JP6552793B2 - 標本観察装置 - Google Patents
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Description
本発明は、標本を載置するステージと、光源から発せられた励起光を前記標本に照射する対物レンズと、該対物レンズにより前記標本に照射される励起光の空間強度分布を変調する変調部と、前記標本における前記対物レンズの焦点位置から戻る戻り光を通過させ、該焦点位置以外からの光を遮断可能な通過制限部材と、該通過制限部材を通過した戻り光を検出して、超解像画像を生成するための元画像データ、および、基準となる基準画像データを取得する画像データ取得部と、該画像データ取得部により取得された前記元画像データと基準になる基準画像データとの前記空間強度分布が広がる方向の位置ずれ量を算出する位置ずれ量算出部と、該位置ずれ量算出部により所定の位置ずれ検出閾値を超える前記位置ずれ量が算出された場合に、前記画像データ取得部により取得される前記元画像データの前記位置ずれ量が前記所定の位置ずれ検出閾値以下になるように前記ステージ、前記変調部および/または前記画像データ取得部を制御する制御部と、前記標本における同一範囲に複数回にわたり励起光を照射して得られる複数の前記元画像データのうち、前記位置ずれ量が前記所定の位置ずれ検出閾値以下の所定の枚数の前記元画像データを積算して積算画像を生成する画像データ積算部と、前記積算画像を元画像として、超解像画像を生成する画像処理部と、を備える標本観察装置を提供する。
このように構成することで、ステージとして電動ステージを採用しなくても位置ずれを解消することができる。
このように構成することで、対物レンズの光軸方向に位置ずれが生じた場合でも、アクティブ型オートフォーカス部により、標本に対する合焦状態が調節されて対物レンズの光軸方向の観察位置のずれが解消される。これにより、観察位置の3次元的な全ての方向のずれを解消することができる。
このように構成することで、元画像データの画素をシフトして位置ずれを補正する場合において、元画像データの周囲の画素を切り捨てても、観察対象領域が元画像データに含まれるようにすることができる。
本発明の第1実施形態に係る標本観察装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る標本観察装置1は、図1に示されるように、標本Sを載置するステージ3と、励起光を発生する光源5と、光源5から発せられた励起光を2次元的に走査させるスキャナ(変調部)7と、スキャナ7により走査された励起光を集光する瞳投影レンズ9と、瞳投影レンズ9により集光された励起光を平行光に変換する結像レンズ13と、結像レンズ13を透過した励起光を標本Sに照射する一方、標本Sにおいて発生る蛍光(戻り光)を集光する対物レンズ15とを備えている。符号11は、結像レンズ13からの励起光を瞳投影レンズ9に向けて反射する反射ミラーである。
スキャナ7は、例えば、近接ガルバノミラーであり、互いに直交する搖動軸回りに搖動可能な2枚のガルバノミラー(図示略)を備えている。このスキャナ7は、2枚のガルバノミラーの各搖動軸回りの揺動角度をそれぞれ制御することで、励起光をX方向およびY方向に走査させて、空間強度分布を変調することができるようになっている。
検出器25は、検出した蛍光の強度に相当する光強度信号を出力するようになっている。
本実施形態に係る標本観察装置1により標本Sの超解像画像を生成する場合において、まず、標本Sの元画像データを取得する過程について説明する。
光源5から発生させた励起光は、ダイクロイックミラー17により反射されてスキャナ7により走査され、瞳投影レンズ9、反射ミラー11、結像レンズ13を介して対物レンズ15により標本Sに照射される。これにより、スキャナ7の各ガルバノミラーの搖動動作に応じて、標本S上で励起光が2次元的に走査される。
本実施形態においては、例えば、元画像データを64枚取得することとする。
まず、上述した手順により標本Sにおける観察位置の基準画像データが取得され(ステップSA1)、画像データ蓄積部35のアドレス0に格納される(ステップSA2)。
このようにすることで、画像間差分が観察位置のずれ等では起こり得ないような大きさになった場合において、観察側の異常あるいは差分算出部37側の異常等、何らかの異常があるとして、システム制御部31による無理な制御を行わないよう対応することができる。
本実施形態においては、基準画像データと元画像データの位置の差分として、輝度差が第1差分閾値を超える位置ずれ画素の数をカウントすることとした。これに対し、第1変形例としては、差分算出部37が元画像データのある領域にわたり輝度差分の積分値を算出し、位置ずれ判定部39が、その輝度差分の積分値が所定の第2差分閾値を超えていた場合に位置ずれが発生したと判定することとしてもよい。この場合も、元画像データの位置ずれが生じていない場合に検出ノイズの積分値で誤検出されないように、ノイズの積分値を明らかに上回った場合に検知するような値の閾値を設定することとすればよい。
