JP6131204B2

JP6131204B2 - 観察装置

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Publication number: JP6131204B2
Application number: JP2014037830A
Authority: JP
Inventors: 兼太松原
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2017-05-17
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Description

本発明は、位相差レンズを用いて位相差計測を行う観察装置に関するものである。

近年、幹細胞などの培養された透明な細胞を非染色に観察する方法として位相差計測が広く使われ始めている。そして、このような位相差計測を行うものとして、位相差レンズを備えた位相差顕微鏡が使用されている（たとえば特許文献１参照）。

一方、明瞭な顕微鏡画像を高速に取得するための手法として、様々な超解像技術が提案されている。その中のひとつとして、構造化照明技術と呼ばれる、明暗照明を被写体へ投影する手法が提案されている。また、顕微鏡画像を高速に取得する手法としても、構造化照明を被写体へ投影させて検出し、対物レンズの位置制御を行って焦点位置を確定する手法も提案されている。

特開平２−２７５９１８号公報

ここで、位相差計測は入射光による直接光と回折光の位相差を検出することを目的としているため、位相差レンズの特定位置に位相板が設けられており、この位相板には、直接光を回折光と同レベルの強度に減光する機能が備えられている。

この位相板は光学的に略無限遠の空間に配置されていることが多く、たとえば位相差顕微鏡において構造化照明を被写体へ投影する場合、位相板を有する位相差レンズを介して構造化照明を投影しようとすると、位相板が空間周波数フィルタとして機能してしまい、意図した構造化照明を被写体へ投影することができない。

本発明は、上記の問題に鑑み、位相差計測用照明光を減光する位相板を有する位相差レンズを備えた観察装置であって、構造化照明光が位相板によって減光されるのを防止することができ、被写体設置面に設置された被写体に対して構造化照明光を適切に照射することができる観察装置を提供することを目的とする。

本発明の観察装置は、明暗のパターンを有する構造化照明光を出射する構造化照明部と、位相差計測用照明光を被写体設置面に対して出射する位相差計測照明部と、位相差計測用照明光を減光する位相板を有し、被写体設置面を通過した位相差計測用照明光が入射され、かつ構造化照明光が光学系を介して位相差計測用照明光の入射方向と異なる方向から入射される位相差レンズと、被写体設置面において反射された構造化照明光の反射光を検出する検出部と、位相差レンズを通過した位相差計測用照明光を結像する観察部とを備え、構造化照明光が上記光学系によってフーリエ変換された際、構造化照明光の空間周波数が、光学的なフーリエ空間上における位相板の位置に対して高周波側または低周波側に設定されていることを特徴とする。

本発明の観察装置は、明暗のパターンを有する構造化照明光を出射する構造化照明部と、
位相差計測用照明光を被写体設置面に対して出射する位相差計測照明部と、位相差計測用照明光を減光する位相板を有し、被写体設置面を通過した位相差計測用照明光が入射され、かつ構造化照明光が光学系を介して位相差計測用照明光の入射方向とは異なる方向から入射される位相差レンズと、被写体設置面において反射された構造化照明光の反射光を検出する検出部と、位相差レンズを通過した位相差計測用照明光を結像する観察部とを備え、位相板が、構造化照明光を透過し、かつ位相差計測用照明光を減光する周波数特性を有するものであることを特徴とする。

上記本発明の観察装置においては、検出部によって検出された反射光の強度に基づいて、位相差レンズの焦点位置を調整する焦点位置調整部を設けることができる。

また、倍率が異なる複数の位相差レンズを交換可能に構成し、その位相差レンズの交換に応じて構造化照明光の空間周波数を変更することができる。

また、構造化照明部が、光を出射する光源と、その光源から出射された光を透過して構造化照明光を出射するグリッドとを備え、位相差レンズの交換に応じてグリッドの空間周波数を変更することができる。

また、構造化照明部が、光を出射する光源と、その光源から出射された光を透過して構造化照明光を出射するグリッドとを備え、位相差レンズの交換に応じて光源から出射される光の波長を変更することができる。

