EP3615977A1 - Mikroskop und mikroskopbeleuchtungsverfahren - Google Patents

Mikroskop und mikroskopbeleuchtungsverfahren

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Publication number
EP3615977A1
EP3615977A1 EP18728319.7A EP18728319A EP3615977A1 EP 3615977 A1 EP3615977 A1 EP 3615977A1 EP 18728319 A EP18728319 A EP 18728319A EP 3615977 A1 EP3615977 A1 EP 3615977A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microscope
light illumination
fluorescence
phase
incident
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18728319.7A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Benjamin DEISSLER
Arnold Müller-Rentz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
Publication of EP3615977A1 publication Critical patent/EP3615977A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/02—Objectives
    • G02B21/025—Objectives with variable magnification
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/14—Condensers affording illumination for phase-contrast observation
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/18—Arrangements with more than one light path, e.g. for comparing two specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/241—Devices for focusing
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B2207/00—Coding scheme for general features or characteristics of optical elements and systems of subclass G02B, but not including elements and systems which would be classified in G02B6/00 and subgroups
    • G02B2207/113—Fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a microscope and a
  • Microscope illumination method in particular a microscope for examining a sample in phase-contrast transmitted light illumination and then or alternately or simultaneously in fluorescence incident illumination and a corresponding microscope illumination method.
  • stained specimens are usually examined with a microscope in transmitted-light brightfield illumination.
  • the color of the microscopically examined sample is an important criterion. For example, with other microscopic examinations
  • Contrasting methods such as phase contrast or Differential Interference Contrast (DIC), make the color of the sample less important.
  • DIC Differential Interference Contrast
  • Contrast methods are usually examined uncolored samples, which are in the transmitted light bright field microscopy as predominantly transparent. The contrasting methods then serve to visualize phase properties of the sample.
  • phase contrast microscopy is a so-called phase ring in or on the microscope objective and a ring diaphragm in the condenser optics of Transmitted light illumination device installed.
  • the ring diaphragm also known as the light ring, limits the incidence of light on the sample to a certain angle of incidence range.
  • the phase ring causes a phase shift of the incident light of 90 °.
  • diffraction of the light for example, on cell structures, light passing through the object is deflected in such a way that, for the most part, it does not pass through the phase ring.
  • the diffraction in the sample also causes a phase shift depending on the refractive index.
  • Backlight causes interference in the image plane.
  • appropriate dimensioning of the phase ring can be represented in this way, the object, for example. Dark against a light background (positive phase contrast). An image in negative phase contrast is also possible.
  • Another known examination method is fluorescence microscopy.
  • the sample to be examined is illuminated by means of an incident-light illumination beam path which traverses a so-called excitation filter.
  • the excitation light leads to fluorescent light in the fluorescently labeled object, wherein the emitted fluorescent light determines the resulting microscope image of the sample.
  • the said microscopy methods are known per se for a long time. For further details reference is made to the existing state of the art.
  • LEDs Light-emitting diodes
  • advantages include higher light output with lower power consumption and longer life.
  • Transmitted light illumination is mainly used with white light LEDs.
  • Such solid state light sources often exhibit luminescence upon excitation by an external light source. This is z.
  • the solid state light source used for transmitted light illumination can be used by the
  • the adaptation filter can remain on the transmitted light illumination axis even when there is a change to transmitted-light bright-field illumination, since in this way the spectrum of, for example, a white-light LED used can be approximated to the spectrum of a halogen lamp. According to this document, however, it is useful when using a contrasting method such as phase contrast, the adaptation filter from the illumination beam path of the
  • Shutter which is switchable on the transmitted light illumination axis.
  • a switchable shutter is forcibly switched on or introduced on the transmitted light illumination axis in order to prevent excitation of the white light LED used as transmitted light bright field illumination source, in which case Activation of transmitted-light brightfield illumination of this shutter forced off or
  • the present invention is therefore based on the object to improve the examination of a sample with a microscope in phase-contrast transmitted light illumination and / or in fluorescence incident illumination, wherein the
  • a microscope the use of a ring diaphragm in such a microscope and a method for microscope illumination with the
  • the invention is based on the finding that one in the
  • Transmitted light illumination optics of the phase contrast transmitted light illumination device located ring diaphragm for shielding the transmitted light illumination source can be used before incident radiation of fluorescence Auflichtbeleuchtungs recommended.
  • Phase contrast transmitted light illumination and / or in fluorescence Incident light illumination has a phase contrast transmitted light illumination device and a fluorescence incident illumination device, wherein the phase contrast transmitted light illumination device is a transmitted light illumination source, in particular a solid state light source, in particular one or more LEDs, in particular one or more white light LEDs, and a transmitted light illumination source, in particular a solid state light source, in particular one or more LEDs, in particular one or more white light LEDs, and a transmitted light illumination source, in particular a solid state light source, in particular one or more LEDs, in particular one or more white light LEDs, and a transmitted light illumination source, in particular a solid state light source, in particular one or more LEDs, in particular one or more white light LEDs, and a
  • Transmitted light illumination optics in particular a condenser optics, having a ring diaphragm, wherein the annular diaphragm (light ring) has an opaque inner diaphragm portion of at least partially
  • the fluorescence incident illumination device has a
  • Incident light source and incident light illumination optics in particular with a beam splitter, on. Furthermore, the microscope for the phase contrast transmitted light illumination is equipped with a lens with a phase ring. To avoid the above-described luminescence by stimulating the
  • the microscope setup is selected such that the fluorescence Auflichtbeleuchtungsstrahlengang generated by the fluorescence Auflichtbeleuchtungschreibs adopted with its cross section after passing through the object plane of the microscope - even with an object located there - for the most part, but especially within the inner aperture of the ring diaphragm of the phase contrast füranderbeleuchtungs leads lies.
