軸ＡＸ（照明光学系４の光軸）を含む面１５を挟む一対の領域ＲＥ１、ＲＥ２のうち一方の領域ＲＥ１のみに、コンデンサレンズ１２の光軸ＡＸから離れた位置に配置される。第１開口部１４の形状は、例えば扇形状である。第１開口部１４の内周は、例えば、光軸ＡＸを中心とする円の一部に相当する円弧状の部分１６と、部分１６の両端からそれぞれ光軸ＡＸに向かって延びる直線状の部分１７と、部分１７の端を結ぶ直線状の部分１８とを含む。

第１絞り部材２は、例えば、第１開口部１４を除く部分において、光源装置３からの光を遮光する。第１絞り部材２は、例えば、コンデンサレンズ１２の光軸ＡＸの周りに回転可能である。例えば、第１絞り部材２は、光軸ＡＸと同軸の回転軸の周りで回転可能である。第１絞り部材２を回転させることで、試料Ｓに対する第１開口部１４の位置を変更することができる。コンデンサレンズ１２は、第１絞り部材２が光路に配置された状態で、第１開口部１４を通った光が入射する位置に配置される。コンデンサレンズ１２は、第１開口部１４を通った光を試料Ｓに照射する。

図１に示すように、コンデンサレンズ１２は、第１絞り部材２が光路から退避された状態（図１に２点鎖線で示す）で、レンズ１１から出射した光が入射する位置に配置され、レンズ１１から出射した光を試料Ｓに照射する。試料Ｓは、例えば、コンデンサレンズ１２の後側焦点を含む面（後側焦点面）に配置される。なお、照明光学系４は、図１の構成に限定されず、適宜変更可能である。例えば、図１において、照明光学系４は、光路をミラー１０で折り曲げる光学系であるが、ミラー１０を含まず光軸ＡＸが直線的な光学系でもよい。また、第１絞り部材２よりも光源装置３に近い側に配置される部材の少なくとも一部は、照明光学系４に含まれなくてもよく、例えば光源装置３に含まれてもよい。

第１観察光学系５は、試料Ｓからの光（観察光）を撮像部６に導く。第１観察光学系５は、対物レンズ２０、レンズ２１、ミラー２２、レンズ２３、ミラー２４、レンズ２５、第２絞り部材２６、ビームスプリッタ２７、及びレンズ２８を備える。対物レンズ２０は、試料Ｓの観察側に配置される。対物レンズ２０は、例えば、その前側焦点を含む面（前側焦点面）がコンデンサレンズ１２の後側焦点面と一致するように、配置される。

なお、第１絞り部材２は、例えば、対物レンズ２０の瞳面（後側焦点面）３０と光学的に共役な瞳共役面の位置またはその近傍に配置される。対物レンズ２０を通った光（観察光）は、レンズ２１を通ってミラー２２で反射した後、レンズ２３に入射する。レンズ２１とレンズ２３との間の光路には、対物レンズ２０の前側焦点面（物体面）と光学的に共役な１次像面３１が形成される。１次像面３１には、試料Ｓの１次像（例、中間像）が形成される。レンズ２３を通った光は、ミラー２４で反射してレンズ２５を通り、第２絞り部材２６に入射する。

第２絞り部材２６は、例えば開口絞りであり、第１観察光学系５の開口数（ＮＡ）および第２観察光学系７の開口数（ＮＡ）を規定する。第２絞り部材２６は、例えば、第１絞り部材２と光学的に共役な位置に配置される。第２絞り部材２６は、例えば、対物レンズ２０の瞳面３０と光学的に共役な瞳共役面の位置、又は瞳面３０の焦点深度の範囲以内で瞳共役面の近傍の位置に配置される。第２絞り部材２６は、例えば、レンズ２５とビームスプリッタ２７との間の光路に、配置される。

