DE102016104534B3

DE102016104534B3 - Mikroskop und Verfahren zur Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie

Info

Publication number: DE102016104534B3
Application number: DE102016104534.9A
Authority: DE
Inventors: Sebastian Borck; Jörg Ritter
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2016-03-11
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2017-07-13
Anticipated expiration: 2036-03-12

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop sowie ein Verfahren zur Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie (LSFM). Die Aufgabe, die Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie (LSFM) so zu verbessern, dass das Abklingverhalten bei der Fluoreszenzlebensdauermikroskopie (FLIM) erfassbar ist, ohne an Zeitintervalle der (seriellen) Bildauslesung gebunden zu sein, wird erfindungsgemäß gelöst, indem eine Beleuchtungseinrichtung (1) einen Kurzpulslaser (14) zur gepulsten Erzeugung eines Lichtstrahls (11) und einen Linearscanner (12) für den Lichtstrahl (11) aufweist, eine Detektionseinrichtung (8) einen Schwenkspiegel (6) mit einer Drehachse (61) enthält, die parallel zu einer vom Mikroskopobjektiv (33) abgebildeten Bildlinie (53) des Lichtstrahls (11) ausgerichtet ist, wobei der Schwenkspiegel (6) entgegengesetzt und synchron zur Scanbewegung des Lichtstrahls (11) beweglich ist, um die Bildlinie (53) ortsfest auf eine Schlitzblende (7) abzubilden, und ein zeitauflösender Detektor (81) vorhanden ist, mit dem entlang der Schlitzblende (7) eine eindimensionale Ortsauflösung von Probenpunkten der Beleuchtungslinie (22) und quer zur Schlitzblende (7) eine Zeitinformation zu den Probenpunkten als ein x, t-Frame für jede Bildlinie (53) aufnehmbar ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop zur Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie mit einer Beleuchtungseinrichtung, durch die eine Lichtscheibe zur Beleuchtung eines Probenbereichs ausgebildet ist, die mittels eines entlang einer Beleuchtungsachse ausgerichteten Lichtstrahls und einer Scanbewegung des Lichtstrahls entlang einer Scanachse quer zur Beleuchtungsachse erzeugt ist, und einer Detektionseinrichtung, mit der Licht detektierbar ist, das entlang der Beleuchtungsachse aus dem Probenbereich abgestrahlt wird, wobei eine Detektionsoptik eine Detektionsachse senkrecht zu der Beleuchtungsachse und einer Objektebene, in der die Beleuchtungsachse liegt, aufweist. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie. Die Erfindung findet vorzugsweise Anwendung bei der Untersuchung von biologischen Proben durch so genanntes Sectioning mit Aufnahmen der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM – Fluorescence-Lifetime Imaging Microscopy).
In der Medizin und Biologie sind hochauflösende optische Mikroskope immer wichtiger werdende Hilfsmittel für Forschung und Diagnostik, da elektronenmikroskopische oder UV-Strahlung nutzende Bearbeitungs- und Untersuchungsverfahren nicht für lebende Zellen geeignet sind. Die sogenannte Lichtblattmikroskopie oder auch Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie (LSFM), die zuweilen auch mit SPIM (englisch: Selective Plane Illumination Microscopy) abgekürzt wird, ist mittlerweile ein gut etabliertes Verfahren zur 3D-Mikroskopie lebender Organismen (Vergl. z. B. Produkt „Lightsheet Z.1” von Zeiss). Dabei kommen entweder scannende Lichtblätter (LSFM) oder scannende Lichtstrahlen DLSFM (englisch: Digital Light Sheet Microscopy) zum Einsatz.
Beim DLSFM-Prinzip liegt in der Probe in einer gewählten Objektebene ein dünner Beleuchtungslichtstrahl (z. B. in x-Richtung) und regt in der Probe Objektpunkte zur Fluoreszenz an. Typische Durchmesser des Lichtstrahls an der schmalsten Stelle der Kaustik sind im Bereich 1 μm bis 20 μm. Objektpunkte außerhalb des Strahls bleiben zunächst dunkel. Eine Detektionsoptik schaut (gegenüber der gewählten Richtung des Beleuchtungsstrahls) aus der z-Richtung auf das Objekt. Der Beleuchtungsstrahl erscheint aus dem Blickwinkel der Detektion als Linie. Durch laterales Scannen der Linie in y-Richtung kann nach und nach innerhalb der Objektebene (x–y-Ebene) das ganze Sichtfeld der Detektionsoptik beleuchtet und durch einen Bildsensor aufgenommen werden. Da die Beleuchtung nur in der x–y-Ebene erfolgt, bleiben Objektpunkte außerhalb der Objektebene (x–y-Ebene) dunkel. Infolgedessen ergibt sich ein sogenanntes optisches Sectioning (Schichtdarstellung) des Objekts, wobei durch Bewegung des Objekts in z-Richtung das Objekt über das gesamte Volumen schichtweise aufgenommen werden kann. Die Bildaufnahme von einer Objektebene erfolgt bevorzugt zeilenweise, d. h. jede Bildzeile wird durch eine einzeln beleuchtete Linie erzeugt und die einzelnen Bildzeilen sequentiell aufgenommen. Die Fusion zu einem Gesamtbild erfolgt im Anschluss im Bildspeicher. Ein derartig aufgebautes Mikroskop ist im Stand der Technik beispielsweise aus der US 8 848 268 B2 bekannt. Ferner gibt die DE 10 2012 020 240 A1 ein Verfahren zur Realisierung der SPIM-Mikroskopie an, bei dem eine Vorabkalibrierung der Probe erfolgt, um die Lage des Lichtblattes im nachfolgenden Detektionsschritt gegenüber der Objektebene des Detektionsobjektivs korrigieren zu können.
Bei üblichen SPIM-Anordnungen werden Mehrfarbaufnahmen typischerweise durch entsprechende gewählte Farbfilter im Detektionsstrahlengang realisiert, wobei durch Filterwechsel, dichroitische Farbteiler oder spezielle Spektralgitter die Zahl der Farbaufnahmen auf wenige (2–3) beschränkt sind, weil sie entweder seriell erfasst werden oder in der Intensität beschränkt sind. Nachteilig bei den vorgenannten Lösungen ist, dass Farbaufnahmen nur geringe Farbauflösung zulassen, weil sie entweder in wenigen (1–2) Spektralbändern durch Bandpass- oder Langpassfilter realisiert werden oder die spektrale Auflösung bei simultaner Verwendung ähnlich fluoreszierender Farbstoffe schwierig oder unmöglich ist.
Ein verbessertes SPIM-Verfahren wurde von Jahr, W. et al. [in: „Hyperspectral light sheet microscopy”, Nat. Commun. 6: 7990 doi: 10.1038/ncomms 8990 (2015)] vorgeschlagen, in dem eine vom zur Erzeugung der Lichtscheibe durch die Probe geschwenkten Beleuchtungsstrahl abgebildete Lichtlinie mittels eines Descanning-Spiegels in eine Linie auf dem Sensor projiziert wird, wodurch sich bei kalibrierter Bewegung des Spiegels eine konfokale Liniendetektion ergibt, die bei Abbildung der gescannt erzeugten Fluoreszenz-Bildlinien auf den Eintrittsspalt eines abbildenden Spektrographen einen Datensatz von x, λ-Frames der Probe erzeugt. Problematisch ist hier allerdings die zeitliche Detektion eines Fluoreszenzverlaufs, für die das multispektrale Lichtscheibenscanning der Probe zu zeitintensiv ist, um über wiederholtes Sectioning den Fluoreszenzverlauf in medizinischem oder biologischem Probenmaterial erfassen zu können.
Zeitaufgelöste Fluoreszenzaufnahmen sind durch Verwendung gepulster Lichtquellen und synchron gesteuerter Kameras mit internem Shutter (gated cameras) möglich. Solche Verfahren sind beispielsweise in den Patenten US 8 921 809 B2 und US 7 508 505 B2 beschrieben, wobei einerseits CCD- oder CMOS-Detektoren mit Lock-in-Techniken verwendet werden, um Weitfeld-FLIM in der Frequenzdomäne zu realisieren, und andererseits ortsauflösende Detektoren als zeitfensterbasierte Bildverstärker oder als zeitauflösende Einzelphotonenzähler für die Fluoreszenzlebensdauermikroskopie (FLIM) in der Zeitdomäne zur Aufzeichnung der Fluoreszenzabklingkurve für jeden aufgenommenen Bildpunkt eingesetzt werden.
