CN110622055B - 显微镜和显微镜照明方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于在相衬‑透射照明中和/或在荧光‑垂直照明中检查样本的显微镜(10)和一种相应的显微镜照明方法，该显微镜具有相衬‑透射照明机构(11)和荧光‑垂直照明机构(12)，其中，所述相衬‑透射照明机构(11)具有透射照明源(101)以及具有带环状光阑(102、201)的透射照明光学器件(103)，其中，所述环状光阑(102、201)具有不透光的内部的光阑区域(203)，该光阑区域被至少部分地透光的环形的区域(202)包围，其中，所述荧光‑垂直照明机构(12)具有垂直照明源(121)以及垂直照明光学器件(122)，其中，所述显微镜(10)具有带相环(106)的物镜(105)，其中，由所述荧光‑垂直照明机构(12)产生的荧光‑垂直照明光路以其横截面在穿过所述显微镜(10)的样品平面(104)之后位于所述相衬‑透射照明机构(11)的环状光阑(102、201)的内部的光阑区域(203)之内。

Description

显微镜和显微镜照明方法

技术领域

本发明涉及显微镜和显微镜照明方法，特别是用于在相衬-透射照明中随后或者交替地或者也同时地在荧光-垂直照明中检查样本的显微镜，以及涉及一种相应的显微镜照明方法。

背景技术

在细胞诊断和病理学中，染色的样本利用显微镜大多在透射-明场照明中予以检查。对于诊断，被显微地检查的样本的颜色是重要的判据。在其它的例如采用对比方法比如相衬或差分干涉对比(DIC)的显微检查情况下，样本颜色的重要性较小。采用这种对比方法大多检查未染色的样本，这些样本在透射-明场显微术中表现为基本透明。对比方法于是用于使得样本的相特性可见。

在相衬显微术中，在显微镜物镜中或上安装了所谓的相环，以及在透射照明机构的聚光器光学器件中安装了环状光阑。环状光阑也称为光圈，它将光在样品上的入射限制于一定的入射角范围内。相环引起入射光的90°的相移。通过例如在细胞结构上的光衍射，经过样品的光发生转向，使得大部分光不穿过相环。然而，样本中的衍射也引起与折射系数有关的相移。衍射的样品光与经过相环的背景光之间的相差在图像平面中引起干涉。通过相应地测量相环，可以按这种方式使得样品在明亮背景下呈现为例如暗色(正的相衬)。也可以在负的相衬中成像。

另一种已知的检查方法是荧光显微术。在此，借助横穿所谓的激发滤光器的垂直照明光路，对有待检查的样本予以照明。激发光在用荧光物质标记的样品中导致荧光，其中，发出的荧光决定了样本的所产生的显微图像。所谓的显微方法本身已公知许久。至于进一步的细节，参见已有的现有技术。

过去在透射显微术中主要使用的卤素灯越来越被具有其已知优点的固体光源例如发光二极管(下称LED)所代替。这些优点包括，在电功率消耗较小的情况下光辐射较高，以及寿命较长。对于透射照明，主要使用白光-LED。这种固体光源在用外部光源激发时往往表现出荧光。例如对于使用磷层以便产生一定的光谱分量的LED(特别是白光-LED，但也可以例如在绿色光谱范围内)来说就是这种情况。对于把透射照明和荧光-垂直照明组合起来的显微镜，用于透射照明的固体光源可以被荧光-垂直照明的光源激发。用于荧光激发的激发光的大部分因而穿过样本，并从那里经过透射照明轴，直至到达透射照明源。在那里由于激发而产生的荧光在荧光图像中被感觉成干扰的背景。这种效应即便在透射照明的固体光源被切断的情况下也出现。

在DE 10 2011 079 941 A1中，这个问题结合以用于检查样本的显微镜，交替地或者同时地在透射-明场照明和垂直-荧光照明中予以处理。为了避免所述的荧光，将调整滤光器装入到透射照明轴中，该调整滤光器阻止来自荧光-垂直照明的引起荧光的激发光。调整滤光器也可以在切换至透射-明场照明时保持在透射照明轴上，因为通过这种方式可以使得例如使用的白光-LED的光谱近似于卤素灯的光谱。但根据该文献，在采用对比方法比如相衬时有益的是，手动地或者机动地把调整滤光器从透射照明的照明光路中移除，从而有较高的光强供所选取的对比方法之用。然而，这种可切换的调整滤光器构造繁琐，需要较大的安装空间，制造成本高昂，而且切换缓慢。

在使用阻止装置(例如百叶)时出现了相同的缺点，该阻止装置可切换地位于透射照明轴上。

例如在DE 10 2011 079 942 A1中提出，在激活垂直-荧光照明时强制地在透射照明轴上接入或装入可切换的百叶，以便防止激发用作透射-明场照明源的白光-LED，其中，于是在激活透射-明场照明时该百叶强制地被切断或摆出。

