JP5982405B2 - オートフォーカス装置を有する顕微鏡及び顕微鏡でのオートフォーカス方法 - Google Patents

Description

本発明は、オートフォーカスビーム経路を用いた、顕微鏡の顕微鏡対物レンズの焦点に位置する試料の顕微鏡検査におけるオートフォーカス方法と、対応するオートフォーカス装置を有する顕微鏡に関する。

試料の顕微鏡検査においては、通常「関心のある領域」に焦点を合わせ、試験のためにその領域の拡大された鮮明な画像を手に入れる。例えば、生きている試料や細胞が含まれるとき及び／又は熱の影響や振動の結果、対物レンズと関心のある領域の光学距離が変化するとき、試験の途中で焦点を再調整する必要がしばしばある。顕微鏡用に様々な種類が知られている所謂オートフォーカス装置（自動焦点装置）は、焦点を位置決めし、保持するのに使用される。たいていのオートフォーカス方法は２つのカテゴリー、すなわち位置感知と画像コンテンツ解析になる。これらの例を、以下で説明する従来技術に関連してより詳細に議論する。

実際、オートフォーカスは、定められた界面、例えば空気中の試料界面や試料液体とガラスの間の界面で鮮明になるようにしばしば設定される。これは、試料を視覚により監視しながらユーザーにより手動で行われたり、オートフォーカス装置の特別な焦点サーチ操作により行われたりする。次いで、実際の顕微鏡検査は「オフセット」を続行することができ、オートフォーカスは、検査されている関心のある領域に位置する視覚焦点とは異なるより効率的に感知された界面にユーザーにより調整される。この種の「オートフォーカスオフセット」には、これら２つの焦点の間の距離、例えば顕微鏡的に調製された試料のカバースリップ厚さ又は視覚により観察される試料が位置しているペトリ皿の基本厚さが分かっていることが必要である。

例えばカバースリップ又はガラスと水溶液の間の定められた界面での焦点ホールドは、特に（例えば細胞試料の）長期間の顕微鏡検査の場合に有利である。焦点ホールドでは、例えばユーザーにより選択された焦点が熱効果や振動のために誤調整されてしまったときに連続的に修正される。

従来技術
特許文献１から公知の所謂「三角法（triangulating）」オートフォーカス装置は、位置感知するオートフォーカス装置という前述のカテゴリーに属する。特許文献２は、前述の特許文献１に「三角法」オートフォーカス原理として記載されたオートフォーカス原理に言及している。「オートフォーカス走査」ユニットとも呼ばれるこの種のオートフォーカス装置は、オートフォーカスビーム経路として、試料に斜めに又は傾斜して入射するオートフォーカス測定ビームを使用する。この測定ビームは顕微鏡対物レンズにより試料に合焦される。そこに、一般にスポット又はスリットの形状の測定パターンが作られる。このオートフォーカス原理は、鏡面反射の又は平坦な反射のオートフォーカス界面を要する。反射の後、測定ビームは顕微鏡対物レンズを再度通過し、次いで位置感知オートフォーカス検出器に方向転換される。この検出器は、測定ビームの横シフトを検知する。その理由は、対物レンズとオートフォーカス界面（「焦点ホールド」）の距離が変わると、測定ビームの横シフトが検出器で生じ、その結果焦点位置に関して修正された信号が生成されるからである。それにより、焦点ぼけの程度が測定でき、よって適切な手段を使用するために補償される。対物レンズとオートフォーカス界面の距離に生じた変化を打ち消すために、１つの補償の可能性は、対応的に対物レンズを移動させるモーターである。三角法オートフォーカス装置の構成と操作方法に関する更なる詳細は、先に述べた特許文献１と特許文献２から得られよう。

特許文献３は、光学装置、特に入射光顕微鏡用の同様のオートフォーカス装置を開示している。この装置により、測定ビーム束を生成するレーザーオートフォーカス装置が備えられる。測定ビーム束の半分の一方は光学部品によりブロックされる。断面を半分に画定された測定ビーム束は、オートフォーカス測定ビームとして入射光顕微鏡の照明ビーム経路に結合される。それは対物レンズ瞳と対物レンズを介して試料に入射する。それにより、半分ブロックされた測定ビーム−好ましくはＩＲ領域のパルス化レーザー光−は、オートフォーカスのために試料上に（顕微鏡観察に干渉しない）測定スポットを生成する。焦点ぼけの場合、この測定スポットは試料の表面上を「移転する」。試料表面での反射後、和らげられたオートフォーカス測定（半）ビームは光学部品（偏向プリズム）に戻り、そこから差動ダイオード（２つのダイオード）で実質的に作られ得る検出器に至る。システムが最適に合焦されると、測定スポットの像は、検出器の２つのダイオードに関して正確に対称位置に位置する。焦点ぼけの場合、焦点ぼけ方向によっては、測定スポットの像は中央位置から２つのダイオードの一方に向かって移転する。第１近似では、差動ダイオードでの測定スポットの変位の大きさは焦点ぼけの大きさに比例する。装置により、検出された焦点ぼけは、対物レンズ及び／又は試料ステージのＺ方向（光軸の方向）の対応する反対制御により打ち消される。

同様の測定原理を有するオートフォーカス装置は特許文献４からも知られている。検出信号と実際の焦点位置の相関がこの特許文献４にグラフィックで描かれている。

透過照明を用いる倒立顕微鏡用の同様のオートフォーカス装置が特許文献５から公知である。フレアを最小化するため、偏光ビームスプリッターとλ／４プレートがオートフォーカス装置のビーム経路に設けられる。

特許文献６も、高処理量スクリーニング顕微鏡の様々な実施形態を記述している。オートフォーカス検出器で捉えられるオートフォーカス測定スポットの変位と形状が解析され、それから焦点ぼけの程度を決定し、次いでスクリーニングプロセスの間焦点を一定に維持する。

特許文献７は、顕微鏡用の第２のカテゴリー、すなわち画像コンテンツ解析のオートフォーカス方法を記述する。ここでは、オートフォーカス光学系、偏向ミラー及び顕微鏡対物レンズによって、オートフォーカスの目的で、照明視野平面内で照明ビーム経路に斜めに組み込まれた格子が焦点画像として試料上に結像される。格子は、例えば溝格子（groove grating）として具体化できる。そこに記載された装置では、格子焦点画像の位置する焦点画像平面は、顕微鏡の結像光学系の焦点平面と特定の角度を囲む。焦点合わせが最適なとき、顕微鏡のＣＣＤカメラで取得される焦点画像は、画像の中央にある、前記の２つの平面の交差線に沿って最もシャープとなり、鮮明さは両方向に外側に向かって減少する。同じことがこの画像のコントラストにも当てはまる。試料がデフォーカスされると、当該交差線は横方向に移転し、格子焦点画像の最良画像の位置も対応してシフトする。試料のデフォーカス（すなわち、Ｚ方向におけるズレ）は、ＣＣＤ検出器での最も鮮明な画像の位置の横方向の変位になる。この文献は、ＣＣＤカメラで取得される焦点画像から強度プロフィールを抽出し、そのプロフィールから、焦点平面からの距離Ｚの関数としてプロットされる強度を確認することを提案する。従って、強度最大値は最適な焦点位置にある。加えて、コントラストプロフィールが畳み込み操作によって強度プロフィールから抽出できる。繰り返すが、コントラスト最大値は最適な焦点の位置にある。制御ユニットがプロフィールに基づいてデフォーカスを算出し、顕微鏡の照明ステージを対応的に変位させてそれを補償する。

前述の三角法オートフォーカス装置の場合、測定スポットの中央位置の横変位、測定スポット又はスリットのエッジ位置、又はフィットしたプロフィールが信号として使用され、信号からデフォーカスの程度が得られる。今述べたオートフォーカス装置の場合、この種の信号は結像格子の強度又はコントラストから得られる。光源（又は視野絞りの構造）から対物レンズ及び試料を介する検出器までの結像経路全体は、評価されるべき信号に関連している。光源、検出器又は偏向要素などの部品が熱ドリフトの結果シフトすると、これが信号に直接影響する。それにより、デフォーカスを決定する際の誤差が生じ、不正確な自動焦点合わせをもたらす。一般に、正確な長期間の検査を実行するために、対応する構成を十分熱的に安定させるのに２時間以上かかる。

特許文献７（前記の記述参照）に係る方法では、カバースリップと水性試料埋め込み媒体の間の界面は検出器にも結像され、界面はＣＣＤ検出器に直接結像される。この界面に位置するのは、観察するつもりの細胞だけでなく、画像、従って得られる信号に直接載った不純物、引っ掻き傷、泡及び他の破損でもある。これらは結局評価を複雑にしたり、歪めたりする。

ＵＳ５１３６１４９Ｂ１ ＤＥ１９５３７３７６Ａ１ ＤＥ３２１９５０３Ａ１ ＵＳ２００４／０１１３０４３Ａ１ ＵＳ７３４５８１４Ｂ２ ＤＥ６０１１６２６８Ｔ２ ＷＯ２００９／０９２５５５Ａ１

"Optik" by E.hecht, Addison-Wesley Publishing Company

この事情に鑑み、本発明の目的は、低いエラー感受性で迅速かつ正確なオートフォーカスを可能にする、顕微鏡におけるオートフォーカスのための方法及び装置を記述することである。