  • the transmitted light illumination optical system comprises a
  • the annular aperture is arranged in the rear focal plane.
  • the annular aperture is fixed on the Transmitted light illumination axis arranged. It can then the other existing in the microscope optics, namely transmitted light illumination optics,
  • Incident light optics and lens individually, in combination or all together adjusted so that the above-mentioned shielding occurs optimally.
  • Adjustments of the optics or of the objective means that lenses located there are changed in their focal length and / or such lenses are displaced along the optical axis.
  • the existing incident illumination optics also as
  • Designated fluorescence axis set such that at a passage of the fluorescence Auflichtbeleuchtungsstrahlengangs through the object plane - both in an object there and in the absence of an object - this with its cross-section in particular completely within the inner
  • the epi-illumination optics include optical elements - in the simplest case a single lens up to a complex system of lenses, filters, apertures, etc.
  • the function of incident illumination optics is to guide as much light from the fluorescence incident illumination source to the sample and there for a uniform illumination of the sample.
  • Incident illumination optics in particular their focal length and / or
  • the inner diameter of the phase ring will generally differ between the lenses. If the fluorescence incident optics is designed such that it can be changed in focal length and / or magnification, then the size of the light cone at the position of the phase ring can be chosen so that the preferably entire light cone in the inner region of the phase ring (and thus also in the interior Area of the light ring) is located.
  • the invention further relates to a use of said ring stop in a microscope of the type mentioned for the purpose of avoiding the excitation of luminescence in the transmitted light source by light of the
  • the invention relates to a method for microscope illumination using a microscope of the type mentioned above, wherein the
  • Transmitted light illumination optics and / or incident light illumination optics and / or the lens of the microscope and / or the position of the ring diaphragm on the transmitted light illumination axis is set such that the of
  • Fluorescence incident light illumination device generated fluorescence reflected light illumination beam path with its cross section after passing through the object plane of the microscope within the inner aperture region of the ring diaphragm of the phase contrast transmitted light illumination device.
  • the Aufanderbeleuchtungsoptik is set such that the fluorescence generated by the fluorescence embark
  • Incident illumination beam path with its cross section after passing through the object plane of the microscope completely within the inner
  • Aperture area of the ring diaphragm of the phase contrast transmitted light illumination device is located. It is furthermore advantageous if the epi-illumination source is imaged essentially in the rear focal plane of the objective, in which the phase ring is also located. This rear focal plane is through the microscope objective and the transmitted light illumination optics or the condenser in the rear
  • the image of the reflected-light illumination source can be selected such that its image is smaller than the diameter of the inner diaphragm region of the annular diaphragm. This in turn should be located in the rear focal plane of the lens image of the
  • Incident light source within the diameter of an inner portion of the phase ring lie. This inner region is the transparent region within the inner diameter of the phase ring.
  • FIG. 2 schematically shows an annular diaphragm as can be used in a microscope according to FIG. 1
  • FIG. 3 shows schematically the optical path of the fluorescence incident illumination in a microscope according to FIG. 1 according to an embodiment of the invention.
  • the microscope shown schematically in FIG. 1 has a phase-contrast transmitted light illumination device 11 and a fluorescence incident illumination device 12.
  • the phase contrast transmitted light illumination device 11 has as essential elements a transmitted light illumination source 101, which in this embodiment represents a solid-state light source such as a white-light LED, as well as a
  • Transmitted light illumination optics 103 which in this embodiment a
  • Condenser represents, on. In the rear focal plane of the condenser is the annular aperture 102, also called light ring.
  • the microscope 10 has an objective 105 with a phase ring 106.
  • the microscope 10 has the said fluorescence incident illumination device 12, which contains as essential elements a reflected-light illumination source 121 and incident-light illumination optics 122.
  • a beam splitter 110 arranged on the optical axis of the objective 105 is shown schematically and directs the fluorescence incident illumination beam path in the direction of the objective 105 and object plane 104. Radiated from a specimen in the object plane 104
  • Fluorescent light passes through the objective 105 and the beam splitter 110 into the tube 131 of the microscope 10.
  • the eyepiece 131 (not shown) and / or a camera 132 can be arranged downstream of the tube 131.
  • the Beam splitter 110 also avoids that light of fluorescent incident light source 121, which is reflected at components of the microscope, such as the lens 105, in the direction of tube 131 passes.
  • the annular aperture 102 of Figure 1 is shown schematically in plan. Clearly visible is the opaque inner diaphragm region 203, which is surrounded by an at least partially translucent substantially annular region. The annular region 202 in turn is followed by an annular opaque region 204.
  • This geometry of the annulus 201 ensures that the sample is illuminated at certain aperture angles when the annulus is placed in the back focal plane of the condenser 103.
  • an object can be imaged and examined in phase contrast.