本发明的目的因而是，改善在相衬-透射照明中和/或在荧光-垂直照明中利用显微镜检查样本，其中，为了抑制干扰的荧光，要避免可切换的部件。

发明内容

根据本发明，提出具有独立权利要求的特征的显微镜、在这种显微镜中对环状光阑的应用以及用于显微镜照明的方法。有利的设计是从属权利要求以及后续说明的主题。

本发明基于如下认识：位于相衬-透射照明机构的透射照明光学器件中的环状光阑可以用于屏蔽透射照明源，免受荧光-垂直照明机构的入射辐射，该透射照明源通常是固体光源。

根据本发明的用于在相衬-透射照明中和/或在荧光-垂直照明中检查样本的显微镜具有相衬-透射照明机构和荧光-垂直照明机构，其中，相衬-透射照明机构具有透射照明源特别是固体光源尤其是一个或多个LED特别是一个或多个白光LED，以及具有带环状光阑的透射照明光学器件特别是聚光器光学器件，其中，环状光阑(光圈)具有不透光的内部的光阑区域，该光阑区域被至少部分地透光的基本上环形的区域包围。荧光-垂直照明机构具有垂直照明源以及特别是带有分光器的垂直照明光学器件。此外，用于相衬-透射照明的显微镜配备了带有相环的物镜。为了避免因激发透射照明源而出现开篇所述的荧光，显微镜结构经过选取，从而由荧光-垂直照明机构产生的荧光-垂直照明光路以其横截面在穿过显微镜的样品平面之后—即使在样品位于那里的情况下—绝大部分地但特别是完全地位于相衬-透射照明机构的环状光阑的内部的光阑区域之内。通过这种方式，垂直照明光路在进入到相衬-透射照明机构中之后且到达透射照明源之前出现特别是完全的遮暗。

相应的显微镜结构可以采用不同的方式来实现。优选地，透射照明光学器件包括聚光器光学器件或聚光器，或者由这种聚光器光学器件或这种聚光器构成，在其后面的光阑平面中布置着环状光阑。优选地，环状光阑固定地布置在透射照明轴上。于是，其余的在显微镜中存在的光学器件，即透射照明光学器件、垂直照明光学器件和物镜，可以分别单独地、组合地或者全部共同地予以调节，从而最佳地出现上述屏蔽。“调节”光学器件或物镜是指，改变位于那里的透镜的焦距，和/或沿着光轴移动这种透镜。存在的垂直照明光学器件也称为荧光轴，它有利地经过调节，从而在荧光-垂直照明光路经过样品平面时—无论是在样品位于那里时，还是在样品不存在时—该荧光-垂直照明光路以其横截面特别是完全地位于环状光阑的内部的光阑区域之内。垂直照明光学器件含有光学部件—在最简单的情况下为一个单独的透镜，乃至由多个透镜、滤光器、光阑等构成的复杂系统。垂直照明光学器件的功能是，把尽量多的光由荧光-垂直照明源引导到样本上，并在那里负责均匀地照明样本。通过适当地调节该垂直照明光学器件，特别是其焦距和/或放大率，可以确保穿过样品平面的、进入到透射照明光学器件中的光在那里被位于那里的环状光阑防止朝向透射照明源进一步传播。

如果显微镜使用不同的物镜和/或不同的光圈，则相环的内部直径在各物镜之间通常是不同的。如果荧光-垂直光学器件经过设计，从而其焦距和/或放大率可改变，则可以在相环的位置选取光锥的大小，使得优选整个光锥都位于相环的内部区域中(因而也位于光圈的内部区域中)。

本发明还涉及在所述类型的显微镜中对所述环状光阑的应用，旨在避免在透射照明源中因荧光-垂直照明源的光而激发荧光。为了避免重复，对此参见结合根据本发明的显微镜所做的上述说明。

最后，本发明涉及使用上述类型的显微镜用于显微镜照明的方法，其中，透射照明光学器件和/或垂直照明光学器件和/或显微镜的物镜和/或环状光阑在透射照明轴上的位置经过调节，从而由荧光-垂直照明机构产生的荧光-垂直照明光路以其横截面在穿过显微镜的样品平面之后位于相衬-透射照明机构的环状光阑的内部的光阑区域之内。对于本发明的方法的其它设计和优点，也参见结合根据本发明的显微镜所做的上述说明。

特别有利的是，在透射照明轴上的环状光阑位置固定时且在按规定调节透射照明光学器件和物镜时，垂直照明光学器件经过调节，从而由荧光-垂直照明机构产生的荧光-垂直照明光路以其横截面在穿过显微镜的样品平面之后完全位于相衬-透射照明机构的环状光阑的内部的光阑区域之内。