この目的は、本発明に従い、独立請求項の特徴によって達成される。本発明の有利な実施形態はそれぞれの従属請求項と以下の記載から明らかである。

デフォーカスのための本発明に従う方法では、オートフォーカスビーム経路を用いた、顕微鏡の顕微鏡対物レンズの焦点に位置する試料の顕微鏡検査の場合、オートフォーカスビーム経路は、試料と反対側の顕微鏡対物レンズの側に配置された偏向装置を介して、顕微鏡対物レンズに向かって指向され、そこから試料領域における反射性のオートフォーカス界面に指向される。そのオートフォーカス界面で反射したオートフォーカスビーム経路は、顕微鏡対物レンズ及び偏向装置を介してオートフォーカス検出器に向けられる。オートフォーカスビーム経路の干渉サブビームを生成するために、偏向装置は、オートフォーカスビーム経路の伝播方向に交互に配置された、すなわち互いに離れて位置する２つの領域を有する。この領域はそれぞれ、オートフォーカスビーム経路を少なくとも部分的に反射する。オートフォーカス検出器は、顕微鏡対物レンズ瞳と結合する（conjugated）平面内に配置され、そこで（結局顕微鏡対物レンズ瞳にも）生じる干渉パターンを取得する。次いで、顕微鏡の焦点はこの取得した干渉パターンに依存して調節される。これは、初期焦点セッティング（所謂、焦点サーチ動作）と理解すべきであるが、顕微鏡検査中において先に確立された焦点位置のホールドとしても理解できる。

本発明の基本的概念は干渉法を用いたオートフォーカスである。このために、オートフォーカスビーム経路は干渉の原因となるサブビーム（部分ビーム）に分けられ又は分割される。この干渉は、焦点シフトに対して、すなわち試料（より正確には試料領域にある反射性のオートフォーカス界面）と顕微鏡対物レンズの間の距離の変化に対して鋭敏でなければならない。よって、発案された発明は、位置感知と画像コンテンツ解析による先に述べたカテゴリーに加えてオートフォーカスプロセスの新たなカテゴリーを含む。オートフォーカス検出器（例えばＣＣＤチップ）で取得される干渉パターンが、焦点に依存して変化する様々な特性に関して評価され得、そこから信号を取り出し、存在するデフォーカスを打ち消す又はデフォーカスを相殺する制御を焦点調節装置に適用できることが明らかになった。

初めに、最適な焦点調節の場合に干渉パターンが見えない（以下で説明する）構成であって、干渉パターンがデフォーカスの場合にのみ生じる構成が可能であることに留意すべきである。このような構成によって、結局顕微鏡の焦点が取得された干渉パターンに依存して調節され、それは消える。

一般に、取得される干渉パターンは干渉ストライプパターンである。デフォーカスの際に干渉ストライプパターンの特性が変化するように、最適な焦点調節の場合に特徴的な干渉ストライプパターンが存在する（すなわち、検出される）構成（以下で更に説明する）が好ましい。

干渉パターンの前記した焦点依存特性の中に含まれるのは、干渉パターン内のストライプの向き、ストライプの密度、干渉パターンの位相角である。オートフォーカスビーム経路のサブビームの干渉は、以下で詳細に説明するように、敏感な検出器表面上に干渉ストライプパターンを生じる。デフォーカスが存在するまで干渉ストライプパターンが生じない構成を選択することも可能である。干渉パターン内のストライプの向き（すなわち、傾斜又は傾斜角度）やそれらの密度も、デフォーカスの程度に依存して変化する。最後に、干渉パターンの「位相角」は変化する。これは次のように理解される。デフォーカスが増大するに連れて、あるストライプが隣の位置を占めるなどするようにストライプは変位する。この効果は干渉パターンに関して物理学で一般に知られている。従って、あるストライプが隣の位置をとったときによぎられた３６０°の位相角を定義することが可能である。ゆえに、対応する部分経路長は０°〜３６０°の位相角を用いて記述できる。「ストライプ」は干渉パターン内の明るさ最大値又は明るさ最小値と理解される。

干渉パターンにおけるストライプの密度、換言すればそれらの空間周波数が、オートフォーカスの目的で干渉パターンの評価のために有利に利用できることが明らかになった。更に、干渉パターンの前記した位相角が非常に僅かなデフォーカスにも非常に敏感に、すなわち非常に動的に反応することが明らかになった。ゆえに、先ず干渉パターンにおけるストライプ密度の評価に基づいて焦点セッティングを評価し、更に（要求があれば）焦点の微調整のために干渉パターンの位相角を評価するのが有利である。評価とその実施形態に関する更なる詳細は以下に詳細に記載する。

発案した発明において、検出器は（オートフォーカスの既に公知のカテゴリーの場合のように）画像平面に配置されず、その代わり顕微鏡対物レンズ瞳と結合する平面内に配置されることに留意すべきである。

更に、本発明の基本原理は原則として、従来技術から公知のミロー干渉計又はマイケルソン干渉計を用いて実行できることに留意すべきである。しかしながら、このような装置は本発明に従い提案される装置と比べて幾つかの不都合を有する。マイケルソン干渉計のデザインは対応する光路長（「アーム」）を有する基準ビーム経路を要し、これはスペースを取り過ぎる。ミロー干渉計の構造は基準ミラーを要し、その収容のために対物レンズと試料の間にはここで議論する顕微鏡に利用できる場所がない。

本発明によれば、焦点に敏感な干渉が以下のように創出される。オートフォーカスビーム経路は、顕微鏡対物レンズを介して試料領域の前記オートフォーカス界面に入射するように、前述した偏向装置により顕微鏡ビーム経路に結合される。偏向装置は、それぞれがオートフォーカスビーム経路を反射する２つの離間した領域又はセグメントであって、オートフォーカスビーム経路の伝播方向に互いに配置された領域又はセグメントを有するので、オートフォーカスビーム経路は分割される。一方で、１つのサブビームは伝播方向の前に位置する領域で反射され、これを以下では第１フロントサブビームと呼ぶ。他方で、別なサブビームは伝播方向のその後ろに位置する領域で反射され、これを以下では第１リアサブビームと呼ぶ。２つのサブビームは先ず対物レンズに向かって平行に進行する。このことに関連して、偏向要素が入射オートフォーカスビーム経路に対して４５°の角度で配置されていると仮定する。２つのサブビームは顕微鏡の焦点で衝突し、焦点に位置する試料領域の反射性のオートフォーカス界面で反射される。これらのサブビームは顕微鏡対物レンズを通って偏向要素に戻り、そこで再びサブビームのそれぞれは偏向装置のフロント領域及びその後ろに位置する領域で反射される。このようにして反射されたサブビームは結局、顕微鏡対物レンズ瞳と結合する平面内に配置されたオートフォーカス検出器に進む。例えばＣＣＤカメラとして構成された検出器は、検出器に達するサブビーム間の様々な等級の干渉を示す画像を生成する。高次の干渉は明るさとコントラストが低い。出て行く及び戻ってくる行程で偏向装置のフロント領域でそれぞれ反射したサブビームは、検出器表面（「領域１」）での一様に照明された部分を生じる。第１フロントサブビームの一部は偏向装置に戻ってきた後そのリア領域で反射する一方、第１リアサブビームの一部は偏向装置に戻ってきた後そのフロント領域で反射する。これら２つの反射したサブビームは、光路差が存在するときに干渉し、よって検出器表面（「領域２」）での容易に評価される干渉ストライプパターンを生じる。更に、可能な干渉は別なサブビームの重なりから生じる。しかし、検出器表面での別な領域（「領域３」など）におけるこれらの干渉は明るさとコントラストが低く、ゆえに評価に使用するのにあまり有効でないが、これらの干渉パターンの可能な評価を除外する意図はない。

前述した構成は、以下のようにして、内結合するオートフォーカスビーム経路（すなわち偏向要素に入射するもの）と外結合するオートフォーカスビーム経路（すなわち偏向要素から検出器に向かって進むオートフォーカスビーム経路）のために偏向装置の２つの離間した反射領域の間隔を選択することで変形できる。つまり、当該領域の間隔が同一、例えば平行平面スプリッター又は一般にオートフォーカスビーム経路をそれぞれ反射する２つの離間した平行平面表面が使用されるとき、焦点セッティングが最適なときには干渉ストライプパターンはオートフォーカス検出器に生じない。明確な干渉ストライプは、サブビームを異なる光路長に沿って進行させるデフォーカスの場合にのみ生じる。

しかしながら、前記領域の間隔が異なって選択される場合、対応するサブビームが異なる光路長に沿って進行しているので、「基準」干渉が、例えば検出器表面の前述した「領域２」において最適な焦点セッティングで既に創出される。この基準干渉に由来して、デフォーカスが干渉パターンの変化に基づいて検出され、打ち消される。異なる間隔の偏向装置の前記領域を具体化する１つの可能性は、光学楔の使用である。最適な焦点調節の場合に「基準」干渉が目視でき、デフォーカスの方向に依存して変化するように、楔角度は選択できる。例えば第１方向のデフォーカスの際、楔角度の結果存在する光路長差は増大できるのに対し、他の方向のデフォーカスの際、楔角度により生じる光路長差は補償される。このタイプの構成によって、焦点調節は比較的広範囲にわたって行われる。

