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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie einer Probe, bei dem ein Mikroskop verwendet wird, das die Probe durch einen Beleuchtungsstrahlengang mit Anregungsstrahlung beleuchtet und längs einer optischen Achse auf einen Kamerachip abbildet, wobei der Beleuchtungsstrahlengang eine verstellbare Blende zur selektiven Zielbereichsbeleuchtung aufweist, ein Bereich auf der Probe als Zielbereich ausgewählt wird und die verstellbare Blende zur selektiven Zielbereichsbeleuchtung so eingestellt wird, dass außerhalb des ausgewählten Bereichs liegende Teile der Probe nicht mit Anregungsstrahlung beleuchtet werden.
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In den Biowissenschaften spielt die Mikroskopie eine wichtige Rolle. Biologische Proben können auf unterschiedlichsten Probenträgern vorliegen, z. B. zwischen Objektträger und Deckglas, in Petrischalen oder Mikrotiterplatten. Sie können noch lebend oder fixiert, ungefärbt oder gefärbt sein. Häufig werden diese Proben mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Zugegebene Fluorophore erlauben es, gezielt bestimmte Zellbestandteile anzufärben. Zur Bildgebung werden die Farbstoffe mit Licht geeigneter Wellenlänge angeregt, was üblicherweise durch eine Auflichtbeleuchtung geschieht, bei der das Beleuchtungslicht durch das Objektiv auf den beobachteten Probenbereich fokussiert wird. Das Fluoreszenzsignal – rotverschoben gegenüber dem Anregungslicht – wird durch dasselbe Objektiv aufgenommen, mittels eines Dichroiten und passenden Filtern vom Anregungslicht getrennt und zu einer Kamera oder einem Okular geführt. Auch ungefärbte Proben können mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden, sofern sie autofluoreszierende Bestandteile als Fluorophore enthalten.
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Fluoreszenzsignale sind häufig sehr schwach, weshalb hohe Anregungslichtintensitäten verwendet werden. Allerdings führen hohe Intensitäten wiederum zu verstärktem Fotobleichen. Unter diesem Begriff werden verschiedene Prozesse zusammengefasst, die dazu führen, dass die Fluorophore kein Licht mehr emittieren. Dabei kann es sich sowohl um reversible Prozesse handeln, bei denen der Fluorophor nach Wechselwirkung mit Licht nur für eine gewisse Zeit ausgeschaltet ist, als auch um irreversible, die den Fluorophor zerstören. Durch Verringerung der Anregungslichtintensität kann das Ausmaß des Fotobleichens reduziert werden, aber gleichzeitig reduziert sich i. A. dadurch auch die Signalintensität. Das lässt sich entweder durch eine Verlängerung der Kameraaufnahmezeiten kompensieren, oder ein schlechteres Signal-zu-Rausch-Verhältnis muss in Kauf genommen werden. Dieser Weg ist somit aufgrund der Schwäche der Fluoreszenzsignale häufig verwehrt.
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Eine andere Möglichkeit, das Fotobleichen zu reduzieren, besteht darin, die Probe nur zu Zeiten der Kameraaufnahme zu beleuchten. Die Lichtquelle wird nur dann eingeschaltet, wenn eine Kameraaufnahme stattfindet und danach sofort wieder ausgeschaltet. Diese Synchronisierung der Beleuchtung und Aufnahme kann Software- oder Hardware-getriggert erfolgen. Alternativ kann in den Beleuchtungsstrahlengang ein Shutter eingeschoben werden, der den Strahlengang blockiert und ihn nur während einer Kameraaufnahme freigibt.
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Weiter sind bei Mikroskopen, die wechselbare Kamerachips aufweisen, sogenannte Leuchtfeldblenden bekannt. Ein Beispiel für ein solches Mikroskop ist das AxioScan.Z1 von Carl Zeiss. Diese Blende dient dazu, bei Kameras mit unterschiedlichen Chipgrößen für jede Kamera den beleuchteten Bereich an die Ausdehnung des Kamerachips anzupassen und den Rest des Objektfeldes nicht zu beleuchten. Da die Kamerachips zur optischen Achse zentriert sind, sind solche Leuchtfeldblenden hinsichtlich ihrer Öffnungsgröße um ein festliegendes Öffnungszentrum, das ebenfalls zur optischen Achse zentriert ist, herum einstellbar.
