WO2009124700A1 - Vorrichtung für mikroskopie mit selektiver beleuchtung einer ebene - Google Patents

Vorrichtung für mikroskopie mit selektiver beleuchtung einer ebene Download PDF

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radiation
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Helmut Lippert
Christopher Power
Christian Dietrich
Benno Radt
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Carl Zeiss Microimaging Gmbh
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    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/10—Condensers affording dark-field illumination

Definitions

  • the present invention relates to a microscopy apparatus, in particular a microscopy apparatus for imaging fluorescence light.
  • FLIM Fluorescence Lifetime Inspecting Microscopy, Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy.
  • the fluorescence lifetime of a fluorophore which can be deliberately introduced into an examination subject or is a natural component of the examination object, depends strongly on the molecular environment of the fluorophore and can therefore be used to represent the environmental parameters of a fluorophore in the context of an imaging process.
  • These environmental parameters may be, for example, the fluorophore concentration, the pH, the temperature or the viscosity.
  • the detection of fluorescent light can be used in the analysis of energy transfer processes, e.g. via a FRET mechanism (fluorescence resonance energy transfer), which, for example, allows statements about the binding or folding properties of proteins.
  • a first type of procedure works in the frequency domain.
  • an excitation light source is used, which is modulated in time with a frequency in the kilohertz range to gigahertz range.
  • the fluorescent light emitted by the examination object in response to the excitation light is detected in a phase-sensitive manner, so that, for example, an average fluorescence lifetime can be derived from the phase shift of the detected fluorescent light.
  • a second type of procedure works in the time domain. In this case, a pulsed laser with pulse durations in the femtosecond to picosecond range is used to generate the excitation light, and the fluorescence Resence decay curve recorded at each pixel. In this case, for example, a time-correlated photon count can be used.
  • Microscopy devices that are suitable for frequency domain imaging fluorescence lifetime microscopy techniques are known for both scanning microscopy methods, i. with a single channel detector, as well as for wide field microscopy methods, i. in conjunction with cameras.
  • rastering methods generally have a problem in that they are relatively time consuming, with typical image acquisition times being in the second range.
  • the wide-field methods typically use time-window-controlled image intensifiers, so-called “gated image intensifiers", in which a multi-channel plate (MCP, multichannel plate, multi-channel plate) is arranged in front of a CCD camera (CCD: Charge Coupled Device)
  • MCP multi-channel plate
  • CCD Charge Coupled Device
  • time resolutions in the range of 100 ps can be achieved, which is sufficient for many applications.
  • at least three image recordings are required to determine the phase shift. With multi-exponential decay processes, the number of required image acquisitions continues to increase.
  • microscopy devices for fluorescence lifetime imaging microscopy methods that work in the time domain are based on the combination of confocal or multi-photon laser scanning microscopes with single photon counting, and in this case can also provide the ability to produce optical sections.
  • the time of arrival of individual fluorescence photons relative to a pulse of the excitation light is measured by a high-speed TDC (TDC: Time to Digital Converter) electronics.
  • TDC Time to Digital Converter
  • microscopy devices for fluorescence imaging endurance microscopy Such a microscopy device is described, for example, in "High-speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permission study of cellular signaling events" by Grant et al., in which Optics Express Vol. 15, No 24, 15656 (2007) inspired objects are excited both focal and extra-focal, although only focal excitation is actually used, so there is a problem with excessive bleaching of the fluorophores.
  • SPIM SPIM-selective plane illumination microscopy, microscopy with selective illumination of one plane
  • This technique is described, for example, in “Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy", H.K. Stelzer et al., Science VOL 305, 1007 (2004), in “Resolution Enhancement in a Light-Sheet-Based Microscope”. SPIM) ", HK Stelzer et al., Optics Letters Vol. 31, no. 10, 1477 (2006), in DE 10 257 423 A1 and in WO 2004/053558 A1.
  • the SPIM technique allows the three-dimensional recording of objects in the form of optical sections, but in the context of a wide-field technique.
  • the fluorophores in the examination subject are excited with laser light in the form of a light sheet.
  • the use of the SPIM technique in fluorescence imaging lifetime measurements is described in "4D Fluorescence Lifetime Imaging using Selective Plane Illumination Microscopy", K. Greger et al., Abstract Book, Focus on Microscopy (Jena, 2005), p 225.
  • the light source is a CW (continuous wave) laser in the form of an ar-ion laser whose output radiation is modulated by a downstream acousto-optical modulator
  • the object of the present invention is then to provide an improved microscopy device for imaging examinations on biological or non-biological examination objects, in particular on the basis of fluorescent light, in which optical sections can be produced by using the SPIM technique with low image acquisition time and low sample loading - -
  • the microscopy device comprises illumination means for generating illumination radiation, an imaging detector for spatially resolved detection of emission radiation emitted by an examination subject, an illumination beam path between the illumination means and the examination subject and a detection beam path between the examination subject and the detector.
  • the illumination beam path comprises an illumination optical unit which is designed to generate a light sheet of the illumination radiation which extends transversely to the axis of the illumination beam path, wherein the axis of the detection beam path is at an angle deviating from 0 °, in particular substantially perpendicular to a sectional plane of the light blade and Object of investigation.
  • the structure of the microscopy device thus essentially corresponds to the SPIM technique and thus enables the acquisition of optical sections of the examination subject with a high speed and a small fading of the sample.
  • the illumination beam path and the detection beam path are completely separated from one another.
  • the illumination means according to the invention comprise a pulsed laser.
  • the illumination radiation over a wide range of wavelengths can be provided and it is a high efficiency of excitation example of fluorescence in the examination subject by the illumination radiation allows.
  • the pulse duration provided by the pulsed laser is preferably less than 1 ns, in particular less than 100 ps.
  • a laser can be used which generates over a wavelength range of 400 nm to 750 nm light pulses with a length of 10 to 40 ps at a repetition rate in the range of 20 to 50 MHz.
  • the use of a laser with pulse lengths in the femtosecond range is also possible.
  • the detector is designed for time-resolved detection of photons of the emission radiation.
  • the spatially resolved detector can be used as a time-window-based image intensifier (ie as a so-called time gated Suitable spatially and temporally resolved single photon counters are described in "A space-and time-resolved single-photon counting detector for fluorescence microscopy and spectroscopy", X. Michalet et al., Proc , of SPIE Vol. 6092, 60920M (2006) and in "Position and time-sensitive single photon detector with delay-line readout", A. Czasch et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A 580 (2007), 1066 -1070.
  • the microscopy device can be used for imaging fluorescence lifetime microscopy methods, especially in the time domain, for example, the detector can provide a fluorescence decay curve as a result of the measurement for each pixel.
  • the time resolution makes it possible to discriminate between different signal components of the emission radiation emitted by the examination object, in particular between autofluorescence radiation of materials naturally contained in the examination subject and fluorescence radiation from fluorescent dyes deliberately introduced into the examination subject, and between fluorescence radiation and reflected or scattered illumination radiation.
  • the different signal components thus discriminated may be used to suppress certain signal components, e.g. Autofluorescence, or used for parallel imaging evaluation of the various signal components. In any case, extremely efficient image acquisition and evaluation is guaranteed.
  • the detector typically comprises a plurality of detector elements, which may be arranged in the form of a regular grid or a matrix, or else in the form of a substantially line-like arrangement in order to realize a line detector.
  • Each of the detector elements is configured to output a time signal dependent on a detection time of at least one photon relative to a pulse of the illumination radiation and / or to control the detection of photons as a function of a time signal generated relative to the pulse of the illumination radiation.
  • time information is thus available via the time signal, which essentially corresponds to the time difference between a pulse of the illumination radiation and the time of detection of a photon of the emission radiation.
  • Fig. 1 shows schematically a microscopy device according to an embodiment of the invention.
  • Fig. 2 shows schematically a microscopy device according to a weathered embodiment of the invention.
  • Fig. 3 illustrates a sequence of pulses of illumination radiation in a microscopy device according to an embodiment of the invention.
  • FIG. 4 shows an exemplary fluorescence decay curve that can be detected by a microscopy device according to an embodiment of the invention.
  • FIG. 5 illustrates the use of a time window for discriminating signal components of emission radiation in a microscopy apparatus according to an embodiment of the invention.
  • Fig. 1 shows schematically a microscopy device according to an embodiment of the invention.
  • the microscopy device is designed for use in the time-domain imaging fluorescence lifetime microscopy method, wherein the generation of optical slices is provided according to the SPIM technique.
