JP4574758B2 - 顕微鏡画像観察装置 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学顕微鏡や走査型レーザ顕微鏡に適用され、観察対象を画像表示する顕微鏡画像観察装置に関する。
【0002】
【従来の技術】
光学顕微鏡は、ステージ上に搭載したプレパラート上の試料を対物レンズで拡大して観察する構成となっており、一般に試料への照明としてランプなどの光源からの光をコンデンサレンズを用いて試料の観察領域全体に均等になるように照射する構造を採用している。通常、接眼レンズを介して像の観察を行なうが、画像の簡単な観察、記録を行なえるようにテレビカメラで撮影し、モニタディスプレイで観察する方法が一般的となっており、近年はテレビカメラの解像度も向上して鮮明に観察を行なうことも可能となった。
【0003】
このように観察画像をデータとして扱うことで、顕微鏡の接眼レンズを覗き込む動作が不要となり、特に試料として生物の培養細胞などの画像をモニタディスプレイにて長時間観察することができる。また、観察している画像をビデオテープレコーダにより容易に記録することもできる。
【0004】
そして、さらに画像の観察を高い分解能でコントラストよく行ないたい場合に、光学顕微鏡による観察では照明系としてフレア等の問題があり、また特に低コントラストの試料を観察する際に得られる画像が大変見づらいものになるという不具合が発生する。これを改善するものとして、点状光投射型(スポット光投射型)の走査型光学顕微鏡が提案されている。
【0005】
この走査型光学顕微鏡は、高輝度の光を光源から対物レンズを介して試料へ点状に照射し、試料からの反射光、もしくは点状の光を照射したことで試料から発生する蛍光を、再び対物レンズ及び光学系を介して点状に結像し、その光をピンホール開口を有する検出器で検出して像の濃度情報を得るようにしたものである。
【0006】
ただし、これだけでは点状光源が照射されたことによる1点の濃度情報しか得られないため、試料をX軸、Y軸の方向にそれぞれ移動して二次元平面内で機械的に移動させるX−Y走査方式を用いたり、光路の走査をCRTディスプレイなどの画像表示装置の画面走査と同期させることで、X−Y走査に対応した上記濃度情報の信号の強度を表示し、画像として観察できるようにしている。
【0007】
以上が走査型光学顕微鏡の原理構成であり、光源としてレーザ光を使うと画像の解像が向上することが広く知られており、実際に光源としてレーザ光を用いたものは走査型レーザ顕微鏡と呼称されている。
【0008】
この走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を走査することにより生じる試料の反射光または蛍光を、検出器である光電子増倍管やフォトダイオードなどで光電変換により電気信号に変換し、画像データとして保存、加工、表示する構成をなしている。
【0009】
図10は、一般的な走査型レーザ顕微鏡の基本構成を示すブロック図である。
図10において、11は光学顕微鏡本体であり、レーザ光源12を用いてこの光学顕微鏡本体11の顕微鏡ステージ111上の試料112表面にレーザ光によるスポット光を照射させる。実際には、試料112表面上をXY走査するために、レーザ光源12からのレーザ光に対し、2次元走査機構部13が対物レンズ113に対するスポット光の光路をXY光路にそれぞれ振らせることになる。
【0010】
図11は、2次元走査の原理を説明するための図である。図11では、X,Y方向の各ガルバノミラーGM1,GM2の2枚を使った場合のXY走査部の概略例を示しており、テレビジョン方式で用いられる所謂ラスタスキャンを実現している。スポット光を照射した結果、試料から得られる反射光または蛍光は、光学顕微鏡本体11の対物レンズ113を通り、2次元走査機構部13を介してピンホール板14を通過した後、光検出部15で受光され、その輝度に応じた電気信号に光電変換される。
【0011】
上記ピンホール板14は、所定径のピンホールが開孔され、光検出部15の前面の結像位置に配置されるもので、ピンホールを通過した光を検出することで試料面上の観察点で合焦している情報のみを検出でき、共焦点効果が得られるようになる。なお、2次元走査機構部13を駆動する場合には、後述する信号処理部16内のCPU16fから走査制御信号が発生され、同時にCPU16fで前記走査制御信号を基準にデータ処理が行なわれる。
【0012】
そして、光検出部15で検出された電気信号は、信号処理部16にて画像処理され、画像信号化されてモニタディスプレイである表示部17に送られ、この表示部17にて表示出力される。
【0013】
