DE202013100660U1

DE202013100660U1 - Vorrichtung zur Sauerstoffmessung

Info

Publication number: DE202013100660U1
Application number: DE201320100660
Authority: DE
Original assignee: Colibri Photonics GmbH
Current assignee: Colibri Photonics GmbH
Priority date: 2013-02-14
Filing date: 2013-02-14
Publication date: 2013-03-07
Anticipated expiration: 2023-02-15

Abstract

Anordnung zur Erzeugung eines den Sauerstoffgehalt in einem Zellpräparat repräsentierenden Wertes enthaltend (a) eine Lichtquelle zur Beleuchtung von Sauerstoffsonden in dem Zellpräparat; (b) einen Detektor zur Aufnahme eines von den Sauerstoffsonden emittierten Phosphoreszenzsignals; und (c) eine Steuer- und Signalauswerteelektronik; gekennzeichnet durch (d) ein Gehäuse mit einer Platine auf welcher die Steuer- und Signalauswerteelektronik angeordnet ist; (e) ein Verbindungselement zum Anschließen der Lichtquelle an einen vorhandenen Port oder Lichtleiteranschluss eines handelsüblichen Fluoreszenzmikroskops; und (f) ein Verbindungselement zum Anschließen des Detektors an einen vorhandenen Kameraport des Fluoreszenzmikroskops oder in Verbindung mit einem handelsüblichen Okular-Adapter im Schacht des Okulars des Fluoreszenzmikroskops.

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Erzeugung eines den Sauerstoffgehalt in einem Zellpräparat repräsentierenden Wertes enthaltend

(a) eine Lichtquelle zur Beleuchtung von Sauerstoffsonden in dem Zellpräparat;
(b) einen Detektor zur Aufnahme eines von den Sauerstoffsonden emittierten Phosphoreszenzsignals; und
(c) eine Steuer- und Signalauswerteelektronik.

Stand der Technik
Es sind Anordnungen zur Messung des Sauerstoffgehalts mittels optischer Sauerstoffsonden bekannt. Laserlicht wird mit einem Messfühler mit einem Lichtleiter in ein Material einführt. Nachteilig bei dieser Technik ist es, dass die Messfühler die Zellpräparate schädigen, die Strömungsverhältnisse beeinflussen und an der Einstichstelle von außen Sauerstoff eindringen kann. In geschlossenen Systemen, wie beispielsweise Mikrokanälen, ist der Einsatz herkömmlicher Messfühler zudem nicht möglich.
Aus der DE 10 2010 037 923 A1 ist ein Bioreaktor bekannt, bei dem Zellen in einem Zellpelletträger Mikrokügelchen beigemischt werden, welche als Sauerstoffsonden dienen. Derartige Bioreaktoren dienen der Kultivierung von Zellen, insbesondere der Kultivierung von Stammzellen. Die Zellen bilden ein Zellpellet und befinden sich mit einer Nährlösung auf einem Zellpelletträger. Der Zellpelletträger ist schalenförmig und innerhalb eines Flaschen-ähnlichen Bioreaktors angeordnet. Die Zellentwicklung, insbesondere die Stammzellenentwicklung in mehrdimensionalem Gewebe hängt vom Sauerstoffgehalt in der unmittelbaren Umgebung ab. Dabei unterscheidet sich der Sauerstoffgehalt in dem Zellpelletträger von dem Sauerstoffgehalt in dem Nährmedium. Es ist daher wünschenswert, den Sauerstoffgehalt im Bereich der Zellen zu messen.
Die genannte Druckschrift offenbart eine Anordnung, bei welcher der Sauerstoffgehalt in unmittelbarer Umgebung der Zellen überwacht werden kann ohne die Zellen und Zellpelletträger zu schädigen und ohne die Strömungsverhältnisse zu beeinflussen. In dem Material werden phosphoreszierende Mikrokugeln als Sauerstoffsonden angeordnet, deren Phosphoreszenzeigenschaften vom Sauerstoffgehalt abhängen. Die bekannte Anordnung umfasst eine Vielzahl von Komponenten und Gerätschaften. Dazu gehören ein auf die Sauerstoffsonden gerichteter Laser mit einer eigenen Lasersteuerung und Energieversorgung, ein Detektor zur Aufnahme eines von den Sauerstoffsonden emittierten Phosphoreszenzsignals mit einer eigenen Steuerung und Energieversorgung und eine Steuer- und Signalauswerteelektronik mit einem Lock-In-Verstärker.
Die Anordnung erlaubt die kontaktlose Messung des Sauerstoffgehalts. Die Zellen und Zellträger werden nicht geschädigt und die Strömungsverhältnisse bleiben unverändert. Mit dem Laser werden die Sauerstoffsonden zur Phosphoreszenz angeregt. Das emittierte Phosphoreszenzsignal wird mit dem Detektor aufgenommen und an eine Auswerteelektronik geleitet. Aus dem Phosphoreszenzsignal kann der Sauerstoffgehalt ermittelt werden. Der Bioreaktor weist lichtdurchlässige Fenster auf und der Laser und der Detektor sind außerhalb des Bioreaktors angeordnet. Die Kultur bleibt dann vollständig ungestört.