第２絞り部材２６は、例えば、対物レンズ２０からの光（観察光）の光路に挿脱可能である（図１に２点鎖線で示す）。なお、偏斜照明を用いない観察（例、明視野観察）を行う際に、第２絞り部材２６は、観察光の光路に挿入されてもよいし、観察光の光路から退避されてもよい。また、第２絞り部材２６は、対物レンズ２０からの光の光路から退避不能でもよい。

図２に示すように、第２絞り部材２６は、対物レンズ２０を通った光の一部が通過可能な第２開口部３４を有する。第２絞り部材２６は、例えば、対物レンズ２０の光軸ＡＸ（第１観察光学系５の光軸、第２観察光学系７の光軸）に関して点対称（回転対称）な形状である。例えば、第２絞り部材２６は、対物レンズ２０の光軸ＡＸを中心とする円環状である。第２絞り部材２６は、第１絞り部材２の第１開口部１４と光学的に共役な領域ＲＥ３の少なくとも一部において、対物レンズ２０を通った光を遮光するように設けられる。例えば、第２開口部３４の半径ｒ１は、領域ＲＥ３において、第１開口部１４の部分１６に対応する円弧状の部分３５の半径ｒ２よりも小さい。

図１の説明に戻り、ビームスプリッタ２７は、対物レンズ２０からの光（観察光）の一部が反射し、対物レンズ２０からの光（観察光）の一部が透過する特性を有する。ビームスプリッタ２７で反射する光の光量と、ビームスプリッタ２７を透過する光の光量との比は、任意に設定され、例えば８：２でもよいし、その他の比でもよい。第２絞り部材２６を通った光（観察光）は、その一部がビームスプリッタ２７で反射してレンズ２８を通り、撮像部６に入射する。

レンズ２３、レンズ２５、及びレンズ２８は、例えばリレー光学系であり、１次像面３１と光学的に共役な２次像面３２を形成する。２次像面３２には、試料Ｓの２次像（例、最終像）が形成される。撮像部６は、例えばＣＭＯＳイメージセンサあるいはＣＣＤイメージセンサなどの２次元イメージセンサを含む。この２次元イメージセンサは、２次像面３２の位置またはその近傍に配置され、試料Ｓの２次像を撮像する。観察者（ユーザ）は、例えば、撮像部６による撮像画像により試料Ｓを観察することができる。

第２観察光学系７は、試料Ｓからの光（観察光）を、観察者の視点３７に導く。第２観察光学系７は、例えば、対物レンズ２０からビームスプリッタ２７までの要素が第１観察光学系５と共通である。第２観察光学系７は、対物レンズ２０からビームスプリッタ２７に入射した光の透過側に、レンズ３９、ミラー４０、及び接眼レンズ４１を備える。ビームスプリッタ２７を透過した光は、レンズ３９を通ってミラー４０で反射した後、接眼レンズ４１に入射する。レンズ２３、レンズ２５、及びレンズ３９は、例えばリレー光学系であり、１次像面３１と光学的に共役な２次像面４２を形成する。２次像面４２には、試料Ｓの２次像が形成される。観察者は、接眼レンズ４１を介して、試料Ｓの２次像を観察することができる。

なお、第１観察光学系５および第２観察光学系７は、図１の構成に限定されず、適宜変更可能である。例えば、顕微鏡１は、第１観察光学系５または第２観察光学系７を備えなくてもよい。例えば、顕微鏡１は、ビームスプリッタ２７、レンズ２８、及び撮像部６を備えなくてもよく、試料Ｓの像を撮像しなくてもよい。また、顕微鏡１は、レンズ３９から接眼レンズ４１までの構成を備えなくてもよく、撮像部６の撮像画像により観察を行うものでもよい。この場合、ビームスプリッタ２７の代わりにミラーを設けてもよい。また、第１観察光学系５は、光路を折り曲げずに２次像面３２を形成するものでもよい。

次に、偏斜照明についてより詳しく説明する。図２に示すように、第１絞り部材２の第１開口部１４を通った光（照明光）は、光軸ＡＸに対して偏った方向から試料Ｓに入射する。照明光は、その一部が試料Ｓの構造で散乱あるいは回折（以下、単に散乱という）して対物レンズ２０に向かい、他の一部が試料Ｓの構造で散乱されずに対物レンズ２０に向かう。