次に、上記信号処理部16にて行なう信号処理の内容を詳述する。光検出部15で得た電気信号について、まず利得可変部16aで所望の電圧値となるように信号増幅を行ない、次にオフセット調整部16bにて所望のオフセット量の増減を行なう。そのオフセット量は、CPU16fによりD/A変換器16h,16gを用いて所望の値に設定される。
【0014】
オフセット調整部16bで得られた信号は、次にA/D変換器16cにてデジタル化された後、記憶部16dに画像データとして一時記憶される。記憶部16dに記憶された画像データは、その後CPU16fにより適宜加工、表示、保存される。すなわち、加工とはCPU16fにより所望の画像処理を行なうことであり、表示とは記憶部16dから読出した画像データをD/A変換器16eにてアナログ化した後に上記表示部17に表示し、画像を観察することである。
【0015】
また特に、併せて試料の深さ方向の情報つまり3次元情報が必要な場合には、Z走査駆動部16jによりステージ111を所望のZ位置へ移動させ、必要な画像を順次記憶部16dに構築させることにより、3次元画像の表示、観察も可能となる。
【0016】
上記のような走査型レーザ顕微鏡では、異なる画像観察システムであっても、同じ顕微鏡鏡体を使用しているため、鏡体の性能が及ぼす影響は共通である。一般に、顕微鏡の鏡体は金属の材質で作られており、熱による鏡体自身の伸縮の影響がある。金属は、材質により固有の熱収縮率を持ち、温度の変化により収縮伸長をする。環境温度にもよるが、顕微鏡鏡体の熱安定まで数時間程度かかることがよくある。また、外部温度が変化するとさらに多くの安定時間を要する。この影響は通常の観察では目立たないが、高倍率及び長時間の画像観察においては、観察画像の位置が視野からずれる要因となる。
【0017】
図12は、観察対象となる試料が視野から外れた場合を例示するもので、図12(a)は観察視野OFのほぼ中心に観察細胞OCが位置している状態、図12(b)は顕微鏡鏡体の熱収縮により観察細胞OCが観察視野OFの中心COFから大きく外れている状態を示す。具体的には、例えば100倍観察において視野が20mmである場合、試料が数十μmずれることで視野中心から外れることとなる。これは、顕微鏡鏡体に約10℃の温度変化が生じたことで実際に起こり得るものである。
【0018】
上記温度変化による熱収縮が生じる主な原因として、ランプ照明からの熱伝導、顕微鏡内部に配置されているユニット、例えばIC、モータ等の電気部品からの熱、及び周囲の環境温度変化等が挙げられる。また、この収縮現象は、顕微鏡の鏡体の形、ユニット構成、材質等に影響を受けるものであって、一概にどのように変化するかを容易に知ることはできない。
【0019】
このような不具合を解消し、画像の取込み状態を改善して見易い画像を取得するシステムが従来よりいくつか提案されている。例えば特開平9−138353号公報には、一般的にレーザ顕微鏡の画像を取得するシステムが開示されている。このシステムでは、画像の明るさの調整を行ない見易くした画像を取得しており、より詳しくは、見やすい画像を得るために画像の明るさ成分に関して最適な調整を行なっている。
【0020】
また、特開平9−197287号公報では、レーザ顕微鏡のシステムにおいて、標本の位置を所定の視野内に位置させることを目的としている。そして、接眼レンズから見ることのできる観察画像範囲位置とモニタ画面に表示される範囲とがずれることがあるため、ステージの位置を再調整して観察視野内に合わせるようにしている。この手法として、入力手段により表示画面上で指定された位置に対応するようステージを制御し、XY移動させることで観察視野の中心に位置させている。また、位置の入力手段としては、表示画面上にタッチパネルを設けたり、あるいは表示画面にファンクションスイッチを設けたりしている。
【0021】
【発明が解決しようとする課題】
上記特開平9−138353号公報のシステムは、一般的なレーザ顕微鏡の画像を取得するものであり、画像の明るさの調整を行なって見やすい画像を取得している。しかしながら、画像の明るさ成分に関しての調整のみしか行なっておらず、位置のずれについては何ら補正が行なわれていない。
【0022】
また、上記特開平9−197287号公報においては、モニタ画面を見ながら画像のずれを手動操作により指定し、ずれ補正を行なっている。そのため、画像を観察する毎に同様の操作を行なう必要があり、その操作が煩雑となる。また、長時間にわたる観察においては、顕微鏡鏡体の変形に伴なって観察像位置がずれ、次の画像取込み及び観察操作の際には観察対象が観察視野から大きく外れてしまい、再度観察対象を画像から探さなければならない。このため、観察者は常に監視を続行しなければならない。
【0023】