Nachteilig bei der bekannten Anordnung ist es, dass diese nur von Spezialisten betrieben werden können. Unterschiedliche Gerätschaften müssen nach Art eines wissenschaftlichen Versuchsaufbaus von Experten mit Kenntnissen im Bereich Laser, Lock-In-Verstärker und Detektoren etc. angeschlossen, eingerichtet und überwacht werden. Die Technologie ist daher für Biologen und deren Laborfachkräfte, die an der Züchtung von Zellen und lediglich an den Messergebnissen interessiert sind, im Allgemeinen nicht oder nur schwer zugänglich.
Offenbarung der Erfindung
Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Messanordnung der eingangs genannten Art zu schaffen, die wenig Raum einnimmt, besonders einfach zu bedienen ist und die sich an den Kenntnissen und Fähigkeiten eines mit Zellzüchtung befassten Wissenschaftlers orientiert.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch:

(d) ein Gehäuse mit einer Platine auf welcher die Steuer- und Signalauswerteelektronik angeordnet ist;
(e) ein Verbindungselement zum Anschließen der Lichtquelle an einen vorhandenen Port oder Lichtleiteranschluss eines handelsüblichen Fluoreszenzmikroskops; und
(f) ein Verbindungselement zum Anschließen des Detektors an einen vorhandenen Kameraport des Fluoreszenzmikroskops oder in Verbindung mit einem handelsüblichen Okular-Adapter im Schacht des Okulars des Fluoreszenzmikroskops.

Die Anordnung ist also derart ausgelegt, dass die Proben im Rahmen eines dem Biologen wohl-bekannten Fluoreszenzmikroskops untersucht werden. Ein Fluoreszenzmikroskop wird regelmäßig zur Untersuchung von Zellkulturen verwendet. Es ist dem Anwender somit wohl vertraut. Er muss die Proben nicht zu einem separaten Messgerät bringen und vermeidet die Gefahr einer Beschädigung durch Auskühlen oder Infektion der Probe.
Lichtquelle und Detektor werden von einem gemeinsamen Steuergerät gesteuert. Dadurch wird die Bedienung vereinfacht und weniger Raum benötig. Sie können über entsprechende Verbindungselemente auf einfache Weise in vorhandene Anschlüsse des Fluoreszenzmikroskops eingesetzt werden.
Vorzugsweise ist an der Anordnung eine standardisierte Schnittstelle zur Verbindung der Steuer- und Signalauswerteelektronik mit Mitteln zur Datenverarbeitung vorgesehen. Das kann ein Anschluss für eine Kabelverbindung, etwa ein USB-Anschluss und/oder ein Sender-Empfänger für eine drahtlose Verbindung sein. Die Steuerung und Datenverarbeitung kann mittels einer geeigneten Software von einem Personalcomputer aus erfolgen. Die Rohdaten können aber auch auf andere Weise übertragen und verwertet werden. Alternativ weist die Anordnung ein Bedienungsinterface direkt am Gerät auf.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist die Lichtquelle von einer Hochleistungsleuchtdiode gebildet. Leuchtdioden sind klein, kostengünstig und schnell verfügbar. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Lichtquelle im langwelligen Bereich oberhalb von 500 nm, insbesondere bei 530 nm emittiert. Mit grünem Licht, beispielsweise bei 530 nm, kann der Sensor immer noch hinreichend gut angeregt werden. Im Gegensatz zu blauem Licht, welches die Entstehung von Singulett-Sauerstoff durch im Nährmedium vorhandenes Riboflavin stimuliert, erzeugt grünes Licht keine photochemischen Nebenreaktionen im Nährmedium. Auch Sensorfarbstoffe, die sich mit rotem Licht anregen lassen, sind geeignet. Es versteht sich, dass auch ein Laser als Lichtquelle eingesetzt werden kann. Beim Betrieb von Leuchtdioden sind Arbeitsschutzvorschriften leichter einzuhalten als bei Betrieb von Lasern.
Vorzugsweise umfasst das Verbindungselement zum Anschließen der Lichtquelle ein mit einer Kabelleitung an das Gehäuse mit der Steuerelektronik anschließbares, separates Lichtquellengehäuse, in dem die Lichtquelle auf einem Kühlkörper angeordnet ist, und das Lichtquellengehäuse ist mit der Lichtquelle in den Port des Fluoreszenzmikroskops einsetzbar. Sinnvollerweise wird der Port verwendet, wo sich normalerweise die Fluoreszenzlampe des Mikroskops befindet. Auf das Lichtquellengehäuse wird je nach Mikroskoptyp und -fabrikat die entsprechende Ringschwalbe aufgeschraubt, so dass sich die Lichtquelle mit wenigen Handgriffen im Port befestigen lässt. Im Zubehörhandel sind Lichtquellenumschalter erhältlich, bei deren Verwendung die bestehende Fluoreszenzlampe nicht abmontiert werden muss.