図２において、試料Ｓの構造で散乱された光を符号Ｌ１（点線）で表し、試料Ｓの構造で散乱されない光を符号Ｌ２（実線）で表す。試料Ｓの構造で散乱した光Ｌ１は、試料Ｓの像の形成に寄与する光であり、その高ＮＡ成分であるほど解像度の確保に寄与する。試料Ｓの構造で散乱しない光Ｌ２は、その少なくとも一部が対物レンズ２０に入射し、試料Ｓの背景の明るさに寄与する。

本発明者は、鋭意、研究開発を行った結果、卵細胞質内精子注入法などの人工受精に適した下記条件（下記の式（１））を見出した。
０．６≦ＮＡ２／ＮＡ１≦１．０・・・（１）
ＮＡ１：第１開口部１４の開口数
ＮＡ２：第２開口部３４の開口数

ここで、第１開口部１４の開口数ＮＡ１、及び第２開口部３４の開口数ＮＡ２の定義について説明する。図２において、符号θ１は、コンデンサレンズ１２から試料Ｓに向かう光の光軸ＡＸに対する最大の角度である。角度θ１は、第１絞り部材２の第１開口部１４により定まり、ＮＡ１は、ＮＡ１＝ｎ１×ｓｉｎθ１で表される。ｎ１は、コンデンサレンズ１２と試料Ｓとの間の媒質の屈折率である。

また、符号θ２は、試料Ｓから対物レンズ２０に向かう光のうち、第２絞り部材２６の第２開口部３４を通ることが可能な光の光軸ＡＸに対する最大の角度である。θ２に対応する光線を図２に符号Ｌ３で示す。ＮＡ２は、ＮＡ２＝ｎ２×ｓｉｎθ２で表される。ｎ２は、試料Ｓと対物レンズ２０との間の媒質の屈折率であり、例えばｎ１と同じ値である。以下の説明において、適宜、ＮＡ２／ＮＡ１をＮＲ（第１開口部１４と第２開口部３４との関係を示すパラメータ）で表す。

次に、顕微鏡１による観察例に基づいて、上記の式（１）の範囲について説明する。顕微鏡１は、例えば、位相物体および振幅物体の双方を含む試料の観察に利用される。

ここでは、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）において、実施形態に係る顕微鏡を卵細胞の観察に用いる例を説明する。図３は、卵細胞の説明図であり、符号ＰＢは第１極体であり、符号ＺＰは透明帯であり、符号ＯＶは卵子である。透明帯ＺＰは、位相物体の一例である。卵細胞ＯＶの表面の凹凸は、振幅物体の一例である。ＩＣＳＩの一般的な手順では、精子を尾部からキャピラリで吸引し、キャピラリの先端を透明帯ＺＰに刺して卵子ＯＶに精子を注入する。ＩＣＳＩを行う際に、透明帯ＺＰが明確に判別できれば、キャピラリの先端を透明帯ＺＰに迅速に刺すことでき、ＩＣＳＩの成功率が高くなる。また、ＩＣＳＩでは、卵細胞ＯＶの表面の凹凸を観察することにより、卵子の質を判断する。したがって、ＩＣＳＩにおいて、透明帯ＺＰおよび卵子ＯＶの表面の凹凸の双方が観察できることが重要である。

本発明者は、位相物体に関して、ＮＲの値を変化させた数値シミュレーションを行い、コントラストを調べた。図４は、数値シミュレーションの条件およびコントラストの説明図である。符号４４は、数値シミュレーションの対象の構造物である。構造物４４は、凸部４５および凹部４６が周期的に並ぶ形状であり、凸部４５と凹部４６との段差Ｈは、０．１μｍである。また、凸部４５の幅Ｄ１、凹部４６の幅Ｄ２は、３μｍである。透明帯ＺＰは１０μｍ程度であるので、凸部４５および凹部４６が周期的に並ぶ形状の構造物４４が識別できれば、透明帯ＺＰが識別できると考えられる。