  • the microscopy apparatus comprises illumination means comprising a broadband laser 1, an acousto-optic tunable external wavelength selection filter 3, and a broadband optical fiber 4.
  • the laser 1 may generate pulses of illumination radiation of 20 ps in length over a wavelength range of 450 to 700 nm , The repetition rate of the pulses is for example 40 MHz.
  • the output radiation of the laser 1 can be a white-light continuous from which the wavelengths used in the illumination radiation are then externally filtered out, for example by the acousto-optically adjustable filter 3, or the laser 1 can itself be a suitable means for wavelength selection such as an internal acousto-optic tunable filter or a frequency conversion unit.
  • the laser 1 may be a fiber-based supercontinuum laser. In the event that the laser 1 itself includes means for wavelength selection, optionally tunable to the acousto-optic Filter 3 are dispensed with.
  • a suitable laser is available, for example, from the company Fiumium Ltd. commercially available.
  • the microscopy device further comprises an illumination beam path 2, in which the illumination radiation generated by the laser 1 is coupled in via the optical fiber 4.
  • an illumination beam path 2 Arranged in the illumination beam path 2 are a cylinder optics 5 and imaging optics 6, which effect a shaping of the illumination radiation into a light sheet 7.
  • the light sheet 7 is directed onto an examination subject 8 and intersects this in a focal plane of the illumination beam path 2.
  • the examination subject may in particular be a biological sample which is embedded, for example, in a transparent gel.
  • the microscopy device further comprises a detection beam path 10, in which a detection objective 9 is arranged, via which emission radiation emitted by the examination subject 8 is recorded.
  • the axis of the detection beam path 10 is substantially perpendicular to the axis of the illumination beam path 2 and in particular substantially perpendicular to the section plane of the light sheet 7 with the examination object 8.
  • the Unters ⁇ ch ⁇ ngs- object 8 is therefore illuminated only in one plane.
  • the detection objective 9 is used for focusing in a focal plane of the detection beam path 10.
  • the illumination beam path 2 and the detection beam path are completely separated from each other and meet only in the respective focal plane. Arrangements are also conceivable with an angle between the detection beam path and the illumination beam path which lies between 0 ° and 90 °. It is crucial that the illumination beam path 2 and the detection beam path are not aligned in parallel.
  • the microscopy device further comprises a device (not shown) for positioning the examination subject 8 relative to the light sheet 7, so that different optical sections of the examination subject 8 are recorded by a relative movement of the examination subject 8 along the axis of the detection beam path 10 and / or relative to the illumination beam path 2 which can serve as a basis for three-dimensional image data sets.
  • the re-motive movement may also include a rotation of the examination object 8. - -
  • the detection beam path 10 further comprises a tube lens 12, via which the emission radiation detected by the detection objective 9 is fed to a detector 14.
  • a color splitter 1 1 may be provided, which, for example, the connection of Auflicht- fluorescence excitation units, e.g. a confocal laser scanning microscope or an epi-fluorescence microscope.
  • an emission filter 13 can be provided in the detection beam path 10, which blocks illumination radiation reflected or scattered via the examination subject 8 into the detection beam path 10.
  • the emission filter 13 is not required for all operations of the microscopy device and is therefore preferably removable. In some operations, the detection of reflected or scattered illumination radiation across the detector 14 may even be desirable.
  • all the excitation lines available in the bandwidth of the illumination radiation provided by the laser 1 can be used for fluorescence excitation or for other illumination of the examination object 8. This makes it possible, in particular, to cover the entire range of fluorescent dyes and even to excite them in an optimized manner if, for example, the wavelength of the absorption maximum of a fluorescent dye is selected for the excitation. Furthermore, it is possible to excite the examination object 8 with a broad spectral band of the illumination radiation in order to provide, for example, an increased power for the excitation. It is also possible to use structured spectral bands of the illumination radiation for excitation. The latter may be advantageous in some fluorescent dyes, e.g. targeted bleaching channels are to be suppressed.
  • the microscope device further comprises the detector 14 as well as Awawerts- and control electronics 15.
  • the detector 14 is able to spatially and temporally resolve the impact of photons emitted by the examination object 8 emission radiation.
  • the detector 14 may comprise a time window-based image intensifier, as described, for example, by Kentech Ltd. is commercially available.
  • the evaluation and control electronics 15 is connected via signal lines 17 and 18 to the detector 14.
  • the evaluation and control unit 15 is connected via a signal line 16 to the laser 1.
  • the laser 1 transmits a trigger signal via the signal line 16 to the evaluation and control electronics 15.
  • the trigger signal comprises trigger pulses which essentially coincide with the detected signal. have pulses of illumination radiation or have a known time offset to these.
  • the evaluation and control electronics 15 generates based on this trigger signal time window control signals which are transmitted via the signal line 17 to the detector 14.
  • the detector 14 in turn transmits information about the detection of a photon via the signal line 18 as well as information about where that photon was detected.
  • the detector 14 may also comprise a spatially and temporally resolved single photon counter as described, for example, in "A space and time resolved single-photon counting detector for fluorescence microscopy and spectroscopy", X. Michalet et al., Proc of SPIE Vol. 6092, 609220M (2006) or in “Position and time-sensitive single photon detector with delay-line readout", A. Czasch et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A 580 (2007), from 1066 to 1070.
  • the detector 14 thus comprises, for example, a multi-alkali photocathode, an MCP (Micro Channel Plate) stack and a crossed retardation wire anode.
  • Photons that hit the cathode are amplified by the MCP stack in their effect and generate on the anode a signal pulse, from whose runtime to the detection electronics statements about the photon contact point can be derived.
  • a segmented anode can also be used.
  • the signal line 17 essentially serves to initialize the detector 14.
  • the following information is preferably transmitted via the signal line 18: the arrival time of a photon of the emission radiation relative to the initialization signal, a delayed signal for a first spatial direction, e.g. an x-position, and a delayed signal for a second spatial direction, e.g. a y position. From this three information, the location and time of capture of the photon can be determined.
  • the detector 14 essentially uses a photon counting method, the detector 14 preferably also comprises a discriminator for suppressing electronic noise components. In this way, readout noise can be avoided.
  • spatial resolution of at least 150x 150 pixels such as 1000x 1000 pixels, and temporal resolutions of about 100 ps can be achieved.
  • the microscopy device further comprises an analysis computer 20, which is connected via a signal line 19 to the evaluation and control electronics 15. Via the signal line 19, the analysis computer 20 is supplied with measurement results determined by the evaluation and control electronics 15.
  • the analysis computer 20 for example, temporal fluorescence decay curves can be visually displayed and stored, or two-dimensional or three-dimensional image data acquired with the microscopy device can be represented, stored and further processed.
  • the evaluation and control electronics 15 and the analysis controller 20 can be implemented in a single microprocessor-based system, which can also simultaneously serve to control the essential functions of the microscopy device, e.g. via a graphical user interface.
  • Fig. 2 shows a microscopy device according to another embodiment of the invention.
  • the microscopy apparatus of Fig. 2 is substantially similar to that of Fig. 1, and similar components have been identified by the same reference numerals. The explanation of these components is omitted here. Rather, reference is made in this regard to the corresponding statements in connection with FIG. 1.
  • FIG. 1 Hereinafter, only the essential differences of the microscopy device of Fig. 2 to that of Fig. 1 should be explained.
  • the light sheet 7 has been shaped by a cylinder optics
  • the microscopy device comprises a first raster unit 21, which performs a corresponding deflection of the light beam coupled by the laser 1 via the optical fiber 4 into the illumination beam path 2.
  • the cylinder optics shown in Fig. 1 5 is replaced by another element of AbbiU training optics 6.
  • a second raster unit 22 is inserted, which is synchronized with the first raster unit 21 in such a way that the row illuminated in the focal plane for the respective recording time is imaged onto a line-like arrangement of detector elements of a detector 24.
  • the synchro nization takes place by means of a synchronization signal, which is transmitted via a signal line 23 between the raster units 21, 22 or to the raster units 21, 22.
  • the detector 24 is therefore not designed as a planar detector, but as a line detector. Consequently, the detector 24 only supplies a one-dimensional position signal, wherein a further position signal is available via the control of the first and second raster unit 21, 22.
  • the properties of the detector 24 correspond to those of the detector 14 of FIG. 1. Consequently, the same spatial and temporal information for evaluation in the evaluation and control electronics 15 is consequently available overall. Due to a simplified technical structure of a line detector over a flat detector but higher spatial and temporal resolutions can be achieved. Furthermore, saturation effects and pile-up effects can be reduced.