Die Kabelleitung kann flexibel und in ausreichender Länge ausgewählt werden. Das Kabel wird an einen zugehörigen Anschluss am Elektronikgehäuse angeschlossen. Es ist keine aufwändige Justage erforderlich, sondern lediglich eine x-y-Justage, um den Lichtspot im Bildfeld zu zentrieren. Das Lichtquellengehäuse wird als Ganzes in den Port eingesetzt. Zusätzliche Linsen und eine x-y-Verstellmöglichkeit im Lichtquellengehäuse ermöglichen die optimale Ausrichtung des Lichtstrahls.
Alternativ kann die Lichtquelle auch im Elektronikgehäuse oder an anderer Stelle angeordnet werden und über Lichtleiter in das Mikroskop geleitet werden. Hierfür verfügen einige Mikroskope über einen geeigneten Lichtleiter-Anschluss. Schließlich kann die Lichtquelle auch an der Stelle angeschlossen werden, die bei dem Fluoreszenzmikroskop für die Lampe für die Durchlichtbeleuchtung vorgesehen ist. Zur Vermeidung einer Gefährdung der Augen ist aus Sicherheitsgründen zu vermeiden, dass das ganze Anregungslicht auf die Okulare gelenkt wird
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist eine weitere Lichtquelle gleicher Bauart vorgesehen, deren Strahlung direkt zum Detektor geführt wird. Diese Lichtquelle kann ebenfalls im Lichtquellengehäuse, insbesondere auf dem gleichen Kühlkörper angeordnet sein. So kann eine Lichtquelle auf der der Probe zugewandten Seite des Kühlkörpers und die andere Lichtquelle auf der anderen Seite des Kühlkörpers vorgesehen sein. Die Strahlung der zweiten Lichtquelle kann, beispielsweise mittels eines Lichtleiters, als Referenzlicht direkt zum Detektor geführt werden. Zu den sauerstoffabhängigen, optischen Phasenverschiebungen kommen häufig elektrische Phasenverschiebungen hinzu. Diese werden beispielsweise von der Verstärkerstufe im Photodetektor erzeugt. Mit einer zweiten Lichtquelle können diese direkt erfasst und ausgewertet werden.
Bei einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfasst das Verbindungselement zum Anschließen des Detektors ein mit einem Kabel an das Gehäuse mit der Steuer- und Auswertelektronik anschließbares Detektorgehäuse, in dem der Detektor angeordnet ist und das Detektorgehäuse mit dem Detektor ist in den Kameraport des Fluoreszenzmikroskops oder in Verbindung mit einem handelsüblichen Okular-Adapter in den Schacht des Okulars des Fluoreszenzmikroskops einsetzbar. Vorzugsweise ist das Detektorgehäuse mit einem normierten C-Mount-Gewinde versehen. Am Elektronikgehäuse ist vorzugsweise eine Anschlussteckdose oder ähnliches vorgesehen, in welches das Kabel mit einem passenden Stecker eingesteckt werden kann. Eine solche lösbare Steckverbindung hat den Vorteil, dass der Detektor jederzeit gelöst und ausgetauscht oder gewartet werden kann. Je nach Anwendung kann es sinnvoll sein, unterschiedliche Detektoren zu verwenden. Diese werden dann auf einfache Weise ausgetauscht.
Das Kabel zum Anschließen des Detektors umfasst vorzugsweise insbesondere Leitungen für die Spannungsversorgung, die Steuerspannung und das detektierte Signal. Die Versorgungsspannung und die Steuerspannung kann dann beispielsweise mit einer geeigneten Software für den jeweiligen Detektor eingestellt und von der Steuer- und Auswerteelektronik bereitgestellt werden. Der Detektor kann beispielsweise einen Photovervielfacher oder eine Photodiode umfassen.
Vor dem Detektor kann sich bei einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ein Detektor-Tubus mit Irisblendenoptik und/oder Strahlteilerwürfel befinden. Mit der Irisblendenoptik kann das Signal von Sensoren ausgeblendet werden, die sich außerhalb der Fokusebene befinden. Auf diese Weise wird die Messung von Sauerstoff-Verteilungen in einer dritten Dimension ermöglicht. Weiterhin ermöglicht die Verwendung einer Irisblendenoptik die Verringerung des detektierten Feldes zur Verringerung von Untergrundsignalen.
Ein Strahlteilerwürfel ermöglicht die Einkopplung von Referenzlicht auf die Detektoroberfläche. Weiterhin ermöglicht der Strahlteilerwürfel den Anschluss eines zweiten Detektors. Dann kann das Anregungslicht und dessen Phasenlage ständig gemessen werden. Das ist dann wichtig, wenn zur Anregung statt einer Leuchtdiode oder statt eines Diodenlasers ein Festkörperlaser verwendet wird, dessen Phasenlage im Betrieb driftet.
Bei einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist zusätzlich ein mit einem Kabel anschließbaren Thermofühler zur Messung der Temperatur in beobachteten Bereichen des Zellpellets vorgesehen. Die Abklingkurven von Phosphoreszenzsignalen sind temperaturabhängig. Diese Abhängigkeit ist in der Regel bekannt und kann aus Referenzkurven bestimmt werden. Statt der Messung der Temperatur kann diese aber auch auf einen konstanten Wert geregelt werden. Wenn Mikroskoparbeitstische oder (Bio-)Probenhalter eine eingebaute Temperaturkontrolle haben, kann diese softwaremäßig aufgezeichnet und verwendet werden. Es ist auch möglich die Temperaturanzeige dieser Geräte durch auslesen der Temperatur-Log-Dateien oder per Kabel über Schnittstellen dieser Geräte einzubinden.
Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche. Ein Ausführungsbeispiel ist nachstehend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung einer Anordnung zur Messung des Sauerstoffgehalts in einer Probe mittels Fluoreszenzmikroskop mit einem Photodetektor.
2 ist eine schematische Darstellung einer Anordnung zur Messung des Sauerstoffgehalts in einer Probe mittels Fluoreszenzmikroskop mit zwei Photodetektoren.
Beschreibung des Ausführungsbeispiels
1 zeigt eine allgemein mit 10 bezeichnete biologische Probe, beispielsweise eine Zellkultur in einer Petrischale. Die Zellkulturen sind mit phosphoreszierenden Sensorpartikeln versetzt. Die Sensorpartikel (Sonden) haben die Form von Mikrokügelchen mit einem Durchmesser im Bereich von 5 bis 100 Mikrometer. Es können aber auch kleiner Kügelchen bis hin zu Nanobeadsuspensionen verwendet werden. Die Sonden werden in die zu untersuchenden Proben eingebracht. Die Sonden bestehen aus einem bioverträglichen Kunststoff, der mit Sensorfarbstoff dotiert wurde.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel sind die Mikrokügelchen mit phosphoreszierenden Farbstoffen, beispielsweise Pt-tetrapentafluorophenylporphyrin gefärbt. Die Strukturformel dieses Farbstoffes ist in der DE 10 2010 037 923 A1 bereits offenbart und braucht hier nicht näher erläutert werden. Zellen umwachsen die Kügelchen. Auch Tris(4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolin) ruthenium (II) perchlorat ist ein geeigneter Farbstoff. Es versteht sich, dass weitere Farbstoffe geeignet sein können und die Auswahl von der Art der Verwendung, der Verfügbarkeit und dem Preis abhängt. Das Phosphoreszenzsignal einer einzigen 10 μm-Mikrokugel genügt, um den O₂-Gehalt in der Umgebung der Kugel zu bestimmen.
Die Probe 10 befindet sich in der Probenaufnahme eines Fluoreszenzmikroskops 12, das hier lediglich schematisch als gestrichelte Linie dargestellt ist. Typische Fluoreszenzmikroskope, die für diese Verwendung geeignet sind, sind bekannt unter den Bezeichnungen Zeiss Axiovert 40, Zeiss Axio Observer, Olympus IX71, Olympus IX81 und Nikon Eclipse Ti. Sie sind dem Fachmann bekannt und brauchen daher hier nicht weiter beschrieben werden.
Das Fluoreszenzmikroskop 12 weist ein Mikroskopobjektiv 14 auf. Vor dem Mikroskopobjektiv 14 ist ein Filterwürfel 16 angeordnet. Der Filterwürfel 16 weist einen Dichroit 18, einen Anregungsfilter 20 und einen Emissionsfilter 22 auf.
Die optischen Filter 18, 20 und 22 sitzen in einem Fluoreszenzfilterwürfel im Filterschieber oder Filterkarusell des Mikroskops 12. Fluoreszenzmikroskope sind darauf optimiert, sehr starkes Anregungslicht von sehr schwachem Fluoreszenzlicht möglichst gut abzutrennen. Die vorliegenden optischen O₂-Messungen haben die gleichen Anforderungen, die mit Fluoreszenzfilterwürfeln verwirklicht werden. Ein Beispiel für einen solchen Filterwürfel 16 ist allgemein bekannt und auf http://www.semrock.com/cubesholders.aspx beschrieben. Er braucht daher hier nicht weiter erläutert werden.
In einem Filterwürfel 16 sitzen drei Filter: Anregungsfilter 20, Dichroit 18 und Emissionsfilter 22. Der Anregungsfilter 20 ist durchlässig für die Anregungslichtwellenlänge – im vorliegenden Fall 530 nm –, blockt aber vollständig bei der Wellenlänge des zu detektierenden Signals. Der Dichroit 18 reflektiert die Anregungslichtquelle im 45°-Winkel und lenkt das Anregungslicht 46 damit in Richtung Probe 10. Für das längerwellige von der Probe emittierte Signallicht 52 ist der Dichroit 18 aber transparent. Der Emissionsfilter 22 ist transparent für das emittierte Signal, blockt aber vollständig bei der Wellenlänge das Anregungslichtes.
Am Mikroskop-Kameraanschluss 26 ist ein Detektortubus 24 angeschraubt oder anderweitig anmontiert. Der Detektortubus 24 weist eine Irisblende 28 und Sammellinsen 34 auf. Mit der Irisblende 28 erfolgt die Ausblendung des Signals von Sensorkügelchen, die sich oberhalb oder unterhalb der Fokusebene befinden. Das ermöglicht die Messung von 3D-O₂-Verteilungen.