  • the microscope 10 shown in FIG. 1 not only permits phase contrast but also the imaging or examination of an object in fluorescence incident illumination. As described above, a portion of the fluorescence incident illumination passes through an object located in the object plane 104 into the phase-contrast transmitted light illumination device 11. There, therefore, part of the fluorescence incident light illumination via the condenser onto the
  • Transmitted light source 101 passed. This is in principle also the case if in the rear focal plane of the condenser 103, an annular aperture 102 is arranged, since this annular aperture has light-transmissive areas.
  • incident light source 121 is incident on the transmitted light illumination source 101, the incident light illumination source 121 leads to luminescence when using solid-state light sources, as explained in detail at the outset, which in turn is disturbing
  • Incident illumination beam path with its cross section after passing through the object plane 104 lies within the inner diaphragm area 203 of the annular diaphragm 102. In this way, the fluorescence incident light illumination is blocked before reaching the transmitted light illumination source 101. It is expedient if the entire cross section comes to rest within the inner diaphragm area 203.
  • the following measures are suitable for this effect of shielding or blocking.
  • the transmitted light illumination optics 103 the microscope objective 105 and incident light illumination optics 122, which can each consist of a single lens to a complex system of lenses, filters, screens etc.
  • these lenses 103, 105 and 122 are adjustable in their focal length.
  • individual lenses of these optics 103, 105, 122 may be displaced along the respective optical axes. It is most expedient to use incident-light illumination optics 122 for the purpose according to the invention, as explained below.
  • Figure 3 shows schematically a possible beam path of
  • the illustrated beam paths show the beam paths for a point in the middle and a point on the edge of incident light illumination source 121.
  • the focal spot of reflected light illumination source 121 is imaged in the rear focal plane of objective 105, in which phase ring 106 is also located. This plane is again imaged by lens 105 and condenser 103 in the rear focal plane of the condenser 103, in which the annular aperture 102 is located.
  • incident light illumination optics 122 By appropriate adjustment of incident light illumination optics 122, the image is selected such that the image of the focal spot of the
  • Incident illumination source 121 is smaller than the diameter of the inner diaphragm portion 203 of the annular diaphragm 102, 201 (see Figure 2), the light cone of the incident illumination beam path at the position of the annular diaphragm 102 will also fall only on the inner diaphragm portion 203 of the annular diaphragm.
  • incident light illumination optics 122 are to be set such that the focal spot of reflected-light illumination source 121 in FIG.
  • Incident illumination beam path at the position of the phase ring 106 may be preferably smaller than the diameter of the inner transparent

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop (10) zur Untersuchung einer Probe in Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtung und/oder in Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtung mit einer Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtungseinrichtung (11) und einer Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung (12), wobei die Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtungseinrichtung (11) eine Durchlichtbeleuchtungsquelle (101) sowie eine Durchlichtbeleuchtungsoptik (103) mit einer Ringblende (102, 201) aufweist, wobei die Ringblende (102, 201) einen lichtundurchlässigen inneren Blendenbereich (203) aufweist, der von einem zumindest teilweise lichtdurchlässigen ringförmigen Bereich (202) umgeben ist, und wobei die Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung (12) eine Auflichtbeleuchtungsquelle (121) sowie eine Auflichtbeleuchtungsoptik (122) aufweist, und wobei das Mikroskop (10) ein Objektiv (105) mit einem Phasenring (106) aufweist, wobei der von der Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung (12) erzeugte Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungsstrahlengang mit seinem Querschnitt nach Durchtritt durch die Objektebene (104) des Mikroskops (10) innerhalb des inneren Blendenbereichs (203) der Ringblende (102, 201) der Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtungseinrichtung (11) liegt, und ein entsprechendes Mikroskopbeleuchtungsverfahren.

Description

Mikroskop und Mikroskopbeleuchtungsverfahren
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop und ein
Mikroskopbeleuchtungsverfahren, insbesondere ein Mikroskop zur Untersuchung einer Probe in Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtung und anschließend oder abwechselnd oder auch gleichzeitig in Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtung sowie ein entsprechendes Mikroskopbeleuchtungsverfahren.
Stand der Technik
In der Zytodiagnostik und in der Pathologie werden eingefärbte Proben mit einem Mikroskop meist in Durchlicht-Hellfeldbeleuchtung untersucht. Für die Diagnose ist die Farbe der mikroskopisch untersuchten Probe ein wichtiges Kriterium. Bei anderen mikroskopischen Untersuchungen beispielsweise mit
Kontrastierverfahren, wie Phasenkontrast oder Differentieller Interferenzkontrast (DIC), ist die Farbe der Probe weniger von Bedeutung. Mit solchen
Kontrastierverfahren werden meist ungefärbte Proben untersucht, die sich in der Durchlicht-Hellfeldmikroskopie als überwiegend transparent darstellen. Die Kontrastierverfahren dienen dann dazu, Phaseneigenschaften der Probe sichtbar zu machen.
In der Phasenkontrastmikroskopie ist ein sogenannter Phasenring in oder an dem Mikroskopobjektiv sowie eine Ringblende in der Kondensoroptik der Durchlichtbeleuchtungseinrichtung eingebaut. Die Ringblende, auch als Lichtring bezeichnet, beschränkt den Lichteinfall auf die Probe auf einen bestimmten Einfallswinkelbereich. Der Phasenring bewirkt eine Phasenverschiebung des auffallenden Lichts von 90°. Durch Beugung des Lichtes bspw. an Zellstrukturen wird durch das Objekt tretendes Licht derart abgelenkt, dass es zum größten Teil nicht durch den Phasenring tritt. Die Beugung in der Probe bewirkt jedoch auch eine Phasenverschiebung abhängig vom Brechungsindex. Die Phasendifferenz zwischen gebeugtem Objektlicht und durch den Phasenring tretendem
Hintergrundlicht bewirkt in der Bildebene eine Interferenz. Durch entsprechende Bemessung des Phasenrings kann auf diese Weise das Objekt bspw. dunkel vor einem hellen Hintergrund (positiver Phasenkontrast) dargestellt werden. Auch eine Abbildung im negativen Phasenkontrast ist möglich.