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Im Zusammenhang mit einer bestimmten Art der Fluoreszenzmikroskopie schildert die
US 8089691 B1 einstellbare Blendenvorrichtungen, mit denen der beleuchtete Bereich in der Probe frei ausgewählt werden kann. Sowohl der Umriss als auch die Lage des beleuchteten Bereichs wird eingestellt. Das in der US-Schrift erwähnte Mikroskop dient zur FRAP-Mikroskopie, bei der ein Zielbereich in der Probe gezielt fotogebleicht werden soll.
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In der
US 6944326 B1 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem im Kamerabild auf einen Punkt geklickt werden kann, dessen Koordinaten sich eine Software merkt. Wird anschließend auf ein Objektiv mit anderer Vergrößerung gewechselt, verfährt der Tisch so, dass sich der angeklickte Punkt wieder an derselben Stelle des Kamerabildes befindet. Außerdem ist das Mikroskop mit einer motorischen Leuchtfeldblende im Durchlichtstrahlengang ausgestattet.
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In der
US 2005/0254696 A1 ist ein Slidescanner beschrieben, der im Durchlicht arbeitet. Nach einem Objektivwechsel kann eine Durchlicht-Leuchtfeldblende auf das entsprechende Objektiv im Rahmen einer Köhlerung eingestellt werden.
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In der
US 2002/0060842 A1 ist ein Mikroskop beschrieben, das im Durchlicht über eine motorisierte Leuchtfeldblende verfügt. Diese kann vom Nutzer in ihrer Größe verändert werden.
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Die Leuchtfeldblende wird eingesetzt, da der Kamerachip in der Regel kleiner ist, als das maximal übertragbare Bildfeld in der Kamerachipebene. Diese Eigenschaft ist auch sehr sinnvoll, da ansonsten Teile des Kamerachips nie zur Probenaufnahme verwendet werden könnten. Da Kamerachips rechteckig sind, liegt dieses Rechteck innerhalb des Bildfeldkreises, welcher durch die Abbildung des vom Strahlengang übertragenen Objektfeldes bestimmt wird. Leuchtfeldblenden sind gleichermaßen für Auflicht- wie für Durchlichtstrahlengänge gebräuchlich.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie einer Probe anzugeben, bei dem ein unerwünschtes Fotobleichen vermieden wird.
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Die Erfindung löst diese Aufgabe mit einem Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie einer Probe, bei dem
- – ein Mikroskop verwendet wird, das die Probe durch einen Beleuchtungsstrahlengang mit Anregungsstrahlung beleuchtet und längs einer optischen Achse in einem Bildfeld auf einen wechselbaren Kamerachip abbildet, wobei der Beleuchtungsstrahlengang eine verstellbare Blende zur selektiven Zielbereichsbeleuchtung aufweist,
- – innerhalb des Bildfeldes ein Bereich auf der Probe als Zielbereich ausgewählt wird und
- – die verstellbare Blende zur selektiven Zielbereichsbeleuchtung so eingestellt wird, dass außerhalb des ausgewählten Bereichs liegende Teile der Probe nicht mit Anregungsstrahlung beleuchtet werden, wobei
- – ein Mikroskop verwendet wird, das im Beleuchtungsstrahlengang eine Leuchtfeldblende aufweist, die eine verstellbare Öffnungsgröße und ein festliegendes Öffnungszentrum hat, um ein auf der Probe beleuchtetes Feld an die Größe des wechselbaren Kamerachips anzupassen,
- – die Leuchtfeldblende als die verstellbare Blende zur selektiven Zielbereichsbeleuchtung eingesetzt wird, indem die Probe und optische Achse so relativverschoben werden, dass der ausgewählte Bereich das Öffnungszentrum überdeckt, und die Öffnungsgröße der Leuchtfeldblende so eingestellt wird, dass der ausgewählte Bereich beleuchtet und außerhalb des ausgewählten Bereichs, aber noch im Bildfeld liegende Teile der Probe nicht beleuchtet werden.