構造物４４に対して斜めから光が入射する場合、構造物４４の像において、凸部４５の影となる段差４７に相当する部分Ｐ１の光強度が極小となり、凸部４５の影とならない段差４８に相当する部分Ｐ２の光強度が極大になる。本実施形態では、光強度の極大値をＭＡＸ、極小値をＭＩＮとして、コントラストＣを、下記の式（２）で表す。
Ｃ＝（ＭＡＸ−ＭＩＮ）／（ＭＡＸ＋ＭＩＮ）・・・（２）

図５（Ａ）、図５（Ｂ）、図５（Ｃ）は、対物レンズ２０の倍率が４０倍、ＮＡが０．５、照明光および観察光の波長が５５０nmとしたときの数値シミュレーション結果を示すグラフである。図５（Ａ）および図５（Ｂ）において、横軸は構造物４４上の位置（単位はμｍ）であり、縦軸は、構造物４４の像の各位置における光強度（単位は、任意単位（ａ．ｕ．））である。図５（Ａ）には、構造物４４の３周期分の結果を示し、図５（Ｂ）には１周期分の結果を拡大して示した。

図５（Ａ）および図５（Ｂ）において、符号Ｑ１〜Ｑ８は、それぞれ、ＮＲの値が０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１である場合の結果に対応する。図５（Ｃ）の符号Ｃは、図５（Ａ）および図５（Ｂ）に示した結果を用いて、ＮＲの各値についてコントラストを求め、ＮＲに対するコントラストのプロットを線で結んだものである。図５（Ｃ）において、横軸はＮＲの値であり、縦軸は上記の式（２）に示したコントラストである。図５（Ｃ）に示すように、コントラストは、ＮＲの値が大きくなるほど低下する。
したがって、位相物体の観察では、ＮＲの値が小さい方が好ましい。しかしながら、図６を参照して後述するように、ＮＲの値が小さいほど、振幅物体の解像力が小さくなってしまうため、振幅物体の観察では、ＮＲの値が大きい方が好ましい。上述したように、ＩＣＳＩにおいて、位相物体である透明帯ＺＰと、振幅物体である卵子ＯＶの表面の凹凸との双方が観察できることが重要であるため、本発明者は、以下の通り、最適なＮＲの値を見出した。
ここで、上述したように、図５（Ｃ）の符号Ｃは、ＮＲに対するコントラストのプロットを線で結んだものであるが、撮像素子のノイズについても考慮する必要がある。試料Ｓの像を撮像素子で撮像する場合、撮像素子において階調（例、８ビットの場合２５６階調）の１０％程度のランダムなノイズ（白色ノイズ）が発生するため、階調値に対して１０％のノイズが発生した場合のコントラストを符号Ｃ１で示した。符号Ｃ１において、ＮＲが１と１．１との間の値で、コントラストが０になるため、本発明者は、位相物体である透明帯を観察するためには、ＮＲが１．０以下であることが必要であることを見出した。また、ＮＲが０．９以下であれば、位相物体を区別することがより容易になる。

次に、振幅物体に関して説明する。図６（Ａ）は、対物レンズ２０の倍率が４０倍、ＮＡが０．５、照明光および観察光の波長が５５０ｎｍとしたときの、ＮＲの値が０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０における光学伝達関数（ＯＴＦ）を示す図である。横軸は、空間周波数であり、縦軸は、光学伝達関数（ＯＴＦ）のコントラスト値である。符号Ｑ１１〜Ｑ１６は、それぞれ、ＮＲの値０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０に対応する。光学伝達関数のコントラスト値が０．１以上であれば、対応する空間周波数の構造を識別することができるため、ここでは、光学伝達関数のコントラスト値が０．１に対応する空間周波数の値を解像力とする。