Eine weitere bekannte Untersuchungsmethode stellt die Fluoreszenzmikroskopie dar. Hier wird mittels eines Auflichtbeleuchtungsstrahlengangs, der einen sogenannten Anregungsfilter durchquert, die zu untersuchende Probe beleuchtet. Das Anregungslicht führt zu Fluoreszenzlicht im mit fluoreszierenden Stoffen markierten Objekt, wobei das abgestrahlte Fluoreszenzlicht das entstehende Mikroskopbild der Probe bestimmt. Die genannten Mikroskopieverfahren sind an sich seit längerem bekannt. Zu weiteren Details wird auf den vorhandenen Stand der Technik verwiesen.
Die in der Durchlichtmikroskopie in der Vergangenheit überwiegend eingesetzte Halogenlampe wird mehr und mehr durch Festkörperlichtquellen, bspw.
Leuchtdioden (im Folgenden LEDs), mit ihren bekannten Vorteilen ersetzt. Diese Vorteile umfassen eine höhere Lichtabstrahlung bei geringerem Verbrauch elektrischer Leistung sowie eine längere Lebensdauer. Für die
Durchlichtbeleuchtung werden überwiegend Weißlicht-LEDs eingesetzt. Solche Festkörperlichtquellen zeigen oftmals eine Lumineszenz bei Anregung durch eine externe Lichtquelle. Dies ist z. B. bei LEDs der Fall, bei denen eine Phosphorschicht benutzt wird, um bestimmte spektrale Komponenten zu erzeugen (insbesondere Weißlicht-LEDs, aber auch z. B. im grünen Spektralbereich). Bei Mikroskopen, die Durchlichtbeleuchtung und Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtung kombinieren, kann die zur Durchlichtbeleuchtung verwendete Festkörperlichtquelle von der
Lichtquelle der Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtung angeregt werden. Ein großer Teil des Anregungslichts für die Fluoreszenzanregung gelangt nämlich durch die Probe hindurch und von dort über die Durchlichtbeleuchtungsachse bis hin zur
Durchlichtbeleuchtungsquelle. Das dort aufgrund von Anregung erzeugte
Lumineszenzlicht wird als störender Untergrund im Fluoreszenzbild
wahrgenommen. Dieser Effekt tritt auch bei ausgeschalteter Festkörperlichtquelle der Durchlichtbeleuchtung auf.
In der DE 10 2011 079 941 AI wird dieses Problem im Zusammenhang mit einem Mikroskop zur Untersuchung einer Probe abwechselnd oder gleichzeitig in Durchlicht-Hellfeldbeleuchtung und Auflicht-Fluoreszenzbeleuchtung behandelt. Zur Vermeidung des genannten Lumineszenzlichtes wird ein Anpassungsfilter in die Durchlichtbeleuchtungsachse eingebracht, das das die Lumineszenz
verursachende Anregungslicht aus der Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtung spektral blockt. Das Anpassungsfilter kann auch bei einem Wechsel zu Durchlicht- Hellfeldbeleuchtung auf der Durchlichtbeleuchtungsachse bleiben, da auf diese Weise das Spektrum einer bspw. eingesetzten Weißlicht-LED an das Spektrum einer Halogenlampe angenähert werden kann. Gemäß dieser Druckschrift ist es jedoch bei Benutzung eines Kontrastierverfahrens wie Phasenkontrast sinnvoll, das Anpassungsfilter aus dem Beleuchtungsstrahlengang der
Durchlichtbeleuchtung manuell oder motorisch zu entfernen, sodass eine höhere Lichtintensität für das gewählte Kontrastierverfahren zur Verfügung steht. Ein solches schaltbares Anpassungsfilter ist jedoch aufwendig konstruiert, benötigt einen größeren Bauraum, ist kostenintensiv herzustellen und zudem langsam in der Umschaltung. Die gleichen Nachteile treten bei Verwendung einer Sperrvorrichtung (z. B.
Shutter) auf, die sich schaltbar auf der Durchlichtbeleuchtungsachse befindet. Beispielsweise wird in der DE 10 2011 079 942 AI vorgeschlagen, dass beim Aktivieren der Auflicht-Fluoreszenzbeleuchtung zwangsweise ein schaltbarer Shutter auf der Durchlichtbeleuchtungsachse eingeschaltet bzw. eingebracht wird, um eine Anregung der als Durchlicht-Hellfeldbeleuchtungsquelle eingesetzten Weißlicht-LED zu verhindern, wobei dann beim Aktivieren der Durchlicht- Hellfeldbeleuchtung dieser Shutter zwangsweise ausgeschaltet bzw.
ausgeschwenkt wird.