此外有利的是，垂直照明源基本上成像到物镜的后面的焦点平面中，相环也位于该焦点平面中。这个后面的焦点平面通过显微镜物镜和透射照明光学器件或聚光器成像到聚光器的后面的焦点平面中，环状光阑位于该焦点平面中。通过合适地调节垂直照明光学器件，可以选取垂直照明源的成像，使得其图像小于环状光阑的内部的光阑区域的直径。为此，垂直照明源的位于物镜的后面的焦点平面中的图像位于相环的内部区域的直径之内。该内部的区域是在相环的内部直径之内的透明区域。

本发明的其它优点和设计可由说明书和附图得到。

不言而喻，前述特征和下面还要介绍的特征不仅可按分别给出的组合予以使用，而且可按其它组合来使用，或者单独使用，而不偏离于本发明的范围。

本发明借助实施例在附图中示意性地示出，并且将在下面参照附图予以介绍。

附图说明

图1示意性地示出根据本发明的一种实施方式的用于在相衬-透射照明和/或荧光-垂直照明中检查样本的显微镜的结构；

图2示意性地示出比如可以在根据图1的显微镜中使用的环状光阑；和

图3示意性地示出根据本发明的一种实施方式在根据图1的显微镜中的荧光-垂直照明的光路。

具体实施方式

图1中示意性地示出的显微镜具有相衬-透射照明机构11和荧光-垂直照明机构12。作为主要的部件，相衬-透射照明机构11具有透射照明源101以及透射照明光学器件103，透射照明源在该实施例中形成固体光源比如白光-LED，透射照明光学器件在该实施例中形成聚光器。环状光阑102也叫光圈，它位于聚光器的后面的焦点平面中。

为了在相衬-透射照明中检查样本，显微镜10具有带相环106的物镜105。

为了在荧光-透射照明中检查样本，显微镜10具有所谓的荧光-垂直照明机构12，该荧光-垂直照明机构含有垂直照明源121以及垂直照明光学器件122作为主要的部件。示意性地示出了布置在物镜105的光轴上的分光器110，它使得荧光-垂直照明光路朝向物镜105和样品平面104转向。由样品平面104中的样本发出的荧光经由物镜105和分光器110进入到显微镜10的镜筒131中。按公知的方式，可以给镜筒131后置目镜(未示出)和/或摄像机132。分光器110还避免荧光-垂直照明源121的在显微镜的组件比如物镜105上反射的光射向镜筒131。

图2中示意性地以俯视图示出图1中的环状光阑102。可明显看到不透光的内部的光阑区域203，该光阑区域被至少部分地透光的基本上环形的区域包围。邻接环形的区域202的又是环形的不透光的区域204。环状光阑201的这种造型确保当环状光阑安装到聚光器103的后面的焦点平面中时样本按一定的孔径角被照明。通过这种方式，如开篇所述，与相环106一起，样品在相衬中成像并受到检查。

图1中示出的显微镜10除了能实现相衬外，还能实现在荧光-垂直照明中对样品的成像或检查。如开篇所述，荧光-垂直照明的一部分透过位于样品平面104中的样品进入到相衬-透射照明机构11中。因而在那里，荧光-垂直照明的一部分经由聚光器被导向至透射照明源101。原则上，当在聚光器103的后面的焦点平面中布置环状光阑102时也是这种情况，因为该环状光阑具有透光区域。在使用固体光源时，如开篇详述，垂直照明源121的到达透射照明源101的光导致荧光，该荧光在荧光-垂直照明中摄取图像时又作为干扰的背景照明而可觉察到。这一点可以通过如下措施予以防止：根据图1的显微镜结构经过选取，从而由荧光-垂直照明机构12产生的荧光-垂直照明光路以其横截面在穿过样品平面104之后位于环状光阑102的内部的光阑区域203之内。通过这种方式，荧光-垂直照明在到达透射照明源101之前被阻挡。有益的是，整个横截面都位于内部的光阑区域203之内。

对于这种屏蔽或阻挡效果，如下措施是适合的。原则上，适宜调节显微镜中的全部可能的可移调的光学部件，即透射照明光学器件103、显微镜物镜105以及垂直照明光学器件122，它们可以分别由一个单独的透镜构成，乃至由多个透镜、滤光器、光阑等构成的复杂系统。通常，这些光学器件103、105和122在其焦距方面可调节。附加地或替代地，这些光学器件103、105、122的各个透镜可以沿着相应的光轴移动。最有益的是，垂直照明光学器件122用于根据本发明的目的，如下所述。