Ein Photovervielfachermodul 30 ist vor einem Strahlteilerwürfel 32 angeordnet. In dem Strahlteilerwürfel 32 ist ein 45°-Kurzpassfilter angeordnet. Statt eines Kurzpassfilters kann auch ein Langpassfilter eingesetzt werden. Dann sitzt der Detektor 30 hinten und das Referenzlicht wird um 45° gespiegelt. Strahlung, die in den Strahlteilerwürfel 32 gelangt, wird so auf den Detektor 30 umgeleitet. Der Strahlteilerwürfel ermöglicht zusätzlich die Zuführung von Strahlung einer nachstehend beschriebenen Referenzlampe 42 auf den Detektor 30 zur Nullwertreferenzierung über einen Lichtwellenleiter 44.
Optional ermöglicht der Strahlteilerwürfel 32 auch den Anschluss eines zweiten Photodetektors 62. In diesem Fall kann das Anregungslicht und dessen Phasenlage ständig mitgemessen werden. Dies ist wichtig, wenn zur Anregung statt einer LED ein Festkörperlaser verwendet wird, dessen Phasenlage im Betrieb driftet. Dieses Ausführungsbeispiel ist in 2 dargestellt. Vor den Photodetektoren 62 und 30 sind geeignete optische Bandpassfilter für das emittierte Signal und das Anregungslicht angeordnet. Vor dem Photodetektor 62 für das Anregungslicht kann zusätzlich auch noch ein Neutraldichtefilter angeordnet werden, um das sehr starke Anregungslicht abzuschwächen. Dadurch wird eine Übersteuerung des Photodetektors 62 vermieden.
In einem separaten Lichtquellengehäuse 36 ist ein Kühlkörper 38 angeordnet. Auf beiden Seiten des Kühlkörpers 38 sind Hochleistungsleuchtdioden 40 und 42 mit einer Emission auf der Wellenlänge im Bereich von 530 nm als Lichtquellen aufgebracht.
Die Diode 40 dient als Probenlampe. Die Diode 42 dient als Referenzlampe. Die Strahlung der Diode 42 wird über einen Lichtleiter 44 (s. 1) in den Strahlteilerwürfel 32 eingekoppelt und auf den Detektor 30 geleitet. Das Lichtquellengehäuse 36 ist im Port des Fluoreszenzmikroskops 12 angeordnet, in dem normalerweise die Fluoreszenzlichtquelle sitzt. Auf das Lichtquellengehäuse 36 wird je nach Mikroskoptyp und -fabrikat die entsprechende Ringschwalbe (nicht dargestellt) aufgeschraubt, so dass sich die Lichtquelle mit wenigen Handgriffen im Fluoreszenzlampenport befestigen lässt. Optional sind im Zubehörhandel auch Lichtquellenumschalter erhältlich, so dass die bestehende Fluoreszenzlampe nicht abmontiert werden muss. Zur optimalen Ausrichtung des Lichtstrahles 46 befinden sich im Lichtquellengehäuse 36 noch Linsen und eine x-y-Verstellmöglichkeit, die hier der Einfachheit halber nicht dargestellt sind.
Die Strahlung der Diode 40 wird über den Filterwürfel 16, durch den Anregungsfilter 20 und das Mikroskopobjektiv 14 auf die Probe gerichtet. Dies ist schematisch als Strahlengang 46 und 48 dargestellt. Das Lichtquellengehäuse 36 ist vergleichsweise klein und über ein Versorgungskabel 60 mit einer nachstehend beschriebenen Hardwareeinheit 56 verbunden. Bei manchen Mikroskopen wird das Fluoreszenzanregungslicht von einer externen Lampe über einen Lichtwellenleiter zum Mikroskop geführt. Optional ist daher für diesen Fall auch eine Lichtquelle mit mikroskopspezifischem Lichtwellenleiteranschluss verfügbar (nicht dargestellt).
Strahlung, die von der Probe 10 abgestrahlt wird, wird durch den Filterwürfel 16 und den Emissionsfilter 22 zum Mikroskop-Kameraanschluss 26 geleitet. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird hier ein Umlenkspiegel 50 dargestellt. In realen Mikroskopen befinden sich im Inneren auf dem Weg zum Kameraport mehrere Umlenkspiegel und Linsen. Die emittierte Strahlung wird im Strahlteilerwürfel 32 zum Detektor 30 umgelenkt und detektiert. Dies ist schematisch als Strahlengang 52 und 54 dargestellt. Der Detektor 30 sitzt in einem Detektorgehäuse. Das Detektorgehäuse hat ein normiertes C-Mount-Gewinde. Damit wird der Detektor an einen Kameraport 26 des Mikroskops angeschlossen. Üblicherweise sind für alle Mikroskope Kameraports mit C-Mount-Gewinde verfügbar. Im Zubehörhandel sind auch Kameraportsplitter verfügbar, falls alle Kameraports belegt sind. Bei einem alternativen Ausführungsbeispiel wird der Detektor 30 mit einem Okular-Adapter angeschlossen. Ein Okular wird dazu herausgezogen und die Detektoreinheit in den freien Schacht eingesteckt.