別な実施形態では、異なる空間方向から干渉の重なりが生じるように、偏向装置として機能する光学楔の楔角度を選択できる。楔角度の１つの向き（以下で説明する）では、検出器表面にて予め定められた方向に指向した干渉ストライプは最適な焦点セッティングで「基準」干渉として生成され、焦点調節用の設定値として有利に機能する。オートフォーカスのために、ストライプ密度及び／又はストライプ傾斜などのこの干渉ストライプパターンの特徴が評価される。この基準干渉パターンはデフォーカスの場合に変化する、すなわちその特徴（ストライプ密度やストライプ傾斜など）が変化する。先に説明した位相角も変化し、評価のために利用できる。

偏向要素としての光学楔の使用、よって最適な焦点セッティングでの基準干渉パターンの存在がデフォーカスの迅速かつ正確な検出に有利であることが明らかになった。光学楔の小さい楔角度（弧の２，３分）でも十分である。光学楔の使用は低いフレア感度の更なる利点を有する。最適な焦点セッティングの場合に干渉ストライプが観察されずデフォーカスの場合にのみ干渉ストライプが生じる、平行平面ダイクロイック板を有する別な構成が本発明によって実現可能であるが、あまり有利でない。

本発明に従い提案されるオートフォーカス方法は原則として、オートフォーカスビーム経路を生成するどんな光源を用いても実施できる。例えば、通常の白色光源が使用できる。検出される干渉パターンのコントラストを増大させるために、単色フィルターを備えた白色光源を操作するのが有益である。実際、ＬＥＤ光源が好ましくは使用される。単色レーザー光も使用できるが、（偏向要素でない）顕微鏡の他の光学界面が干渉に寄与し得るので、レーザー光の非常に長いコヒーレンス長のために、望んでいない干渉効果が予期される。有利には、オートフォーカスビーム経路の波長は顕微鏡検査のために使用される波長領域の外側になければならない。赤外スペクトル領域の周波数が好適だと判明した。

偏向装置として、オートフォーカスビーム経路を少なくとも部分的に反射するダイクロイックスプリッター（又は単に「ダイクロイック」）であって、オートフォーカスビーム経路に位置するその２つの境界画定面が伝播方向に離間しオートフォーカスビーム経路を反射する２つの領域を形成するもの、を使用すると有利である。

オートフォーカスビーム経路の波長に対して顕著に反射する一方、顕微鏡観察波長に対して顕著に透過させるダイクロイックが使用される。これにより、オートフォーカスビーム経路からの光が顕微鏡の観察ビーム経路に入ることが防止される。別な結果は、顕微鏡ビーム経路に結合するたいていのオートフォーカスビーム経路がオートフォーカス検出器に達することである。原則として互いに対して平行平面に延在する平面を示す、このタイプのダイクロイックスプリッターの物理的な境界画定面が、オートフォーカスビーム経路のサブビームを生成するのに最も適していることが明らかになった。

偏向装置の２つの離間した領域は、互いに平行平面に延在してもよく、又は互いに楔角度を有して楔形状で延在する平面として具体化されてもよい。基本的必要条件は、オートフォーカスビーム経路がその伝播方向に位置する２つの反射性領域に衝突し、結果としてサブビームに分割されることである。当該領域が互いに平行平面に延在する場合、検出器表面の上で定めた「領域２」の原因であるサブビームの光路長が同一となり、干渉パターンは最適な焦点調節の場合に生じず、デフォーカスの場合にのみ生じる。互いに楔角度を有して楔形状で延在する平坦な領域の場合、これらのサブビームは合焦されたセッティングで異なる光路長を既に有している。従って、「基準」干渉、すなわち基準値として使用できる基準干渉パターンは最適な焦点セッティングの場合に既に生じている。既に議論したように、そこから始まり、ストライプの向き及び密度に関して及び干渉パターンの位相角に関して、デフォーカスの場合に基準干渉パターンの変化が生じる。

楔角度として０．５´〜１０´の角度が選択できる。楔角度が増大すると、ストライプ密度が上昇するが、干渉ストライプパターンのコントラストは減少する。ストライプパターンを評価するため、対応的により感度の高い検出器が必要である。好ましくは、楔角度として０．５´〜２´の角度が選択される。これにより、平均の感度を有する検出器を用いてもハイコントラストの干渉ストライプパターンの良好な評価が可能になるからである。

本明細書の導入部で既に説明したように、「オフセット」を用いてオートフォーカス装置を操作すると、すなわち視覚により観察される試料を走査せず、代わりにオートフォーカスビーム経路の焦点位置を試料領域にある高反射性の界面に配置する（「オートフォーカス界面」）と有益である。ガラスカバー（ここでは一般にペトリ皿の基体として具体化される）と試料媒体の間の界面は特にこれに適している。それに代えて、試料と反対側のガラスカバーのサイドと空気の間の界面、特に試料媒体と反対側のペトリ皿基体のサイドと、ペトリ皿及びその下に位置する倒立顕微鏡対物レンズの間の空気との間の界面が、オートフォーカスビーム経路を用いた走査に使用されてもよい。

干渉パターンの評価を以下に詳細に説明する
干渉ストライプパターンはストライプ密度、すなわち干渉ストライプの空間周波数に関して評価できる。以下に説明するように、焦点調節のために使用できる線形特性曲線はフーリエ変換により得られる。

更に、干渉パターン内のストライプの向きが評価され得る。このために、干渉パターン内のストライプの傾斜角度がデフォーカスの程度に依存してプロットされる。そこから得られる特性曲線も焦点調節のために使用できる。これは後で更に議論する。

最後に、干渉パターンの位相角がデフォーカスの程度に依存してプロットされ得る。これは、特に微調節のため、すなわち焦点のまわりの小さい領域での正確なオートフォーカスのために使用できる急勾配の特性曲線になる。これも後で更に議論する。

実際には、先ず干渉パターンのストライプ密度の評価に基づいて焦点調節を実行し、次いで場合により焦点の微調節のために干渉パターンの位相角を付加的に評価することが有益である。この方法−ストライプ密度の評価に後続する位相角の評価−は、実際に最も適していることが判明した。

特にストライプ密度に関して干渉パターンを評価するために、フーリエ変換、特に高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を使用するのが有利である。このために、オートフォーカス検出器で取得される干渉パターンの一部がフーリエ変換される。

どのようにして干渉パターンがフーリエ変換によって評価されるかを説明するため、最適な焦点調節の場合のために、垂直に交互に延在する明るいストライプと暗いストライプ（干渉パターン内の強度最大値と強度最小値に対応する）からなる基準干渉パターンがオートフォーカス検出器で取得されると仮定する。デフォーカスの場合、例えば界面は焦点の下に５０μｍ変位し、ストライプは右に傾く、すなわち傾斜角度が垂直に対して負になる。同時に、ストライプ密度は増加する。フーリエ変換を介する評価についてこれらの仮定を用いて更に説明する。フーリエ変換の基本原理は公知の通りである。

フーリエ変換により、空間領域に存在するパターンは空間周波数領域に変換され、パターン内に存在するＸ，Ｙ方向の空間周波数が見えるようになる。ストライプが空間領域においてＹ軸と平行に延在する垂直ストライプパターンの場合、Ｘ方向での最大値が、ストライプの周波数に対応する位置で空間周波数領域で得られる。加えて、ゼロの空間周波数では、パターンの平均明るさに対応する主最大値と、負の符号を有するストライプの周波数に対応する位置でＸ方向での別な最大値が得られる。ゼロの空間周波数での最大値を以下では「主最大値」と呼ぶ一方、正及び負の空間周波数の位置での２つの最大値をそれぞれ「副最大値」と呼ぶ。

負の傾斜角度を有するストライプパターンの場合、フーリエ変換は再び空間周波数領域において主最大値と、主最大値の横に配された副最大値を生じる。空間周波数はこの場合Ｘ方向とＹ方向の両方に存在するので、空間周波数領域における対応する最大値はＸ方向とＹ方向のそれぞれの成分を有する。垂直ストライプパターンのフーリエ変換に対して、互いに対する最大値の相対位置、すなわち最大値の間隔と、最大値の絶対的位置が変化したのが明らかである。空間周波数領域における２つの副最大値を見ると、副最大値の間隔の変化と、副最大値間の接続線の向きの変化が観察される。この例は、後で供する例示の実施形態で図式的に議論する。

従って、フーリエ変換の座標系において、最大値、特に主最大値のまわりに位置する２つの副最大値の相対位置、特にこれら副最大値の間隔を互いに対して評価することで、及び／又は最大値のうちの１つ、特に前記した副最大値のうちの１つの位置を評価することで、大きさと符号に関して正確にデフォーカスを識別することが可能である。「焦点位置」は、走査された界面に対する対物レンズの相対位置と理解される。デフォーカスは「＋」又は「−」符号を用いて記載される。符号は焦点位置の上方又は下方への変化を示す。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）として公知の方法の高速度のおかげで、高速の評価方法が利用できる。

評価のために、フーリエ変換座標系において、主最大値に隣接する副最大値の位置を利用すると特に有利であることが判明した。デフォーカスが焦点の上から焦点を通って焦点の下の位置に進む際、これらの座標は直線のままである。顕微鏡検査が始まる前に、この直線は較正の目的で生成される。ゆえに、較正曲線は顕微鏡検査の間オートフォーカス用の制御曲線として機能する。線形相関が存在し、線は十分な傾斜を有するので、それはオートフォーカス用の制御曲線として特に好適である。