  • the illumination radiation comprises sharply defined pulses, in the illustrated example the pulse length being approximately 20 ps.
  • the distance between two pulses is again 25 ns, which corresponds to a repetition rate of 40 MHz.
  • the illumination means for generating the pulsed illumination radiation comprise a suitably designed laser.
  • the laser may be a supercontinuum laser covering a wavelength range of at least 450-700 nm.
  • FIG. 4 shows an example of the course of a fluorescence decay curve, as can be obtained as a result of the time-resolved evaluation of the emission radiation by means of the detector 14, 24 and the evaluation and control electronics 15 of the microscopy devices of FIGS. 1 and 2.
  • the signal strength of the fluorescence radiation is designated F in FIG. 4.
  • the time axis is denoted by t.
  • the detectors 14, 24 provide for each of their detector elements, i. for each pixel, a decay curve of the type shown in FIG.
  • the fluorescence decay curve can be detected substantially over the entire time period between two successive pulses of the illumination radiation.
  • the fluorescence decay curve is detected by taking multiple measurements with different time slots set. From the position of the time window arises then the position of a point of the decay curve along the time axis.
  • the time information can be obtained directly from the output of the detector 14, 24.
  • the value F for a particular point on the time axis results from the number of photons counted for the area of this time, ie by a histogram-like evaluation of the detected photons.
  • a fluorescence decay curve of the type shown in Fig. 4 can be used in contrast imaging imaging according to a fluorescence lifetime microscopy method. For example, two different fluorescent dyes can be distinguished from one another, which can be converted into contrast information. If the fluorescence decay curve is recorded in detail, the fluorescence lifetime can also be calculated.
  • FIG. 5 exemplifies a situation in which the detected fluorescence decay curve is composed of a plurality of signal components.
  • the signal strength of the fluorescence radiation is indicated by F.
  • the time axis is denoted by t.
  • the laser pulse is shown by a dashed line.
  • a solid line illustrates the total signal, which is composed of the first signal component and the second signal component.
  • a time window used for the detection is shown in Fig. 5 by the hatched area G.
  • the first signal component of the fluorescence of a deliberately introduced into the examination subject fluorescent dye correspond, while the second signal component corresponds to an autofluorescence of naturally contained in the examination subject material.
  • autofluorescence-based signal component leads to a strong contrast reduction.
  • the time window G is set such that, within the time window G, the course of the total decay curve essentially corresponds to that of the first signal component, since at the beginning of the time window the decay process of the first signal component has already been substantially completed.
  • This is achieved by setting the start time of the time window G relative to the pulse of the illumination radiation such that it is substantially greater than the lifetime ⁇ of the signal component to be suppressed.
  • a second time window could be set, which covers the period before the start of the time window G.
  • the suppression of autofluorescence radiation is particularly advantageous in connection with resolution-increasing methods, such as e.g. Betzig et al., Science, 313, 1542 (2006).
  • the focus of intensity distribution on a single-molecule, spatially resolved detector is determined from multiple single-molecule excitations, yielding resolutions can be effectively suppressed as described above in the microscopy devices of Fig. 1 and Fig. 2, these enable such a resolution-increasing method also in the imaging examination of optical see cuts with the
  • the excitation volume limiting methods such as fluorescence microscopy with total internal reflection or TIRF microscopy (TIRF: Total Interal Reflection Fluorescence), can be dispensed with.
  • the time-resolved detection of the emission radiation is suitable for separating signal components of the illumination radiation, in particular reflected illumination radiation, from the other signal components.
  • This can in turn be used to suppress the signal component of reflected illumination radiation in the detected emission radiation without the emission filter 13 being required for this purpose, or in parallel to carry out a separate imaging evaluation based on the reflected illumination radiation.
  • the emission filter 13 is preferably removed from the detection beam path.
  • the illumination means may also comprise a plurality of lasers, the output radiation of which is jointly coupled into the illumination beam path.

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Abstract

Eine Mikroskopievorrichtung, insbesondere zur Verwendung bei einem bildgebenden Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren, umfasst Beleuchtungsmittel (1, 3, 4) zur Erzeugung einer Beleuchtungsstrahlung, einen bildgebenden Detektor (14; 24) zur ortsaufgelösten Erfassung einer von einem Untersuchungsobjekt (8) abgegebenen Emissionsstrahlung, einen Beleuchtungsstrahlengang (2) zwischen den Beleuchtungsmitteln (1, 3, 4) und dem Untersuchungsobjekt (8) und einen Detektionsstrahlengang (10) zwischen dem Untersuchungsobjekt (8) und dem Detektor (14; 24). Der Beleuchtungsstrahlengang (2) umfasst eine Beleuchtungsoptik (5, 6), welche zur Erzeugung eines Lichtblattes (7) der Beleuchtungsstrahlung ausgestaltet ist, welches sich quer zu der Achse des Beleuchtungsstrahlengangs (2) erstreckt, wobei die Achse des Detektionsstrahlengangs (10) im Wesentlichen senkrecht zu einer Schnittebene des Lichtblattes (7) und des Untersuchungsobjekts (8) ausgerichtet ist. Die Beleuchtungsmittel (1, 3, 4) umfassen einen gepulsten Laser (1).

Description

VORRICHTUNG FÜR MIKROSKOPIE MIT SELEKTIVER BELEUCHTUNG EINER EBENE
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Mikroskopievorrichtung, insbesondere eine Mikroskopievorrichtung zur bildgebenden Erfassung von Fluoreszenzlicht.
Im Bereich der Mikroskopie ist es bekannt, Fluoreszenzlicht bei der Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Abbildungen eines Untersuchungsobjekts, z.B. einer biologischen Probe, einzusetzen. Insbesondere kann dabei die Fluoreszenzintensität erfasst werden. Darüber hinaus ist es möglich, die individuelle Fluoreszenzlebensdauer von Fluorophoren zur Erzeugung von Kontrasten einzusetzen. Die letztgenannte Vorgehensweise wird mit FLIM bezeichnet (FLIM: Fluorescence Lifetime I- maging Microscopy, Bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopie). Die Fluoreszenzlebensdauer eines Fluorophors, welcher gezielt in ein Untersuchungsobjekt eingebracht werden kann oder natürlicher Bestandteil des Untersuchungsobjekts ist, hängt stark ab von der molekularen Umgebung des Fluorophors und kann daher herangezogen werden, um die Umgebungsparameter eines Fluorophors im Rahmen eines bildgebenden Verfahrens darzustellen. Bei diesen Umgebungsparametern kann es sich beispielsweise um die Fluorophorkonzentration, den pH-Wert, die Temperatur oder die Viskosität handeln. Weiterhin kann die Erfassung von Fluoreszenzlicht eingesetzt werden bei der Analyse von Energietransferprozessen, z.B. über einen FRET-Mechanismus (FRET: Fluorescent Resonance Energy Transfer, Fluores- zenz-Resonanz-Energie-Transfer), wodurch beispielsweise Aussagen über Bin- dungs- oder Faltungseigenschaften von Proteinen möglich sind.
Für bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren sind grundsätzlich zwei verschiedene Verfahren bekannt. Ein erster Verfahrenstyp arbeitet in der Fre- quenzdomäne. Es wird in diesem Fall eine Anregungslichtquelle eingesetzt, welche mit einer Frequenz im Kilohertzbereich bis Gigahertzbereich zeitlich moduliert ist. Das von dem Untersuchungsobjekt in Reaktion auf das Anregungslicht abgegebene Fluoreszenzlicht wird phasensensitiv erfasst, so dass z.B. aus der Phasenverschiebung des erfassten Fluoreszenzlichts eine mittlere Fluoreszenzlebensdauer abgelei- tet werden kann. Ein zweiter Verfahrenstyp arbeitet in der Zeitdomäne. In diesem Fall wird zur Erzeugung des Anregungslichts ein gepulster Laser mit Pulsdauern im Femtosekundenbereich bis Pikosekundenbereich eingesetzt, und es wird die Fluo- reszenzabklingkurve an jedem Bildpunkt erfasst. Hierbei kann beispielsweise eine zeitkorrelierte Photonenzählung zum Einsatz kommen.