Der vorliegenden Erfindung liegt folglich die Aufgabe zu Grunde, die Untersuchung einer Probe mit einem Mikroskop in Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtung und/oder in Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtung zu verbessern, wobei zur
Unterdrückung von störender Lumineszenz schaltbare Elemente vermieden werden sollen. Offenbarung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird ein Mikroskop, die Verwendung einer Ringblende in einem solchen Mikroskop sowie ein Verfahren zur Mikroskopbeleuchtung mit den
Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vorgeschlagen. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zu Grunde, dass eine in der
Durchlichtbeleuchtungsoptik der Phasenkontrast- Durchlichtbeleuchtungseinrichtung befindliche Ringblende zum Abschirmen der Durchlichtbeleuchtungsquelle, die in der Regel eine Festkörperlichtquelle darstellt, vor auftreffender Strahlung der Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung eingesetzt werden kann. Ein erfindungsgemäßes Mikroskop zur Untersuchung einer Probe in
Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtung und/oder in Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtung weist eine Phasenkontrast- Durchlichtbeleuchtungseinrichtung und eine Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtungseinrichtung auf, wobei die Phasenkontrast- Durchlichtbeleuchtungseinrichtung eine Durchlichtbeleuchtungsquelle, insbesondere eine Festkörperlichtquelle, insbesondere ein oder mehrere LEDs, insbesondere ein oder mehrere Weißlicht LEDs, sowie eine
Durchlichtbeleuchtungsoptik, insbesondere eine Kondensoroptik, mit einer Ringblende aufweist, wobei die Ringblende (Lichtring) einen lichtundurchlässigen inneren Blendenbereich aufweist, der von einem zumindest teilweise
lichtdurchlässigen im Wesentlichen ringförmigen Bereich umgeben ist. Die Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung weist eine
Auflichtbeleuchtungsquelle sowie eine Auflichtbeleuchtungsoptik, insbesondere mit einem Strahlteiler, auf. Weiterhin ist das Mikroskop für die Phasenkontrast- Durchlichtbeleuchtung mit einem Objektiv mit einem Phasenring ausgestattet. Zur Vermeidung der eingangs geschilderten Lumineszenz durch Anregung der
Durchlichtbeleuchtungsquelle wird der Mikroskopaufbau derart gewählt, dass der von der Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung erzeugte Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtungsstrahlengang mit seinem Querschnitt nach Durchtritt durch die Objektebene des Mikroskops - auch bei einem dort befindlichen Objekt - zum größten Teil insbesondere aber vollständig innerhalb des inneren Blendenbereichs der Ringblende der Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtungseinrichtung liegt. Auf diese Weise kommt es zu einer insbesondere vollständigen Abschattung des Auflichtbeleuchtungsstrahlengangs nach Eintritt in die Phasenkontrast- Durchlichtbeleuchtungseinrichtung vor Auftreffen auf die
Durchlichtbeleuchtungsquelle.
Der entsprechende Mikroskopaufbau kann auf verschiedene Weisen erzielt werden. Vorzugsweise umfasst die Durchlichtbeleuchtungsoptik eine
Kondensoroptik bzw. einen Kondensor oder besteht aus einer solchen
Kondensoroptik bzw. einem solchen Kondensor, in dessen hinterer Brennebene die Ringblende angeordnet ist. Vorzugsweise ist die Ringblende fest auf der Durchlichtbeleuchtungsachse angeordnet. Es können dann die übrigen in dem Mikroskop vorhandenen Optiken, nämlich Durchlichtbeleuchtungsoptik,
Auflichtbeleuchtungsoptik und Objektiv, einzeln, in Kombination oder alle gemeinsam derart eingestellt werden, dass die oben erwähnte Abschirmung optimal eintritt. Unter "Einstellungen" der Optik bzw. des Objektivs ist zu verstehen, dass dort befindliche Linsen in ihrer Brennweite verändert werden und/oder solche Linsen entlang der optischen Achse verschoben werden. Mit Vorteil wird die vorhandene Auflichtsbeleuchtungsoptik, auch als
Fluoreszenzachse bezeichnet, derart eingestellt, dass bei einem Durchtritt des Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungsstrahlengangs durch die Objektebene - sowohl bei einem dort befindlichen Objekt als auch bei Abwesenheit eines Objekts - dieser mit seinem Querschnitt insbesondere vollständig innerhalb des inneren
Blendenbereichs der Ringblende zu liegen kommt. Die Auflichtbeleuchtungsoptik beinhaltet optische Elemente - im einfachsten Fall eine einzelne Linse bis hin zu einem komplexen System aus Linsen, Filtern, Blenden etc. Die Funktion der Auflichtbeleuchtungsoptik ist es, möglichst viel Licht von der Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtungsquelle auf die Probe zu führen und dort für eine gleichmäßige Ausleuchtung der Probe zu sorgen. Durch geeignete Einstellung dieser
Auflichtbeleuchtungsoptik, insbesondere ihrer Brennweite und/oder
Vergrößerung, kann sichergestellt werden, dass durch die Objektebene hindurch tretendes Licht, das in die Durchlichtbeleuchtungsoptik gelangt, dort von der dort befindlichen Ringblende an einer weiteren Ausbreitung in Richtung