既に先に議論したように、位相角、すなわち干渉ストライプの移転により、特に焦点位置の微調節が可能になる。また、生じるものは、デフォーカスに依存する位相角の線形相関である。対応する線が大きい傾斜を有するので、これは、僅かなデフォーカスでかなり変化する非常に敏感な変数である。値は０°〜３６０°の位相角サイクルとして「ジャンプして戻る」ので、位相角は焦点位置の絶対的な決定に利用できない。位相角はフーリエ変換に基づいて決定されてもよい。この更なる説明のために例示の実施形態を参照されたい。

干渉ストライプの傾斜角度は焦点位置と線形相関を有していない。相関は、焦点位置のまわりの小さい領域でのみ直線で近似できる。この領域の外側では、傾斜角度は飽和に向かって進む。従って、この評価は焦点のまわりの小さい領域でのみ高感度を有する。

本発明は更に、コンピュータプログラムと、本発明に係るフォーカス方法を実行するためのプログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品に関する。コンピュータプログラムは、後で説明する本発明に係る顕微鏡のオートフォーカス評価ユニットで有効に実行できる。コンピュータプログラムは特に、干渉パターンを獲得・評価するステップ、また評価結果に依存して制御を焦点調節装置に適用することに関する。有益には、コンピュータプログラムは焦点サーチ操作と、顕微鏡検査中に先に確立された焦点位置の後続の保持を制御する。焦点を保持するために、取得した干渉パターンが例えば１秒当たり２０回評価され、結果に基づいて対応的にリフォーカスされる。評価は好ましくはフーリエ変換によって実行されるので、コンピュータプログラムによる評価の場合に高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を使用するのは当然である。これが非常に迅速にかつ計算上効率的に実行されるからである。

コンピュータプログラムは、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリー、またＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット又はハードドライブなどの適切なデータ媒体に記憶される。内部又は公共の利用可能なネットワークを介するコンピュータプログラムのダウンロードも可能である。

上で詳細にカバーした方法に加えて、本発明は、顕微鏡対物レンズを含む顕微鏡の焦点を調節するオートフォーカス装置を有する対応する顕微鏡にも関する。この種の顕微鏡は、オートフォーカスビーム経路を生成するためのオートフォーカス焦点光学系を有する。顕微鏡は更に、試料と反対側の顕微鏡対物レンズのサイドに配置された偏向装置を有し、偏向装置はオートフォーカスビーム経路を顕微鏡対物レンズに導き、そこから試料領域における反射性のオートフォーカス界面に導き、オートフォーカス界面で反射して顕微鏡対物レンズを通過したオートフォーカスビーム経路をオートフォーカス検出器に導く。オートフォーカスビーム経路の干渉サブビームを生成するために、偏向装置は、オートフォーカスビーム経路の伝播方向に互いに離れて位置する２つの領域を有する。この領域はそれぞれ、オートフォーカスビーム経路を反射する。加えて、干渉パターンを取得するオートフォーカス検出器は顕微鏡対物レンズ瞳と結合する平面内に配置されている。取得した干渉パターンの評価のために、オートフォーカス評価ユニットがオートフォーカス検出器に一体化され、又はそれと作用係合している。最後に、顕微鏡の焦点を調節する焦点調節装置がオートフォーカス評価ユニットと作用係合している。

オートフォーカス装置を有する本発明に係る顕微鏡の前記した構成部品の操作方法に関して、本発明に係る方法に関連する上述の記載が明らかに参考になる。同じことが可能な実施形態にも当てはまる。

焦点調節装置は、顕微鏡の焦点を調節するために、顕微鏡対物レンズと試料領域の界面との距離を変更するように構成され、その目的のために通常は制御が試料ステージのＺ位置に適用され、及び／又はズームレンズが顕微鏡対物レンズとして使用されるときその焦点長さは変更される。

オートフォーカス装置は倒立顕微鏡の場合に特に有利に使用できる。

上で述べた特徴と以下で説明する特徴は、本発明の範囲を逸脱せずに、示されたそれぞれの組み合わせだけでなく他の組み合わせや単独でも使用できると理解されたい。

本発明を例示の実施形態に基づいて図面に概略的に描き、図面に則して以下に詳細に記載する。

本発明に係る顕微鏡用のオートフォーカス装置の基本的なビーム経路の概略図である。 図１の一部に基づき、最適な焦点調節とデフォーカスを有する状態を示す図である。 偏向装置として光学楔を使用した効果を示す図である。 試料の種類に応じて適切なオートフォーカス界面を選択する図である。 顕微鏡内でオートフォーカスビーム経路を生成、検出する変形構成を示す図である。 検出器表面での干渉パターンの典型的配置を示す図である。 平行平面板又は光学楔を用いたときに得られる様々な干渉ストライプパターンを示す図である。 評価のために利用される干渉ストライプパターンの典型的画像を示す図である。 例として、２つのストライプパターンとそれらのフーリエ変換と、それから得られる較正曲線を示す図である。 様々な焦点位置での干渉ストライプパターンのフーリエ変換の様々な画像を示す図である。 焦点調節において制御曲線として使用するための、導かれた焦点特性曲線を示す図である。 焦点位置に依存して、干渉ストライプパターンの位相角の変化を示す図である。 焦点位置に依存して、干渉ストライプパターンのストライプの傾きを示す図である。 焦点位置に依存して、干渉ストライプパターンのフーリエ変換における主最大値と副最大値の距離を示す図である。

図１は、顕微鏡１用のオートフォーカス装置８の基本的ビーム経路を概略図にて示し、実質的に当該顕微鏡１の顕微鏡対物レンズ２のみ描かれている。顕微鏡１の全ての別な部品は観察光学系１８として示されている。観察光学系１８は、倍率変更器やズーム装置、鏡筒、接眼レンズなどの顕微鏡の公知の構成要素を包含する。接眼レンズに加えて又は代えて、顕微鏡画像の獲得のためにカメラが備えられてもよい。顕微鏡画像自体は例えばモニターに表示できる。ここで描いた例は、「生きている細胞」検査にしばしば使用される倒立顕微鏡１に関する。これは、水溶液（栄養液）に埋め込まれた細胞試料を用いた作業を含む。顕微鏡ステージ１７は透過光開口１７ａを有し、その上に、検査すべき試料３を有するペトリ皿１３が配されている。試料３は、例えば既に述べたように水溶液中の細胞試料を含む。ペトリ皿１３の基本厚さは一般に０．１７ｍｍに等しい。試料の検査は、例えば蛍光又は差動干渉コントラスト（ＤＩＣ）などの顕微鏡的コントラスト法により行われる。細胞の細部を分析するために、２０Ｘの倍率（例えば６３Ｘ／１．２０の水又は１００Ｘ／１．４０のオイル）で始まる、殆ど高倍率液浸対物レンズのみ使用される。ユーザーはたいていの場合、自分の関心のある試料位置を視覚により探し、長時間にわたり、例えば細胞試料の操作により長期間の検査の間それを観察したい。一般的に、関心のある試料領域の顕微鏡画像はこの目的のためにデジタルカメラを使用して準備される。観察領域と顕微鏡対物レンズ２の間の光学距離は熱影響や振動の結果変わり得る。試料に、例えば細胞分裂の結果寸法や位置が変わる生きた細胞を含ませることも可能である。しかし、顕微鏡画像の有効な評価のために、顕微鏡対物レンズ２と関心のある領域との不変の距離を維持し、一貫した質の顕微鏡画像を得ることが極めて重要である。この目的は、ここで考慮する例示の実施形態において、「オフセット」で作動するオートフォーカス装置８によって、オートフォーカスが、検査すべき関心のある領域に位置する視覚焦点よりも効果的に走査される界面に設定される点で果たされる。考慮しているケースでは、試料と反対側のペトリ皿基体１５のサイドと基体の下に位置する空気１４の間の界面７がオートフォーカス界面７として使用される。よって、視覚焦点は当該オートフォーカス界面７から０．１７ｍｍ（ペトリ皿１３の基体厚さ）ずれて位置する。

ここで議論しているオートフォーカス装置８は、オートフォーカス照明光学系１６によってオートフォーカスビーム経路４を生成する。近赤外スペクトル領域（例えば７５０ｎｍ〜９００ｎｍ）のＬＥＤ光源が光源１６ａとして機能する。それに代えて、単色フィルターを有する白色光源が使用されてもよい。光学系（ここでは照明レンズ１６ｂとして概略的に描く）はオートフォーカスビーム経路４を生成する（これに関連して図５の説明も参照）。このオートフォーカスビーム経路４は、偏向装置５により顕微鏡ビーム経路に結合する。偏向装置５は、顕微鏡対物レンズ２と観察光学系１８、特に観察光学系１８の結像レンズの間に位置する。オートフォーカスは近赤外で実施されるので、オートフォーカスは、目視スペクトル領域（略４００ｎｍ〜７００ｎｍ）での作業も、近紫外領域（略３４０ｎｍ〜４５０ｎｍ）での蛍光照明の下での検査も妨害しない。オートフォーカスビーム経路４は対物レンズ２を通過し、オートフォーカス界面７で反射され、そこで対物レンズ２を再び通過し、今度は偏向装置５で反射される。それにより、オートフォーカスビーム経路４は対物レンズ瞳と結合する平面内でオートフォーカス検出器９で受けられる。

偏向装置５で反射されるときのオートフォーカスビーム経路４の進行をより詳細に考察する。先ず、図１から明らかなように、オートフォーカスビーム経路４は領域５１で部分的に反射される。サブビーム４１がこの反射の結果創出される。領域５１の背後にあるのが、領域５１を通過してきたサブビームに反射的に作用する、別な離間した領域５２である。偏向装置５の領域５２での反射は、偏向装置５から出現して顕微鏡対物レンズ２に向かって進むサブビーム４２を生じる。付加的な反射とサブビームは、ここで示すオートフォーカス原理の理解には重要でないので、以下では考慮しない。