図６（Ｂ）は、ＮＲの値に対して、解像力（コントラスト値が０．１となる空間周波数）をプロットしたグラフである。本発明者は、卵子ＯＶ（図３参照）の表面の凹凸を観察するためには、解像力が１以上必要であること、つまり、ＮＲが０．６以上であればよいことを見出した。なお、ＮＲが０．７以上であればさらによい。例えば、ＮＲ（ＮＡ２／ＮＡ１）は、０．７≦ＮＲ≦０．９を満たしてもよい。

なお、顕微鏡１は、倍率が異なる複数の対物レンズ２０を交換可能でもよい。この場合、第１絞り部材２および第２絞り部材２６は、複数の対物レンズ２０の倍率に応じて、複数セット設けられてもよい。

［第２実施形態］
第２実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図７は、第２実施形態に係る第１絞り部材２から像面（２次像面３２、２次像面４２）までの光路を示す図である。

本実施形態に係る顕微鏡１は、第２開口部３４の一部を覆う透過率フィルタ５０を備える。透過率フィルタ５０は、例えば、第２絞り部材２６の第２開口部３４と同心、かつ第２開口部３４よりも内径が小さい第３開口部５１を有する。図７の符号ｒ３は、第３開口部５１の内径に相当する。透過率フィルタ５０は、例えば、ＮＤフィルタ等であり、その透過率が面内でほぼ均一である。透過率フィルタ５０は、対物レンズ２０を通った光（観察光）のうち、第３開口部５１の外側かつ第２開口部３４の内側の領域を通る光の一部のみを吸収する。

透過率フィルタ５０は、例えば、対物レンズ２０の瞳面３０（図１参照）と光学的に共役な位置またはその近傍に配置される。図７において、透過率フィルタ５０は、第２絞り部材２６に対して像面側に、第２絞り部材２６と近接して配置される。透過率フィルタ５０は、第２絞り部材２６と接してもよいし、第２絞り部材２６から離れていてもよい。透過率フィルタ５０は、第２絞り部材２６に対して対物レンズ２０側に配置されてもよいし、図７と異なる位置に配置されてもよい。

透過率フィルタ５０は、例えば、対物レンズ２０を通った光の光路に挿脱可能である。例えば、第２絞り部材２６と透過率フィルタ５０とはユニット化され、一体的に光路に挿脱される。透過率フィルタ５０は、第２絞り部材２６とユニット化されなくてもよいし、第２絞り部材２６と別に光路に挿脱可能でもよく、光路から退避不能でもよい。透過率フィルタ５０を入れることにより、コントラストを微調整することができる。

ところで、図５（Ｃ）に示すように、位相物体のコントラストを上げるには第２絞り部材２６の第２開口部３４をより小さくして、NRを小さくすれば良いが、図６（Ｂ）に示すように振幅物体の解像力が悪化する傾向がある。本実施形態のように、透過率フィルタ５０を用いると高ＮＡ成分の一部が透過率フィルタ５０を透過するので、振幅物体の解像力を維持したまま位相物体のコントラストを微調整することができる。本発明者は、０．６≦ＮＡ２／ＮＡ１≦１．０では、透過率フィルタ５０の透過率Ｔを、Ｔ≦０．２５とすることにより、コントラストを最適に微調整できることを見出した。

［第３実施形態］
第３実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図８は、第３実施形態に係る顕微鏡を示す図であり、図９は、第３実施形態に係る第１絞り部材２から像面までの光路を示す図である。

顕微鏡１は、第１偏光部材５３、第１波長板５４、第２波長板５５、及び第２偏光部材５６を備える。第１偏光部材５３は、コンデンサレンズ１２へ向かう光の光路に第１絞り部材２と交換可能に設けられ、直線偏光が透過する特性を有する。第１波長板５４は、第１偏光部材５３とともに配置され、第１偏光部材５３を透過した直線偏光を円偏光に変換する。第１波長板５４は、例えば、第１偏光部材５３と同様に、コンデンサレンズ１２へ向かう光の光路に挿脱可能に設けられる。例えば、第１波長板５４と第１偏光部材５３とがユニット化された第１素子５７が、レンズ１１とコンデンサレンズ１２との間の光路に、第１絞り部材２と交換可能に配置される。