Durchlichtbeleuchtungsquelle gehindert wird. Werden mit dem Mikroskop unterschiedliche Objektive und/oder unterschiedliche Lichtringe verwendet, so wird sich der innere Durchmesser des Phasenrings im allgemeinen zwischen den Objektiven unterscheiden. Ist die Fluoreszenz- Auflichtoptik so ausgelegt, dass sie in Brennweite und/oder Vergrößerung veränderbar ist, so kann die Größe des Lichtkegels an der Position des Phasenrings so gewählt werden, dass der vorzugsweise gesamte Lichtkegel im inneren Bereich des Phasenrings (und somit auch im inneren Bereich des Lichtrings) liegt. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Verwendung einer genannten Ringblende in einem Mikroskop der genannten Art zu dem Zweck der Vermeidung der Anregung von Lumineszenz in der Durchlichtbeleuchtungsquelle durch Licht der
Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungsquelle. Zur Vermeidung von Wiederholungen sei hierzu auf die obigen Aufführungen in Zusammenhang mit dem
erfindungsgemäßen Mikroskop verwiesen.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Mikroskopbeleuchtung unter Verwendung eines Mikroskops der oben genannten Art, wobei die
Durchlichtbeleuchtungsoptik und/oder die Auflichtbeleuchtungsoptik und/oder das Objektiv des Mikroskops und/oder die Position der Ringblende auf der Durchlichtbeleuchtungsachse derart eingestellt wird, dass der von der
Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung erzeugte Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtungsstrahlengang mit seinem Querschnitt nach Durchtritt durch die Objektebene des Mikroskops innerhalb des inneren Blendenbereichs der Ringblende der Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtungseinrichtung liegt. Zu weiteren Ausgestaltungen und Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens sei wiederum auf die obigen Ausführungen im Zusammenhang mit dem
erfindungsgemäßen Mikroskop verwiesen.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn bei feststehender Position der Ringblende auf der Durchlichtbeleuchtungsachse und bei vorgegebener Einstellung der
Durchlichtbeleuchtungsoptik und des Objektivs die Auflichtbeleuchtungsoptik derart eingestellt wird, dass der von der Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtungseinrichtung erzeugte Fluoreszenz-
Auflichtbeleuchtungsstrahlengang mit seinem Querschnitt nach Durchtritt durch die Objektebene des Mikroskops vollständig innerhalb des inneren
Blendenbereichs der Ringblende der Phasenkontrast- Durchlichtbeleuchtungseinrichtung liegt. Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn die Auflichtbeleuchtungsquelle im Wesentlichen in die hintere Brennebene des Objektivs abgebildet wird, in der sich auch der Phasenring befindet. Diese hintere Brennebene wird durch das Mikroskopobjektiv und die Durchlichtbeleuchtungsoptik bzw. den Kondensor in die hintere
Brennebene des Kondensors abgebildet, in der sich die Ringblende befindet. Durch geeignete Einstellung der Auflichtbeleuchtungsoptik kann die Abbildung der Auflichtbeleuchtungsquelle derart gewählt werden, dass deren Bild kleiner ist als der Durchmesser des inneren Blendenbereichs der Ringblende. Hierzu wiederum sollte das in der hinteren Brennebene des Objektivs befindliche Bild der
Auflichtbeleuchtungsquelle innerhalb des Durchmessers eines inneren Bereichs des Phasenrings liegen. Dieser innere Bereich ist der transparente Bereich innerhalb des inneren Durchmessers des Phasenrings.
Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der
Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispiels in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben.
Figurenbeschreibung zeigt schematisch den Aufbau eines Mikroskops zur Untersuchung einer Probe in Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtung und/oder Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, Figur 2 zeigt schematisch eine Ringblende, wie sie in einem Mikroskop gemäß Figur 1 eingesetzt werden kann, und Figur 3 zeigt schematisch den Strahlengang der Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtung in einem Mikroskop gemäß Figur 1 gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
Das in Figur 1 schematisch dargestellte Mikroskop weist eine Phasenkontrast- Durchlichtbeleuchtungseinrichtung 11 und eine Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtungseinrichtung 12 auf. Die Phasenkontrast- Durchlichtbeleuchtungseinrichtung 11 weist als wesentliche Elemente eine Durchlichtbeleuchtungsquelle 101, die in diesem Ausführungsbeispiel eine Festkörperlichtquelle wie eine Weißlicht-LED darstellt, sowie eine
Durchlichtbeleuchtungsoptik 103, die in diesem Ausführungsbeispiel einen
Kondensor darstellt, auf. In der hinteren Brennebene des Kondensors befindet sich die Ringblende 102, auch Lichtring genannt.
Zur Untersuchung einer Probe in Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtung weist das Mikroskop 10 ein Objektiv 105 mit einem Phasenring 106 auf.