対物レンズ２を通過して、オートフォーカス界面７にて反射された後、更にサブビーム４１，４２が偏向装置５に向かって伝播し、そこでサブビーム４１，４２は、互いから離れて位置していて、オートフォーカスビーム経路の伝播方向に前後に配置された領域５４，５３に衝突する。これに関連して、「オートフォーカスビーム経路」は、明示的にこのように呼ばなくても、生成されるサブビームを包含することを常に意図していることを強調しておく。第１フロントサブビーム４１はフロント領域５４で部分的に（図示せず）反射され、別な部分はリア領域５３で反射され、今度は偏向装置５から出現するサブビーム４３を生じる（繰り返し反射はここでは再び考慮しない）。第１リアサブビーム４２は、偏向装置５のフロント領域５４で部分的に反射する。ここで反射したサブビームはサブビーム４３と重なり、サブビーム４４を形成する。サブビーム４２の付加的な反射は、理解に必要ないのでここでは考慮しない。従って、サブビーム４４は、偏向装置５のリア領域で反射した、第１フロントサブビーム４１のサブビーム４３と、偏向装置５のフロント領域で反射した、第１リアサブビーム４２のサブビームを含む。サブビーム４４を形成する２つの前記サブビームが光路長差を示す場合、このサブビーム４４は干渉パターンを生じるのに適している。対応する干渉パターンは、明細書で先に定められた「領域２」において検出器表面に生じる。「領域１」は、フロント領域５１と５４でそれぞれ反射されたサブビームにより構成される。検出器表面に一様に照射されたセグメントがこの領域で作られる。別な領域（「領域３」など）も同様に干渉パターンを示すが、明るさとコントラストはより低く、ゆえにここで議論する評価には使用されない。

図１に描かれる最適な焦点セッティングの場合、光路長差が生じるのはデフォーカスの場合のみなので、サブビーム４４を形成するサブビームの重なりも同様に、検出器表面の領域２にて一様に照射されたセグメントを生じる。この例を図２を参照して説明する。

図１に描かれるように、オートフォーカスサブビームを生成するための領域５１，５２及び５３，５４の装置は実際には、境界画定面６，６’を有するダイクロイックスプリッターにより実施される。境界画定面６は少なくとも部分的にオートフォーカスビーム経路４に対して反射的に作用し、同じことが面６’にも当てはまる。他方で、ダイクロイックスプリッターは他のスペクトル領域を透過させ、それで前述の顕微鏡法が強度の損失無しに実行される。

検出器９の下流には、詳細に後述するように検出器９で取得された干渉パターンを評価するオートフォーカス評価ユニット２２がある。評価に依存して、どんなデフォーカスも相殺されるように焦点調節装置２３に送られる信号が生成される。図１に描いた例では、焦点調節装置２３はこの目的のため顕微鏡ステージ１７へ制御を加える。制御の適用は、Ｚ方向（対物レンズ２の主軸の方向）に顕微鏡ステージ１７を変位させる、顕微鏡ステージ１７のＺドライブを制御することで行われる。最適な焦点セッティングからのずれが連続的に０に調整されるように、焦点調節を制御ループとして実施すると有利である。

図２は図１の一部を示し、最適な焦点セッティングとデフォーカスの場合での、偏向装置５とオートフォーカス界面７の間でオートフォーカスビーム経路４のとる経路を示す。図２は、一方でオートフォーカス装置の焦点がオートフォーカス界面７に設定された最適な焦点セッティングを用いたビームプロフィールを示す。この例のために、図１の説明を参照されたい。それと同時に、図２はデフォーカスの場合、すなわち例えば振動や熱ドリフトの結果、オートフォーカス界面７が界面７’に変位した場合のビームプロフィールを示す。界面７’で反射したサブビーム４１，４２は図２でそれぞれ４１’，４２’を付されている。それらサブビームは横オフセットを有して対物レンズ２に進行し、そこから偏向装置５に進行する。検出器９は対物レンズ瞳と結合する平面内に配されているので、ビーム経路４４と４４’の間の対物レンズ領域で依然として存在する横オフセットは、検出器表面ではもはや存在しない。デフォーカスの場合に生じるサブビーム４４’は、偏向装置５のリア領域での反射で第１フロントサブビーム４１’から作られるサブビーム４３’と、偏向装置５のフロント領域での反射で第１リアサブビーム４２’とから作られる。図２から、焦点セッティングが最適なときに存在する対称条件がデフォーカスの場合には破壊され、それによりサブビーム４４’を形成するサブビームが光路長の差を生じることが明らかである。従って、干渉ストライプパターンが生じる。既に上述したように、この干渉ストライプパターンは検出器表面の特に領域２で最も明瞭に認識でき、検出できる。

明細書の他の箇所で既に詳細に説明したように、最適な焦点セッティングの場合にも「基準」干渉を生成するのが有利である。この基準干渉から出発して、基準干渉ストライプパターンの特性が変化する事実により、デフォーカスが素早く明確に検出される。この種の「基準」干渉は、例えば光学楔を用いて、例えばダイクロイックスプリッター内の楔角度により生成される。

第１実施形態では、（図１の描写から出発して）２つの境界画定面６，６’がそれらの間に楔角度を囲み、それで楔角度が、出て行く及び戻ってくるオートフォーカスビーム経路４の位置する平面（この場合、図面の平面）を張ると仮定する。図１の描写に関して容易に図示可能なこの場合、最適な焦点セッティングの場合でも、検出器９での干渉ストライプパターンが結果になるように、サブビーム４４を構成するサブビームは異なる光路長に沿って進む必要がある。ある方向（例えば対物レンズ２から離れる方向）のデフォーカスはこの光路長差を増大させ得るのに対し、他の方向（例えば対物レンズ２に向かう方向）のデフォーカスは合焦されたセッティングに存在する光路長差を補償し得る。補償の場合には、検出器での干渉パターンは消え、一様な照明が見えるだろう。

第２実施形態では、偏向装置５として使用されるものは、楔角度が図１の図平面と垂直、すなわち出て行く及び戻ってくるオートフォーカスビーム経路４の位置する平面と垂直な平面を張る光学楔である。この状況は図３に描かれている。図３に描かれた構成は干渉ストライプの傾斜の９０°回転を生じる。図１に係る構成で、実質的に水平に延在する干渉ストライプがデフォーカスの場合に検出器表面に作られると仮定する場合、図３に係る構成で生じるものが、干渉ストライプが垂直に進行する「基準」干渉であることは明らかである。ここで記載する干渉ストライプの向きはもちろん、偏向装置５として光学楔を使用する効果のより良い解明にのみ役立つ。従って、境界画定面６，６’の間の楔角度の対応する異なる向きによって、「基準」干渉パターンの干渉ストライプの傾斜に影響を与え、評価のためにそれを最適に調整することも可能である。

図３は、境界画定面６，６’を有する、偏向装置５としての好ましい光学楔５０の使用を示す。図１又は２のものと同じ部分及びビーム経路はここでは同じ参照文字を付してある。図３は、焦点調節のために最適に使用できる干渉パターンを生じるサブビーム４４を再び描いている。対応する干渉パターンは検出器表面上の「領域２」で生じる（図６も参照）。サブビーム４４の右に進行するサブビームは、偏向装置５のフロント領域、すなわちフロント境界画定面６で反射したビームのみ含み、検出器表面の「領域１」に一様に照明されたセグメントをもたらす。図３においてサブビーム４４の左側に破線で描かれた別なサブビームは、偏向装置５のリア領域、すなわちリア境界画定面６’でのサブビーム４２の反射から生じる。繰り返し反射により創出されるこの種のサブビームは検出器表面に別な領域をつくるが、これら領域の明るさとコントラストは低い。

検出器、通常は空間解析ＣＣＤカメラは、対物レンズ瞳と結合する平面に配置される。平行平面板が４５度の偏向角度で配置されていると仮定して、検出器表面上の前記「領域」は板厚さの０．７５倍の瞳ずれを示す。それぞれの領域の高さは、オートフォーカスビーム経路を生成するのに使用されるスリットのギャップ幅に一致する。

図４は、２つの異なるタイプの対物レンズ用の適切なオートフォーカス界面７の選択を示す。図４ａは液浸対物レンズを示し、液浸媒体（オイル）が対物レンズ２とペトリ皿基体１５の間の領域に存在する。通常、ここでオートフォーカス界面７として使用されるものは、ペトリ皿の基体１５と隣接試料３の間の界面である。というのは、この界面がオートフォーカスビーム経路４をより良好に反射するからである。図４ｂは、乾燥対物レンズ２の場合の条件と図１に従うオートフォーカス界面７の選択を示す。

図５は、顕微鏡１におけるオートフォーカス装置８のビーム経路の変形構成を示す。
コレクター２５及びその前のスペクトルフィルター２６を有する白色光源２４から出発して、照明スポットが開口２７により生成される。照明光学系２８は集束レンズ２９と共に照明スポットを視野絞り３０に作る。オートフォーカスビーム経路４は、集束レンズ２９（光軸に沿って変位可能）と別な輸送レンズ３２とを包含する所謂輸送光学系３１を介して顕微鏡１の対物レンズ２に向けられる。ダイクロイックビームスプリッター５は、オートフォーカス装置８の（ここに描かれた）ビーム経路４から顕微鏡１の（観察光学系１８の鏡筒に至る）結像ビーム経路３５を分割する。オートフォーカスビーム経路４はオートフォーカス界面７に達し、そこで反射される。