第２波長板５５は、対物レンズ２０を通った光の光路に第２偏光部材５６とともに配置され、第１波長板５４により変換された円偏光を直線偏光に変換する。第２偏光部材５６は、第２波長板５５により変換された直線偏光の少なくとも一部を遮光する。例えば、第２波長板５５、第２偏光部材５６およびデポラライザ５８がユニット化された第２素子５９が、対物レンズ２０とレンズ２１との間の光路に挿脱可能に配置される。デポラライザ５８は、第２偏光部材５６を通った直線偏光を非偏光に変換する。なお、デポラライザ５８は、第２素子５９に含まれなくてもよい。

図１０は、第１偏光部材５３から第２偏光部材５６までの光路における偏光状態を示す説明図である。第１偏光部材５３は、例えば透過軸６０を有する偏光板である。第１偏光部材５３は、は、透過軸６０と同方向の直線偏光が透過し、透過軸６０に垂直な偏光成分を吸収する特性を有する。第１波長板５４は、第１偏光部材５３を透過した直線偏光Ｌ５を、円偏光Ｌ６を含む光（例、円偏光、楕円偏光）に変換する。第１波長板５４は、例えば、光学軸６１（進相軸、遅相軸）を有する１／４波長板である。第１波長板５４は、光学軸６１の方向と、光学軸６１に垂直な方向とで屈折率の異方性を有し、これら２方向の偏光成分に異なる位相を付与する。第１偏光部材５３の透過軸６０と第１波長板５４の光学軸６１との角度は、例えば４４°以上４６°以下の範囲内（ここでは、４５°として説明する）に設定される。なお、第１波長板５４は、第１波長板５４から出射する光が円偏光の成分を含んでいればよく、第１偏光部材５３の透過軸６０と第１波長板５４の光学軸６１との角度が、上記の範囲外であってもよい。

第１素子５７により変換された円偏光Ｌ６は、コンデンサレンズ１２により、試料Ｓに照射される。試料Ｓからの光は、試料Ｓにより散乱した光Ｌ１と、試料Ｓで散乱しない光Ｌ２とを含む。試料Ｓからの光は、対物レンズ２０を通って、第２素子５９に入射する。試料Ｓで散乱しない光Ｌ２（円偏光Ｌ６）は、第２波長板５５により、直線偏光Ｌ７に変換される。第２波長板５５は、例えば、第１波長板５４の光学軸６１と同方向の光学軸６２（進相軸、遅相軸）を有する１／４波長板である。第１波長板５４の光学軸６１が進相軸である場合、光学軸６２も進相軸であり、第１波長板５４の光学軸６１が遅相軸である場合、光学軸６２も遅相軸である。

第２波長板５５は、光学軸６２の方向と、光学軸６２に垂直な方向とで屈折率の異方性を有し、これら２方向の偏光成分に異なる位相を付与する。第２波長板５５により変換された直線偏光Ｌ７は、直線偏光Ｌ５に対して２×４５°＝９０°傾く。第２偏光部材５６は、例えば、第１偏光部材５３の透過軸６０と同方向の透過軸６３を有する偏光板である。よって、試料Ｓで散乱しない光Ｌ２は、第２偏光部材５６に吸収される。

試料Ｓで散乱した光Ｌ１は、試料Ｓに入射する前と偏光状態が変化し、楕円偏光になる。この楕円偏光のうち、円偏光の成分は光Ｌ２と同様に第２偏光部材５６に吸収されるが、直線偏光の成分は、第２波長板５５によって円偏光となり、その一部が第２偏光部材５６を透過して像面に像を結ぶ。なお、デポラライザ５８は、第２偏光部材５６を透過した直線偏光を非偏光に変換し、例えば、デポラライザ５８よりも像面側における偏光依存性の影響を減らす。