Zur Untersuchung einer Probe in Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtung weist das Mikroskop 10 die genannte Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung 12 auf, die als wesentliche Elemente eine Auflichtbeleuchtungsquelle 121 sowie eine Auflichtbeleuchtungsoptik 122 enthält. Ein auf der optischen Achse des Objektivs 105 angeordneter Strahlteiler 110 ist schematisch dargestellt und lenkt den Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungsstrahlengang in Richtung Objektiv 105 und Objektebene 104. Von einer Probe in der Objektebene 104 abgestrahltes
Fluoreszenzlicht gelangt über das Objektiv 105 und den Strahlteiler 110 in den Tubus 131 des Mikroskops 10. In bekannter Weise kann dem Tubus 131 ein Okular (nicht dargestellt) und/oder eine Kamera 132 nachgeordnet sein. Der Strahlteiler 110 vermeidet außerdem, dass Licht der Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtungsquelle 121, das an Komponenten des Mikroskops, wie dem Objektiv 105 reflektiert wird, in Richtung Tubus 131 gelangt. In Figur 2 ist die Ringblende 102 aus Figur 1 schematisch in Aufsicht dargestellt. Deutlich zu erkennen ist der lichtundurchlässige innere Blendenbereich 203, der von einem zumindest teilweise lichtdurchlässigen im Wesentlichen ringförmigen Bereich umgeben ist. Dem ringförmigen Bereich 202 schließt sich wiederum ein ringförmiger lichtundurchlässiger Bereich 204 an. Diese Geometrie der Ringblende 201 stellt sicher, dass die Probe unter bestimmten Aperturwinkeln beleuchtet wird, wenn die Ringblende in die hintere Brennebene des Kondensors 103 eingebracht ist. Auf diese Weise kann, wie eingangs erläutert, zusammen mit dem Phasenring 106 ein Objekt im Phasenkontrast abgebildet und untersucht werden. Das in Figur 1 dargestellte Mikroskop 10 ermöglicht neben Phasenkontrast auch die Abbildung bzw. Untersuchung eines Objekts in Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtung. Wie eingangs geschildert, gelangt ein Teil der Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtung durch ein in der Objektebene 104 befindliches Objekt hindurch in die Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtungseinrichtung 11. Dort wird also ein Teil der Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtung über den Kondensor auf die
Durchlichtbeleuchtungsquelle 101 geleitet. Dies ist prinzipiell auch dann der Fall, wenn in der hinteren Brennebene des Kondensors 103 eine Ringblende 102 angeordnet ist, da diese Ringblende lichtdurchlässige Bereiche aufweist. Auf die Durchlichtbeleuchtungsquelle 101 treffendes Licht der Auflichtbeleuchtungsquelle 121 führt bei Verwendung von Festkörperlichtquellen wie ausführlich eingangs erläutert zur Lumineszenz, die sich wiederum als störende
Hintergrundbeleuchtung bei der Aufnahme von Bildern in Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtung bemerkbar macht. Dies kann dadurch verhindert werden, dass der Mikroskopaufbau gemäß Figur 1 derart gewählt wird, dass der von der Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung 12 erzeugte Fluoreszenz-
Auflichtbeleuchtungsstrahlengang mit seinem Querschnitt nach Durchtritt durch die Objektebene 104 innerhalb des inneren Blendenbereichs 203 der Ringblende 102 liegt. Auf diese Weise wird die Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtung vor Erreichen der Durchlichtbeleuchtungsquelle 101 abgeblockt. Zweckmäßig ist, wenn der gesamte Querschnitt innerhalb des inneren Blendenbereichs 203 zu liegen kommt.
Für diesen Effekt der Abschirmung oder Abblockung sind folgende Maßnahmen geeignet. Prinzipiell bietet sich eine Einstellung aller möglichen verstellbaren optischen Elemente im Mikroskop an, nämlich die Durchlichtbeleuchtungsoptik 103, das Mikroskopobjektiv 105 sowie die Auflichtbeleuchtungsoptik 122, die jeweils aus einer einzelnen Linse bis hin zu einem komplexen System aus Linsen, Filtern, Blenden etc. bestehen können. Häufig sind diese Optiken 103, 105 und 122 in ihrer Brennweite verstellbar. Zusätzlich oder alternativ können einzelne Linsen dieser Optiken 103, 105, 122 entlang der jeweiligen optischen Achsen verschoben werden. Am zweckmäßigsten ist es, die Auflichtbeleuchtungsoptik 122 zu dem erfindungsgemäßen Zweck einzusetzen, wie nachfolgend erläutert.
Figur 3 zeigt schematisch einen möglichen Strahlengang der
Fluoreszenzbeleuchtung bei einem Mikroskop gemäß Figur 1. Insofern kann bezüglich sämtlicher Details auf die Figurenbeschreibung zu Figur 1 verwiesen werden. Die abgebildeten Strahlengänge zeigen die Strahlenverläufe für einen Punkt in der Mitte sowie einen Punkt am Rande der Auflichtbeleuchtungsquelle 121. Der Brennfleck der Auflichtbeleuchtungsquelle 121 wird jeweils in die hintere Brennebene des Objektivs 105 abgebildet, in der sich auch der Phasenring 106 befindet. Diese Ebene wird durch Objektiv 105 und Kondensor 103 wiederum in die hintere Brennebene des Kondensors 103 abgebildet, in der sich die Ringblende 102 befindet. Ist durch geeignete Einstellung der Auflichtbeleuchtungsoptik 122 die Abbildung derart gewählt, dass das Bild des Brennflecks der
Auflichtbeleuchtungsquelle 121 kleiner ist als der Durchmesser des inneren Blendenbereichs 203 der Ringblende 102, 201 (vgl. Figur 2), so wird der Lichtkegel des Auflichtbeleuchtungsstrahlengangs an der Position der Ringblende 102 ebenfalls nur auf den inneren Blendenbereich 203 der Ringblende fallen. In einer geeigneten Ausführungsform ist somit die Auflichtbeleuchtungsoptik 122 so einzustellen, dass der Brennfleck der Auflichtbeleuchtungsquelle 121 im
Wesentlichen in die hintere Brennebene des Objektivs 105 fällt. Wie der Fachmann verstehen wird, muss diese Bedingung selbstverständlich nicht genau, sondern nur im Wesentlichen erfüllt sein. Jedoch sollte der Lichtkegel des
Auflichtbeleuchtungsstrahlengangs an der Position des Phasenrings 106 vorzugsweise kleiner sein als der Durchmesser des inneren transparenten
Bereichs dieses Phasenrings 106.