次に、本発明の第2実施形態に係る標本観察装置について説明する。
本実施形態に係る標本観察装置1は、差分算出部(第2位置ずれ量算出部)37が、元画像データと基準画像データとのZ方向の位置ずれ量(第2位置ずれ量)を算出し、システム制御部(第2制御部)31が、差分算出部37により所定の第2差分閾値(第2閾値)を超える位置ずれ量が算出された場合に、画像データ取得部33により取得される元画像データの位置ずれ量が所定の第2差分閾値以下になるようにステージ3および/または対物レンズ15を制御する点で第1実施形態と異なる。
以下、第1実施形態に係る標本観察装置1と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
本実施形態においては、超解像画像を生成するための積算画像として、Z方向に断面の位置が異なるものを3枚(3スライス)生成する場合を例示して説明する。
この場合は、まず、図15〜17に示すように、Z方向の位置が異なる3つの基準位置(Z=1、Z=2、Z=3)においてそれぞれ基準画像データを取得する。
Z=2以降のスライスについても、Z=1の場合と同様の手順により、観察位置のずれが生じた場合にX,Y,Z方向に補正した元画像データを取得する。
次に、本発明の第3実施形態に係る標本観察装置について説明する。
本実施形態に係る標本観察装置101は、図18に示すように、スキャナ7および共焦点ピンホール21に代えて、集光レンズアレイ151および共焦点ディスク(変調部)153とを備え、また、コリメートレンズ23、検出器25、画像データ取得部33に代えて、リレーレンズ155およびCCDのような撮像素子(画像データ取得部)157を備える点で第1実施形態と異なる。
以下、第1実施形態に係る標本観察装置1と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
リレーレンズ155は、共焦点ディスク153を介して戻る蛍光をリレーして撮像素子157の受光面上に結像させるようになっている。
本実施形態に係る標本観察装置101により画像データを取得する場合、回転モータ159により集光レンズアレイ151および共焦点ディスク153を所定の回転軸回りに回転させて、光源5から励起光を発生させる。
差分算出部37による元画像データと基準画像データとの画像間差分の算出や、位置ずれ判定部39による観察位置のずれの判定、観察位置にずれが生じた場合の元画像データの取得し直し等については第1実施形態と同様である。
次に、本発明の第4実施形態に係る標本観察装置について説明する。
本実施形態に係る標本観察装置201は、図21に示すように、位置ずれが生じている元画像データを後処理で補正する画像シフト補正部(位置ずれ補正部)161を備える点で第1実施形態と異なる。
以下、第1実施形態に係る標本観察装置1と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
なお、両端のZスライスははじかれてしまう可能性があるので、予めZスライスはドリフトで予想される分広めに設定しておくことが好ましい。
3 ステージ
7 スキャナ(変調部)
15 対物レンズ
21 共焦点ピンホール(通過範囲制限部材)
25 検出器(画像データ取得部)
31 システム制御部(制御部、第2制御部)
33 画像データ取得部
37 差分算出部(位置ずれ量算出部、第2位置ずれ量算出部)
41 画像データ積算部
157 撮像素子
161 画像シフト補正部(位置ずれ補正部)
S 標本
Claims (13)
- 標本を載置するステージと、
光源から発せられた励起光を前記標本に照射する対物レンズと、
該対物レンズにより前記標本に照射される励起光の空間強度分布を変調する変調部と、
前記標本における前記対物レンズの焦点位置から戻る戻り光を通過させ、該焦点位置以外からの光を遮断可能な通過制限部材と、
該通過制限部材を通過した戻り光を検出して、超解像画像を生成するための元画像データ、および、基準となる基準画像データを取得する画像データ取得部と、
該画像データ取得部により取得された前記元画像データと基準になる基準画像データとの前記空間強度分布が広がる方向の位置ずれ量を算出する位置ずれ量算出部と、
該位置ずれ量算出部により所定の位置ずれ検出閾値を超える前記位置ずれ量が算出された場合に、前記画像データ取得部により取得される前記元画像データの前記位置ずれ量が前記所定の位置ずれ検出閾値以下になるように前記ステージ、前記変調部および/または前記画像データ取得部を制御する制御部と、