図５から明らかなように、オートフォーカス開口ストッパ３３が光軸１８に沿って延びる光線束の断面の半分においてオートフォーカスビーム経路４を生成し、それでオートフォーカスビーム経路４は光軸１８から中心から外れて進む。

返ってくる、すなわち界面７から反射したオートフォーカスビーム経路４は、図５に概略を描いているように、ビームスプリッター５及び輸送光学系３１を介して偏向プリズム３４に進む。オートフォーカスビーム経路４は、偏向プリズム３４によって照明側と反対に位置するオートフォーカス装置８の検出器側に反射される。検出器９は対物レンズ瞳と結合する平面に配置され、例えば２次元ＣＣＤカメラとして具体化される。

使用される各対物レンズ２に対する、倍率、ウェット又は乾燥対物レンズ状態及び開口数などの技術的データは、オートフォーカス装置の制御アプリケーション装置に記憶される。これらに加えて、必要なら、許可されたＺ値、すなわち試料３に対する対物レンズ２の距離に関するレンジ表示があってもよい。これにより、対物レンズ２のフロントレンズ要素が損傷し得る、当該要素が試料３に不注意にかぶさることが防がれる。予定された検査に使用されているカバースリップ又はペトリ皿の厚さもオートフォーカス装置の制御アプリケーション装置に記憶される。対物レンズの瞳位置は一般に使用されている特定の対物レンズ２に依存するため、それぞれの対物レンズの瞳位置が検出器９上に最適に結像されるように、集束レンズ２９は光軸に沿って変位可能に設置される。これにより、対物レンズ２が変更されても検出器の変位が回避される。

アプライト顕微鏡の場合、例えば、試料と反対側のカバースリップの側は、オートフォーカス界面７での走査焦点のための位置として選択される（カバースリップ厚さは略１７０μｍに等しい）一方、顕微鏡の視覚焦点はカバースリップの下、すなわち当該界面上に位置する。これは、オートフォーカスビーム経路４がオートフォーカス界面を構成するガラス−空気面に向けられ、より良好な制御挙動を有するより強い焦点信号が生成されるようにより強い反射が得られるという利点を有する。一旦視覚焦点が（自動的に又は手動で）調節されると、オートフォーカス界面７及びオートフォーカスサブビームの（前述の）後続の界面でのオートフォーカスビーム経路４の反射により作られる対応する干渉パターンが取得され、基準干渉パターンとして記憶又は保存される。特に、干渉パターンのフーリエ変換からの対応するデータ又は前述の特性が保存される。この基準干渉パターンは最適な焦点調節として、ゆえに焦点調節の後続の調整用の設定値として機能する。

次いで、これに顕微鏡検査が後続する。検査の間走査焦点がオートフォーカス装置８により一定に保持され、それにより視覚焦点が変わらないことも保証される。

図６は、１´の楔角度を有する光学楔５０と２０ｘ／０．７０の対物レンズ２を有するオートフォーカス装置８の前述の構成を用いて対物レンズ瞳に生じる典型的な干渉パターンを示す。オートフォーカス検出器９としてここで用いたＣＣＤカメラは、１０４０×１３９２ピクセルの解像度を有する。図６での軸ラベルはピクセル数に対応する。異なる領域が白色背景の数字「１」、「２」、「３」、「４」で識別されており、ここで「領域１」は光学楔５０のフロント表面からそれぞれ由来する反射から生じる。ここでは、干渉ストライプパターンは予想されない。「領域２」は、サブビーム４４により生成される前述の干渉を示す（図１参照）。あまり明るくない前述した高位の干渉は「領域３」に、初期には「領域４」に表れている。干渉ストライプ、すなわち明るさの最大値と明るさの最小値が特有のストライプ傾斜の特有のストライプ密度を有することは明白である（任意に選択される軸参照）。「スナップショット」から始まり、デフォーカスが増加するに連れてストライプの移動が観察され、明るいストライプは例えばその隣の位置に移動している。明るいストライプがこのようにして元の隣の明るいストライプの位置になるとき、３６０°（２π）の位相角を横切る。

図７は、デフォーカスの場合の干渉ストライプパターンの挙動と楔角度の影響を非常に概略的に示す。図７の右側は、平行平面の境界画定面６，６’（図１参照）、すなわち平行平面スプリッターを有する偏向装置を用いて得られる干渉パターン（以下では常に、検出器表面での「領域２」からの干渉パターンを意味する）を描く。逆に図７の左側は、光学楔５０を偏向装置５として使用することで得られる干渉パターンを描く。Ｚ軸は対物レンズ２の主軸と平行に位置し、その０位置は焦点位置に一致する。

平行平面板（図７の右側）の使用により、焦点位置（既に詳細に述べた）に、一様に照明された「領域２」が生じる。Ｚ軸の正の方向のデフォーカスは水平な干渉ストライプパターンを生じさせ、その密度は更なるデフォーカスにより増加する。干渉ストライプパターンの同様の挙動はＺ軸の負の方向のデフォーカスの場合にも生じる。

光学楔を使用するとき、典型的な「基準」干渉が焦点位置（Ｚ＝０）で得られ、すなわちこの場合、干渉ストライプパターンは垂直方向に延在する。楔角度の向きはここでは図３の状況に対応する。楔角度のない状況に比べて、それは干渉ストライプの９０°回転を示す。デフォーカスの場合、Ｚ軸の正の方向には、（焦点位置におけるストライプの垂直方向から始まって）正の角度方向の干渉ストライプの傾斜が観察される。Ｚ軸の正の方向の更なるデフォーカスの場合、傾斜角度は更に増加し、干渉ストライプは水平向きに近づく。同時に、干渉ストライプの密度も増加する。ストライプが他の方向（垂直に対して負の傾斜角度）に傾斜する点を除いて、同様の条件がＺ軸の負の方向のデフォーカスの場合にも存在する。デフォーカスの増加に伴い、ストライプ密度も高くなっている。

原則として、（楔のある及びない）描かれた可能性の両方ともオートフォーカスに利用できる。最終的に、「基準干渉」ストライプパターン（Ｚ＝０での）が定義可能な向きを有するように、楔角度は異なって指向されてもよい。他方で、「基準」干渉は基準位置として考慮でき、基準干渉からのずれは明瞭且つ明確に検出可能なので、図７は、楔角度を用いた評価がより確実に実施されることを明瞭に示す。デフォーカスの方向も容易に識別できる。評価に関する詳細は後述する。

図８は、評価のために使用される検出器表面（「領域２」）での典型的な干渉ストライプパターンを拡大して図式的に再度示している。

評価のための様々な可能性を詳細に更に説明する前に、フーリエ解析の基礎への洞察を幾らか行う。フーリエ解析により、空間周波数に基づいて光学プロセスを考慮することができる。フーリエ変換により、時空間のパラメータに関する空間表現は空間周波数表現に変換される。実際に、空間領域（空間ドメイン）での各関数は様々な空間周波数の正弦及び余弦関数の重なり状態として表現される。簡単に表現すると、特有の密度を有するストライプの配置は空間領域における周期的関数として解釈できる。フーリエ変換はこの周期的構造を空間周波数領域に変換し、その周期的構造に存在する全ての空間周波数でそこで最大値を示す。

干渉ストライプパターンは２次元強度プロフィールを示すので、２次元フーリエ変換が評価のために使用される。１次元フーリエ変換は、入力信号の正弦成分及び余弦成分への分解を示すので、２次元フーリエ変換は、入力信号の平坦な波への分解としてイメージできる。ｆ（ｘ，ｙ）が、空間領域における座標としてｘ，ｙを用いて例えば干渉ストライプパターンの２次元（周期的）関数を表す場合、Ｆ（ｋ_ｘ，ｋ_ｙ）は、Ｘ，Ｙ方向のそれぞれの空間角度周波数として座標ｋ_ｘ，ｋ_ｙを用いて空間周波数領域における関連するフーリエ変換を示す。以下の相関関係が存在する。

（ストライプと垂直な方向の干渉ストライプパターンの関数に匹敵する）空間領域における正弦関数のフーリエ変換は、例えば、とりわけ空間周波数と位相を含む。フーリエ変換の対称性のために、空間周波数は、正及び負の周波数領域の両方においてゼロ空間周波数に対して対称に配置される。位相は、問題になっている正弦関数が基準正弦関数に対して右又は左にシフトする程度に関する情報を与える。フーリエ変換は、コントラスト、すなわち空間領域における最も明るい位置と最も暗い位置の間の明るさの差に関する情報も含む（正弦関数の最大値及び最小値、又は干渉パターン内の明るい及び暗いストライプに対応する）。最後に、フーリエ変換は、ゼロ空間周波数で、考慮中の空間領域における領域の平均明るさを示す主最大値を含む。ゆえに、干渉パターンの場合、この値はゼロより常に大きくなるだろう。フーリエ変換の特性に関する、また空間領域（ストライプパターンや他の明るさ画像）における表現と空間周波数領域（対応するフーリエ変換）における表現の間の関係に関する非常に実例的説明は、ウェブサイトhttp://sharp.bu.edu/~slehar/fourier/fourier.htmlで、Steven Leharによる記事「An intuitive explanation of Fourier theory」から得られる。そこで扱われているものは以下の議論にとって基本知識と想定される。