Mikroskopievorrichtungen, welche geeignet sind für in der Frequenzdomäne arbei- tende bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren, sind bekannt sowohl für Raster- bzw. Scanning-Mikroskopieverfahren, d.h. mit einem einkanaligen Detektor, als auch für Weitfeldmikroskopieverfahren, d.h. in Verbindung mit Kameras. Bei den Rasterverfahren besteht jedoch allgemein ein Problem dahingehend, dass sie relativ zeitaufwändig sind, wobei typische Bildaufnahmezeiten im Sekun- denbereich liegen. Bei den Weitfeldverfahren kommen typischerweise zeitfensterge- steuerte Bildverstärker zu Einsatz, so genannte „Gated-Image lntensifiers", bei welchen vor einer CCD-Kamera (CCD: Charge Coupled Device) eine Multikanalplatte (MCP, Multichannel Plate, Multikanalplatte), angeordnet ist, deren Spannung moduliert werden kann . Auf dies Weise können Zeitauflösungen im Bereich von 100 ps erreicht werden, was für viele Anwendungen ausreichend ist. Typischerweise sind mindestens drei Bildaufnahmen erforderlich, um die Phasenverschiebung zu ermitteln. Bei multiexponentiellen Abklingvorgängen erhöht sich die Anzahl von erforderlichen Bildaufnahmen weiter. Hierdurch ergeben sich Probleme hinsichtlich des Zeitaufwands für die Messungen. Weiterhin können Probleme hinsichtlich möglicher Bleichprozesse in den Fluorophoren auftreten. Auch besteht bei den bekannten Verfahren, welche in der Frequenzdomäne arbeiten, ein Problem dahingehend, dass eine effiziente Diskriminierung des Anregungslichts oder Autofluoreszenzlichts des Untersuchungsobjekts bezüglich der interessierenden Fluoreszenzstrahlung nicht möglich ist. Signalanteile von Anregungslicht oder Autofluoreszenzlicht in der erfass- ten Emissionsstrahlung führen typischerweise zu einer Verfälschung der ermittelten mittleren Fluoreszenzlebensdauer und sollten daher möglichst vermieden werden.
Mikroskopievorrichtungen für bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren, die in der Zeitdomäne arbeiten, basieren beispielsweise auf der Kombination von konfokalen oder Mehrphotonen-Laser-Rastermikroskopen mit einer Einzelphotonenzählung und können in diesem Fall auch die Möglichkeit zur Erzeugung optischer Schnitte bieten. Dabei wird durch eine schnelle TDC-Elektronik (TDC: Time to Digital Converter, Zeit-Digital-Wandler) die Ankunftszeit einzelner Fluoreszenzphotonen relativ zu einem Puls des Anregungslichts gemessen. Hierbei kommen Lichtquellen mit Pulsdauern im Femtosekundenbereich bis Pikosekundenbereich zum Einsatz. Die erreichbaren Zeitauflösungen liegen im Bereich weniger Pikosekunden. Weiterhin sind Mikroskopievorrichtungen für bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopie- ver-fahren in der Zeitdomane bekannt, welche eine Weitfelddetektion einsetzen und die Möglichkeit zur Erzeugung optischer Schnitte bieten Eine solche Mikroskopievor- πchtung ist beispielsweise beschrieben in „High speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits study of hfe cell signaling events" D M Grant et al , Optics Express Vol. 15, No 24, 15656 (2007) Die Untersuchungsobjekte werden hier sowohl fokal als auch außerfokal angeregt, obwohl nur die fokale Anregung tatsächlich genutzt wird, so dass ein Problem bezüglich übermäßiger Bleichung der Fluorophore besteht.
Weiterhin ist im Zusammenhang mit Fluoreszenzmikroskopieverfahren die Verwendung der sogenannten SPIM-Technik (SPIM- Selective Plane Illumination Microsco- py, Mikroskopie mit selektiver Beleuchtung einer Ebene) bekannt. Diese Technik ist beispielsweise beschrieben in „Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy", H. K Stelzer et al., Science VOL 305, 1007 (2004), in „Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM)", H. K. Stelzer et al., Optics Letters Vol. 31 , No. 10, 1477 (2006), in der DE 10 257 423 A1 und in der WO 2004/053558 A1.
Ähnlich wie die konfokale Laser-Rastermikroskopie erlaubt die SPIM-Technik die dreidimensionale Aufnahme von Objekten in Form optischer Schnitte, allerdings im Rahmen einer Weitfeldtechnik. Im Unterschied zu der Fluoreszenzmikroskopie im Auf- oder Durchlichtverfahren werden die Fluorophore hier im Untersuchungsobjekt mit Laserltcht in Form eines Lichtblattes angeregt. Der Einsatz der SPIM-Technik bei bildgebenden Fluoreszenzlebensdauermessungen ist beschrieben in „4D Fluores- cence Lifetime Imaging using Selective Plane Illumination Microscopy", K. Greger et al., Abstract Book, Focus on Microscopy (Jena, 2005), S 225. In diesem Fall kommt als Lichtquelle ein CW-Laser (CW. Continuous Wave) in Form eines Ar-lonen-Lasers zum Einsatz, dessen Ausgangsstrahlung durch einen nachgeschalteten akusto- optischen Modulator moduliert wird
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht dann, eine verbesserte Mikroskopievorrichtung bereitzustellen für bildgebende Untersuchungen an biologischen oder nicht biologischen Untersuchungsobjekten, insbesondere auf Basis von Fluoreszenzlicht, bei welcher durch Verwendung der SPIM-Technik mit geringer Bildaufnahme- zeit und geringer Probenbelastung optische Schnitte erzeugt werden können - -
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Mikroskopievorrichtung gemäß Anspruch 1. Die abhängigen Patentansprüche definieren bevorzugte und vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung.
Die erfindungsgemäße Mikroskopievorrichtung umfasst Beleuchtungsmittel zur Erzeugung einer Beleuchtungsstrahlung, einen bildgebenden Detektor zur ortsaufgelösten Erfassung einer von einem Untersuchungsobjekt abgegebenen Emissionsstrahlung, einen Beleuchtungsstrahlengang zwischen den Beleuchtungsmitteln und dem Untersuchungsobjekt und einen Detektionsstrahlengang zwischen dem Unter- suchungsobjekt und dem Detektor. Der Beleuchtungsstrahlengang umfasst eine Beleuchtungsoptik, welche zur Erzeugung eines Lichtblattes der Beleuchtungsstrahlung ausgestaltet ist, welches sich quer zu der Achse des Beleuchtungsstrahlengangs erstreckt, wobei die Achse des Detektionsstrahlengangs in einem von 0° abweichenden Winkel, insbesondere im Wesentlichen senkrecht zu einer Schnittebene des Lichtblattes und des Untersuchungsobjekts ausgerichtet ist. Der Aufbau der Mikroskopievorrichtung entspricht somit im Wesentlichen der SPIM-Technik und ermöglicht somit die Aufnahme von optischen Schnitten des Untersuchungsobjekts mit einer hohen Geschwindigkeit und einem geringen Ausbleichen der Probe. Der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang sind vollständig voneinan- der getrennt.
Die Beleuchtungsmittel umfassen erfindungsgemäß einen gepulsten Laser. Auf diese Weise kann die Beleuchtungsstrahlung über eine große Bandbreite von Wellenlängen bereitgestellt werden und es wird eine hohe Effizienz der Anregung beispiels- weise von Fluoreszenz in dem Untersuchungsobjekt durch die Beleuchtungsstrahlung ermöglicht. In diesem Zusammenhang ist es besonders vorteilhaft, wenn mit der Beleuchtungsstrahlung eine Bandbreite von wenigstens 200 nm abgedeckt werden kann. Die von dem gepulsten Laser bereitgestellte Pulsdauer beträgt vorzugsweise weniger als 1 ns, insbesondere weniger als 100 ps. Insbesondere kann ein Laser verwendet werden, welcher über einen Wellenlängenbereich von 400 nm bis 750 nm Lichtpulse mit einer Länge von 10 bis 40 ps mit einer Wiederholrate im Bereich von 20 bis 50 MHz erzeugt. Auch der Einsatz eines Lasers mit Pulslängen im Femtose- kundenbereich ist möglich.
Gemäß einer Ausführungsform ist der Detektor zur zeitaufgelösten Erfassung von Photonen der Emissionsstrahlung ausgestaltet. Insbesondere kann der ortsaufgelöste Detektor als zeitfensterbasierter Bildverstärker (d.h. als so genannter „Time-Gated Image Intensifier") oder als zeitaufgelöster Einzelphotonenzähler ausgestaltet sein. Geeignete orts- und zeitaufgelöste Einzelphotonenzähler sind beschrieben in „A space- and time-resolved single-photon counting detector for fluorescence micros- copy and spectroscopy", X. Michalet et al., Proc. of SPIE Vol. 6092, 60920M (2006) und in "Position- and time-sensitive Single photone detector with delay-line readout", A. Czasch et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A 580 (2007), 1066-1070.