ところで、本発明者は、鋭意、研究開発を行った結果、第１実施形態、第２実施形態では、透明帯ＺＰと、卵子ＯＶの表面の凹凸は観察できるが、紡錘体の観察が困難であることを見出した。ＩＣＳＩによる顕微授精では、精子を卵子にインジェクションする場合に紡錘体に傷を付けないことが重要である。したがって、紡錘体を観察することは重要である。第３実施形態の顕微鏡１は、紡錘体を観察することができ、例えばインジェクション時に紡錘体を傷つけることを避けることができる。また、第１実施形態または第２実施形態と第３実施形態とを組み合わせる場合、ＩＣＳＩによる顕微授精において、卵子の透明体や卵子表面の微細な凹凸を観察することができ、かつ紡錘体を観察することができるため、受精率を向上させることができる。また、第３実施形態の顕微鏡１は、第１絞り部材と、第１素子５７が交換可能（切り替え可能）に構成され、第２素子５９が挿入可能に構成されているので、簡易な構成で、顕微授精の受精率を向上させることができる。なお、上述したように、デポラライザ５８は、第２素子５９に含まれなくてもよい。また、第３実施形態において、ＮＡ２／ＮＡ１は、上記の式（１）の範囲から選択されてもよいし、上記の（１）と異なる範囲から選択されてもよい。

図１１は、変形例に係る第１偏光部材から第２偏光部材までの光路における偏光状態を示す説明図である。本変形例の顕微鏡１は、第１偏光部材５３、第１波長板５４、第２波長板６５、及び第２偏光部材６６を備える。顕微鏡１は、図８に示した顕微鏡１における第２波長板５５を第２波長板６５に代え、第２偏光部材５６を第２偏光部材６６に代えたものである。

第２素子５９に入射する光は、図１０と同様であるため、説明を省略する。第２波長板６５は、例えば、第１波長板５４の光学軸６１（進相軸、遅相軸）と垂直な光学軸６７（進相軸、遅相軸）を有する１／４波長板である。第１波長板５４の光学軸６１が進相軸である場合、光学軸６７も進相軸であり、第１波長板５４の光学軸６１が遅相軸である場合、光学軸６７も遅相軸である。

第２波長板６５は、第１波長板５４が付与する位相差を相殺し、円偏光を、第１偏光部材５３により変換された直線偏光と同方向の直線偏光に変換する。第２偏光部材６６は、例えば、第１偏光部材５３の透過軸６０と垂直な透過軸６８を有する偏光板である。すなわち、透過軸６８は、第２波長板５５によって変換された直線偏光に対して垂直であり、第２偏光部材６６は、この直線偏光を吸収する。

なお、図１０の第２波長板５５および第２偏光部材５６（例、第２素子５９）を光軸ＡＸの周りで９０°回転させると、図１１と等価になる。また、第２波長板５５および第２偏光部材５６の代わりに、第１偏光部材５３および第１波長板５４を光軸ＡＸの周りで９０°回転させる場合も同様である。なお、第１偏光部材５３、第２偏光部材５６は、ＴＥ偏光とＴＳ偏光とを、反射と透過とで分離する反射型の偏光素子でもよい。第１波長板５４、第２波長板５５は、屈折率の異方性を有するもの、位相差を付与するものを適宜用いることができ、例えば液晶を用いたものでもよい。

なお、第１偏光部材５３および第１波長板５４が第１絞り部材２と交換不能に設けられ、かつ第２偏光部材５６および第２波長板５５が第２絞り部材２６と交換不能に設けられてもよい。例えば、第１偏光部材５３および第１波長板５４が第１絞り部材２の代わりに設けられ、かつ第２偏光部材５６および第２波長板５５が第２絞り部材２６の代わりに設けられてもよい。

［第４実施形態］
第４実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図１２は、第４実施形態に係る顕微鏡を示す図である。上述の実施形態において顕微鏡１は透過型であるが、本実施形態に係る顕微鏡１は、反射型である。この顕微鏡１は、試料Ｓを落射照明し、試料Ｓで反射した光を観察に用いる。