Bezugszeichenliste
10 Mikroskop
11 Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtungseinrichtung 12 Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung
100 Durchlichtbeleuchtungsachse, optische Achse
101 Durchlichtbeleuchtungsquelle
102 Ringblende
103 Durchlichtbeleuchtungsoptik, Kondensor
104 Objektebene
105 Objektiv
106 Phasenring 110 Strahlteiler
116 innerer Bereich des Phasenrings
121 Auflichtbeleuchtungsquelle
122 Auflichtbeleuchtungsoptik
131 Tubus
132 Kamera
201 Ringblende
202 ringförmiger Bereich
203 innerer Blendenbereich
204 äußerer Blendenbereich

Claims

15.05.2018/mb/mg
Patentansprüche
Mikroskop (10) zur Untersuchung einer Probe in Püasenkontrast- Durchlichtbeleuchtung und/oder in Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtung mit einer Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtungseinrichtung (11) und einer Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung (12), wobei
die Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtungseinrichtung (11) eine
Durchüchtbeleuchtungsquelle (101) sowie eine
Durchlichtbeleuchtungsoptik (103) mit einer Ringblende (102, 201) aufweist, wobei die Ringblende (102, 201) einen lichtundurchlässigen inneren Blendenbereich (203) aufweist, der von einem zumindest teilweise lichtdurchlässigen ringförmigen Bereich (202) umgeben ist, und wobei die Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung (12) eine
Auflichtbeleuchtungsquelle (121) sowie eine Auflichtbeleuchtungsoptik (122) aufweist, und wobei
das Mikroskop (10) ein Objektiv (105) mit einem Phasenring (106) aufweist, wobei
der von der Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung (12) erzeugte Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungsstrahlengang mit seinem Querschnitt nach Durchtritt durch die Objektebene (104) des Mikroskops (10) innerhalb des inneren Blendenbereichs (203) der Ringblende (102, 201) der Phasenkontrast-Durchlichtbeleuchtungseinrichtung (11) liegt.
2. Mikroskop (10) nach Anspruch 1, wobei die Durchüchtbeleuchtungsquelle (101) eine Festkörperlicütquelle umfasst oder darstellt.
3. Mikroskop (10) nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Durchlichtbeleuchtungsoptik (103) einen Kondensor umfasst, in dessen hinterer Brennebene die Ringblende (102, 201) angeordnet ist.
4. Mikroskop (10) nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die
Brennweite und/oder Vergrößerung der Auflichtbeleuchtungsoptik (122) veränderbar ist.
5. Mikroskop (10) nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die
Brennweite des Objektivs (105) veränderbar ist.
6. Verwendung der Ringblende (102, 201) eines Mikroskops (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verhinderung der Anregung der
Durchlichtbeleuchtungsquelle (101) durch Licht der
Auflichtbeleuchtungsquelle (121), indem der lichtundurchlässige innere Blendenbereich (203) der Ringblende (102, 201) die
Durchlichtbeleuchtungsquelle (101) von dem Licht der
Auflichtbeleuchtungsquelle (121) abschirmt.
7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Durchlichtbeleuchtungsoptik (103) und/oder die Auflichtbeleuchtungsoptik (122) und/oder das Objektiv (105) derart eingestellt wird, dass der von der Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtungseinrichtung (12) erzeugte Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtungsstrahlengang mit seinem Querschnitt nach Durchtritt durch die Objektebene (104) des Mikroskops (10) innerhalb des inneren Blendenbereichs (203) der Ringblende (102, 201) der Phasenkontrast- Durchlichtbeleuchtungseinrichtung (11) liegt.
8. Verfahren zur Mikroskopbeleuchtung unter Verwendung eines Mikroskops (10) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die
Durchlichtbeleuchtungsoptik (103) und/oder die
Auflichtbeleuchtungsoptik (122) und/oder das Objektiv (105) derart eingestellt wird, dass der von der Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtungseinrichtung (12) erzeugte Fluoreszenz- Auflichtbeleuchtungsstrahlengang mit seinem Querschnitt nach Durchtritt durch die Objektebene (104) des Mikroskops (10) innerhalb des inneren Blendenbereichs (203) der Ringblende (102, 201) der Phasenkontrast- Durchlichtbeleuchtungseinrichtung (11) liegt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei bei feststehender Position der
Ringblende (102, 201) auf der Durchlichtbeleuchtungsachse (100) und bei vorgegebener Einstellung der Durchlichtbeleuchtungsoptik (103) und des Objektivs (105) die Auflichtbeleuchtungsoptik (122) derart eingestellt wird, dass der von der Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungseinrichtung (12) erzeugte Fluoreszenz-Auflichtbeleuchtungsstrahlengang mit seinem
Querschnitt nach Durchtritt durch die Objektebene (104) des Mikroskops (10) vollständig innerhalb des inneren Blendenbereichs (203) der
Ringblende (102, 201) der Phasenkontrast- Durchlichtbeleuchtungseinrichtung (11) liegt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Auflichtbeleuchtungsoptik (122) derart eingestellt wird, dass die Auflichtbeleuchtungsquelle (121) in die hintere Brennebene des Objektivs (105), in der der Phasenring (106) angeordnet ist, innerhalb eines inneren Bereichs (116) diesen Phasenrings (106) abgebildet wird.
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