Durch Verwendung dieser zeitaufgelösten Detektoren ist die Mikroskopievorrichtung einsetzbar für bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren, insbesondere in der Zeitdomäne, wobei beispielsweise der Detektor als Ergebnis der Messung für jeden Bildpunkt eine Fluoreszenzabklingkurve liefern kann. Darüber hinaus wird durch die Zeitauflösung ermöglicht, zwischen verschiedenen Signalanteilen der von dem Untersuchungsobjekt abgegebenen Emissionsstrahlung zu diskriminieren, insbesondere zwischen Autoftuoreszenzstrahlυng von in dem Untersuchungsobjekt natürlich enthaltenen Materialien und Fluoreszenzstrahlung von gezielt in das Untersuchungsobjekt eingebrachten Fluoreszenzfarbstoffen, sowie zwischen Fluoreszenzstrahlung und reflektierter oder gestreuter Beleuchtungsstrahlung. Die auf diese Weise diskriminierten verschiedenen Signalanteile können zur Unterdrückung bestimm- ter Signalanteile, z.B. Autofluoreszenz, oder zur parallelen bildgebenden Auswertung der verschiedenen Signalanteile herangezogen werden. In jedem Fall wird eine äußerst effiziente Bildaufnahme und Auswertung gewährleistet.
Zur Bereitstellung der Ortsauflösung umfasst der Detektor typischerweise eine Viel- zahl von Detektorelementen, welche angeordnet sein können in Form eines regelmäßigen Gitters oder einer Matrix, oder aber auch in Form einer im Wesentlichen linienartigen Anordnung, um einen Zeilendetektor zu realisieren. Jedes der Detektorelemente ist dazu ausgestaltet, ein von einem Erfassungszeitpunkt wenigstens eines Photons relativ zu einem Puls der Beleuchtungsstrahlung abhängiges Zeitsignal aus- zugeben und/oder die Erfassung von Photonen abhängig von einem relativ zu dem Puls der Beleuchtungsstrahlung erzeugten Zeitsignal zu steuern. In jedem Fall ist somit über das Zeitsignal eine Zeitinformation verfügbar, welche im Wesentlichen der Zeitdifferenz zwischen einem Puls der Beleuchtungsstrahlung und dem Zeitpunkt des Erfassens eines Photons der Emissionsstrahlung entspricht. Durch Erfassen mehre- rer Photonen kann somit beispielsweise die Abklingkurve der Fluoreszenzstrahlung eines Fiuorophors in dem Untersuchungsobjekt erfasst werden. Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
Fig. 1 zeigt schematisch eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem Ausführungsbei- spiel der Erfindung.
Fig. 2 zeigt schematisch eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem wetteren Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Fig. 3 veranschaulicht eine Folge von Pulsen der Beleuchtungsstrahlung in einer Mikroskopievorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Fig. 4 zeigt eine beispielhafte Fluoreszenzabklingkurve, welche durch eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung erfassbar ist.
Fig. 5 veranschaulicht die Verwendung eines Zeitfensters zur Diskriminierung von Signalanteilen einer Emissionsstrahlung in einer Mikroskopievorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Fig. 1 zeigt schematisch eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die Mikroskopievorrichtung ist zur Verwendung bei bildgebenden Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren in der Zeitdomäne ausgestaltet, wobei die Erzeugung optischer Schnitte gemäß der SPIM-Technik vorgesehen ist.
Die Mikroskopievorrichtung umfasst Beleuchtungsmittel, welche einen breitbandigen Laser 1 , ein akusto-optisches einstellbares Filter 3 zur externen Wellenlängenselektion und eine breitbandige Lichtleitfaser 4. Beispielsweise kann der Laser 1 in einem Wellenlängenbereich von 450 bis 700 nm Pulse der Beleuchtungsstrahlung mit einer Länge von 20 ps erzeugen. Die Wiederholrate der Pulse liegt beispielsweise bei 40 MHz. Bei der Ausgangsstrahlung des Lasers 1 kann es sich um ein Weisslichtkonti- nuum handeln, aus dem dann die in der Beleuchtungsstrahlung verwendeten Wellenlängen extern herausgefiltert werden, z.B. durch das akusto-optische einstellbare Filter 3, oder der Laser 1 kann selbst ein geeignetes Mittel zur Wellenlängenselektion beinhalten, wie z.B. ein internes akusto-optisches einstellbares Filter oder eine Fre- quenzkonversionseinheit. Bei dem Laser 1 kann es sich um einen faserbasierten Su- perkontinuum-Laser handeln. In dem Fall, dass der Laser 1 selbst Mittel zur Wellenlängenselektion beinhaltet, kann gegebenenfalls auf das akusto-optische einstellbare Filter 3 verzichtet werden. Ein geeigneter Laser ist beispielsweise über die Firma Fi- anium Ltd. kommerziell verfügbar.
Die Mikroskopievorrichtung umfasst weiterhin einen Beleuchtungsstrahlengang 2, in welchem die von dem Laser 1 erzeugte Beleuchtungsstrahlung über die optische Faser 4 eingekoppelt wird. In dem Beleuchtungsstrahlengang 2 sind eine Zylinderoptik 5 sowie Abbildungsoptiken 6 angeordnet, welche eine Formung der Beleuchtungsstrahlung zu einem Lichtblatt 7 bewerkstelligen. Das Lichtblatt 7 ist auf ein Untersuchungsobjekt 8 gerichtet und schneidet dieses in einer Fokusebene des Be- leuchtungsstrahlengangs 2. Bei dem Untersuchungsobjekt kann es sich insbesondere um eine biologische Probe handeln, welche beispielsweise in ein transparentes Gel eingebettet ist.
Die Mikroskopievorrichtung umfasst weiterhin einen Detektionsstrahlengang 10, in welchem ein Detektionsobjektiv 9 angeordnet ist, über welches von dem Untersuchungsobjekt 8 abgegebene Emissionsstrahlung aufgenommen wird. Die Achse des Detektionsstrahlengangs 10 steht im Wesentlichen senkrecht auf der Achse des Beleuchtungsstrahlengangs 2 und insbesondere im Wesentlichen senkrecht auf der Schnittebene des Lichtblatts 7 mit dem Untersuchungsobjekt 8. Das Untersυchυngs- objekt 8 wird folglich nur in einer Ebene beleuchtet. Das Detektionsobjektiv 9 dient der Fokussierung in einer Fokusebene des Detektionsstrahlengangs 10. Der Beleuchtungsstrahlengang 2 und der Detektionsstrahlengang sind vollständig voneinander getrennt und treffen sich lediglich in der jeweiligen Fokusebene. Es sind auch Anordnungen denkbar mit einem Winkel zwischen Detektionsstrahlengang und Be- leuchtungsstrahlengang der zwischen 0° und 90° liegt. Entscheidend ist, dass der Beleuchtungsstrahlengang 2 und der Detektionsstrahlengang nicht parallel ausgerichtet sind.
Die Mikroskopievorrichtung umfasst weiterhin eine Vorrichtung (nicht dargestellt) zur Positionierung des Untersuchungsobjekts 8 relativ zu dem Lichtblatt 7, so dass durch eine Relativbewegung des Untersuchungsobjekts 8 entlang der Achse des Detektionsstrahlengangs 10 und/oder relativ zu dem Beleuchtungsstrahlengang 2 verschiedene optische Schnitte des Untersuchungsobjekts 8 aufgenommen werden können, welche als Grundlage für dreidimensionale Bilddatensätze dienen können. Die ReIa- tivbewegung kann auch eine Rotation des Untersuchungsobjekts 8 umfassen. - -
Der Detektionsstrahlengang 10 umfasst weiterhin eine Tubuslinse 12, über welche die von dem Detektionsobjektiv 9 erfasste Emissionsstrahlung einem Detektor 14 zugeführt ist. Weiterhin kann in dem Detektionsstrahlengang 10 ein Farbteiler 1 1 vorgesehen sein, welcher beispielsweise die Anbindung von Auflicht- Fluoreszenzanregungseinheiten, z.B. ein konfokales Laser-Rastermikroskop oder ein Epi-Fluoreszenzmikroskop, ermöglicht. Weiterhin kann in dem Detektionsstrahlengang 10 ein Emissionsfilter 13 vorgesehen sein, welches über das Untersuchungsobjekt 8 in den Detektionsstrahlengang 10 reflektierte oder gestreute Beleuchtungsstrahlung blockiert. Das Emissionsfilter 13 ist jedoch nicht für alle Betriebsweisen der Mikroskopievorrichtung erforderlich und ist daher bevorzugt herausnehmbar. Bei einigen Betriebsweisen kann die Erfassung von reflektierter oder gestreuter Beleuchtungsstrahlung über den Detektor 14 sogar wünschenswert sein.