１次元フーリエ変換は、ｙ＝０であるｆ（ｘ，ｙ）の前記方程式から得られる。フーリエ変換を計算するために非常に卓越的に使用されるアルゴリズムは、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）と呼ばれる。このために、先ず前記方程式の数学的積分が和で置換される。

１次元の場合に得られるものが（数３）であるように、指数関数が類似に変形されなければならない。

ここで、ω_ｋ＝ｋ２π／Ｎ、ｋ＝０，１，…，Ｎ−１である。

Ｗ＝ｅｘｐ（−ｉ２π／Ｎ）を用いて、前記方程式は離散フーリエ変換のために以下の（数４）を生じる。

類似の表現が２次元フーリエ変換のために供される。これは、必要な計算時間が最適化される前述のＦＦＴアルゴリズムのための開始地点である。フーリエ変換及び高速フーリエ変換アルゴリズムの数学的基礎についての更なる詳細は、広範な技術文献に見出せる。同じことが干渉法の物理的基礎にも当てはまる。これに関連して非特許文献１を参照されたい。ドイツ語バージョンの第２版（１９９２）は、干渉についてのチャプター（チャプター９）とフーリエ光学についてのチャプター（チャプター１１）を含む。

図９は例として、Ｚ＝０とＺ＝−５０μｍに対して、図７の左半分に概略的に描かれた干渉パターン１０のフーリエ変換（２次元ＦＦＴ）の結果を示す。

Ｚ＝０の場合、垂直に延在する干渉ストライプパターンの基準干渉が得られるのに対し、Ｚ＝−５０μｍへのデフォーカスにより、ストライプ１１，１２は傾斜し、幾らか共に近づいている。関連するフーリエ変換はそれぞれ、平均画像明るさを記述する主最大値２０ａと副最大値２０ｂ，２０ｃを示す。それらの位置は、２つの空間方向Ｘ，Ｙにおけるそれぞれのストライプパターンの空間周波数の特徴を示す。

２つのフーリエ変換の画像の比較は、副最大値２０ｂ，２０ｃの位置が絶対的にまた互いに対して変化することを示す。例えば、右側の副最大値２０ｃの座標は多数のＺ位置に対して確認でき、較正曲線に集められる。この多数の副最大値２０ｃの座標（ｋ_ｘ，ｋ_ｙ）が直線上にあることは明らかである。後で説明するように、この種の直線は、焦点調節のための制御曲線として特に好ましく適する。

図１０は、Ｚ＝−５０μｍ、−２５μｍ、０μｍ、＋２５μｍ、＋５０μｍの焦点位置で、図９に関して説明した方法を用いて得られるフーリエ変換の５つの画像を示す。２つの副最大値２０ｂ，２０ｃは白い点として描かれている。補助線ｈを用いて、例えば左側の副最大値２０ｂがどのように（上から下に見て）僅かに右側に、より明確には下方にシフトするか理解するのは容易である。

図１１は、副最大値２０ｂ，２０ｃのうちの１つのｋ_ｘ，ｋ_ｙの座標をプロットすることで得られる「焦点特性曲線」と以下で呼ぶ直線の描写を再び示す。この描写の代わりとして、値ｋ_ｙがＺに対してプロットされる（又はｋ_ｘがＺに対してプロットされる）描写が選択されてもよい。Ｚはそれぞれの焦点位置を示す（Ｚ＝０で最適な焦点）。線形の焦点特性曲線はこの代わりの描写によっても得られる。

図１１に描かれる焦点特性曲線から始まり、焦点調節は以下のように行われる。特有の座標値（ｋ_ｘ０，ｋ_ｙ０）は最適な焦点セッティングに対応する直線上の点を表す。図１１の２つの軸の単位は任意に（ピクセルとして）選択されることに留意すべきである。オートフォーカスのために、干渉パターンは１秒当たり数回、例えば１秒当たり２０回評価される。このために、干渉ストライプパターンはＦＦＴにより２次元フーリエ変換される。フーリエ変換から、副最大値の座標が図９に記載したように確認される。これらの座標（ｋ_ｘ０，ｋ_ｙ０）が同一でない場合、デフォーカスが存在し、それはオートフォーカス界面７と対物レンズ２の間の距離の対応する変更によりオートフォーカス装置によって相殺される。測定される座標（ｋ_ｘ，ｋ_ｙ）が焦点座標（ｋ_ｘ０，ｋ_ｙ０）に一致するように、焦点からのずれをゼロに制御する制御ループがこの目的のために存在すると有利である。原則として、焦点調節は制御を顕微鏡ステージに適用することで実施される。

図１２は、干渉ストライプパターンの別な特性、すなわち干渉ストライプパターン１０のフーリエ変換から決定される位相角を示す。この角度は度で示され、μｍで焦点位置に対してプロットされている。それぞれ−１８０°と＋１８０°の間の角度領域を通過して−１８０°に「ジャンプして」戻る線の急な向きが明らかに見てとれる。これら線の急な傾斜のために、位相角は、焦点位置からの最も僅かなずれも確実に検出する能力をもたらす。線がＺ方向（焦点位置）に略４０μｍ毎に「ジャンプして戻る」ので、位相角による制御は焦点のまわりに４０μｍより少ない領域でのみ明らかに可能である。

ゆえに、図１１に基づいて記載した制御アプローチと図１２に関して記載した制御アプローチを組み合わせることが特に有利だと判明した。例えば、２０Ｘ／０．７０対物レンズを用いて、図１１に従う制御アプローチによって、＋／−１μｍのフォーカス精度を有する＋／−１５０μｍのフォーカスレンジをカバーすることが可能である。１μｍの値は、対物レンズの焦点深度（被写界深度）に略対応する。図１２に従う制御アプローチが更に使用される場合、すなわち位相角の評価が制御アプローチに付加的に組み込まれる場合、焦点深度の３分の１に対応する１／３μｍの精度が実現される。位相角は記載のように明確でなく、よってストライプ密度（基準制御）と位相角（細かい制御）は互いを有効に補うので、この２重アプローチは有効である。

図１３は、干渉ストライプの別な特性、つまり焦点位置（μｍ）に対してプロットされたストライプ（度）の先に議論した傾斜を示す。明らかに、「基準」干渉セッティングに依存して、特有の傾斜角度（この場合０°）が存在する（図７、左側）。Ｚ軸の正の方向のデフォーカスの際、干渉ストライプの傾斜角度が生じる。これは先ず殆ど直線的に立ち上がり、次いで減少する傾斜で飽和に近づく。同じ挙動が、Ｚ軸の負の方向のデフォーカスにも反対の符号により明らかである。図１３の傾斜角度の性質は、この曲線が焦点調節のための制御曲線としても使用できることを示す。しかしながら、実際に直線的な制御曲線（図１１，１２のように）は制御工学の観点で実施するのが容易であることは明らかである。更に、図１１に従う焦点特性曲線と図１２に従う位相角がストライプの傾斜より高感度の測定変量を表すことは明らかである。

最後に、図１４は、干渉ストライプのまた別な特性、つまり焦点位置（μｍ）に対する距離（ピクセル）としてプロットされた、２次元フーリエ変換の副最大値の１つと主最大値との距離を示す。出現しているものは、光学楔の正しい配置により焦点位置（ゼロ）に対して対称的な放物曲線である。放物形状のために、この特性は焦点位置に関して明確でなく、すなわち前記頂点からそれぞれ同距離にある２つの焦点位置に対して同一の値が得られる。

議論した例示の実施形態は、干渉ストライプパターンとそのフーリエ変換の特有の特性の好ましい評価可能性を示した。例は本発明を限定する意図でなく、本発明の潜在能力と利点を供する。もちろん、本発明は議論した倒立顕微鏡だけでなくアプライト顕微鏡でのオートフォーカスにも適する。アプライト顕微鏡に関して、図４ａ，４ｂは上下逆さまに仮定でき、よってペトリ皿１５は試料３上に位置するカバースリップに対応する。他の点では、全ての考慮が同様に当てはまる。

１ 顕微鏡
２ 顕微鏡対物レンズ
３ 試料、サンプル
４ オートフォーカスビーム経路
５ 偏向装置
６，６’ 境界画定面
７ オートフォーカス界面
８ オートフォーカス装置
９ オートフォーカス検出器
１０ 干渉パターン
１１ ストライプ（明るい）
１２ ストライプ（暗い）
１３ ペトリ皿
１４ 空気
１５ ペトリ皿基体
１６ オートフォーカス照明光学系
１６ａ 光源
１６ｂ 照明レンズ
１７ 顕微鏡ステージ
１７ａ 透過光開口
１８ 観察光学系
２０ａ，２０ｂ，２０ｃ 最大値
２１ フーリエ変換
２２ オートフォーカス評価ユニット
２３ 焦点調節装置
２４ 白色光源
２５ コレクター
２６ スペクトルフィルター
２７ 開口
２８ 照明光学系
２９ 集束レンズ
３０ 視野絞り
３１ 輸送光学系
３２ 輸送レンズ
３３ オートフォーカス開口ストッパ
３４ 偏向プリズム
３５ 結像ビーム経路
４１，４２，４３，４４ サブビーム
５０ 光学楔
５１，５２，５３，５４ 領域
γ 楔角度
ｈ 補助線

Claims (21)