顕微鏡１は、照明光学系７１を備える。照明光学系７１は、光源装置３の光出射側に、レンズ７２、第１絞り部材２、レンズ７３、ビームスプリッタ７４、及びコンデンサレンズ（対物レンズ２０）を備える。対物レンズ２０は、照明光学系７１と第１観察光学系５と第２観察光学系７とで共通であり、照明光学系７１は、対物レンズ２０をコンデンサレンズとして利用する。

光源装置３から出射した光（照明光）は、レンズ７２を透過して第１絞り部材２に入射する。第１絞り部材２の第１開口部１４（図２参照）を通った光は、レンズ７３を透過してビームスプリッタ７４に入射する。ビームスプリッタ７４は、レンズ７３からの光（照明光）の少なくとも一部が反射し、試料Ｓから対物レンズ２０を介して入射する光（観察光）の少なくとも一部が透過する特性を有する。ビームスプリッタ７４で反射した照明光は、コンデンサレンズ（対物レンズ２０）を介して試料Ｓに照射される。試料Ｓで反射した光（観察光）は、対物レンズ２０を介してビームスプリッタ７４に入射し、その少なくとも一部がビームスプリッタ７４を透過する。ビームスプリッタ７４を透過した光は、図１と同様に観察に利用される。

なお、本発明の技術範囲は、上述の実施形態などで説明した態様に限定されるものではない。上述の実施形態などで説明した要件の１つ以上は、省略されることがある。また、上述の実施形態などで説明した要件は、適宜組み合わせることができる。また、法令で許容される限りにおいて、上述の実施形態などで引用した全ての文献の開示を援用して本文の記載の一部とする。

１・・・顕微鏡、２・・・第１絞り部材、３・・・光源装置、４・・・照明光学系、５・・・第１観察光学系、６・・・撮像部、７・・・第２観察光学系、Ｓ・・・試料、１２・・・コンデンサレンズ、１４・・・第１開口部、２０・・・対物レンズ、３４・・・第２開口部、５０・・・透過率フィルタ、５３・・・第１偏光部材、５４・・・第１波長板、５５、６５・・・第２波長板、５６、６６・・・第２偏光部材、６０・・・透過軸（第１変更部材）、６１・・・光学軸（第１波長板）、６２・・・光学軸（第２波長板）、６３、６７・・・透過軸（第２変更部材）

Claims

第１開口部を有する第１絞り部材と、
前記第１開口部を通った光を試料に照射するコンデンサレンズと、
対物レンズと、
前記対物レンズを通った光の一部が通る第２開口部を有する第２絞り部材と、を備え、
前記第１開口部は、前記コンデンサレンズの光軸を含まないように配置され、前記第１開口部を通った光が前記試料に偏斜照明されるように設けられ、
前記第１開口部の開口数をＮＡ１とし、前記第２開口部の開口数をＮＡ２としたときに、０．６≦ＮＡ２／ＮＡ１≦１．０を満たす、顕微鏡。
前記第１開口部は、
前記コンデンサレンズの光軸を含む面を挟む一対の領域のうち一方の領域のみに、前記コンデンサレンズの光軸から離れた位置に配置される、請求項１に記載の顕微鏡。
前記ＮＡ１および前記ＮＡ２は、０．７≦ＮＡ２／ＮＡ１≦０．９を満たす、請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
前記第１絞り部材は、挿脱可能である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
前記第１絞り部材は、前記コンデンサレンズの光軸周りに回転可能である、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
前記第２開口部の一部を覆う透過率フィルタを備える、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
前記透過率フィルタは、前記第２絞り部材の前記第２開口部と同心、かつ前記第２開口部よりも内径が小さい第３開口部を有する、請求項６に記載の顕微鏡。
前記透過率フィルタは、挿脱可能である、請求項６または請求項７に記載の顕微鏡。
前記透過率フィルタの透過率をＴとしたときに、Ｔ≦０．２５を満たす、請求項６または請求項７に記載の顕微鏡。
前記第１絞り部材と交換可能に設けられた、第１偏光部材および第１波長板と、
前記対物レンズを通った光に作用する第２波長板および第２偏光部材と、を備える、請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の顕微鏡。