Bei der Mikroskopievorrichtung können alle in der von dem Laser 1 bereitgestellten Bandbreite der Beleuchtungsstrahlung verfügbaren Anregungslinien zur Fluoreszenzanregung oder für eine anderweitige Beleuchtung des Untersuchungsobjekts 8 verwendet werden. Hierdurch ist es insbesondere möglich, die vollständige Bandbreite an Fluoreszenzfarbstoffen abzudecken und sogar optimiert anzuregen, wenn beispielsweise die Wellenlänge des Absorptionsmaximums eines Fluoreszenzfarbstoffs für die Anregung ausgewählt wird. Weiterhin ist es möglich, das Untersuchungsobjekt 8 mit einem breiten spektralen Band der Beleuchtungsstrahlung anzuregen, um beispielsweise eine erhöhte Leistung für die Anregung zur Verfügung zu stellen. Es ist auch möglich, strukturierte spektrale Bänder der Beleuchtungsstrahlung zur Anregung einzusetzen. Letzteres kann bei einigen Fluoreszenzfarbstoffen von Vorteil sein, wenn z.B. gezielt Bleichkanäle unterdrückt werden sollen.
Die Mikroskopievorrichtung umfasst weiterhin den Detektor 14 sowie eine Aυswerte- und Steuerelektronik 15. Im Zusammenhang mit der Auswerte- und Steuerelektronik 15 ist der Detektor 14 in der Lage, das Auftreffen von Photonen der von dem Unter- suchungsobjekt 8 ausgesendeten Emissionsstrahlung räumlich und zeitlich aufzulösen. Der Detektor 14 kann insbesondere einen zeitfensterbasierten Bildverstärker umfassen, wie er beispielsweise über die Firma Kentech Ltd. kommerziell verfügbar ist. Die Auswerte- und Steuerelektronik 15 ist über Signalleitungen 17 und 18 mit dem Detektor 14 verbunden. Darüber hinaus ist die Auswerte- und Steuereinheit 15 über eine Signalleitung 16 mit dem Laser 1 verbunden. Der Laser 1 übermittelt über die Signalleitung 16 ein Triggersignal an die Auswerte- und Steuerelektronik 15. Das Triggersignal umfasst Triggerpulse, welche im Wesentlichen zeitgleich zu den er- zeugten Pulsen der Beleuchtungsstrahlung sind oder einen bekannten Zeitversatz zu diesen aufweisen. Die Auswerte- und Steuerelektronik 15 erzeugt basierend auf diesem Trigger-Signal Zeitfenstersteuerungssignale, welche über die Signalleitung 17 an den Detektor 14 übermittelt werden. Der Detektor 14 übermittelt wiederum über die Signalleitung 18 eine Information bezüglich der Erfassung eines Photons sowie eine Information, an welchem Ort dieses Photon erfasst wurde.
Alternativ kann der Detektor 14 auch einen orts- und zeitaufgelösten Einzelphotonenzähler umfassen, wie er beispielsweise beschrieben ist in „A space- and time- resolved single-photon counting detector for fluorescence microscopy and spectros- copy", X. Michalet et al., Proc. of SPIE Vol. 6092, 609220M (2006) oder in „Position- and time-sensitive Single photon detector with delay-line readout", A. Czasch et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A 580 (2007), 1066-1070. Der Detektor 14 umfasst somit beispielsweise eine Multialkali-Fotokathode, einen MCP-Stapel (MCP: Micro Channel Plate, Mikrokanalplatte) und eine gekreuzte Verzögerungsdraht-Anode. Photonen, die auf die Kathode treffen, werden über den MCP-Stapel in ihrer Wirkung verstärkt und erzeugen auf der Anode einen Signalimpuls, aus dessen Laufzeit zur Detektionselektronik Aussagen über den Photonenauf- treffpunkt abgeleitet werden können. Anstelle der Verzögerungsdraht-Anode kann auch einen segmentierte Anode verwendet werden. In diesem Fall dient die Signalleitung 17 im Wesentlichen der Initialisierung des Detektors 14. Über die Signalleitung 18 werden bevorzugt die folgenden Informationen übermittelt: die Ankunftszeit eines Photons der Emissionsstrahlung relativ zum Iπitialisierungssignal, ein verzögertes Signal für eine erste Raumrichtung, z.B. eine x-Position, und ein verzögertes Sig- nal für eine zweite Raumrichtung, z.B. eine y-Position. Aus diesen drei Informationen kann Ort und Zeitpunkt der Erfassung des Photons bestimmt werden. Da bei dem Detektor 14 im Wesentlichen ein Photonenzählverfahren zum Einsatz kommt, umfasst der Detektor 14 vorzugsweise auch einen Diskriminator zur Unterdrückung von elektronischen Rauschanteilen. Auf diese Weise kann Ausleserauschen vermieden werden.
Durch Einsatz eines solchen ortsaufgelösten und zeitaufgelösten Einzelphotonenzählers besteht keine Beschränkung auf Zeitfenster bei der Erfassung der Photonen. So kann vermieden werden, dass Verluste für Photonen der Emissionsstrahlung auf- treten, welche außerhalb der gesetzten Zeitfenster auf den Detektor 14 treffen. Durch Verwendung von ortsaufgelösten und zeitaufgelösten Einzelphotonenzählern als De- tektoren können Ortsauflösungen von wenigstens 150x 150 Bildpunkten, z.B. 1000x 1000 Bildpunkte, und zeitliche Auflösungen von etwa 100 ps erreicht werden.
Die Mikroskopievorrichtung umfasst darüber hinaus einen Analyserechner 20, wel- eher über eine Signalleitung 19 mit der Auswerte- und Steuerelektronik 15 verbunden ist. Über die Signalleitung 19 werden dem Analyserechner 20 von der Auswerte- und Steuerelektronik 15 ermittelte Messresultate zugeführt. Mittels des Analyserechners 20 können beispielsweise zeitliche Fluoreszenzabklingkurven optisch dargestellt und gespeichert werden oder mit der Mikroskopievorrichtung erfasste zweidimensionale oder dreidimensionale Bilddaten dargestellt, gespeichert und weiterverarbeitet werden. Es versteht sich, dass die Auswerte- und Steuerelektronik 15 und der Analyse- rechπer 20 in einem einzigen mikroprozessorbasierten System implementiert sein können, welches auch gleichzeitig der Steuerung der wesentlichen Funktionen der Mikroskopievorrichtung dienen kann, z.B. über eine graphische Benutzeroberfläche.
Fig. 2 zeigt eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die Mikroskopievorrichtung von Fig. 2 entspricht im Wesentlichen derjenigen von Fig. 1 , und ähnliche Komponenten wurden mit den gleichen Bezugszeichen gekennzeichnet. Auf die Erläuterung dieser Komponenten wird an dieser Stelle verzichtet. Vielmehr wird diesbezüglich auf die entsprechenden Ausführungen im Zusammenhang mit Fig. 1 verwiesen. Nachfolgend sollten lediglich die wesentlichen Unterschiede der Mikroskopievorrichtung von Fig. 2 zu derjenigen von Fig. 1 erläutert werden.
Während bei der Mikroskopievorrichtung von Fig. 1 das Lichtblatt 7 durch eine Zylinderoptik geformt wurde, wird es bei der Mikroskopievorrichtung von Fig. 2 durch einen die Fokusebene abrastemden annähernd linienförmigen Lichtstrahl aufgespannt. Die Mikroskopievorrichtung umfasst zu diesem Zweck eine erste Rastereinheit 21 , welche eine entsprechende Ablenkung des von dem Laser 1 über die optische Faser 4 in den Beleuchtungsstrahlengang 2 eingekoppelten Lichtstrahls vornimmt. Weiterhin ist die in Fig. 1 dargestellte Zylinderoptik 5 durch ein weiteres Element der AbbiU dungsoptik 6 ersetzt.