Ferner ist von K. GREGER et al. (Three-dimensional Fluorescence-Lifetime Imaging with a Single Plane Illumination Microscope Provides an Improved Signal to Noise Ratio) in Optics Express Vol. 19, Issue 21, pp. 20743-20750 (2011), eine SPIM-FLIM-Kombination zur hochauflösenden Bildaufnahme in der Intensitäts- und in der Lebensdauer-Domäne beschrieben, bei der die mittels frequenzmodulierter Laserdiode erzeugte Fluoreszenz mit einer phasenverschoben getriggerten gegatete CCD-Kamera zur FLIM-Bildaufnahme angesteuert wird.
Die vorgenannten Verfahren sind aber nur gut geeignet für Fluoreszenzabklingzeiten im ns-Bereich, aber zu langsam, um extrem kurze Abklingzeiten der Fluoreszenz im Bereich deutlich unter 100 ps zu erfassen. In der vorgenannten US 8 921 809 B2 wird die Information über das zeitliche Abklingverhalten der Fluoreszenz gewonnen, indem eine gegatete Kamera nur Fluoreszenz in definierten Zeitfenstern mit bekanntem zeitlichem Versatz zum Anregungsimpuls des Kurzpulslasers aufnimmt, wobei sich über die relativen Intensitäten in mehreren solcher Zeitfenster der Fluoreszenzabfall bestimmen lässt. Nachteilig ist hierbei jedoch, dass Photonen, die außerhalb des jeweils aufgenommenen Zeitfensters auf den Detektor auftreffen, nicht detektiert werden und somit verloren gehen. Weiterhin müssen für die Bestimmung des Fluoreszenzabfalls mehrere Aufnahmen mit unterschiedlichem Zeitversatz zum Anregungsimpuls aufgenommen werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Möglichkeit zur Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie zu finden, die beim Sectioning mittels eines gescannten Lichtstrahls bei hoher axialer und/oder spektraler Auflösung die zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung (FLIM) derart verbessert, dass das Fluoreszenzabklingverhalten erfassbar ist, ohne an Zeitintervalle der (seriellen) Auslesung mehrerer vollständiger Fluoreszenzbilder einer Lichtscheibe gebunden zu sein.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe bei einem Mikroskop zur Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie einer Beleuchtungseinrichtung, die mittels eines entlang einer Beleuchtungsachse ausgerichteten Lichtstrahls und einer Scanbewegung des Lichtstrahls entlang einer Scanachse quer zur Beleuchtungsachse zur Erzeugung einer Lichtscheibe als ein beleuchteter Probenbereich ausgebildet ist, und einer Detektionseinrichtung, mit der Licht detektierbar ist, das entlang einer scannenden Beleuchtungslinie aus dem Probenbereich abgestrahlt wird, wobei eine Detektionsoptik eine Detektionsachse senkrecht zu der Beleuchtungsachse und einer Objektebene, in der der beleuchtete Probenbereich durch die Beleuchtungslinie erzeugt ist, aufweist, dadurch gelöst, dass die Beleuchtungseinrichtung einen Kurzpulslaser zur gepulsten Erzeugung des Lichtstrahls und einen Linearscanner aufweist und dass die Detektionseinrichtung nach Mikroskopobjektiv und Tubuslinse einen zwischen einer vor- und einer nachgeordneten Relayoptik angeordneten Schwenkspiegel enthält mit einer Drehachse, die parallel zu einer vom Mikroskopobjektiv abgebildeten Bildlinie des Lichtstrahls ausgerichtet ist, wobei der Schwenkspiegel in einer Pupillenebene der dem Schwenkspiegel nachgeordneten Relayoptik angeordnet und entgegengesetzt und synchron zur Scanbewegung des Lichtstrahls der Beleuchtungslinie beweglich ist, sodass die Bildlinie in einer weiteren Zwischenbildebene der nachgeordneten Relayoptik ortsfest abgebildet ist, eine Schlitzblende innerhalb der weiteren Zwischenbildebene der nachgeordneten Relayoptik aufweist, mit der eine eindimensionale Ortsauflösung von Probenpunkten entlang der Beleuchtungslinie als jeweils genau eine descannte Bildlinie des Lichtstrahls aufnehmbar ist, und einen der Schlitzblende nachgeordneten zeitauflösenden Detektor enthält, der entlang der Schlitzblende eine eindimensionale Ortsauflösung von Probenpunkten entlang der Beleuchtungslinie und quer zur Schlitzblende eine Zeitinformation zu den Probenpunkten erzeugt, sodass für jede descannte Bildlinie des Lichtstrahls ein x, t-Frame aufnehmbar ist.
Vorteilhaft weist der Linearscanner eine Scanfrequenz im Bereich zwischen 0,1 kHz und 40 kHz auf.
Der Kurzpulslaser weist vorzugsweise Impulsfrequenzen im Bereich von 1 kHz bis 100 MHz auf.
Als zeitauflösender Detektor wird zweckmäßig eine Streak-Kamera zur Aufnahme des x, t-Frames eingesetzt. Dabei enthält die Streak-Kamera eine elektronische Ablenkeinheit mit einer zeitabhängigen Hochspannungssteuerung, die mit einer Frequenz synchron zu einer typischen Repetitionsrate des Kurzpulslasers eingestellt ist, sodass dadurch FLIM-Messungen von einer Probe aufnehmbar sind.
In einer ersten Ausführung ist die Ablenkeinheit der Streak-Kamera in ihrer Frequenz auf typische Repetitionsraten des Kurzpulslasers im Bereich zwischen 10 MHz und 100 MHz synchronisierbar, um in der Ein-Photonen-Laserscanning-Mikroskopie verwendet zu werden. In einer zweiten Ausführung ist die Ablenkeinheit der Streak-Kamera in ihrer Frequenz auf typische Repetitionsraten des Kurzpulslasers im Bereich zwischen 1 kHz und 250 kHz synchronisierbar, um Anwendungen in der Multi-Photonen-Laserscanning-Mikroskopie zu realisieren. Dabei kann der Kurzpulslaser bevorzugt als ein regeneratives Verstärkersystem ausgebildet sein.
In einer modifizierten Arbeitsweise der LSFM ist die Ablenkeinheit der Streak-Kamera in ihrer Frequenz auf typische Scanfrequenzen des Linearscanners und des Schwenkspiegels im Bereich von 0,1 Hz bis 1 kHz synchronisierbar, um neben FLIM-Aufnahmen zusätzlich reguläre 2D-Bilder der Probe aufzunehmen. Zweckmäßig ist die Ablenkeinheit der Streak-Kamera in ihrer Synchronisation elektronisch zwischen Laserrepetitionsrate und Linearscannerfrequenz umschaltbar, um zwischen FLIM-Aufnahmen und 2D-Bildern der Probe wählen zu können.
Vorteilhaft ist die Beleuchtungseinrichtung aus Kurzpulslaser und Beleuchtungsoptik als ein regeneratives Verstärkersystem ausgebildet.
In einer besonders bevorzugten Ausführung sind die Beleuchtungsoptik als ein Axicon und der vom Kurzpulslaser ausgesendete Lichtstrahl als ein Besselstrahl ausgebildet.
Bei Verwendung eines Kurzpulslasers mit typischen Repetitionsraten im kHz- bis MHz-Bereich und Detektorbildraten im Videofrequenzbereich ist das erfindungsgemäße LSFM-Mikroskop vorteilhaft zum Austausch des der Schlitzblende nachgeordneten zeitauflösenden Detektors zur FLIM-Messung durch einen spektral-selektiven Detektor zur SPIM-Messung vorgesehen, wodurch entlang der Schlitzblende eine eindimensionale Ortsauflösung von Probenpunkten und quer zur Schlitzblende ein von den einzelnen Probenpunkten ausgehendes Fluoreszenzspektrum aufnehmbar ist, sodass sich für jede descannte Bildlinie des Lichtstrahls ein x, λ-Frame ergibt, um SPIM-Bilder (Selective Plane Illumination Microscopy) von der Probe zu erhalten.