また、位相差レンズの交換に応じて上記光学系の倍率を変更することができる。

また、観察部が、被写体設置面および位相差レンズを通過した位相差計測用照明光を撮像する撮像素子を備えることができる。

また、位相差板を、構造化照明光を透過し、かつ位相差計測用照明光を減光する周波数特性を有するものとする場合、構造化照明光を近赤外光とし、位相差計測用照明光を可視光とすることができる。

また、この場合、位相板の構造化照明光に対する透過率を７５％〜１００％とし、位相差計測用照明光に対する透過率を０％〜５０％とすることができる。

また、位相差計測用照明光として、リング状の照明光を用いることができる。

また、構造化照明光を、位相差計測用照明光の入射方向とは反対側から位相差レンズに入射するようにできる。

本発明の観察装置によれば、位相差計測用照明光を減光する位相板を有する位相差レンズを備えた観察装置において、構造化照明光の空間周波数を、光学的なフーリエ空間上における位相板の位置に対して高周波側または低周波側に設定するようにしたので、構造化照明光が位相板によって減光されるのを防止することができ、被写体設置面に設置された被写体に対して構造化照明光を適切に照射することができる。

本発明の観察装置によれば、位相差計測用照明光を減光する位相板を有する位相差レンズを備えた観察装置において、位相板を、構造化照明光を透過し、かつ位相差計測用照明光を減光する周波数特性を有するものとしたので、構造化照明光が位相板によって減光されるのを防止することができ、被写体設置面に設置された被写体に対して構造化照明光を適切に照射することができる。

本発明の観察装置の第１の実施形態を用いた顕微鏡装置の概略構成を示す図スリット板の構成を示す図位相差レンズの構成を示す図構造化照明光が投影光学系によってフーリエ変換作用を受けた場合の像の一例を示す図構造化照明光の空間周波数を位相板の位置に対して高周波側または低周波側に設定する例を説明するための図本発明の観察装置の第２の実施形態を用いた顕微鏡装置の概略構成を示す図第２の実施形態の顕微鏡装置における位相板の周波数特性の一例を示す図位相板の機能を付加したハーフミラーの一例を示す図第２の実施形態の顕微鏡装置の変形例の概略構成を示す図

以下、本発明の観察装置の第１の実施形態を用いた顕微鏡装置について、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、第１の実施形態の顕微鏡装置１の概略構成を示す図である。

本実施形態の顕微鏡装置１は、図１に示すように、構造化照明部１０と、位相差計測照明部２０と、位相差レンズ３０と、観察部４０と、検出部５０と、焦点位置調整部６０とを備えている。

構造化照明部１０は、縞状のパターンを有する構造化照明光を出射するものである。本実施形態の構造化照明部１０は、具体的には、白色光を出射する白色光源１１と、白色光源１１から出射された白色光を透過する線状部分と遮光する線状部分とから構成されるグリッド１２と、グリッド１２から出射された縞状の明暗のパターンを有する構造化照明光を反射するとともに、被写体設置面において反射された構造化照明の反射光を透過する第１のハーフミラー１３と、第１のハーフミラー１３において反射された構造化照明が入射され、その構造化照明を投影する投影光学系１４と、投影光学系１４によって投影された構造化照明光を被写体設置面に向けて反射するとともに、位相差計測照明部２０から出射され、被写体設置面および位相差レンズ３０を通過した位相差計測用照明光を透過する第２のハーフミラー１５とを備えている。

なお、本実施形態においては、グリッド１２を用いることによって縞状の明暗のパターンを有する構造化照明光を形成するようにしたが、構造化照明光を形成する方法としては、これに限らず、たとえば空間光変調素子などを用いて構造化照明光を形成するようにしてもよい。

位相差計測用照明部２０は、観察対象の被写体が設置される被写体設置面に対して、いわゆる位相差計測用の照明光を出射するものであり、本実施形態では、その位相差計測用照明光としてリング状照明光を出射するものである。本実施形態の位相差計測照明部２０は、具体的には、白色光を出射する白色光源２１と、リング形状のスリットを有し、白色光源２１から出射された白色光が入射されてリング状照明光を出射するスリット板２２と、スリット板２２から射出されたリング状照明光が入射され、その入射されたリング状照明光を被写体設置面に設置された被写体に対して照射する対物レンズ２３とを備えている。