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Durch das erfindungsgemäße Konzept kann bei herkömmlichen Mikroskopen die Leuchtfeldblende mit einem überraschenden Zusatznutzen eingesetzt werden. Durch geeignete Einstellung der Leuchtfeldblende und Relativverschiebung der Probe derart, dass der Zielbereich am Öffnungszentrum der Leuchtfeldblende liegt, idealerweise dort zentriert ist, kann durch Verstellen der Öffnungsweite der Leuchtfeldblende ein unerwünschtes Fotobleichen von Bereichen, die außerhalb des als Zielbereich ausgewählten Bereiches liegen, vermieden werden. Wo der Stand der Technik noch einen aufwändigen Aufbau benötigte, um einen frei wählbaren Zielbereich zu maskieren, kann das Verfahren nun mit einer bereits aus anderen Gründen vorhandenen Leuchtfeldblende arbeiten. Solche Leuchtfeldblenden sind in insbesondere bei Mikroskopen vorhanden deren Kamerachip wechselbar ist – entweder weil das Mikroskop wechselbare Chips hat oder weil verschiedene Kameras zur Bildaufnahme angebracht werden können.
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Es ist ein wesentlicher Aspekt der Erfindung, dass die Probe quer zur optischen Achse so relativverschoben wird, dass der ausgewählte Bereich das Öffnungszentrum der Leuchtfeldblende überdeckt. Die Verschiebung quer zur optischen Achse kann dabei dadurch erfolgen, dass ein Probentisch bewegt wird. Als Analogon dazu ist es gleichfalls möglich, das Objektiv senkrecht zur optischen Achse zu bewegen. Auch dies ist eine Relativverschiebung von Probe und optischer Achse.
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Im erfindungsgemäßen Verfahren kann ein Mikroskop verwendet werden, dessen Leuchtfeldblende eine in Breite und Höhe verstellbare Rechteckblende ist. Solche Rechteckblenden sind bei rechteckigen Kamerachips üblich. Gleichermaßen ist es möglich, dass die Leuchtfeldblende eine im Durchmesser verstellbare Irisblende ist.
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Die Leuchtfeldblende wird hinsichtlich ihrer Öffnungsgröße so eingestellt, dass sie im Bildfeld den als Zielbereich ausgewählten Bereich maskiert. Darunter ist zu verstehen, dass der ausgewählte Bereich mit Anregungsstrahlung beleuchtet wird und im Bildfeld außerhalb des ausgewählten Bereiches liegende Abschnitte der Probe abgeschattet sind. Je nach Umriss des ausgewählten Bereiches liegen natürlich mitunter unmittelbar angrenzende Teile der Probe noch innerhalb des maskierten Bereiches. Dennoch ist sichergestellt, dass weite Bereiche der Probe vor Anregungsstrahlung und damit vor Fotobleichen geschützt sind. Bei der Relativverschiebung der Probe ist es zweckmäßig, die Mitte der größten Ausdehnung der Probe direkt auf das Öffnungszentrum zu platzieren, da dann der von der Leuchtfeldblende maskierte Bereich des Bildfeldes zu einem möglichst großen Anteil vom Zielbereich gebildet ist. Mit anderen Worten, der Anteil an Probenbestandteilen des Bildfeldes, die innerhalb des von der Leuchtfeldblende maskierten Bereichs liegen und nicht zum eigentlichen Zielbereich zählen, ist dann minimiert. Die Öffnungsgröße der Leuchtfeldblende kann bei einer derartigen Ausrichtung der Relativlage der Probe auf diese Weise minimiert werden.
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Je nach Mikroskop kann es der Fall sein, dass die Leuchtfeldblende sich in einer Ebene befindet, die nicht exakt zur Kamerachipebene konjugiert ist. In diesem Fall werden Kanten der Leuchtfeldblende nicht scharf in die Kamerachipebene abgebildet, sondern mit einer gewissen Unschärfe. Um bei der Begrenzung des ausgewählten Bereiches keine Unschärfe am Rand zu erzeugen, ist es zu bevorzugen, die Leuchtfeldblende etwas größer aufzuziehen. Eine Pufferzone von 0,3 bis 0,8 mm Breite in der Kamerachipebene ist vorteilhaft. Es ist deshalb bevorzugt, dass der ausgewählte Bereich um eine Pufferzone der genannten Breite erweitert wird, bevor die Öffnungsgröße der Leuchtfeldblende eingestellt wird.