Weiterhin ist im Detektionsstrahlengang 10 eine zweite Rastereinheit 22 eingefügt, welche mit der ersten Rastereinheit 21 derart synchronisiert ist, dass die zum jeweiligen Aufnahmezeitpunkt in der Fokusebene beleuchtete Zeile auf eine zeilenartige Anordnung von Detektorelementen eines Detektors 24 abgebildet wird. Die Synchro- nisation erfolgt mittels einer Synchronisationssignals, welches über eine Signalleitung 23 zwischen den Rastereinheiten 21 , 22 oder an die Rastereinheiten 21 , 22 ü- bermittelt wird. Der Detektor 24 ist folglich nicht als flächenhafter Detektor, sondern als Zeilendetektor ausgestaltet. Der Detektor 24 liefert folglich nur ein eindimensiona- les Positionssignal, wobei ein weiteres Positionssignal über die Ansteuerung der ersten und zweiten Rastereinheit 21 , 22 verfügbar ist. Im Übrigen entsprechen die Eigenschaften des Detektors 24 denjenigen des Detektors 14 von Fig. 1. Es sind folglich insgesamt die gleichen räumlichen und zeitlichen Informationen für eine Auswertung in der Auswerte- und Steuerelektronik 15 verfügbar. Aufgrund eines technischen vereinfachten Aufbaus eines Zeilendetektors gegenüber einem flächigen Detektor können jedoch höhere räumliche und zeitliche Auflösungen erreicht werden. Weiterhin können Sättigungseffekte und so genannte Pile-Up-Effekte (Überlagerungseffekte) vermindert werden.
Fig. 3 zeigt eine beispielhafte Folge von Pulsen der Beleuchtungsstrahlung. In Fig. 3 ist die Intensität der Beleuchtungsstrahlung mit I bezeichnet. Die Zeitachse ist mit t bezeichnet. Es ist zu erkennen, dass die Beleuchtungsstrahlung scharf definierte Pulse umfasst, wobei bei dem dargestellten Beispiel die Pulslänge bei etwa 20 ps liegt. Der Abstand zweier Pulse liegt wiederum bei 25 ns, was einer Wiederholrate von 40 MHz entspricht. Wie bereits erwähnt, umfassen die Beleuchtungsmittel zur Erzeugung der gepulsten Beleuchtungsstrahlung einen geeignet ausgestalteten Laser. Bei dem Laser kann es sich insbesondere um einen Superkontinuum-Laser handeln, welcher einen Wellenlängenbereich von wenigstens 450-700 nm abdeckt.
Fig. 4 zeigt beispielhaft den Verlauf einer Fluoreszenzabklingkurve, wie sie als Resultat der zeitaufgelösten Auswertung der Emissionsstrahlung mittels des Detektors 14, 24 und der Auswerte- und Steuerelektronik 15 der Mikroskopievorrichtungen von Fig. 1 und 2 gewonnen werden kann. Die Signalstärke der Fluoreszenzstrahlung ist in Fig. 4 mit F bezeichnet. Die Zeitachse ist mit t bezeichnet. Die Detektoren 14, 24 liefern für jedes ihrer Detektorelemente, d.h. für jeden Bildpunkt, eine Abklingkurve des in Fig. 4 dargestellten Typs. Die Fluoreszenzabklingkurve kann im Wesentlichen über den gesamten Zeitraum zwischen zwei aufeinander folgenden Pulsen der Beleuchtungsstrahlung erfasst werden.
Wenn in dem Detektor 14, 24 ein zeitfensterbasierter Bildverstärker verwendet wird, wird die Fluoreszenzabklingkurve erfasst, indem mehrere Messungen mit unterschiedlich gesetzten Zeitfenstern erfolgen. Aus der Lage des Zeitfensters ergibt sich dann die Position eines Punktes der Abklingkurve entlang der Zeitachse. Wenn in dem Detektor 14, 24 ein orts- und zeitaufgelöster Einzelphotonenzähler verwendet wird, kann die Zeitinformation direkt aus der Ausgabe des Detektors 14, 24 gewonnen werden. Der Wert F für einen bestimmten Punkt auf der Zeitachse ergibt sich aus der für den Bereich dieses Zeitpunkts gezählten Anzahl von Photonen, d.h. durch eine histogrammartige Auswertung der erfassten Photonen.
Eine Fluoreszenzabklingkurve des in Fig. 4 dargestellten Typs kann bei bildgebenden Untersuchungen zur Kontrastgebung gemäß einem Fluoreszenzlebensdauer- mikroskopieverfahren genutzt werden. Beispielsweise können zwei unterschiedliche fluoreszierende Farbstoffe voneinander unterschieden werden, was in eine Kontrastinformation umgesetzt werden kann. Bei einer detaillierten Erfassung der Fluoreszenzabklingkurve kann auch die Fluoreszenzlebensdauer rechnerisch ermittelt werden.
In dem Fall, dass lediglich zwischen zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen unterschieden werden soll, kann bei Verwendung eines zeitfensterbasierten Bildverstärkers darauf verzichtet werden, im Wesentlichen die gesamte Fluoreszenzabklingkurve aufzunehmen. Vielmehr kann es ausreichen, lediglich zwei geeignet ge- setzte Zeitfenster zu verwenden. Allgemein ist es möglich, anhand einer Abklingkurve des in Fig. 4 dargestellten Typs, verschiedene Signalanteile der Emissionsstrahlung voneinander zu unterscheiden und diese zu diskriminieren, wenn diese ein unterschiedliches Abklingverhalten aufweisen. Dies kann bei den Mikroskopievorrich- tungen von Fig. 1 und Fig. 2 einerseits genutzt werden, um unerwünschte Signalan- teile, z.B. Autofluoreszenzstrahlung oder reflektierte oder gestreute Beleuchtungsstrahlung, zu unterdrücken. Es ist jedoch auch möglich, diese verschiedenen Signalanteile separat auszuwerten und in Kontrastinformationen für das Bildgebungsver- fahren umzusetzen.
Fig. 5 veranschaulicht beispielhaft eine Situation, in welcher sich die erfasste Fluoreszenzabklingkurve aus mehreren Signalanteilen zusammensetzt. Die Signalstärke der Fluoreszenzstrahlung ist mit F bzeichnet. Die Zeitachse ist mit t bezeichnet. In Fig. 5 ist der Laserimpuls durch eine gestrichelte Linie dargestellt. Ein erster Signalanteil der erfassten Abklingkurve ist durch eine strichpunktierte Linie dargestellt. Die- sem Signalanteil ist eine das Abklingverhalten charakterisierende Lebensdauer von τ=10 ns zugeordnet. Ein zweiter Signalanteil der erfassten Abklingkurve ist durch eine gepunktete Linie dargestellt. Diesem Signalanteil ist eine das Abklingverhalten charakterisierende Lebensdauer von τ=1 ns zugeordnet. Eine durchgezogene Linie veranschaulicht das Gesamtsignal, welches sich aus dem ersten Signalanteil und dem zweiten Signalanteil zusammensetzt. Ein für die Detektion verwendetes Zeitfenster ist in Fig. 5 durch die schraffierte Fläche G dargestellt. Beispielsweise kann der erste Signalanteil der Fluoreszenz eines gezielt in das Untersuchungsobjekt eingebrachten Fluoreszenzfarbstoffs entsprechen, während der zweite Signalanteil einer Autofluoreszenz von in dem Untersuchungsobjekt natürlich enthaltenem Material entspricht. Bei vielen Anwendungen führt ein solcher auf Autofluoreszenz basierender Signalanteil zu einer starken Kontrastminderung.
Wie aus Fig. 5 ersichtlich, ist das Zeitfenster G derart gesetzt, dass innerhalb des Zeitfensters G der Verlauf der Gesamtabklingkurve im Wesentlichen demjenigen des ersten Signalanteils entspricht, da zu Beginn des Zeitfensters der Abklingvorgang des ersten Signalanteils bereits im Wesentlichen abgeschlossen ist. Dies wird er- reicht, indem die Anfangszeit des Zeitfensters G relativ zu dem Puls der Beleuchtungsstrahlung derart gesetzt ist, dass er wesentlich größer ist als die Lebensdauer τ des zu unterdrückenden Signalanteils. Um die beiden Signalanteile separat auswerten zu können, könnte ein zweites Zeitfenster gesetzt werden, welches den Zeitraum vor Beginn des Zeitfensters G abdeckt.