図２は、スリット板２２の具体的な構成を示す図である。図２に示すように、スリット板２２は、白色光源２１から出射された白色光を遮光板２２ｂに対して白色光を透過するリング形状のスリット２２ａが設けられたものであり、この白色光がスリット２２ａを通過することによってリング状照明光が形成される。

なお、本実施形態においては、上述したようにスリット板２２を用いてリング状照明光を形成するようにしたが、リング状照明光を形成する方法としては、これに限らず、たとえば空間光変調素子などを用いてリング状照明光を形成するようにしてもよい。

また、本実施形態においては、位相差計測用照明光としてリング状照明光を用いるようにしたが、リング状以外の構造を有する照明光でもよく、後述する位相板と共役な形状となっていれば三角形状や四角形状などその他の形状でもよい。

位相差レンズ３０は、対物レンズ３１と、位相板３２とを備えたものである。図３は、位相板３２の具体的な構成を示す図である。図３に示すように、位相板３２は、リング状照明光の波長に対して透明な透明板３２ｂに対して位相リング３２ａを形成したものである。なお、上述したスリット２２ａの大きさは、この位相リング３２ａと共役な関係にある。

位相リング３２ａは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相差レンズ３０に入射された直接光は対物レンズ３１によって集光され、位相リング３２ａを通過することによって位相が１／４波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、被写体設置面に設置された被写体によって回折された回折光は大部分が位相板３２の透明板３２ｂを通過し、その位相および明るさは変化しない。

また、本実施形態の位相差レンズ３０は、リング状照明光の入射方向とは異なる方向から構造化照明光が入射されるものであり、本実施形態では、リング状照明光の入射側とは反対側から、第２のハーフミラー１５において反射された構造化照明光が入射されるものである。

ここで、上述した構造化照明部１０においてグリッド１２から出射された縞状の明暗のパターンを有する構造化照明光は、投影光学系１４のレンズによるフーリエ変換作用によって、図４に示すように、光学的なフーリエ空間の空間周波数の軸上に、複数の点状の像が並んだ像Ｌとして結像される。すなわち、この複数の点状の像Ｌが、第２のハーフミラー１５によって反射されて位相差レンズ３０に入射される。

一方、本実施形態の位相差レンズ３０は、上述したように位相板３２を備えており、この位相板３２の位相リング３２ａは減光フィルタとして機能するものであるから、たとえば、上述した複数の点状の像Ｌの光学的なフーリエ空間上の位置が、位相リング３２ａの位置と重なってしまった場合には、位相リング３２ａによって複数の点状の像Ｌが減光されてしまい被写体設置面に構造化照明光を適切に照射することができない。

そこで、本実施形態においては、上述したように光学的なフーリエ空間上において、構造化照明光の像Ｌの位置が、位相リング３２ａの位置に重ならないように構造化照明光の空間周波数が設定されている。具体的には、図５に示すように、光学的なフーリエ空間上における位相リング３２ａの位置に対して、構造化照明光の点状の像が、高周波側または低周波側に位置するように構造化照明光の空間周波数が設定されている。図５に示す像Ｌ１は、構造化照明光が低周波側に設定された場合の像であり、像Ｌ２は、構造化照明光が高周波側に設定された場合の像である。構造化照明光の空間周波数は、具体的には、グリッド１２のパターンを調整することによって設定すればよく、たとえば低周波側の空間周波数として２ｃｙｃ/ｍｍ、高周波側の空間周波数として２００ｃｙｃ/ｍｍなどでグリッドのパターンを形成するようにすればよい。

このように構造化照明光の空間周波数を設定することによって、構造化照明光が、位相リング３２ａによって減光されるのを防止することができ、被写体設置面に設置された被写体に対して構造化照明光を適切に照射することができる。

観察部４０は、位相差レンズ３０を通過した直接光および回折光が入射され、これらの光を結像する結像レンズ４１と、結像レンズ４１によって結像された位相差像を撮像する撮像素子４２とを備えている。撮像素子４２としては、ＣＣＤ（charge-coupled device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどが用いられる。