Als Detektor wird im vorliegenden Ausführungsbeispiel ein Photovervielfachermodul des Typs H10723-20 von Hamamtsu eingesetzt. Es versteht sich, dass auch jeder andere Detektor geeignet ist, der eine ausreichende Empfindlichkeit und zeitliche Auflösung hat.
Die Steuerung der Anordnung, die Energieversorgung und die Signalauswertung erfolgt mittels Hardwareeinheit 56. Das Detektorgehäuse ist vergleichsweise klein und über zwei Kabel mit der Hardwareeinheit verbunden. Eines der Kabel ist im vorliegenden Ausführungsbeispiel ein 5-poliges Kabel für Spannungsversorgung und Steuerspannung. Das andere Kabel dient als Signalleitung für das detektierte Signal.
Die optoelektronische Hardwareeinheit 56 ist über eine USB-Schnittstelle mit einem handelsüblichen Personal Computer 58 verbunden. Der Computer 58 ist mit einer Software ausgestattet, welche die Bedienung der einzelnen Komponenten erlaubt. Die Software übernimmt die Steuerung der Komponenten, Datenverarbeitung, Messwertauswertung, graphische Darstellung, Speicherung von Daten usw.
In der Hardwareeinheit ist die gesamte Elektronik zur Komponentensteuerung, zur Signalerfassung und -auswertung untergebracht. Alle Funktionen werden via USB-Schnittstelle über den Computer 58 gesteuert.
Die Hardwareeinheit enthält folgende Komponenten:
Treiber für eine externe Lichtquelle mit hoher Durchlassspannung (LED oder Laser). Der Treiber produziert kaum Abwärme und macht einen Lüfter überflüssig, der erhebliche Temperaturgradienten und damit potentiell Phasendrift verursacht. Ferner ist ein Schalter zum Umschalten Signal- und Referenzlampe vorgesehen. Neben der Spannungsversorgung für Photovervielfachermodul ist auch die Steuerspannungsregelung auf der Platine vorgesehen. Die an der Photovervielfacherröhre anliegende Hochspannung wird über einen Steuerspannungseingang am Modul eingestellt.
Die Hardwareeinheit weist außen lösbare Anschlüsse für den Anschluss des Computers, der Leuchten und der Detektoren auf. Dabei ist insbesondere ein Anschluss für einen zweiten Photodetektor zur externen Referenzierung mit eigener Spannungsversorgung und eigener Steuerspannungsregelung vorgesehen.
In der Hardwareeinheit ist ein Signalgenerator zur Erzeugung von zwei überlagerten Sinussignalen mit zwei frei einstellbaren Frequenzen zwischen 0 und ca. 80 kHz vorgesehen. Weiterhin ist ein hochpräziser, digitaler Lock-In-Verstärker auf FPGA-Basis integriert, der selbst aus kleinen verrauschten Signalen noch die Phasenlage genau ermittelt. Bei guten Signalverhältnissen erfolgt die Ermittlung auf 0.01° genau, bei kleinen stark verrauschten Signalen immer noch besser als 0,1°. Der Lock-In-Verstärker misst die Phasenlagen bei zwei verschiedenen Frequenzen gleichzeitig. Dadurch ist es möglich, zwischen Phosphoreszenz im μs-Bereich und störender Untergrundfluoreszenz im ns-Bereich zu unterscheiden.
Zusätzlich zur externen Referenzierung verfügt die Hardwareeinheit über eine interne Referenzierung, die softwaremäßig auch auf externe Referenzierung umgeschaltet werden kann. Es hat sich herausgestellt, dass die Endstufe des Signalgenerators einer merklichen Phasendrift unterliegt. Schon Schwankungen der Raumtemperatur um wenige Grad verursachten merkliche Messfehler. Deswegen wird eine zusätzliche Referenzleitung vom Ausgang der Endstufe zum Lock-In-Verstärker-Modul gelegt. Es wird nun die Phasenlage des Signalgenerators immer mitgemessen. Temperaturänderungen spielen dann keine Rolle mehr. Damit wurde das Gerät de facto von einem 2-Kanal-Lock-In-Verstärker zu einem 4-Kanal-Lock-Verstärker ausgebaut. Zwei Kanäle sind für das Signal des Photodetektors bei den Modulationsfrequenzen A und B vorgesehen und zwei Referenzkanäle ebenfalls bei den Modulationsfrequenzen A und B. Statt des Generatorsignals kann auch das Signal eines weiteren Photodetektors, der das grüne Anregungslicht misst, zur Referenzierung verwendet werden. Dies ist in 2 dargestellt. Dazu wird eine Umschaltmöglichkeit der Referenzleitung auf einen externen Anschluss realisiert. Damit sollen nun auch Festkörperlaser, deren Phasenlage immer etwas hin- und -herdriftet, einsetzbar sein.
Die Anordnung umfasst ferner ein eingebautes Thermometer. Wahlweise kann ein Pt 100-Thermofühler oder ein Thermoelement angeschlossen werden.
Ein Sinusausgang ist für den Fall vorgesehen, dass ein externer Lasertreiber verwendet werden soll.