前記標本における同一範囲に複数回にわたり励起光を照射して得られる複数の前記元画像データのうち、前記位置ずれ量が前記所定の位置ずれ検出閾値以下の所定の枚数の前記元画像データを積算して積算画像を生成する画像データ積算部と、
前記積算画像を元画像として、超解像画像を生成する画像処理部と、
を備える標本観察装置。 - 前記制御部が、前記ステージおよび/または前記変調部の制御により、前記標本における励起光の照射位置を調整する請求項1に記載の標本観察装置。
- 前記画像データ取得部が前記標本の像が結像する位置に配された撮像素子であり、
前記制御部が、前記標本の結像に対する前記撮像素子の位置を調整する請求項1に記載の標本観察装置。 - 前記位置ずれ量算出部が、前記画像データ取得部により前記元画像データが取得される度に前記位置ずれ量を算出し、
前記画像データ取得部が、前記位置ずれ量算出部により前記所定の位置ずれ検出閾値を超える位置ずれ量が算出された場合に前記元画像データの取得を中断し、前記制御部により前記元画像データの位置ずれが解消された後に前記元画像データの取得を再開する請求項1から請求項3のいずれかに記載の標本観察装置。 - 前記画像データ取得部が、前記標本における観察位置とは異なる位置である位置ずれ検出位置の画像データを取得し、
前記位置ずれ量算出部が、前記画像データ取得部により取得された前記位置ずれ検出位置の画像データを用いて前記元画像データと前記基準画像データとの位置ずれ量を算出する請求項1から請求項4のいずれかに記載の標本観察装置。 - 前記制御部が、前記基準画像データに対する前記元画像データの位置ずれ量と該位置ずれ量を前記所定の位置ずれ検出閾値以下にするために必要な前記ステージ、前記変調部および/または前記画像データ取得部の制御量とを対応付けたテーブルを有する請求項1から請求項5のいずれかに記載の標本観察装置。
- 前記位置ずれ量算出部により算出される前記位置ずれ量が所定の異常検出閾値を超えた場合に異常状態であることを報知する報知部を備える請求項1から請求項6のいずれかに記載の標本観察装置。
- 前記制御部が、前記変調部の制御により観察位置の位置ずれを補正する請求項1から請求項7のいずれかに記載の標本観察装置。
- 前記元画像データと前記基準画像データとの前記空間強度分布が広がる方向に交差する方向の第2位置ずれ量を算出する第2位置ずれ量算出部と、
該第2位置ずれ量算出部により所定の第2閾値を超える第2位置ずれ量が算出された場合に、前記画像データ取得部により取得される前記元画像データの前記位置ずれ量が前記所定の位置ずれ検出閾値以下になるように前記ステージおよび/または前記対物レンズを制御する第2制御部とを備える請求項1から請求項7のいずれかに記載の標本観察装置。 - 前記標本に対する前記対物レンズの光軸方向の合焦状態を調節するアクティブ型オートフォーカス部を備える請求項1から請求項8のいずれかに記載の標本観察装置。
- 光源から発せられた励起光を標本に照射する対物レンズと、
該対物レンズにより前記標本に照射された励起光の空間強度分布を変調する変調部と、
前記標本における前記対物レンズの焦点位置から戻る戻り光を通過させ、該焦点位置以外からの光を遮断可能な通過制限部材と、
該通過制限部材を通過した戻り光を検出して、超解像画像を生成するための元画像データ、および、基準となる基準画像データを取得する画像データ取得部と、
該画像データ取得部により取得された前記元画像データと基準になる基準画像データとの前記空間強度分布が広がる方向の位置ずれ量を算出する位置ずれ量算出部と、
前記標本における同一範囲に複数回にわたり励起光を照射して得られる複数の前記元画像データのうち、前記位置ずれ量が所定の位置ずれ検出閾値以下の前記元画像データを積算して積算画像を生成する画像データ積算部と、
前記積算画像を元画像として、超解像画像を生成する画像処理部と、
前記位置ずれ量算出部により前記所定の位置ずれ検出閾値を超える前記位置ずれ量が算出された場合に、前記画像データ積算部により積算する前記元画像データの前記基準画像データに対する位置ずれ量が前記所定の位置ずれ検出閾値以下となるように、前記元画像データの画素をシフトして前記位置ずれを補正する位置ずれ補正部と、
を備える標本観察装置。 - 前記画像データ取得部が、観察対象領域よりも広い視野の前記元画像データを取得する請求項11に記載の標本観察装置。
- 前記位置ずれ量算出部が、前記元画像データと前記基準画像データとの前記空間強度分布が広がる方向に交差する方向の位置ずれをも算出する請求項11または請求項12に記載の標本観察装置。
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