検出部５０は、被写体設置面において反射された構造化照明光の反射光を検出するものである。本実施形態における検出部５０は、１次元に光電変換素子が配列されたラインセンサから構成されるものである。被写体設置面において反射された反射光は、位相差レンズ３０を透過し、第２のハーフミラー１５において反射され、投影光学系１４および第１のハーフミラー１３を透過して検出部５０によって受光される。

焦点位置調整部６０は、検出部５０によって検出された反射光の強度に基づいて、位相差レンズ３０の位置を矢印Ａ方向に移動させることによって、位相差レンズ３０の焦点位置を調整するものである。すなわち、焦点位置調整部６０は、検出部５０によって検出された反射光の強度に基づいて、いわゆるオートフォーカス制御を行うものである。焦点位置調整部６０は、たとえば検出部５０によって検出された反射光のコントラストを算出し、そのコントラストが最大となる焦点位置に制御するものであるが、構造化照明光に基づく焦点調整については既に公知であるので、その公知な手法を用いて制御するようにすればよい。

次に、図１に示す顕微鏡装置１の作用について説明する。

まず、被写体設置面上に観察対象である被写体が設置される。被写体としては、たとえばＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞や、幹細胞を分化誘導した細胞などがある。

そして、構造化照明部１０におけるグリッド１２を通過した縞状のパターンを有する構造化照明光は第１のハーフミラー１３によって反射され、投影光学系１４によって第２のハーフミラー１５に投影される。そして、構造化照明光は、第２のハーフミラー１５によって反射された後、位相差レンズ３０を透過して被写体設置面に設置された被写体に照射される。

そして、被写体設置面において反射された構造化照明光の反射光は、位相差レンズ３０を透過し、第２のハーフミラー１５によって反射された後、投影光学系１４および第１のハーフミラー１３を介して検出部５０によって入射され、検出部５０により受光される。

検出部５０によって検出された反射光の強度信号は焦点位置調整部６０に出力され、焦点位置調整部６０は、入力された反射光の強度信号に基づいて位相差レンズ３０を移動させることによってオートフォーカス制御を行う。

一方、リング状照明部２０のスリット板２２を通過したリング状照明光は、対物レンズ２３によって被写体設置面上の被写体に対して照射される。そして、被写体設置面を通過したリング状照明光の直接光および回折光が位相差レンズ３０に入射される。

そして、位相差レンズ３０に入射された直接光は、対物レンズ３１によって集光されて位相リング３２ａを通過する。これにより直接光は、位相リング３２ａの位相膜によって位相が１／４波長ずらされるとともに、減光フィルタによって減光される。一方、回折光は、その大部分が位相板３２の透明板３２ｂを通過する。

そして、直接光と回折光は、第２のハーフミラー１５を透過し、結像レンズ４１によって撮像素子４２の像面に結像されて撮像される。撮像素子４２によって撮像された画像信号は、図示省略した信号処理部によって所定の信号処理が施された後、モニタなどに出力され、モニタなどにおいて被写体の位相像が表示される。

次に、本発明の観察装置の第２の実施形態を用いた顕微鏡装置について説明する。図６は、第２の実施形態の顕微鏡装置２の概略構成を示す図である。第１の実施形態の顕微鏡装置１においては、構造化照明光を被写体設置面に照射するために構造化照明光の空間周波数を調整するようにしたが、第２の実施形態の顕微鏡装置２は、このような構造化照明光の空間周波数の調整を行うのではなく、位相差レンズ３０の位相板３３の位相リングの周波数特性を調整するようにしたものである。

具体的には、第２の実施形態の位相差レンズ３０の位相板３３の位相リングは、図７に示すような周波数特性を有するものであり、すなわち構造化照明光の波長帯域を透過するとともに、位相計測用のリング状照明光を減光するものである。そして、構造化照明光としては、たとえば近赤外光を用いることができ、リング状照明光としては、可視光を用いることができる。位相板３３の位相リングの構造化照明光に対する透過率は７５％〜１００％とし、リング状照明光に対する透過率は０〜５０％であることが望ましい。