Die Unterdrückung von Autofluoreszenzstrahlung ist insbesondere von Vorteil im Zusammenhang mit auflösungssteigemden Verfahren, wie z.B. dargestellt in „Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution", E. Betzig et al., Science 313, 1542 (2006). Hier wird aus mehreren Einzelmolekülanregungen der Schwer- punkt der Intensitätsverteilung auf einem ortsaufgelösten Detektor für ein einzelnes Molekül ermittelt, wodurch Auflösungen bis zu 20 nm erreicht werden können. Da wie oben dargestellt bei den Mikroskopievorrichtungen von Fig. 1 und Fig. 2 Autofluoreszenzstrahlung effektiv unterdrückt werden kann, ermöglichen diese, ein solches auf- lösungssteigerndes Verfahren auch bei der bildgebenden Untersuchung von opti- sehen Schnitten mit der SPIM-Technik einzusetzen. Insbesondere kann auf das Anregungsvolumen begrenzende Verfahren, wie z.B. Fluoreszenzmikroskopie mit interner Totalreflexion oder TIRF-Mikroskopie (TIRF: Total Interal Reflection Fluorescence), verzichtet werden.
Weiterhin ist aus Fig. 5 auch ersichtlich, dass die zeitaufgelöste Erfassung der Emissionsstrahlung geeignet ist, Signalanteile der Beleuchtungsstrahlung, insbesondere reflektierte Beleuchtungsstrahlung, von den anderen Signalanteilen abzutrennen. Dies kann wiederum eingesetzt werden, um den Signalanteil reflektierter Beleuchtungsstrahlung in der erfassten Emissionsstrahlung zu unterdrücken, ohne dass hierfür das Emissionsfilter 13 erforderlich ist, oder um basierend auf der reflektierten Beleuchtungsstrahlung parallel eine separate bildgebende Auswertung vorzunehmen. Im letzteren Fall wird das Emissionsfilter 13 bevorzugt aus dem Detektionsstrahlen- gang entfernt. Hierbei ergibt sich als besonderer Vorteil, dass bei der Erzeugung der Beleuchtungsstrahlung keine Einschränkung hinsichtlich möglicher Anregungswellenbereiche oder -kombinationen besteht. Es können z.B. auch solche Anregungswellenbereiche oder -kombinationen verwendet werden, für welche keine als Emis- sionsfilter geeigneten optischen Filter verfügbar sind oder für welche solche Filter nur mit hohen Kosten oder hohem technischen Aufwand bereitgestellt werden können.
Es versteht sich, dass die vorangegangene Beschreibung lediglich einige Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung abdeckt und dass in diesen Ausführungs- beispielen verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne von den wesentlichen Konzepten der Erfindung abzuweichen. Beispielsweise können die Beleuchtungsmittel auch mehrere Laser umfassen, deren Ausgangsstrahlung gemeinsam in den Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt wird. Außerdem ist es auch möglich, das Lichtblatt durch zeilenartiges Abrastern in der Fokusebene des Be- leuchtungsstrahlengangs zu erzeugen, wie im Zusammenhang mit Fig. 2 erläutert, jedoch zur Erfassung der Emissionsstrahlung einen flächigen Detektor einzusetzen, wie im Zusammenhang mit Fig. 1 erläutert. In diesem Fall kann auf die zweite Rastereinheit im Detektionsstrahlengang verzichtet werden. Darüber hinaus ist es auch möglich, einen orts- und zeitaufgelösten Einzelphotonenzähler mit Detektionszeit- fenstern zu betreiben, wie in Zusammenhang mit Fig. 5 erläutert.

Claims

A N S P R U C H E
1 Mikroskopievorrichtung, umfassend
Beleuchtungsmittel (1 , 3, 4) zur Erzeugung einer Beleuchtungsstrahlung, einen bildgebenden Detektor (14, 24) zur ortsaufgelosten Erfassung einer von einem
Untersuchungsobjekt (8) abgegebenen Emissionsstrahlung, einen Beleuchtungsstrahlengang (2) zwischen den Beleuchtungsmitteln (1 , 3, 4) und dem Untersuchungso_bjekt (8), und einen Detektionsstrahlengang (10) zwischen dem Untersuchungsobjekt (8) und dem Detektor (14, 24), wobei der Beleuchtungsstrahlengang (2) eine Beleuchtungsoptik (5, 6, 21) umfasst, welche zur Erzeugung eines Lichtblattes (7) der Beleuchtungsstrahlung ausgestaltet ist, welches sich quer zu der Achse des Beleuchtυngsstrahlengangs (2) erstreckt, wobei die Achse des Detektionsstrahlengangs (10) in einem von 0° abweichenden Winkel zu einer Schnittebene des Lichtblattes (7) und des Untersuchungsobjekts (8) ausgerichtet ist, und wobei die Beleuchtungsmittel (1 , 3, 4) einen gepulsten Laser (1) umfassen
2 Mikroskopievorrichtung nach Anspruch 1 , wobei der Detektor (14, 24) zur zeitaufgelosten Erfassung von Photonen der Emissionsstrahlung ausgestaltet ist
3 Mikroskopievorrichtung nach Anspruch 2, wobei der Detektor (14, 24) als zeitfensterbasierter Bildverstärker ausgestaltet ist
4 Mikroskopievorrichtung nach Anspruch 2, wobei der Detektor (14, 24) als Einzelphotonenzahler ausgestaltet ist
5 Mikroskopievorrichtung nach einem der Ansprüche 2-4, wobei der Detektor (14, 24) eine Vielzahl von Detektorelementen umfasst, welche jeweils dazu ausgestaltet sind, ein von einem Erfassungszeitpunkt wenigstens eines Photons relativ zu einem Puls der Beleuchtungsstrahlung abhangiges Zeitsignal aus- zugeben und/oder die Erfassung von Photonen abhangig von einem relativ zu einem Puls der Beleuchtungsstrahlung erzeugten Zeitsignal zu steuern - -
6. Mikroskopievorrichtung nach Anspruch 5, wobei die Mikroskopievorrichtung Auswerte- und Steuermittel (15) umfasst, welche zur Auswertung der Zeitsignale bezüglich wenigstens einer Fluoreszenzlebensdauer ausgestaltet sind.
7. Mikroskopievorrichtung nach einem der Ansprüche 2-6, wobei die Mikroskopievorrichtung Auswerte- und Steuermittel (15) umfasst, welche zur Diskriminierung von verschiedenen Signalanteilen der Emissionsstrahlung abhängig von einem Erfassungszeitpunkt von Photonen der Emissionsstrahlung aus- gestaltet sind.
8. Mikroskopievorrichtung nach Anspruch 7, wobei die verschiedenen Signalanteile Autofluoreszenzstrahlung des Untersuchungsobjekts (8), Fluoreszenzstrahlung von in das Untersuchungsobjekt (8) einge- brachten Fluoreszenzfarbstoffen und/oder reflektierte Beleuchtungsstrahlung umfassen.
9. Mikroskopievorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Steuer- und Auswertemittel (15) dazu ausgestaltet sind, eine bildgebende Auswertung parallel für wenigstens zwei der Signalanteile durchzuführen.
10. Mikroskopievorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend: eine erste Rastereinheit (21) zur im Wesentlichen linienförmigen Abrasterung der Fokusebene im Beleuchtungsstrahlengang (2).
11. Mikroskopievorrichtung nach Anspruch 10, umfassend: eine zweite Rastereinheit (22) zur im Wesentlichen linienförmigen Abrasterung der Fokusebene im Detektionsstrahlengang (10), wobei der Detektor (24) als Zeilendetektor ausgestaltet ist.
12. Mikroskopievorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Beleuchtungsoptik (5, 6) eine Zylinderoptik zur Ausbildung des Lichtblattes (7) umfasst.
13. Mikroskopievorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der gepulste Laser (1) eine Pulsdauer von weniger als 1 ns, vorzugsweise weniger als 100 ps aufweist.
14. Mikroskopievorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Beleuchtungsmittel (1 , 3, 4) derart ausgestaltet sind, dass mit der Beleuchtungsstrahlung eine Bandbreite von wenigstens 200 nm abgedeckt werden kann.
15. Mikroskopievorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Laser (1) als Superkontinuum-Laser ausgestaltet ist.
16. Mikroskopievorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend: ein einstellbares Filter (3) zur spektral strukturierten Filterung der Beleuchtungsstrahlung.
17. Mikroskopievorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend:
Mittel zur Positionierung des Untersuchungsobjekts (8) relativ zu dem Beleuchtungsstrahlengang (2) und/oder Detektionsstrahlengang (10).
18. Mikroskopievorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Achse des Detektionsstrahlengangs (10) im Wesentlichen senkrecht zu einer Schnittebene des Lichtblattes (7) und des Untersuchungsobjekts (8) ausgerichtet ist.
19. Verwendung einer Mikroskopievorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche bei einem bildgebenden Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren.
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