これは、基本的に接眼レンズからの観察画像と走査して得たモニタ画像との位置ずれの補正が、初期状態にしか対応していないことに起因するもので、顕微鏡鏡体の熱変形が生じたときの観察画像の位置ずれは、その度毎に手動で補正せざるを得ない。
【0024】
本発明の目的は、顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合であっても、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、常に対象画像を観察視野の基準位置に位置するようにして表示させることが可能な顕微鏡画像観察装置を提供することにある。
【0025】
【課題を解決するための手段】
請求項1記載の発明は、顕微鏡で得た画像を観察するための顕微鏡画像観察装置であり、前記画像中の観察対象に係る平面方向の第1の位置情報及び観察光軸方向の第2の位置情報の両方を求め、かつ任意に設定された時間間隔後の、前記画像に係る前記平面方向の基準位置に対する前記第1の位置情報のずれ量とずれ方向、及び前記画像に係る前記観察光軸方向の基準値に対する前記第2の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出する算出手段と、前記顕微鏡の対物レンズと前記観察対象を載置したステージとの相対位置を変化させる駆動手段と、前記算出手段で得た前記第1の位置情報及び前記第2の位置情報の両方に関する前記ずれ量と前記ずれ方向に基いて前記駆動手段の駆動を制御し、前記対物レンズと前記観察対象との位置ずれを補正する制御手段と、を具備したことを特徴とする。
【0026】
このような構成とした結果、顕微鏡の顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合であっても、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、常に対象画像を観察視野の基準位置に位置するようにして表示させることが可能となる。
【0027】
請求項2記載の発明は、観察対象に対してスポット光を走査して得られる光信号から画像を構築して観察するための顕微鏡画像観察装置であり、前記光信号を検出する検出機構とは別に設けられ、前記画像を撮像する撮像手段と、前記撮像手段で得た前記画像中の前記観察対象に係る平面方向の第1の位置情報及び観察光軸方向の第2の位置情報の両方を求め、かつ任意に設定された時間間隔後の、前記画像に係る前記平面方向の基準位置に対する前記第1の位置情報のずれ量とずれ方向、及び前記画像に係る前記観察光軸方向の基準値に対する前記第2の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出する算出手段と、前記顕微鏡の対物レンズと前記観察対象を載置したステージとの相対位置を変化させる駆動手段と、前記算出手段で得た前記第1の位置情報及び前記第2の位置情報の両方に関する前記ずれ量と前記ずれ方向に基いて前記駆動手段の駆動を制御し、前記対物レンズと前記観察対象との位置ずれを補正する制御手段と、を具備し、前記制御手段により前記平面方向及び前記観察光軸方向の位置ずれを補正した状態で前記スポット光の走査による画像構築を行うことを特徴とする。
【0028】
このような構成とした結果、特に走査型レーザ顕微鏡等で、観察画像を得るためのレーザ光源や2次元走査機構を用いることなしに、顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合でも、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、無駄な電力消費を抑え、レーザ光源の長寿命化を図りながら、常に対象画像を観察視野の基準位置に位置するようにして表示させることが可能となる。
【0029】
請求項3記載の発明は上記請求項1または2記載の発明において、前記算出手段が、算出したずれ量及びずれ方向の少なくとも一方を、顕微鏡鏡体の熱変形に係る情報を基に補正することを特徴とする。
【0030】
このような構成とした結果、上記請求項1または2記載の発明の作用に加えて、顕微鏡鏡体に熱変形による平面方向または観察光軸方向の位置ずれが発生した場合であっても対物レンズの合焦範囲を考慮してこれを補正することができる。
【0031】
請求項4記載の発明は上記請求項1乃至3記載の発明において、前記第1の位置情報は前記観察対象の重心位置であり、前記基準位置は前記画像の中心位置であることを特徴とする。
【0032】
このような構成とした結果、上記請求項1乃至3のいずれかに記載の発明の作用に加えて、顕微鏡の顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合であっても、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、常に対象画像を観察視野の中心に位置するようにして表示させることが可能となる。