Die Aufgabe wird des Weiteren durch ein Verfahren der Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie zur Fluoreszenzlebensdauer-Messung (FLIM) mittels eines durch eine Probe gescannten Lichtstrahls gelöst mit folgenden Schritten:

– Erzeugen des Lichtstrahls entlang einer Beleuchtungsachse mittels eines Kurzpulslasers,
– Scannen des Lichtstrahls entlang einer zur Beleuchtungsachse orthogonalen Scanachse mittels eines Linearscanners mit einer Frequenz zwischen 0,1 Hz bis 1 kHz,
– Erzeugen einer mikroskopischen Abbildung entlang einer optischen Achse derart, dass ein Mikroskopobjektiv entlang einer Detektionsachse senkrecht zu der Beleuchtungsachse und einer Objektebene, in der die Beleuchtungsachse gescannt wird, jeweils eine Beleuchtungslinie von der Probe als Bildlinie in eine Zwischenbildebene abbildet,
– Rückstellen der durch die Scanbewegung des Linearscanners erzeugten Bewegung des von den Probenpunkten ausgehenden Fluoreszenzlichts mittels eines zwischen einer vor- und einer nachgeordneten Relayoptik angeordneten Schwenkspiegels mit einer parallel zu der vom Mikroskopobjektiv abgebildeten Bildlinie ausgerichteten Drehachse, wobei der Schwenkspiegel synchron, aber entgegengesetzt zur Scanbewegung des Lichtstrahls so bewegt wird, dass die Bildlinie von einer Pupillenebene der dem Schwenkspiegel nachgeordneten Relayoptik in eine weitere Zwischenbildebene ortsfest abgebildet wird, sodass das von allen Probenpunkten ausgehende Fluoreszenzlicht in eine Schlitzblende fällt,
– zeitaufgelöstes Detektieren der Lebensdauer des Fluoreszenzlichts jeder Bildlinie mittels eines der Schlitzblende nachgeordneten zeitauflösenden Detektors durch Synchronisation einer zeitabhängigen Hochspannung einer orthogonal zur Schlitzblende und zur optischen Achse wirksamen Ablenkeinheit, sodass von jeder Bildlinie ein x, t-Frame der Probe aus der belichteten Lichtscheibe erzeugt wird.

Vorteilhaft wird der Kurzpulslaser mit einer Pulsrepetionsrate zwischen 1 kHz und 100 MHz betrieben und die Ablenkeinheit des zeitauflösenden Detektors mit der Laserpulsrepetitionsrate synchronisiert, um eine FLIM-Aufnahme der Probe zu erzeugen und in jeder Bildlinie die Lebensdauer des Fluoreszenzlichts mittels einer Streak-Kamera als zeitauflösender Detektor zu detektieren.
In einer bevorzugten Ausführung wird die Ablenkeinheit des zeitauflösenden Detektors nach einer vollständigen FLIM-Aufnahme bei Bedarf von ihrer Synchronisation mit der Laserrepetitionsrate auf eine Synchronisation mit der Linearscannerfrequenz elektronisch umgeschaltet, wobei die Synchronisation mit der Scanfrequenz von Linearscanner und Schwenkspiegel erfolgt, sodass mit der herkömmlichen Streak-Kamera auch einzelne 2D-Bilder der Probe aufgenommen werden können.
In einer weiteren Modifikation kann es vorteilhaft sein, den zeitauflösenden Detektor durch einen spektral-selektiven Detektor auszutauschen, um – alternativ zu FLIM-Aufnahmen – SPIM-Bilder durch Erzeugung von entlang der Schlitzblende linear konfokalen x, λ-Frames jeder Bildlinie aufzunehmen.
Die Erfindung basiert auf der Grundüberlegung, dass der Stand der Technik stets daran leidet, dass multispektrale oder zeitliche Auflösung der Fluoreszenz nach dem DLSFM-Prinzip zumeist eine Folge von mehreren seriell aufgenommenen Bildern (sowohl bei SPIM als auch FLIM) erfordert, wobei sich die Unmöglichkeit multispektraler Beobachtung von Abklingzeiten, insbesondere bei typischen Zeitauflösungen im oberen Picosekunden- bis Nanosekundenbereich ergibt. Die Erfindung löst diese Probleme durch Anwendung einer linear-konfokalen Arbeitsweise des Mikroskops, indem ein Schwenkspiegel für eine abtastungssynchrone Abbildung der in der Probe angeregten Beleuchtungslinie auf einen parallel zu dessen Bildlinie ausgerichteten Eintrittsspalt eines zeitauflösenden Detektors (Streak-Kamera) oder eines spektral-selektiven Detektors (Spektrometer) sorgt und durch die serielle Abbildung einzelner zeitlich oder spektral zerlegter eindimensional erzeugter Fluoreszenzorte der Probe eine Aufnahme aus einzelnen Bildzeilen-Frames (x, t-Frames oder x, λ-Frames) der gescannten Lichtscheibe der Probe synchron zur Abtastgeschwindigkeit des Linearscanners der Beleuchtungseinrichtung oder zur Impulsfrequenz des Kurzpulslasers aufgenommen wird, die zudem durch eine parallel zur Bildlinie angeordnete Schlitzblende konfokal beschränkt ist und somit eine höhere räumlich Auflösung aufweist.
Mit der Erfindung wird eine verbesserte Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie (LSFM) realisiert, die beim Sectioning von medizinischen oder biologischen Proben mittels eines gescannten Lichtstrahls und eines Descanning-Spiegels zur Rückführung der durch den Lichtstrahl gescannt angeregten und als bewegte lineare Bildlinie abgebildete Fluoreszenz in eine stationär auf eine konfokale Schlitzblende vor dem Detektor abgebildete Bildlinie eine höhere axiale und/oder spektrale Auflösung erreicht. Mit diesem Aufbau lässt sich bei Einsatz eines Kurzpulslasers die zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung (FLIM) verbessern, indem das Fluoreszenzabklingverhalten mit einer Streak-Kamera erfasst wird, ohne an Zeitintervalle der (seriellen) Auslesung mehrerer vollständiger Fluoreszenzbilder einer komplett abgetasteten Lichtscheibe gebunden zu sein.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert werden. Dabei zeigen:
1: eine Prinzipdarstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops zur LSFM für FLIM-Messungen;
2: eine schematische Darstellung einer bekannten DLSFM-Ausführung des Standes der Technik, bei der die spektrale Auflösung der Fluoreszenz mittels wechselbarer Filter durch serielle Aufnahme von 2D-Bildern erfolgt;
3: eine schematische Darstellung einer DLSFM-Ausführung für FLIM-Messungen in Anlehnung an die US 8 921 809 B2 (Stand der Technik);
4: eine schematische Darstellung einer Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops zur FLIM-Analyse durch zeitauflösende Aufnahme der Fluoreszenz unter Verwendung eines mit der Impulsanregung eines Kurzpulslasers synchronisierten Schwenkspiegels und einer Schlitzblende zu einem zeitauflösenden Detektor (z. B. Streak-Kamera) mit konfokaler Erfassung einer Vielzahl von eindimensionalen x, t-Frames, die anschließend im Bildspeicher fusioniert werden;
5: eine schematische Darstellung einer modifizierten Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops zur multispektralen Aufnahme der Fluoreszenz unter Verwendung des mit der Scanbewegung des Lichtstrahls synchronisierten Schwenkspiegels zur Rückführung der gescannten Fluoreszenz-Bildlinie auf die konfokale Schlitzblende als Eintrittsspalt eines Gitterspektrometers zur Erfassung von eindimensionalen x, λ-Frames, die anschließend im Bildspeicher fusioniert werden, und
6: eine schematische Darstellung der Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops gemäß 5, wobei die Schlitzblende als Eintrittsspalt eines Prismenspektrometers zur Erfassung eindimensionaler x, λ-Frames ausgebildet ist.