第２の実施形態の顕微鏡装置２においては、上述したように位相板３３の位相リングの周波数特性を調整することによって、たとえ構造化照明光の像が位相板３３の位相リングの位置に結像したとしても、位相板３３の位相リングにおいて構造化照明光を透過させることができ、被写体設置面に対して構造化照明光を適切に照射することができる。

なお、第２の実施形態の顕微鏡装置２においては、構造化照明光の光源として近赤外光源１６を用い、グリッド１２、第１のハーフミラー１３、投影光学系１４および第２のハーフミラー１５などの構造化照明光の光学系は、近赤外光の波長帯域に合わせたものが用いられるものとする。

また、第２の実施形態の顕微鏡装置２のその他の構成および作用については、第１の実施形態の顕微鏡装置１と同様である。

また、第２の実施形態の顕微鏡装置２において、図８に示すように、位相差レンズ３０における位相板３３をハーフミラー１５におけるリング状照明光の入射側の面に設け、これによりハーフミラー１５に対して位相板の機能を持たせるようにしてもよい。

また、上記第２の実施形態の顕微鏡装置２においては、図９に示すように、互いに倍率が異なる複数の位相差レンズ３０，７０を交換可能な構成としてもよい。位相差レンズを交換可能な構成としては、たとえばターレットを設けて複数の位相差レンズを交換可能としてもよいし、その他の公知な構成を採用するようにしてもよい。

そして、上述したように倍率の異なる複数の位相差レンズ３０，７０を交換可能に構成した場合、対物レンズ３１と対物レンズ７１の倍率の変更に応じて位相板３３の位相リングと位相板７２の位相リングの大きさも変更される。したがって、この位相リングの大きさの変更に応じて、位相リングの位置と構造化照明光の像の位置とが一致するように、構造化照明光の空間周波数を変更するようにしてもよい。具体的には、たとえば位相差レンズの倍率を２０倍から４倍に変更した場合、構造化照明光の空間周波数を５０ｃｙｃ/ｍｍから５ｃｙｃ/ｍｍに変更するようにしてもよい。なお、具体的な位相差レンズの倍率と構造化照明光の空間周波数との関係は、これに限らず、第１のハーフミラー１３、投影光学系１４、第２のハーフミラー１５の光学特性や位置関係などに応じて適宜設定するようにすればよい。

構造化照明光の空間周波数を変更する方法としては、たとえば空間周波数が異なるグリッド１２とグリッド１８を変更するようにすればよい。また、グリッド１２，１８の変更に限らず、たとえば近赤外光源から出射される近赤外光自体の波長を変更するようにしてもよい。近赤外光の波長を変更する方法としては、波長の異なる近赤外光を出射する近赤外光源１６と近赤外光源１７を変更するようにしてもよいし、たとえば近赤外光源としてＬＥＤ（Light Emitting Diode）やＬＤ（laser Diode）を用いる場合にはその駆動電圧を変更するようにしてもよい。また、倍率の異なる投影光学系１４と投影光学系１９とを変更することによって、構造化照明光の空間周波数を変更するようにしてもよい。

また、第２の実施形態の顕微鏡装置２に限らず、第１の実施形態の顕微鏡装置１においても、倍率の異なる複数の位相差レンズ３０，７０を交換可能に構成し、その交換に応じて構造化照明光の空間周波数を変更するようにしてもよい。第１の実施形態の顕微鏡装置１の場合には、構造化照明光の像が、位相リングの位置からずれるように構造化照明光の空間周波数を変更するようにすればよい。

また、上記第１および第２の実施形態の顕微鏡装置１，２においては、構造化照明光の反射光をラインセンサである検出部５０によって検出し、その検出信号に基づいてオートフォーカス制御を行うようにしたが、これに限らず、検出部５０として、ＣＭＯＳイメージセンサやＣＣＤイメージセンサを用い、これらのイメージセンサによって構造化照明光の照射によるモアレ像を検出するようにしてもよい。そして、複数のモアレ像を演算処理することによって高解像度画像を取得するようにしてもよい。なお、構造化照明光を用いた高解像度画像の取得方法については、既に公知な方法を用いることができる。