图3针对根据图1的显微镜示意性地示出荧光照明的可能的光路。在这方面，全部细节都可以参照针对图1所做的附图说明。绘出的光路示出了在中间的点以及在垂直照明源121边缘的点的光路径。垂直照明源121的焦点分别成像到物镜105的后面的焦点平面中，相环106也位于该焦点平面中。这个平面通过物镜105和聚光器103又成像到聚光器103的后面的焦点平面中，环状光阑102位于该焦点平面中。如果通过适当地调节垂直照明光学器件122来选取成像，使得垂直照明源121的焦点的图像小于环状光阑102、201的内部的光阑区域203的直径(参见图2)，则垂直照明光路的光锥在环状光阑102的位置同样仅仅照射到环状光阑的内部的光阑区域203上。因而在一种合适的实施方式中适当地调节垂直照明光学器件122，使得垂直照明源121的焦点基本上落入到物镜105的后面的焦点平面中。如本领域技术人员所理解，该条件不必精确地满足，而是只需基本上满足。然而，垂直照明光路的光锥在相环106的位置应优选小于该相环106的内部的透明的区域的直径。

附图标记清单

10显微镜

11相衬-透射照明机构

12荧光-垂直照明机构

100透射照明轴、光轴

101透射照明源

102环状光阑

103透射照明光学器件、聚光器

104样品平面

105物镜

106相环

110分光器

116相环的内部区域

121垂直照明源

122垂直照明光学器件

131镜筒

132摄像机

201环状光阑

202环形的区域

203内部的光阑区域

204外部的光阑区域

Claims (9)

1.一种用于在相衬-透射照明中和/或在荧光-垂直照明中检查样本的显微镜(10)，具有相衬-透射照明机构(11)和荧光-垂直照明机构(12)，其中，所述相衬-透射照明机构(11)具有透射照明源(101)以及具有带环状光阑(102、201)的透射照明光学器件(103)，其中，所述环状光阑(102、201)具有不透光的内部的光阑区域(203)，该光阑区域被至少部分地透光的环形的区域(202)包围，其中，所述荧光-垂直照明机构(12)具有垂直照明源(121)以及垂直照明光学器件(122)，其中，

所述显微镜(10)具有带相环(106)的物镜(105)，其中，

由所述荧光-垂直照明机构(12)产生的荧光-垂直照明光路以其横截面在穿过所述显微镜(10)的样品平面(104)之后完全位于所述相衬-透射照明机构(11)的环状光阑(102、201)的内部的光阑区域(203)之内，

所述垂直照明源(121)在所述相环(106)的内部的区域(116)之内成像到所述物镜(105)的后面的焦点平面中，所述相环(106)布置在该焦点平面中，

所述荧光-垂直照明光路的光锥在所述相环(106)的位置小于所述相环(106)的内部的区域(116)的直径。

2.如权利要求1所述的显微镜(10)，其中，所述透射照明源(101)包括或者是固体光源。

3.如前述权利要求中任一项所述的显微镜(10)，其中，所述透射照明光学器件(103)包括聚光器，在该聚光器的后面的焦点平面中布置着所述环状光阑(102、201)。

4.如前述权利要求中任一项所述的显微镜(10)，其中，所述垂直照明光学器件(122)的焦距和/或放大率可改变。

5.如前述权利要求中任一项所述的显微镜(10)，其中，所述物镜(105)的焦距可改变。

6.如权利要求1～5中任一项所述的显微镜(10)的环状光阑(102、201)的应用，用于防止因垂直照明源(121)的光而激发透射照明源(101)，其方式为，所述环状光阑(102、201)的不透光的内部的光阑区域(203)使得所述透射照明源(101)相对于垂直照明源(121)的光屏蔽。

7.如权利要求6所述的应用，其中，透射照明光学器件(103)和/或垂直照明光学器件(122)和/或物镜(105)经过调节，从而由所述荧光-垂直照明机构(12)产生的荧光-垂直照明光路以其横截面在穿过所述显微镜(10)的样品平面(104)之后完全位于所述相衬-透射照明机构(11)的环状光阑(102、201)的内部的光阑区域(203)之内。

8.使用根据权利要求1～5中任一项所述的显微镜(10)进行显微镜照明的方法，其中，透射照明光学器件(103)和/或垂直照明光学器件(122)和/或物镜(105)经过调节，从而由所述荧光-垂直照明机构(12)产生的荧光-垂直照明光路以其横截面在穿过所述显微镜(10)的样品平面(104)之后完全位于所述相衬-透射照明机构(11)的环状光阑(102、201)的内部的光阑区域(203)之内。

9.如权利要求8所述的方法，其中，在透射照明轴(100)上的环状光阑(102、201)位置固定时且在按规定调节透射照明光学器件(103)和物镜(105)时，垂直照明光学器件(122)经过调节，从而由所述荧光-垂直照明机构(12)产生的荧光-垂直照明光路以其横截面在穿过所述显微镜(10)的样品平面(104)之后完全位于所述相衬-透射照明机构(11)的环状光阑(102、201)的内部的光阑区域(203)之内。

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