Ein Mikroskop zur LSFM-Mikroskopie gemäß der Erfindung enthält in seinem Grundaufbau – wie in 1 dargestellt – eine Beleuchtungseinrichtung 1 mit einem dünnen Lichtstrahl 11 entlang einer Beleuchtungsachse X, der mittels eines Linearscanners 12 zur Erzeugung einer Lichtscheibe L (die auch häufig Lichtblatt genannt wird) entlang einer Scanachse Y quer zur Beleuchtungsachse X gescannt wird, und eine Detektionseinrichtung 8, mit der Licht detektierbar ist, das entlang der Beleuchtungsachse X aus einem Probenbereich 21 abgestrahlt wird, wobei ein Mikroskopobjektiv 33 eine Detektionsachse Z senkrecht zur Beleuchtungsachse X und einer Objektebene 32, in der die Beleuchtungsachse X liegt, aufweist. Charakteristisch im Detektionsstrahlengang entlang einer optischen Achse 31 ist ein mit der Scanbewegung des Lichtstrahls 11 synchronisierter Schwenkspiegel 6, der die laterale Bewegung einer Bildlinie 53, die infolge der durch lineare Scanbewegung des Lichtstrahls 11 mittels des Linearscanners 12 erzeugten Beleuchtungslinie 22 entsteht, kompensiert. Dabei wird die descannte Beleuchtungslinie 22 in einer Zwischenbildebene 51 abgebildet und ist als quer zur Längsausdehnung ebenfalls lateral bewegte Bildlinie 53 sichtbar. In einer weiteren über eine Relayoptik 35, 36 erzeugten Zwischenbildebene 52 wird diese Bewegung der Bildlinie 53 durch eine entgegengesetzt und synchron zur Verschiebung der Bildlinie 53 ausgeführte Kippbewegung des Schwenkspiegels 6 so kompensiert, dass die Bildlinie 53 für jede Scanbewegung des Lichtstrahls 11 in der Probe 2 in der weiteren Zwischenbildebene 52 nach der nachgeordneten Relayoptik 36 ortsfest zu liegen kommt und somit mittels einer Schlitzblende 7 konfokal gefiltert wird. Diese konfokale Auswertung wird erreicht, indem der Schwenkspiegel 6 in einer Pupillenebene der nachgeordneten Relayoptik 36 positioniert ist und synchron entgegengesetzt zur Scanbewegung des Linearscanners 12 bewegt wird und in der der nachgeordneten Relayoptik 36 nachfolgenden Bildebene 5 die Schlitzblende 7 parallel zur ortsfesten Position der Bildlinie 53 in der weiteren Zwischenbildebene 52 ausgerichtet ist. Die Schlitzblende 7 dient als konfokale Apertur und ermöglicht ein zusätzliches optisches Sectioning, das eine Steigerung der Auflösung gegenüber dem reinen beleuchtungsbedingten Sectioning, das durch die Scheibendicke der Beleuchtung begrenzt ist, darstellt.
Zur Darstellung und Erläuterung der Vorzüge der Erfindung soll zunächst auf die üblicherweise gemäß den LSFM-Anordnungen des Standes der Technik auftretenden Probleme bzw. Beschränkungen der Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie anhand der 2 und 3 eingegangen werden.
2 zeigt stilisiert vereinfacht die Vorgehensweise der LSFM in einer Ausführung der Bildaufnahme 9, bei der eine Beleuchtungseinrichtung 1 entlang einer Beleuchtungsachse X eine Beleuchtungslinie 22 erzeugt, die mittels eines Scans entlang einer Scanachse Y (hier vertikal) innerhalb eines Probenbereiches 21 zu einer beleuchteten Lichtscheibe L (nur in 1 dargestellt) kombiniert wird (DLSFM). Ein dünner Lichtstrahl 11 liegt in einer Probenebene (o. B. d. A in x-Richtung) und regt die Probe 2 zur Fluoreszenz an. Probenpunkte außerhalb des Lichtstrahls 11 bleiben dunkel. Eine Detektionsoptik 3, bestehend aus Mikroskopobjektiv 33 und Tubuslinse 34, schaut auf die Probe 2 aus der z-Richtung (Detektionsachse Z). Der Lichtstrahl 11 erscheint aus dem Blickwinkel der Detektion als Beleuchtungslinie 22.
Durch das laterale Scannen der Beleuchtungslinie 22 innerhalb der Objektebene 32 (y-Richtung) wird nach und nach der gesamte Probenbereich 21 (nur in 1 dargestellt) beleuchtet und kann detektiert werden. Die Bildaufnahme 9 erfolgt zeilenweise, d. h. jede Bildzeile wird einzeln beleuchtet und somit seriell aufgenommen. Die Fusion zu einem Gesamtbild erfolgt im Anschluss im Bildspeicher (nicht dargestellt). Für spektral-selektive Bildaufnahmen 9 zur Erzeugung von Frame-Stapeln 91 mit Spektralparametern (d. h. für unterschiedliche Wellenlängenbereiche λ₁, λ₂, ..., λ_n) sind erneute Serien von seriell aufgenommenen Bildzeilen erforderlich. Da die Beleuchtung nur in der x, y-Ebene erfolgt, bleiben Probenpunkte außerhalb der Objektebene 32 dunkel. Infolgedessen ergibt sich ein optisches Sectioning durch die Beleuchtung. Beim DLSFM ist zum einen die spektrale Auflösung der Fluoreszenz beschränkt, weil für die Anwendung unterschiedlicher Bandpass- oder Langpassfilter wechselbare Filter anstelle des Spektralfilters 4 zwischen dem Mikroskopobjektiv 33 und der Tubuslinse 34 nacheinander eingesetzt werden müssen, wodurch jeweils ein erneutes Descannen des beleuchteten Probenbereichs 21 (serielle Aufnahme der descannten Beleuchtungslinie 22) notwendig ist. Zum anderen ist das axiale Auflösungsvermögen beim optischen Sectioning durch die endliche Dicke des Lichtstrahls 11 begrenzt und bleibt häufig hinter der durch die Schärfentiefe der Detektionsoptik 3 möglichen Auflösung zurück, sodass das Fluoreszenzlicht aus der gesamten Dicke der durch den Lichtstrahl 11 angeregten Lichtscheibe L ausgelesen wird.
In 3 ist eine im Stand der Technik praktizierte Verfahrensweise zur FLIM-Aufzeichnung der Fluoreszenzabklingkurve für jeden aufgenommenen Bildpunkt mittels ortsauflösender Detektoren als zeitauflösende Einzelphotonenzähler für eine Fluoreszenzlebensdauermikroskopie in der Zeitdomäne gezeigt. Im Unterschied zu 2 ist hier eine modulierte Lichtquelle mit einer Modulationsfrequenz im MHz-Bereich und Pulslängen im ps-Bereich vorhanden. Das Licht dieses in der Beleuchtungseinrichtung 1 eingesetzten Kurzpulslasers 14 wird über eine Beleuchtungsoptik 13 und ein Spektralfilter 4 auf die Probe 2 gerichtet, indem – wie zu 2 beschrieben – der entlang einer Beleuchtungsachse X ausgerichtete Lichtstrahl 11 entlang einer quer zur Beleuchtungsachse X ausgerichteten Scanachse Y den Lichtstrahl 11 schwenkt, wodurch die für das Sectioning gewünschte Lichtscheibe L entsteht. Für die Aufnahme des von der Probe 2 emittierten Fluoreszenzlichts ist das Mikroskopobjektiv 33 entlang einer senkrecht zu Beleuchtungsachse X und Scanachse Y ausgerichteten Detektionsachse Z angeordnet und dem Mikroskopobjektiv 33 ist eine Rastereinheit 62 nachgestellt, die mittels einer Bildaufnahmesteuerung 93 mit dem Linearscanner 12 in der Beleuchtungsachse X und der Detektionseinrichtung 8 derart synchronisiert ist, dass die zum jeweiligen Aufnahmezeitpunkt in der Objektebene 32 beleuchtete Zeile über eine Filtereinheit 63 mit der gewählten Emissionswellenlänge λ_E auf eine Detektorzeile der Detektionseinrichtung 8 abgebildet wird. Die Detektionseinrichtung 8 liefert nur ein eindimensionales Positionssignal. Über die Aufnahme mehrerer solcher eindimensionaler Bilder bei verschiedenen Positionen des Lichtstrahls 11 kann rechnergesteuert ein zweidimensionales Bild erstellt werden. Die Ortsinformation in der Scanachse Y erhält man aus dem Positionssignal der Ansteuerung des Laserscanners 12. Information über das zeitliche Abklingverhalten der Fluoreszenz kann gewonnen werden, indem eine gegatete Kamera in der Detektionseinrichtung 8 nur Fluoreszenz in definierten Zeitfenstern mit bekanntem zeitlichem Versatz zum Anregungsimpuls des Kurzpulslasers 14 aufnimmt. Über die relativen Intensitäten in mehreren solcher Zeitfenster lässt sich der Fluoreszenzabfall bestimmen. Nachteilig ist hierbei jedoch, dass Photonen, die außerhalb des jeweils aufgenommenen Zeitfensters auf die Detektionseinrichtung 8 auftreffen, nicht detektiert werden und somit verloren gehen. Weiterhin müssen für die Bestimmung des Fluoreszenzabfalls mehrere Aufnahmen mit unterschiedlichem Zeitversatz zum Anregungsimpuls aufgenommen werden.