また、検出部５０としてラインセンサとイメージセンサとの両方を設け、構造化照明光の反射光をさらにハーフミラーなどで分光することによって、これらのセンサの両方で反射光を検出するようにしてもよい。

１，２顕微鏡装置
１０構造化照明部
１１白色光源
１２，１８グリッド
１３第１のハーフミラー
１４，１９投影光学系
１５第２のハーフミラー
１６，１７近赤外光源
２０リング状照明部
２１白色光源
２２スリット板
２２ａスリット
２２ｂ遮光板
２３対物レンズ
３０，７０位相差レンズ
３１対物レンズ
３２位相板
３２ａ位相リング
３２ｂ透明板
３３位相リング
４０観察部
４１結像レンズ
４２撮像素子
５０検出部
６０焦点位置調整部

Claims

明暗のパターンを有する構造化照明光を出射する構造化照明部と、
位相差計測用照明光を被写体設置面に対して出射する位相差計測照明部と、
前記位相差計測用照明光を減光する位相板を有し、前記被写体設置面を通過した位相差計測用照明光が入射され、かつ前記構造化照明光が光学系を介して前記位相差計測用照明光の入射方向とは異なる方向から入射される位相差レンズと、
前記被写体設置面において反射された前記構造化照明光の反射光を検出する検出部と、
前記位相差レンズを通過した前記位相差計測用照明光を結像する観察部とを備え、
前記構造化照明光が前記光学系によってフーリエ変換された際、前記構造化照明光の空間周波数が、光学的なフーリエ空間上における前記位相板の位置に対して高周波側または低周波側に設定されていることを特徴とする観察装置。
明暗のパターンを有する構造化照明光を出射する構造化照明部と、
位相差計測用照明光を被写体設置面に対して出射する位相差計測照明部と、
前記位相差計測用照明光を減光する位相板を有し、前記被写体設置面を通過した位相差計測用照明光が入射され、かつ前記構造化照明光が光学系を介して前記位相差計測用照明光の入射方向とは異なる方向から入射される位相差レンズと、
前記被写体設置面において反射された前記構造化照明光の反射光を検出する検出部と、
前記位相差レンズを通過した前記位相差計測用照明光を結像する観察部とを備え、
前記位相板が、前記構造化照明光を透過し、かつ前記位相差計測用照明光を減光する周波数特性を有するものであることを特徴とする観察装置。
前記検出部によって検出された反射光の強度に基づいて、前記位相差レンズの焦点位置を調整する焦点位置調整部を備えた請求項１または２記載の観察装置。
倍率が異なる複数の前記位相差レンズが交換可能に構成されたものであり、
前記位相差レンズの交換に応じて前記構造化照明光の空間周波数が変更されるものである請求項１から３いずれか１項記載の観察装置。
前記構造化照明部が、光を出射する光源と、該光源から出射された光を透過して前記構造化照明光を出射するグリッドとを備えたものであり、
前記位相差レンズの交換に応じて前記グリッドの空間周波数を変更するものである請求項４記載の観察装置。
前記構造化照明部が、光を出射する光源と、該光源から出射された光を透過して前記構造化照明光を出射するグリッドとを備えたものであり、
前記位相差レンズの交換に応じて前記光源から出射される光の波長を変更するものである請求項４記載の観察装置。
前記位相差レンズの交換に応じて前記光学系の倍率が変更されるものである請求項４記載の観察装置。
前記観察部が、前記被写体設置面および前記位相差レンズを通過した前記位相差計測用照明光を撮像する撮像素子を備えたものである請求項１から７いずれか１項記載の観察装置。
前記構造化照明光が近赤外光であり、前記位相差計測用照明光が可視光である請求項２記載の観察装置。
前記位相板の前記構造化照明光に対する透過率が７５％〜１００％であり、前記リング状照明光に対する透過率が０％〜５０％である請求項２記載の観察装置。
前記位相差計測用照明光が、リング状の照明光である請求項１から１０いずれか１項記載の観察装置。
前記構造化照明光が、前記位相差計測用照明光の入射方向とは反対側から前記位相差レンズに入射されるものである請求項１から１１いずれか１項記載の観察装置。