1. オートフォーカスビーム経路（４）を用いた、顕微鏡（１）の顕微鏡対物レンズ（２）の焦点に位置する試料（３）の顕微鏡検査におけるオートフォーカス方法であって、オートフォーカスビーム経路（４）は、試料と反対側の顕微鏡対物レンズの側に配置された偏向装置（５）により、顕微鏡対物レンズ（２）に向かって導かれ、そこから試料領域における反射性のオートフォーカス界面（７）に導かれ、オートフォーカス界面（７）で反射したオートフォーカスビーム経路（４）は、顕微鏡対物レンズ（２）及び偏向装置（５）を介してオートフォーカス検出器（９）に向かって導かれ、
   オートフォーカスビーム経路（４）の干渉サブビーム（４１，４２，４３，４４）を生成するために、偏向装置（５）は、オートフォーカスビーム経路（４）の伝播方向に互いに離間した２つの領域（５１，５２；５３，５４）であって、それぞれオートフォーカスビーム経路（４）を反射する領域を有し、
   オートフォーカス検出器（９）は、顕微鏡対物レンズ瞳と結合する平面内に配置され、そこで生じる干渉パターンを取得し、
   顕微鏡（１）の焦点は取得した干渉パターン（１０）に依存して調節され、
   焦点調節のために、取得した干渉パターン（１０）が、干渉パターン（１０）のストライプ（１１，１２）の向き及び／又は密度に関して、及び／又は干渉パターン（１０）の位相角に関して評価され、
   干渉パターン（１０）の評価がフーリエ変換、特に高速フーリエ変換を用いて実行され、
   干渉パターン（１０）のフーリエ変換（２１）の平面座標系における最大値（２０ａ，２０ｂ，２０ｃ）の位置が決定され、フーリエ変換（２１）の座標系における最大値（２０ａ，２０ｂ，２０ｃ）のうちの１つの位置及び／又は最大値（２０ａ，２０ｂ，２０ｃ）の互いに対する相対位置が評価される、方法。
2. 偏向装置（５）として使用されるものが、オートフォーカスビーム経路（４）を少なくとも部分的に反射するダイクロイックスプリッターであり、オートフォーカスビーム経路内に位置するその２つの境界画定面（６，６’）がオートフォーカスビーム経路（４）を反射する２つの離間した領域（５１，５２，５３，５４）を形成する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 偏向装置（５）の２つの離間した領域（５１，５２，５３，５４）は互いに平行平面に延在する、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. 偏向装置（５）の２つの離間した領域（５１，５２，５３，５４）はそれぞれ平坦に具体化され、互いに対して楔角度（γ）で楔形状に延在する、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
5. 楔角度（γ）として、０．５´〜１０´の角度、特に０．５´〜２´の角度を選択した、ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 顕微鏡（１）の試料領域に位置する試料スライドであって、試料媒体及びそこに配置されたカバースリップを有する試料スライドが使用されるとき、カバースリップと試料媒体の間の界面か、試料媒体と反対側の、カバースリップと空気の間の界面のいずれかが、試料領域においてオートフォーカスビーム経路（４）を合焦させるオートフォーカス界面（７）として使用される、ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 試料媒体を含み、顕微鏡（１）の試料領域に位置するペトリ皿（１３）が使用されるとき、ペトリ皿基体（１５）と試料媒体の間の界面か、試料媒体と反対側の、ペトリ皿基体（１５）とペトリ皿基体（１５）の下の空気（１４）の間の界面のいずれかが、試料領域においてオートフォーカスビーム経路（４）を合焦させるオートフォーカス界面（７）として使用される、ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 焦点調節が、先ず干渉パターン（１０）のストライプ密度の評価に基づいて実施され、干渉パターン（１０）の位相角が焦点の微調節のために更に評価される、ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 顕微鏡対物レンズ（２）を含む顕微鏡（１）の焦点を調節するためのオートフォーカス装置（８）を有する顕微鏡（１）であって、
   オートフォーカスビーム経路（４）を生成するためのオートフォーカス照明光学系（１６）、
   試料と反対側の顕微鏡対物レンズの側に配置された偏向装置（５）、
   取得した干渉パターン（１０）を評価するオートフォーカス評価ユニット（２２）、及び
   顕微鏡（１）の焦点を調節するために、オートフォーカス評価ユニット（２２）と作用係合する焦点調節装置（２３）を有し、
   偏向装置（５）は、オートフォーカスビーム経路（４）を顕微鏡対物レンズ（２）に向かって導き、そこから試料領域における反射性のオートフォーカス界面（７）に指向させ、オートフォーカス界面（７）で反射して顕微鏡対物レンズ（２）を通過したオートフォーカスビーム経路（４）をオートフォーカス検出器（９）に向かって導き、
   オートフォーカスビーム経路（４）の干渉サブビーム（４１，４２，４３，４４）を生成するために、偏向装置（５）は、オートフォーカスビーム経路（４）の伝播方向に互いに離間した２つの領域（５１，５２；５３，５４）であって、それぞれオートフォーカスビーム経路（４）を反射する領域を有し、
   干渉パターン（１０）を取得するために、オートフォーカス検出器（９）は対物レンズ瞳と結合する平面内に配置され、
   オートフォーカス評価ユニット（２２）が、干渉パターン（１０）のストライプ（１１，１２）の向き及び／又は密度に関して、及び／又は干渉パターン（１０）の位相角に関して取得した干渉パターン（１０）を評価するように具体化され、
   干渉パターン（１０）の評価がフーリエ変換、特に高速フーリエ変換を用いて実行され、
   干渉パターン（１０）のフーリエ変換（２１）の平面座標系における最大値（２０ａ，２０ｂ，２０ｃ）の位置が決定され、フーリエ変換（２１）の座標系における最大値（２０ａ，２０ｂ，２０ｃ）のうちの１つの位置及び／又は最大値（２０ａ，２０ｂ，２０ｃ）の互いに対する相対位置が評価される、顕微鏡。
10. 偏向装置（５）は、オートフォーカスビーム経路（４）を少なくとも部分的に反射するダイクロイックスプリッターを有し、オートフォーカスビーム経路（４）内に位置するその２つの境界画定面（６，６’）がオートフォーカスビーム経路（４）を反射する２つの離間した領域（５１，５２，５３，５４）を形成する、ことを特徴とする請求項９に記載の顕微鏡。
11. ダイクロイックスプリッターは平行平面板として具体化され、偏向装置（５）の２つの離間した領域（５１，５２，５３，５４）は互いに平行平面に延在する、ことを特徴とする請求項１０に記載の顕微鏡。
12. ダイクロイックスプリッターは楔角度（γ）を有する光学楔（５０）として具体化され、偏向装置（５）の２つの離間した領域（５１，５２，５３，５４）はそれぞれ平坦に具体化され、互いに対して楔角度（γ）で楔形状に延在する、ことを特徴とする請求項１０に記載の顕微鏡。
13. 楔角度（γ）は０．５´〜１０´、特に０．５´〜２´に等しい、ことを特徴とする請求項１２に記載の顕微鏡。
14. 試料媒体及びそこに配置されたカバースリップを有する試料スライドが、顕微鏡（１）の試料領域に位置決め可能であり、カバースリップと試料媒体の間の界面か、試料媒体と反対側の、カバースリップと空気の間の界面のいずれかが、オートフォーカスビーム経路（４）を合焦させるオートフォーカス界面（７）として使用できる、ことを特徴とする請求項９〜１３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
15. 試料媒体を含むペトリ皿（１３）が、顕微鏡（１）の試料領域に位置決め可能であり、ペトリ皿基体（１５）と試料媒体の間の界面か、試料媒体と反対側の、ペトリ皿基体（１５）とペトリ皿基体（１５）の下の空気（１４）の間の界面のいずれかが、オートフォーカスビーム経路（４）を合焦させるオートフォーカス界面（７）として使用できる、ことを特徴とする請求項９〜１３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
16. 干渉パターン（１０）のストライプの向きが評価されて、焦点調節装置（２３）がその評価に基づいて第１の焦点調節を行い、更に干渉パターン（１０）の位相角が評価されて、焦点調節装置（２３）がその評価に基づいて微細な焦点調節を行うように、オートフォーカス評価ユニット（２２）を構成した、ことを特徴とする請求項９〜１５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
17. 顕微鏡（１）の焦点を調節するために、焦点調節装置（２３）は、顕微鏡対物レンズ（２）とオートフォーカス界面（７）の間の距離を変更し、及び／又は、ズームレンズが顕微鏡対物レンズ（２）として使用されるときはその焦点距離を変更するように構成された、ことを特徴とする請求項９〜１６のいずれか一項に記載の顕微鏡。
18. 倒立顕微鏡（１）として具体化されることを特徴とする請求項９〜１７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
19. オートフォーカス照明光学系（１６）は、特に単色フィルター（２６）を有する白色光源（２４）又はＬＥＤ光源（１６ａ）を有する、ことを特徴とする請求項９〜１８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
20. コンピュータプログラムがコンピュータ又は対応する計算ユニット、特に請求項９に記載の顕微鏡（１）内のオートフォーカス評価ユニット（２２）上で実行されるときの、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法の全てのステップを実行するためのプログラム暗号手段を有するコンピュータプログラム。
21. コンピュータプログラムがコンピュータ又は対応する計算ユニット、特に請求項９に記載の顕微鏡（１）内のオートフォーカス評価ユニット（２２）上で実行されるときの、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法の全てのステップを実行する、コンピュータ可読データ媒体に記憶されたプログラム暗号手段を有するコンピュータプログラム製品。
    

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