Im Grundaufbau eines erfindungsgemäßen LSFM für FLIM-Messungen, wie er in 1 sehr schematisch dargestellt ist, wird in der Beleuchtungseinrichtung 1 als Quelle für den Lichtstrahl 11 ein Kurzpulslaser 14 (vorzugsweise fs-Laser oder ps-Laser) zur Fluoreszenzanregung verwendet. In einer Zwischenbildebene 51 der Detektionsoptik 3 erfolgt ein Descanning der Beleuchtungslinie 22 der Probe 2. Die Bildlinie 53 der Beleuchtungslinie 22 bewegt sich über die Zwischenbildebene 51. Mit einer Relayoptik 35, 36 wird die Bildlinie 53 in eine weitere Zwischenbildebene 52 übertragen, wobei sich in einer Pupillenebene der nachgeordneten Relayoptik 36 der mit dem Linearscanner 12 synchronisierte Schwenkspiegel 6 befindet, der so angesteuert wird, dass in der weiteren Zwischenbildebene 52 die Bildlinie 53 ortsfest ist. Die Abbildung der descannten Bildlinie 53 erfolgt auf die Schlitzblende 7, die als konfokale Aperturblende dient und ein zusätzliches detektionsoptisches Sectioning ermöglicht, das die durch den Lichtstrahl 11 vorgegebene Lichtscheibendicke unterschreiten kann, wodurch sich in der Folge eine erhöhte axiale Auflösung gegenüber einem normalen Mikroskop zur Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie ergibt. Die Schlitzblende 7 in der weiteren Zwischenbildebene 52 dient in dieser Ausführung der Erfindung der Detektionseinrichtung 8 als Eintrittsspalt 71 eines zeitauflösenden Detektors 81, der bevorzugt in Form einer Streak-Kamera ausgeführt ist. Im zeitauflösenden Detektor 81 wird (nach dem Streak-Kamera-Prinzip) das gepulst übertragene Fluoreszenzlicht einer Bildlinie 53 auf eine Photokathode 82 gerichtet, erzeugt dort Photoelektronen, die wie in einer Elektronenstrahlröhre im elektrischen Feld beschleunigt werden und auf eine Mikrokanalplatte 84 (MOP – Micro-Channel Plate mit Phosphorschirm, nicht separat gezeichnet) treffen, wobei zusätzlich mittels der Ablenkeinheit 83 eine seitliche Hochfrequenzablenkung mit der Scanfrequenz des Linearscanners 12 synchronisiert wird, um dadurch die Zeitinformation, die im Impulsprofil steckt, in eine räumliche Verteilung des Fluoreszenzverlaufs umzuwandeln. Die MOP 84 mit Phosphorschirm verstärkt die auftreffenden Photoelektronen und stellt diese über den Phosphorschirm auf dem Chip einer Kamera 85 dar. Dabei können die Photoelektronen auch auf einem Phosphorschirm sichtbar gemacht und durch optische Abbildung auf den Chip der Kamera 85 übertragen werden (nicht gezeichnet).
Die Synchronisation mit der Impulsfrequenz des Kurzpulslasers 14 liefert ein x, t-Frame bei Aufnahme mit einer geeigneten Kamera 85 (CCD, ICCD, EMCCD, sCMOS). Die Ortsinformation entlang der Beleuchtungsachse X wird dabei, abgebildet entlang der Schlitzblende 7, direkt übertragen und senkrecht dazu entsteht die Zeitinformation, die aus dem Impulsprofil der Laserimpulse des Zeitintervalls Δt als eine räumliche Verteilung Δx (als sog. Streak-Bild) des Fluoreszenzverlaufs gewandelt vorliegt. Die Bildaufnahme 9 von zeitaufgelösten Fluoreszenzlebensdauer-Bildern erfolgt wieder durch zeilenweises Scannen der Probe 2 entlang der Scanachse Y und Speicherung der Frame-Stapel 92 mit Zeitparametern, d. h. der Stapel von x, t-Frames, die jeweils für die unterschiedlichen (synchronisierten) Scanpositionen (y₁, y₂, ... y_n) seriell aufgenommen wurden, und anschließende Fusionen der Daten der x, t-Frames zu jeweils einem x, y, t-Bild.
Ein Ausführungsbeispiel zur erfindungsgemäßen LSFM-Mikroskopie für die Detektion von zeitaufgelöster Fluoreszenz ist in 4 dargestellt. Dafür sind im Stand der Technik Aufnahmen mehrerer Bilder (≥ 3) notwendig, um Abklingzeiten der Fluoreszenz zu erfassen. Beim vorliegenden LSFM mit konfokaler Schlitzblende 7 ist eine solche serielle Mehrfachaufnahme nicht notwendig.