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Das Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie ist natürlich bei einem automatisierten Mikroskop und insbesondere bei einer automatischen Einstellung der Leuchtfeldblende besonders vorteilhaft. Es ist daher bevorzugt, dass ein Mikroskop verwendet wird, dessen Leuchtfeldblende motorisiert verstellbar ist und das eine Steuereinrichtung aufweist, die einem Benutzer ein Vorab-Bild der Probe anzeigt, eine Auswahlmöglichkeit für den Zielbereich anbietet und Probenrelativverschiebung und Leuchtfeldblendenverstellung automatisch durchführt.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
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1 eine schematische Darstellung eines Mikroskops zur Fluoreszenzmikroskopie,
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2 eine Draufsicht auf einen Kamerachip des Mikroskops der 1 und
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3 ein Flussdiagramm zum Ablauf eines Verfahrens zur Fluoreszenzmikroskopie, wobei zu einzelnen Schritten exemplarische Einstelllagen einer Leuchtfeldblende des Mikroskops der 1 eingetragen sind.
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1 zeigt schematisch ein Mikroskop 1 zur Fluoreszenzmikroskopie einer in einer Probenebene 2 befindlichen Probe P. Diese wird längs einer optischen Achse OA in eine Kamerachipebene 3 abgebildet, in der sich ein Kamerachip einer Mikroskopkamera befindet. Das Mikroskop 1 ist zum Wechseln der Mikroskopkamera ausgebildet, d. h. in der Kamerachipebene 3 können verschiedene Kamerachips, insbesondere mit unterschiedlichen Ausdehnungen und/oder Aspektverhältnissen angeordnet werden.
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Die Abbildung der Probe P in der Probenebene 2 längs der optischen Achse OA erfolgt durch einen Abbildungsstrahlengang 4, der insbesondere ein Objektiv 5 und eine Tubuslinse 6 aufweist. In den Abbildungsstrahlengang 4 ist ein Beleuchtungsstrahlengang 7 zur Auflichtbeleuchtung der Probe P über einen Strahlteiler 8 eingespiegelt. Durch den Abbildungsstrahlengang 4 wird Licht aus einer Lichtquelle 9 auf die Probe P gerichtet. Zwischen dem Strahlteiler 8 und der Probenebene 2 verlaufen somit der Abbildungsstrahlengang 4 und der Beleuchtungsstrahlengang 7 miteinander.
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Der Abbildungsstrahlengang umfasst eine Tubuslinse 10 sowie eine Leuchtfeldblende 11, mit der das beleuchtete Feld in der Probe P eingestellt werden kann. Das Mikroskop 1 entspricht insofern herkömmlicher Bauweise und kann beispielsweise in Form des Mikroskops AxioScan.Z1 der Firma Carl Zeiss realisiert werden.
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Das in 1 gezeigte Mikroskop 1 ist ein Auflichtmikroskop. Die nachfolgenden Erläuterungen gelten jedoch, soweit nicht explizit anders erwähnt, auch für ein Durchlichtmikroskop. Bei diesem würde gegenüber dem Mikroskop der 1 der Strahlteiler 8 entfallen und der Beleuchtungsstrahlengang 7 würde längs der optischen Achse OA von der dem Objektiv 5 gegenüberliegenden Seite der Probenebene 2 die Anregungsstrahlung zur Fluoreszenzmikroskopie einstrahlen.
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Die Lichtquelle 9 ist im hier beschriebenen Mikroskopieverfahren zur Fluoreszenzmikroskopie der Probe P ausgebildet. Die im Beleuchtungsstrahlengang 7 geführte Strahlung ist somit Anregungsstrahlung, und der Beleuchtungsstrahlengang 7 ist zum Beleuchten der Probe mit Anregungsstrahlung ausgebildet.
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2 zeigt in einer Draufsicht längs der optischen Achse OA auf die Kamerachipebene 3 einen Kamerachip 12, wie er im Mikroskop der 1 zum Einsatz kommt. Der Kamerachip 12 ist rechteckig. Das vom Abbildungsstrahlengang 4 bereitgestellte Bildfeld 13 ist, wie bereits im allgemeinen Teil der Beschreibung erläutert, größer als der Kamerachip 12. Zum Anpassen des vom Mikroskop beleuchteten Teils des Bildfeldes 13 an den Kamerachip 12 dient die Leuchtfeldblende 11. Sie ist im einfachsten Fall als rechteckige Blende ausgebildet, deren jeweils gegenüberliegenden Kanten synchron und gegenläufig verstellt werden, so dass die Öffnungsgröße der Leuchtfeldblende 11 an die Größe des Kamerachips 12 angepasst werden kann. Die Leuchtfeldblende 11 kann somit an jede rechteckige Form eingestellt werden, allerdings bleibt das Öffnungszentrum der Blende immer an derselben Stelle.