Die Anordnung arbeitet wie folgt:
Die Strahlung der Leuchtdiode 40 ist auf das Zellpellet 10 gerichtet. Die Steuerung der Leuchtdiode 40 erfolgt derart, dass das Licht mit zwei unterschiedlichen, bekannten Frequenzen von 63 kHz und 33 kHz moduliert werden kann. Die Größenordnung richtet sich nach der Abklingzeit des verwendeten Farbstoffs.
Der Farbstoff wird von dem eingestrahlten Licht zur Phosphoreszenz angeregt. Das Licht versetzt den Farbstoff der Mikrokügelchen aus dem Grundzustand in einen angeregten Singulett-Zustand. Aus dem angeregten Zustand gehen die Farbstoffpartikel zurück in den Grundzustand unter Emission von Strahlung. Die emittierte Strahlung wird in alle Richtungen ausgesendet. Ein Teil der Strahlung wird durch Fluoreszenz erzeugt. Ein Teil der Fluoreszenz entsteht zusätzlich an Nährmediuminhaltsstoffen, Zellinhaltsstoffen und oft auch am Probengefäß, z. B. an Kunststoffteilen oder an Klebestellen. Bei manchen Experimenten werden Zellen verwendet, die zuvor gezielt mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt wurden. Oder Zellen, die ihre eigenen Farbstoffe produzieren: GFP, YFP etc. Die Fluoreszenz-Strahlung klingt sehr schnell ab. Ein anderer Teil der Strahlung wird von Farbstoff-Atomen erzeugt, die über einen längeren Zeitraum phosphoreszieren. Hierzu erfolgt zunächst ein strahlungsloser Übergang in den angeregten Triplett-Zustand. Dieser hat eine längere Lebensdauer als der Singulett-Zustand. Entsprechend gelangen die Atome langsamer aus dem Triplett-Zustand unter Emission von phosphoreszierender Strahlung zurück in den Grundzustand. Nur die phosphoreszierende Strahlung wird ausgewertet.
Die emittierte Strahlung wird durch ein optisches Filter 22 von gestreutem Anregungslicht getrennt und mit einem Detektor 30 detektiert. Das Detektorsignal wird an die Signalauswertung geleitet.
Die Signalauswertung misst die Phasenverschiebungen bei beiden Modulationsfrequenzen. Anschließend wird eine Untergrundkorrektur durchgeführt, die Abklingzeit ermittelt und der Sauerstoffgehalt durch Vergleich mit gespeicherten Kalibrierkurven bestimmt. Im Falle eines monoexponentiellen Abklingverhaltens hängt die Phasenverschiebung Φ dabei mit der Abklingzeit zusammen nach τ = (tanΦ)/ω.
Bei gleichzeitiger Anwesenheit von Phosphoreszenz mit der Abklingzeit τ₁ und Untergrundfluoreszenz mit der Abklingzeit τ₂ ergibt sich durch Überlagerung ein Gesamtsignal mit einer Phasenverschiebung φ_App, die kleiner ist als die Phasenverschiebung φ des reinen Phosphoreszenzsignals. Misst man φ_App bei zwei verschiedenen Modulationsfrequenzen ω₁ und ω₂, so lässt sich der Anteil an Untergrundfluoreszenz bestimmen und damit die untergrundkorrigierte Phasenverschiebung φ nach der aus der DE 10 2010 037 923 A1 bekannten Formel ermitteln. Die Formel basiert auf der Tatsache, dass die Abklingzeit τ₂ des Untergrundsignals wesentlich kleiner ist, als die Abklingzeit τ₁ der Phosphoreszenz.,
Zu den sauerstoffabhängigen optischen Phasenverschiebungen kommen noch elektrische, z.B. von der Verstärkerstufe im Photodetektor, die erfasst und ausreferenziert werden müssen. Wenn Anregungslicht direkt auf den Detektor 30 trifft, dann ist die optische Phasenverschiebung definitionsgemäß Null. Man könnte nun zur Nullwertreferenzierung, z.B. mit optischen Umschaltern, das Licht der Signallampe 40 auf den Detektor 30 lenken. Hier wird eine einfachere Lösung realisiert: Da die Referenzlampe 42 bauartgleich zur Signallampe 40 ist und zudem auf dem gleichen Kühlkörper 38 sitzt, hat sie dieselbe Phasenlage wie die Signallampe 40. Die Nullreferenzierung kann also durch einfaches Umschalten auf die Referenzlampe 42 erfolgen.