FLIM-Aufnahmen laufen dabei wie folgt ab. Für die Generierung der FLIM-Bilder wird die Probe 2 über die Bewegung des Schwenkspiegels 6 zeilenweise auf die Schlitzblende 7 abgebildet und in der Detektionseinrichtung 8 detektiert. Die x-Achse der Probe 2 ist dabei zur Orientierung der Schlitzblende 7 so ausgerichtet, dass deren Abbild mit der Schlitzblende 7 zusammenfällt. Die Beleuchtungseinrichtung 1 mit Linearscanner 12 stellt dabei sicher, dass nur die jeweils gerade auf die Schlitzblende 7 des zeitauflösenden Detektors 81 abgebildete Zeile beleuchtet wird. Dazu sind Linearscanner 12 und Schwenkspiegel 6 in geeigneter Weise zueinander synchronisiert. Die Aufnahme eines zweidimensionalen Bildes kann durch die computergestützte Zusammenfügung der generierten einzelnen Bildlinien 53 realisiert werden. Dabei ist die Anzahl und effektive Größe der Pixel in der x-Richtung von Pixelzahl und -abstand des zeitauflösenden Detektors 81 der Detektionseinrichtung 8 abhängig. In der y-Richtung sind die Pixel dagegen prinzipiell frei wählbar. Durch eine geeignete Wahl des Zeilenversatzes zwischen den einzelnen Aufnahmen kann man (o. B. d. A.) Pixel von einheitlicher Kantenlänge erzielen. Die Zahl der Pixel in y-Richtung kann ebenfalls frei eingestellt werden. Im zeitauflösenden Detektor 81 wird die Bildlinie 53 der jeweiligen Beleuchtungslinie 22 nach dem Prinzip einer Streak-Kamera temporal in ein zweidimensionales Bild aufgespaltet. Die Probe 2 wird dazu mit einer gepulsten Lichtquelle (Kurzpulslaser 14) zur Fluoreszenz angeregt. Die Probe 2 emittiert dabei nach jedem Anregungsimpuls Photonen mit einem typischen Zeitverlauf, der durch die Fluoreszenzlebensdauer (z. B. eines eingebrachten Markers) gegeben ist. Dieses emittierte Licht wird nun auf den Eintrittsspalt 71 des zeitauflösenden Detektors 81 (Streak-Kamera) abgebildet, hinter dem sich eine Photokathode 82 befindet, die die einfallenden Photonen absorbiert und eine entsprechende Anzahl Elektronen freisetzt. Die von dieser Photokathode 82 ausgehenden Elektronen werden dabei über eine Beschleunigungsspannung auf eine Mikrokanalplatte 84 (MOP) hin beschleunigt. Diese vervielfältigt die eintreffenden Elektronen und beschleunigt diese auf den zugehörigen Phosphorschirm, der mittels einer Kamera 85 abgebildet wird. Vor dem Auftreffen auf die MOP 84 passieren die Elektronen ein elektrisches Wechselfeld einer Ablenkeinheit 83, durch das sie quer zur Spaltrichtung des Eintrittsspaltes 71 abgelenkt werden. Dieses Wechselfeld der Ablenkeinheit 83 ist synchronisiert mit der Impulsfolge des Kurzpulslasers 14, sodass der Ort quer zum Eintrittsspalt 71 von der verstrichenen Zeit der Emission eines Photons relativ zum dazugehörenden Anregungsimpuls abhängt. Vorzugsweise (aber o. B. d. A.) wird dabei die Wechselspannung der Ablenkeinheit 83 als Sinus ausgeführt und nur der lineare Teil des Kurvenverlaufs herangezogen. Die derart in ein zweidimensionales Bild konvertierte x(t)-Bildlinie 54 wird dann über die Mikrokanalplatte 84 verstärkt auf einem Phosphorschirm dargestellt und auf einer Kamera 85 aufgenommen. Die Dauer der Aufnahme einer Zeile hängt in der Regel vom Erreichen eines hinreichenden Signal-zu-Rausch-Verhältnisses (SNR) ab und umfasst praktisch eine Vielzahl von Impulszügen und kann im Bereich weniger hundertstel Sekunden bis Sekunden liegen, also mehrerer Millionen Pulszüge. Für eine Verbesserung des SNR können zusätzlich auch mehrere Einzelaufnahmen gemittelt oder aufaddiert werden. Die Repetitionsrate des Kurzpulslasers 14 liegt dabei vorzugsweise im Bereich mehrerer 10 MHz. Typische Beleuchtungseinrichtungen 1 sind dabei Ti:Saphir-Laser (häufigste Repetitionsraten von 80 MHz) oder handelsübliche gepulste Diodenlaser (mit Impulsraten im Bereich 10 MHz, 20 MHz, 40 MHz, 50 MHz, 80 MHz). Die genaue Repetitionsrate kann dabei so abgestimmt werden, dass sie optimal zur Lebensdauer der jeweils detektierten Fluorophore passt. Es ist auch denkbar, regenerative Verstärkersysteme mit Repetitionsraten im Bereich von ca. 1 kHz bis 250 kHz zu verwenden, wenn man anstelle einer 1-Photonen-Anregung eine nichtlineare 2-Photonen-Anregung verwenden will. Als Ergebnis erhält man zunächst für jede Bildzeile in y-Richtung eine Serie von (x, t)-Frames. Diese können dann anschließend zu einem (x, y, t)-Datensatz fusioniert werden und ergeben somit den Verlauf der Abklingkurve für einen bestimmten beobachteten Fluorophor (z. B. einen verwendeten Marker).
Vorteil der Verwendung einer Streak-Kamera gegenüber anderen FLIM-Verfahren (z. B. gated ICCDs) liegt vor allem in der hohen erzielbaren Zeitauflösung, die je nach konkreter Ausführung bis in den Bereich weniger Pikosekunden gebracht werden kann.
Für den verwendeten Aufbau des erfindungsgemäßen LSFM-Mikroskops sind nachfolgend noch Modifikationen beschrieben, die die DLSFM abwandeln und somit multivalent einsetzbar machen.
LSFM mit Streak-Kamera für 2D-Modus der Bildaufnahme Bei dieser Betriebsvariante wird derselbe LSFM-Aufbau, wie in 4 gezeigt, genutzt. Ein gewünschter 2D-Modus ist dem Aufnahmemodus des FLIM grundsätzlich ähnlich. Der wesentliche Unterschied besteht darin, dass die Ablenkeinheit 83 des zeitauflösenden Detektors 81 (der Streak-Kamera) nicht mit dem Impulszug des Kurzpulslasers 14 synchronisiert wird, sondern mit dem Linearscanner 12 (durch die gestrichelte Steuerungsleitung vom Linearscanner 12 zur Ablenkeinheit 83 symbolisiert) bzw. dem Schwenkspiegel 6 (der mit dem Kurzpulslaser 14 synchronisiert ist). Die Ablenkspannung wird hierbei proportional zum Auslenkwinkel des Schwenkspiegels 6 gewählt. Hierdurch kann der durch den Schwenkspiegel 6 aufgehobene y-Versatz der Bildlinie 53 wieder rückgängig gemacht werden und ein schnelles 2D-Imaging ist möglich, wie bei einem normalen LSFM-Kamera-System. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass man keine optische Umgehung der Streak-Kamera oder einen zweiten abgespaltenen Strahlengang mit separater Kamera benötigt und somit Bauraum und Kosten sparen kann. Bei der Aufnahme wird für eine möglichst hohe Aufnahmegeschwindigkeit die Belichtungszeit der Kamera 85 so eingestellt, dass diese identisch ist mit der Zeit, die der Lichtstrahl 11 benötigt, um einmal über die Probe 2 geschwenkt zu werden. Je nach Helligkeit der Probe 2 kann dies im Bereich weniger Mikrosekunden bis zu einer Sekunde sein. Für eine einfachere Synchronisation der Aufnahme mit dem Schwenkspiegel 6 kann es auch vorteilhaft sein, die Beleuchtung stroboskopisch auszuführen, d. h. über ein schnelles Schalten der Beleuchtungseinrichtung 1 die Beleuchtung auf den abzubildenden Probenbereich 21 einzuschränken und den Kurzpulslaser 14 außerhalb des abzubildenden Probenbereichs 21 abzuschalten. Dies hat den Vorteil, dass die Anforderungen an das Kamera-Timing nicht mehr ganz so hoch sind. Die oben erwähnten Laserlichtquellen können i. d. R. hinreichend genau gesteuert werden (direktmodulierte Diodenlaser, akusto-optische Modulatoren) mit Timing-Geschwindigkeiten im μs-Bereich. Typische Aufnahmeraten (fps – frames per second) werden hierbei von der Kamera 85 limitiert und können je nach verwendeter Kamera 85 im Bereich bis zu einigen hundert Bildern pro Sekunde (10 fps bis 300 fps) liegen, wobei typische Aufnahmeraten aber eher im Bereich von Videoraten (25 fps bis 30 fps) und darunter liegen werden. Die gepulste Natur der Anregung fällt bei den letzteren Bildraten nicht mehr ins Gewicht und die Anregung ist quasi eine cw-Anregung. Diese Tatsache lässt sich für weitere Modifikationen des erfindungsgemäßen LSFM-Mikroskops ausnutzen, die im Folgenden beschrieben sind.
5 zeigt eine modifizierte Ausführung des erfindungsgemäßen LSFM-Mikroskops, mit der die in 2 aufgezeigten Nachteile der SPIM beseitigt werden, indem der zeitauflösende Detektor 81 durch einen spektral-selektiven Detektor 86 ausgetauscht wird. Wie nach dem DLSFM-Prinzip üblich, wird durch die Beleuchtungseinrichtung 1 ein Lichtstrahl 11 generiert, der in diesem Beispiel von einem Kurzpulslaser 14 (als Quasi-cw-Laser) mit einem Strahldurchmesser zwischen 1 μm und 20 μm erzeugt ist. Der Linearscanner 12 sorgt für die Scanbewegung des Lichtstrahls 11 entlang einer quer zur Beleuchtungsachse X ausgerichteten Scanachse Y und erzeugt in der Probe 2 eine Beleuchtungslinie 22, die sich innerhalb eines definierten Probenbereichs 21 (Lichtscheibe L innerhalb der Objektebene 32 der Detektionsoptik 3) innerhalb einer definierten Ebene bewegt.