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Der Bereich in der Probe P, der im Bildfeld 13 als Zielbereich ausgewählt wird, und an dem Fluoreszenzmikroskopie ausgeführt werden soll, wird natürlich in der Regel nicht zentriert zur optischen Achse OA liegen. Um dennoch ein Fluoreszenzbleichen von im Bildfeld 13, aber außerhalb des ausgewählten Bereiches liegenden Probenteilen zu vermeiden, wird das in 3 schematisch dargestellte Verfahren durchgeführt.
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In Schritt S1 wird ein Bild der Probe P aufgenommen. Anschließend wird in einem Schritt S2 ein Zielbereich 14 im Bildfeld 13 definiert. Die durch den gestrichelten Doppelpfeil zugeordnete Darstellung der Draufsicht auf die Leuchtfeldblende 11 mit dem Kamerachip 12 zeigt die Verhältnisse im Bildfeld 13 und damit in der Probenebene 2. Da die Kamerachipebene 3 zur Probenebene 2 konjugiert ist, ist in der obersten schematischen Darstellung auf der rechten Seite der 3 auch der Kamerachip 12 schematisch eingezeichnet. Die optische Achse OA läuft durch das Öffnungszentrum 16 und steht in der schematischen Darstellung, die Schritt S2 zugeordnet ist, senkrecht zur Zeichenebene.
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In 2 wird im Bildfeld 13 ein ausgewählter Bereich 14 als Zielbereich für die Fluoreszenzmikroskopie ausgewählt. Er liegt, wie bereits erwähnt, in der Regel dezentral zum Öffnungszentrum 16 der Leuchtfeldblende 11, die durch Blendenkanten 15a–15d gebildet ist. Die jeweils gegenüberliegenden Kanten 15a/15c und 15b/15d sind synchron und gegensinnig verstellbar, so dass die Öffnungsgröße der Leuchtfeldblende 11 um das Öffnungszentrum 16 herum einstellbar ist. Ein bloßes Einstellen der Leuchtfeldblende 11 würde große Bereiche des Bildfeldes 13 mitbeleuchten, die außerhalb des ausgewählten Bereiches 14 liegen.
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In einem Schritt S3 wird deshalb eine Relativverstellung von Probe P und optischer Achse OA vorgenommen, in der Regel durch eine Verstellung eines Probentisches. Die Relativverstellung erfolgt so, dass der ausgewählte Bereich 14 das Öffnungszentrum 16 überdeckt, idealerweise zu diesem zentriert ist. Dieser Zustand ist in der dem Schritt S3 zugeordneten Schemadarstellung gezeigt.
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Nun wird in einem Schritt S4 eine Berechnung durchgeführt, die aus den Rändern des ausgewählten Bereichs 14 die minimale Öffnungsgröße der Leuchtfeldblende 11 ermittelt. Anschließend wird in einem Schritt S5 die Öffnungsgröße der Leuchtfeldblende 11 entsprechend eingestellt, indem die die Leuchtfeldblende 11 begrenzenden Kanten 15a und 15c passend aufeinander zu bewegt werden, analog die Kanten 15b und 15d. Da, wie bereits eingangs erwähnt, die Abbildung der Kanten 15a–15d und damit die Maskierung mittels der Leuchtfeldblende 11 mit einer Unschärfe behaftet sein kann, wird bevorzugterweise eine Pufferzone 17 von 0,3 bis 0,8 mm Breite (gemessen in der Kamerachipebene 3) um den ausgewählten Bereich 14 vorgehalten, um eine gleichförmige Ausleuchtung des ausgewählten Bereichs 14 mit Anregungsstrahlung zu gewährleisten.
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Anschließend wird in einem Schritt S6 ein Bild des ausgewählten Bereiches 14 aufgenommen, bei dem aufgrund der Einstellung der Leuchtfeldblende 11 und der Justierung der Probe P relativ zur optischen Achse OA (und damit zum Öffnungszentrum 16) im Bildfeld 13 im wesentlichen nur der ausgewählte Bereich 14 als Zielbereich beleuchtet und außerhalb dessen liegende Teile des Bildfeldes 13 vor Anregungsstrahlung geschützt werden.
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Die Reihenfolge der Schritte S3 und S4 kann variiert werden. Ob erst die Probe relativverschoben wird (Schritt S3) und anschließend die Leuchtfeldlende angepasst wird (Schritt S4) oder umgekehrt, spielt keine Rolle. Beides kann auch parallel ausgeführt werden.