Wenn im Spektralbereich der Sensorphosphoreszenz zusätzlich Untergrundfluoreszenz vorhanden ist, so addieren sich bei der Phasenmodulations-Technik beide Sinus-Signale. Aus der Untergrundfluoreszenz, bei der die Phasenlage näherungsweise 0° im Vergleich zum Anregungslicht ist, da die schnelle Fluoreszenz bei Modulationsfrequenzen im kHz-Bereich praktisch keine Phasenverschiebung erzeugt, und dem Sensorsignal bei dem die Phasenlage irgendwo im zweistelligen Gradbereich ist, entsteht durch Superposition ein Summensignal mit einer neuen Phasenlage, die kleiner ist als die des ursprünglichen Sensorsignals. Das führt gerade bei kleinen, signalschwachen Sonden zu erheblichen Messfehlern. Misst man aber die Phasenlagen des Summensignals bei zwei verschiedenen Modulations-Frequenzen gleichzeitig, so kann man unter der Voraussetzung, dass das Untergrundsignal eine Phasenlage von 0° hat, den Anteil an Untergrundsignal bestimmen und die Phasenverschiebung des reinen Sensorsignals ausrechnen. Diese Methode ermöglicht die Verwendung der kleinen Mikrokügelchen in biologischen Proben, da an Zellen und in Nährmedien fast immer Untergrundfluoreszenz entsteht. Die so ausgewerteten Signale liefern ein Maß für den Sauerstoffgehalt in unmittelbarer Umgebung der Zellen ohne dass diese bei ihrer Entwicklung beeinträchtigt werden.
Die beschrieben Anordnung kann verwendet werden für die Überwachung der O₂-Verhältnisse bei der Zellzucht, für die Beobachtung von metabolischen Prozessen und für die Messung von O₂-Gradienten in Zellgewebe.
Die Anordnung erlaubt die Messung in kleinsten Volumina. Durch Verwendung der hochwertigen Mikroskopoptik genügt das Signal einer einzigen Kugel mit 10 μm Durchmesser. Es kann ferner nichtinvasiv gemessen werden, d.h. es muss kein Messfühler in die Probe eingestochen werden. Eine Verletzung der Probe durch Einstechen und Verfälschung des Ergebnisses durch Eindringen von Sauerstoff in den Stichkanal mit zugehörigem Infektionsrisiko wird vermieden.
Mit der Anordnung kann an ansonsten unzugänglichen Stellen wie beispielsweise in Mikrokanälen gemessen werden. Mit mehreren Kugeln in der Probe können auch O₂-Gradienten und O₂-Verteilungen gemessen werden.
Die Anordnung kann an praktisch alle Fluoreszenzmikroskope angeschlossen werden. Der Anwender kann sein vorhandenes Equipment nutzen, mit dessen Bedienung er vertraut ist. Zusätzlich werden Kosten und Platz gespart.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 102010037923 A1 [0003, 0026, 0052]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

http://www.semrock.com/cubesholders.aspx [0029]

Claims

Anordnung zur Erzeugung eines den Sauerstoffgehalt in einem Zellpräparat repräsentierenden Wertes enthaltend (a) eine Lichtquelle zur Beleuchtung von Sauerstoffsonden in dem Zellpräparat; (b) einen Detektor zur Aufnahme eines von den Sauerstoffsonden emittierten Phosphoreszenzsignals; und (c) eine Steuer- und Signalauswerteelektronik; gekennzeichnet durch (d) ein Gehäuse mit einer Platine auf welcher die Steuer- und Signalauswerteelektronik angeordnet ist; (e) ein Verbindungselement zum Anschließen der Lichtquelle an einen vorhandenen Port oder Lichtleiteranschluss eines handelsüblichen Fluoreszenzmikroskops; und (f) ein Verbindungselement zum Anschließen des Detektors an einen vorhandenen Kameraport des Fluoreszenzmikroskops oder in Verbindung mit einem handelsüblichen Okular-Adapter im Schacht des Okulars des Fluoreszenzmikroskops.
Anordnung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine standardisierte Schnittstelle zur Verbindung der Steuer- und Signalauswerteelektronik mit Mitteln zur Datenverarbeitung.
Anordnung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle von einer Hochleistungsleuchtdiode gebildet ist.
Anordnung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle im langwelligen Bereich oberhalb von 500 nm emittiert.
Anordnung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verbindungselement zum Anschließen der Lichtquelle ein mit einer Kabelleitung an das Gehäuse mit der Steuerelektronik anschließbares, separates Gehäuse umfasst, in dem die Lichtquelle auf einem Kühlkörper angeordnet ist, und das separate Gehäuse mit der Lichtquelle in den Port des Fluoreszenzmikroskops einsetzbar ist.
Anordnung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine weitere Lichtquelle gleicher Bauart vorgesehen ist, deren Strahlung direkt zum Detektor geführt wird.
Anordnung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verbindungselement zum Anschließen des Detektors ein mit einem Kabel an das Gehäuse mit der Steuer- und Auswertelektronik anschließbares separates Gehäuse umfasst, in dem der Detektor angeordnet ist und das separate Gehäuse mit dem Detektor in den Kameraport des Fluoreszenzmikroskops oder in Verbindung mit einem handelsüblichen Okular-Adapter in den Schacht des Okulars des Fluoreszenzmikroskops einsetzbar ist.
Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Kabel zum Anschließen des Detektors Leitungen für die Spannungsversorgung, die Steuerspannung und das detektierte Signal umfasst.
Anordnung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor einen Photovervielfacher oder eine Photodiode umfasst.
Anordnung nach einem der vorgehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen zusätzlich mit einem Kabel anschließbaren Thermofühler zur Messung der Temperatur in beobachteten Bereichen des Zellpräparats.