Entlang einer Detektionsachse Z, die orthogonal auf Beleuchtungsachse X und Scanachse Y steht, wird über das Mikroskopobjektiv 33 und die Tubuslinse 34 entlang der optischen Achse 31 in einer Zwischenbildebene 51 eine Bildlinie 53 der vom Lichtstrahl 11 erzeugten Beleuchtungslinie 22 abgebildet. Diese Bildlinie 53 führt entsprechend dem Abbildungsmaßstab der Detektionsoptik 3 eine der Scanbewegung ähnliche Bewegung aus und wird über eine Relayoptik 35, 36 in eine weitere Zwischenbildebene 52 übertragen. Der dazwischen in einer Pupillenebene der Relayoptik 35, 36 liegende Schwenkspiegel 6 weist eine Drehachse 61 auf, die orthogonal zur optischen Achse 31 und parallel zur Bildlinie 53 orientiert ist. Seine Schwenkbewegung ist mit dem Linearscanner 12 synchronisiert und derart entgegengesetzt ausgeführt, dass die infolge der Scanbewegung der Beleuchtungslinie 22 von der Bildlinie 53 ausgeführte Bewegung kompensiert wird. Das heißt, dass die Bildlinie 53 in der weiteren Zwischenbildebene 52 nach der nachgeordneten Relayoptik 36 stationär gehalten wird, sodass sie in eine Schlitzblende 7 einfällt, die als konfokale Aperturblende des Mikroskops wirkt und ausschließlich die Bildlinie 53 passieren lässt.
In der Ausführung von 5 hat die Schlitzblende 7 die Funktion eines Eintrittsspaltes 71 für einen spektral-selektiven Detektor 86, der in Form eines Gitterspektrometers ausgebildet ist. Das durch die Schlitzblende 7 als Eintrittsspalt 71 einfallende Fluoreszenzlicht fällt in dem spektral-selektiven Detektor 86 auf ein dispersives Gitter 87, wird spektral zerlegt (aufgefächert) und über eine Abbildungsoptik 88 auf die Bildebene 5 einer Kamera 85, die beispielsweise eine CCD, ICCD, EMCCD oder sCMOS sein kann, abgebildet. In der Bildebene 5 wird dann die vollständig oder bereichsweise separierte spektrale Charakteristik der Fluoreszenz der Probe 2 im beleuchteten Probenbereich 21 aufgenommen. Die Bildaufnahme 9 der x, λ-Frames erfolgt hier in Form eines Frame-Stapels 91 mit Spektralparametern, d. h. Wellenlängencharakteristik als Stapel von x, λ-Frames, die jeweils für die unterschiedlichen (synchronisierten) Scanpositionen (y₁, y₂, ... y_n) seriell aufgenommen werden. Die spektral aufgelösten Gesamtbilder entstehen durch zeilenweises Abscannen der Probe 2 und anschließende Fusion der Daten der Frame-Stapel 91 zu jeweils einem x, y, λ-Bild.
6 enthält ein zu 5 gleichwertiges Ausführungsbeispiel, bei dem die Art des spektral-selektiven Detektors 86 in Form eines Prismenspektrometers ausgeführt ist. Dabei tritt das durch die Schlitzblende 7 in das Spektrometer einfallende Fluoreszenzlicht in ein Dispersionsprisma 89 ein, wird spektral zerlegt und mittels der Abbildungsoptik 88 in die Bildebene 5 abgebildet, wo es mittels einer ICCD-, EMCCD- oder sCMOS-Kamera 85 detektiert werden kann. Alle Grundfunktionen und die Auswertung des Sectioning der Probe 2 für eine SPIM-Aufnahme erfolgen in der gleichen Weise wie zu 5 beschrieben.
Mit dem erfindungsgemäßen LSFM-Mikroskop für FLIM-Aufnahmen lassen sich zeitlich hochaufgelöste Fluoreszenzlebensdauerbeobachtungen durchführen, ohne dass Serien von LSFM-Aufnahmen mit hohen Bildraten erfolgen müssen oder die Fluoreszenz in Zeitfenstern mit einem definierten Versatz bezüglich deren Fluoreszenzabfalls analysiert werden, die jeweils hohe Fluoreszenzintensitäten erfordern. Das ist dadurch möglich, weil bei einer fortlaufenden DLSFM-Aufnahme für jedes Pixel der beobachteten Fluoreszenz-Bildlinie 53 die Fluoreszenzdynamik aufgrund einer räumlichen Konvertierung des Fluoreszenzverlaufs der einzelnen Anregungsimpulse erfasst wird. Zum erfindungsgemäßen Aufbau des LSFM zur FLIM-Aufnahme zählt auch die Umschalt-Möglichkeit – ohne Änderung des zeitauflösenden Detektors 81 (z. B. Streak-Kamera) und ohne dessen optische Umgehung – 2D-Bilder aufzunehmen, indem lediglich die Synchronisation von der Frequenz des Linearscanners 12 und des Schwenkspiegels 6 auf die Impulsfrequenz des Kurzpulslasers 14 umgeschaltet wird. Durch eine Modifikation des FLIM-Aufbaus, bei der lediglich der zeitauflösende Detektor 81 durch einen spektral-selektiven Detektor 86 ausgetauscht wird, kann die Fluoreszenz auch spektral-selektiv erfasst und aufgrund linear-konfokaler Aufnahmen das Sectioning unabhängig von der Dicke der beleuchteten Lichtscheibe L mit höherer Auflösung betrieben werden.
Bezugszeichenliste

1: Beleuchtungseinrichtung
11: Lichtstrahl
12: Linearscanner
13: Beleuchtungsoptik
14: Kurzpulslaser
2: Probe
21: Probenbereich (beleuchtet)
22: Beleuchtungslinie
3: Detektionsoptik
31: optische Achse
32: Objektebene (der Mikroskopoptik)
33: Mikroskopobjektiv
34: Tubuslinse
35, 36: Relayoptik
4: Spektralfilter
5: Bildebene
51: Zwischenbildebene
52: weitere Zwischenbildebene
53: Bildlinie (des Lichtstrahls)
54: x(t)-Bildline
6: Schwenkspiegel
61: Drehachse
62: Rastereinheit
63: (Emissions-)Filtereinheit
7: Schlitzblende (konfokale Aperturblende)
71: Eintrittsspalt
8: Detektionseinrichtung
81: zeitauflösender Detektor
82: Photokathode
83: Ablenkeinheit
84: Mikrokanalplatte (MOP) mit Phosphorschirm
85: Kamera
86: spektral-selektiver Detektor
87: dispersives Gitter
88: Abbildungsoptik
89: Dispersionsprisma
9: Bildaufnahme
91: Frame-Stapel (mit Spektralparameter)
92: Frame-Stapel (mit Zeitparameter)
93: Bildaufnahmesteuerung
L: Lichtscheibe
X: Beleuchtungsachse
Y: Scanachse
Z: Detektionsachse

Claims

Mikroskop zur Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie mit – einer Beleuchtungseinrichtung (1), die mittels eines entlang einer Beleuchtungsachse (X) ausgerichteten Lichtstrahls (11) und einer Scanbewegung des Lichtstrahls (11) entlang einer Scanachse (Y) quer zur Beleuchtungsachse (X) zur Erzeugung einer Lichtscheibe (L) als ein beleuchteter Probenbereich (21) ausgebildet ist, und – einer Detektionseinrichtung (8), mit der Licht detektierbar ist, das entlang einer scannenden Beleuchtungslinie (22) aus dem Probenbereich (21) abgestrahlt wird, wobei eine Detektionsoptik (3) eine Detektionsachse (Z) senkrecht zu der Beleuchtungsachse (X) und einer Objektebene (32), in der der beleuchtete Probenbereich (21) durch die Beleuchtungslinie (22) erzeugt ist, aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass – die Beleuchtungseinrichtung (1) einen Kurzpulslaser (14) zur gepulsten Erzeugung des Lichtstrahls (11) und einen Linearscanner (12) aufweist und – die Detektionseinrichtung (8) nach Mikroskopobjektiv (33) und Tubuslinse (34) enthält: • einen zwischen einer vor- und einer nachgeordneten Relayoptik (35; 36) angeordneten Schwenkspiegel (6) mit einer Drehachse (61), die parallel zu einer vom Mikroskopobjektiv (33) abgebildeten Bildlinie (53) des Lichtstrahls (11) ausgerichtet ist, wobei der Schwenkspiegel (6) in einer Pupillenebene der dem Schwenkspiegel (6) nachgeordneten Relayoptik (36) angeordnet und entgegengesetzt und synchron zur Scanbewegung des Lichtstrahls (11) der Beleuchtungslinie (22) beweglich ist, sodass die Bildlinie (53) in einer weiteren Zwischenbildebene (52) der nachgeordneten Relayoptik (36) ortsfest abgebildet ist, • eine Schlitzblende (7) innerhalb der weiteren Zwischenbildebene (52) der nachgeordneten Relayoptik (36), mit der eine eindimensionale Ortsauflösung von Probenpunkten entlang der Beleuchtungslinie (22) als jeweils genau eine descannte Bildlinie (53) des Lichtstrahls (11) aufnehmbar ist, und • einen der Schlitzblende (7) nachgeordneten zeitauflösenden Detektor (81), der entlang der Schlitzblende (7) die eindimensionale Ortsauflösung von Probenpunkten entlang der Beleuchtungslinie (22) und quer zur Schlitzblende (7) eine Zeitinformation zu den Probenpunkten ergibt, sodass für jede descannte Bildlinie (53) des Lichtstrahls (11) ein x, t-Frame aufnehmbar ist.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Linearscanner (12) eine Scanfrequenz im Bereich zwischen 0,1 kHz und 40 kHz aufweist.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kurzpulslaser (14) Impulsfrequenzen im Bereich von 1 kHz bis 100 MHz aufweist.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der zeitauflösende Detektor (81) eine Streak-Kamera zur Aufnahme des x, t-Frames ist.
Mikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Streak-Kamera eine elektronische Ablenkeinheit (83) mit einer zeitabhängigen Hochspannungssteuerung enthält, die mit einer Frequenz synchron zu einer typischen Repetitionsrate des Kurzpulslasers (14) eingestellt ist, sodass dadurch FLIM-Messungen von einer Probe (2) aufnehmbar sind.
Mikroskop nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinheit (83) der Streak-Kamera in ihrer Frequenz auf typische Repetitionsraten des Kurzpulslasers (14) im Bereich zwischen 10 MHz und 100 MHz synchronisierbar ist.
Mikroskop nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinheit (83) der Streak-Kamera in ihrer Frequenz auf typische Repetitionsraten des Kurzpulslasers (14) im Bereich zwischen 1 kHz und 250 kHz synchronisierbar ist.
Mikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinheit (83) der Streak-Kamera in ihrer Frequenz auf typische Scanfrequenzen von Linearscanner (12) und Schwenkspiegel (6) im Bereich von 0,1 Hz bis 1 kHz synchronisierbar ist.
Mikroskop nach Anspruch 5 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinheit (83) der Streak-Kamera in ihrer Synchronisation elektronisch zwischen Repetitionsrate des Kurzpulslasers (14) und Scanfrequenz des Linearscanners (12) umschaltbar ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung (1) aus Kurzpulslaser (14) und Beleuchtungsoptik (13) als regeneratives Verstärkersystem ausgebildet ist.
Mikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsoptik (13) als ein Axicon und der vom Kurzpulslaser (14) ausgesendete Lichtstrahl (11) als ein Besselstrahl ausgebildet sind.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtscheibenfluoreszenzmikroskop zum Austausch des zeitauflösenden Detektors (81) zur FLIM-Messung durch einen spektral-selektiven Detektor (86) zur SPIM-Messung vorgesehen ist, wodurch entlang der Schlitzblende (7) eine eindimensionale Ortsauflösung von Probenpunkten und quer zur Schlitzblende (7) ein von den einzelnen Probenpunkten ausgehendes Fluoreszenzspektrum aufnehmbar ist, sodass sich für jede descannte Bildlinie (53) des Lichtstrahls (11) ein x, λ-Frame ergibt.
Verfahren der Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie zur Fluoreszenzlebensdauer-Messung mittels eines durch eine Probe (2) gescannten Lichtstrahls (11) mit den Schritten: – Erzeugen des Lichtstrahls (11) entlang einer Beleuchtungsachse (X) mittels eines Kurzpulslasers (14), – Scannen des Lichtstrahls (11) entlang einer zur Beleuchtungsachse (X) orthogonalen Scanachse (Y) mittels eines Linearscanners (12) mit einer Frequenz zwischen 0,1 Hz bis 1 kHz, – Erzeugen einer mikroskopischen Abbildung entlang einer optischen Achse (31) derart, dass ein Mikroskopobjektiv (33) entlang einer Detektionsachse (Z) senkrecht zu der Beleuchtungsachse (X) und einer Objektebene (32), in der der Lichtstrahl (11) gescannt wird, jeweils eine Beleuchtungslinie (22) von der Probe (2) als Bildlinie (53) in eine Zwischenbildebene (51) abbildet, – Rückstellen der durch die Scanbewegung des Linearscanners (12) erzeugten Bewegung von entlang der Beleuchtungslinie (22) aus Probenpunkten ausgehendem Fluoreszenzlicht mittels eines zwischen einer vor- und einer nachgeordneten Relayoptik (35; 36) angeordneten Schwenkspiegels (6) mit einer parallel zu der vom Mikroskopobjektiv (33) abgebildeten Bildlinie (53) ausgerichteten Drehachse (61), wobei der Schwenkspiegel (6) synchron, aber entgegengesetzt zur Scanbewegung des Lichtstrahls (11) so bewegt wird, dass die Bildlinie (53) von einer Pupillenebene der dem Schwenkspiegel (6) nachgeordneten Relayoptik (36) in eine weitere Zwischenbildebene (52) ortsfest abgebildet wird, sodass von allen in die Bildlinie (53) abgebildeten Probenpunkten ausgehendes Fluoreszenzlicht in eine Schlitzblende (7) fällt, – zeitaufgelöstes Detektieren der Lebensdauer des Fluoreszenzlichts jeder Bildlinie (53) mittels eines der Schlitzblende (7) nachgeordneten zeitauflösenden Detektors (81) durch Synchronisation einer zeitabhängigen Hochspannung einer orthogonal zur Schlitzblende (7) und zur optischen Achse (31) wirksamen Ablenkeinheit (83), sodass von jeder Bildlinie (53) ein x, t-Frame der Probe (2) aus einer belichteten Lichtscheibe (L) erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Kurzpulslaser (14) mit einer Pulsrepetionsrate zwischen 1 kHz und 100 MHz betrieben und die Ablenkeinheit (83) des zeitauflösenden Detektors (81) mit der Laserpulsrepetitionsrate synchronisiert wird, um eine FLIM-Aufnahme der Probe (2) zu erzeugen und in jeder Bildlinie die Lebensdauer des Fluoreszenzlichts mittels einer Streak-Kamera zu detektieren.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Ablenkeinheit (83) des zeitauflösenden Detektors (81) nach einer vollständigen FLIM-Aufnahme bei Bedarf von ihrer Synchronisation mit der Laserrepetitionsrate auf Synchronisation mit der Linearscannerfrequenz elektronisch umgeschaltet wird, wobei eine Synchronisation mit der Scanfrequenz von Linearscanner (12) und Schwenkspiegel (6) erfolgt, sodass mit der herkömmlichen Streak-Kamera einzelne 2D-Bilder der Probe (2) aufgenommen werden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei durch Austauschen des zeitauflösenden Detektors (81) durch einen spektral-selektiven Detektor (86) SPIM-Bilder durch Erzeugung von entlang der Schlitzblende (7) linear konfokalen x, λ-Frames jeder Bildlinie (53) aufgenommen werden.