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Die Definition des Zielbereichs im Bildfeld 13 kann auch ohne vorherige Abbildung der Probe P erfolgen, wenn die Lage des Zielbereichs im Bildfeld 13 anderweitig bekannt ist. Das kann z.B. aus Referenzmarkierungen für die Platzierung der Probe P der Fall sein. Schritt S1 ist folglich optional, und Schritt S2 muss nicht zwingend ein Probenbild zur Definition des ausgewählten Bereichs 14 als Zielbereich verwenden.
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Bisher wurden nur rechteckige Leuchtfeldblenden betrachtet. Die Erfindung ist aber genauso auch mit anderen Leuchtfeldblenden nutzbar, z. B. mit Irisblenden, wie sie in okularbasierten Mikroskopen häufig anzutreffen sind. Irisblenden geben nur kreisförmige oder annähernd kreisförmige Leuchtfelder frei. Ihr Vorteil besteht darin, dass mit nur einem Motor die Größe des Feldes gesteuert werden kann. Wird eine Irisblende verwendet, kann die Blende auch an einen rechteckigen Zielbereich so angepasst werden, dass die Leuchtfeldblende einen Umkreis dieses Rechtecks beschreibt.
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Alle bisher beschriebenen Ausführungsbeispiele haben die motorisierte Leuchtfeldblende im Auflichtstrahlengang. Selbstverständlich sind die Ausführungsbeispiele auch mit der Leuchtfeldblende in einem Durchlichtstrahlengang möglich. Der Sinn einer Leuchtfeldblende im Durchlichtstrahlengang liegt jedoch hauptsächlich darin, das Leuchtfeld an die Objektfelder anzupassen, die bei unterschiedlichen Objektivvergrößerungen sehr unterschiedlich sein können. Durchlichtbeleuchtungen sind auch wesentlich weniger kritisch, was das Bleichen von Fluorophoren anbetrifft. Dennoch kann es insbesondere bei sehr empfindlichen Fluorophoren von Vorteil sein, die Lichtbelastung an den für die augenblickliche Beobachtung nicht relevanten Stellen des Probenfeldes zu minimieren, indem eine Durchlicht-Leuchtfeldblende eingeschränkt wird. Zusätzlich kann ein eingeschränktes Leuchtfeld das Fokussieren erheblich vereinfachen: Viele Proben sind im Durchlicht kontrastschwach, was hohe Anforderungen an einen Autofokus stellt. Wird hingegen die Leuchtfeldblende eingeschränkt, so dass ihre Kanten im Bild sichtbar sind, können diese Kanten für die Fokussierung genutzt werden, da sie ein sehr starkes Kontrastsignal liefern.
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Die beschriebenen Ausführungsformen sind insbesondere für die folgenden mikroskopischen Aufgabenstellungen vorteilhaft:
- 1. In einem Übersichtsbild sollen einzelne Zellen anhand des Fluoreszenzsignals detektiert, segmentiert und über die Zeit beobachtet werden. Die Zellen in der Umgebung, die ebenfalls eine Fluoreszenzfärbung aufweisen, sollen in dieser Zeit möglichst nicht beleuchtet werden und damit nicht vorzeitig gebleicht werden. Zur Reduktion der Phototoxizität im aktuell nicht relevanten Teil der Probe P kann die Leuchtfeldblende 11 eingesetzt werden.
- 2. Einsatz eines Software-Autofokus. Dazu wird aus Geschwindigkeitsgründen häufig ein Zielbereich auf dem Chip definiert, der für die Bildauswertung relevant ist. Während der SW-AF arbeitet, ist es nicht sinnvoll, die Probenteile außerhalb dieses Zielbereiches zu beleuchten. Für die AF-Funktion ist daher der Einsatz einer Leuchtfeldblende zur Reduktion des beleuchteten Feldes auf die AF-Region sinnvoll.
- 3. In einem Bild soll nur eine Zelle oder ein bestimmter Bereich durch Photoaktivierung mit Licht angeregt werden. Die umliegenden Zellen bzw. Bereiche sollen aber von der Aktivierung ausgeschlossen bleiben. Um den aktivierten Bereich einzugrenzen, lässt sich die Leuchtfeldblende 11 einsetzen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 8089691 B1 [0006]
- US 6944326 B1 [0007]
- US 2005/0254696 A1 [0008]
- US 2002/0060842 A1 [0009]