【0033】
請求項5記載の発明は上記請求項1乃至3記載の発明において、前記第2の位置情報と前記基準値は、各々前記画像のコントラスト値であることを特徴とする。
【0034】
このような構成とした結果、上記請求項1乃至3のいずれかに記載の発明の作用に加えて、画像のコントラスト値を基に観察光軸方向の位置ずれ、すなわち合焦位置ずれを補正し、合焦位置のずれていない観察画像を得ることが可能となる。
【0035】
請求項6記載の発明は上記請求項1乃至3記載の発明において、前記第2の位置情報と前記基準値は、各々前記対物レンズと前記ステージとの相対位置であることを特徴とする。
【0036】
このような構成とした結果、上記請求項1乃至3のいずれかに記載の発明の作用に加えて、演算処理を行なうことなく、前記対物レンズと前記ステージとの相対位置を基に観察光軸方向の位置ずれ、すなわち合焦位置ずれを補正し、合焦位置のずれていない観察画像を得ることが可能となる。
請求項7記載の発明は請求項1乃至6のいずれかに記載の発明において、観察当初における前記第一の位置情報は操作者によって設定されることを特徴とする。
請求項8記載の発明は請求項1記載の発明において、前記顕微鏡画像観察装置は、前記観察対象に対してスポット光を走査して得られる光信号から前記画像を構築して観察する走査型レーザ顕微鏡であることを特徴とする。
【0037】
【発明の実施の形態】
(第1の実施の形態)
以下、本発明の第1の実施の形態について図面を参照して説明する。
【0038】
図1は、光学顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図である。光学顕微鏡本体21には、観察画像のXY平面方向に移動可能なスキャニングステージ211が設けられ、画像観察用のテレビカメラ22が取付けられている。テレビカメラ22で得たステージ211上の試料213の画像信号は、信号処理部231とモニタディスプレイからなる表示部24へ送られる。
【0039】
信号処理部231では、テレビカメラ22で得た画像信号をA/D変換器23aによりデジタル化した後、記憶部23bに記憶させる。この記憶部23bに記憶された画像信号は、D/A変換器23cで読出されて再びアナログ化された後、表示部24とビデオテープレコーダからなる画像記録部25へ送られる一方、重心検出部23dでも読出され、特定の画像処理、すなわち観察視野中の観察対象である試料213における重心位置の算出がなされる。
【0040】
なお、CPU23e1の有する図示しないメモリには、後述する光学顕微鏡本体21の鏡体の熱変形によって生じる位置ずれを補正するための補正処理情報が記憶されている。
【0041】
さらに、重心検出部23dでは、求めた重心位置と観察視野の中心位置とのなす距離及び方向をずれ情報として算出し、その算出結果により距離換算部23fが、その時点での光学顕微鏡本体21における対物レンズの倍率等を考慮し、実際のX,Y各方向の移動量に換算し、XY駆動部23gへ送る。XY駆動部23gでは、距離換算部23fから送られてくる情報に基いて、光学顕微鏡本体21のスキャニングステージ211をX,Y各方向へ駆動して移動させ、試料213の重心位置と観察視野の中心位置とを一致させる。
【0042】
なお、記憶部23bでの画像信号の記憶、重心検出部23dでの重心位置の算出、距離換算部23fでのずれ状態の算出、及びXY駆動部23gでのスキャニングステージ211の駆動は、すべてCPU23e1の駆動制御によりなされる。表示部24では、テレビカメラ22から直接送られる画像信号、あるいは信号処理部231のD/A変換器23cから出力される画像信号の一方を、モニタ画面で表示する。また、画像記録部25は、表示部24を介して送られてきた画像信号あるいはD/A変換器23cからの画像信号を順次記録する。
【0043】
次に、本顕微鏡画像観察装置の動作について説明する。テレビカメラ22により撮像された観察対象の画像信号は、信号処理部231にて画像処理される。すなわち、まずA/D変換器23aにおいてデジタル化され、画像データとして記憶部23bに記憶される。この記憶部23bに記憶された画像データを用いて、重心検出部23dで観察対象となる試料の重心が求められる。
【0044】
図2は、試料である観察細胞OCの観察視野OFにおける位置関係を例示する図である。図2に示すように、観察細胞OCの重心COCと観察視野OFの中心COFとが大きく離れており、観察細胞OCが観察視野OF中の外れた位置にあることがわかる。なお、観察当初の観察位置の設定に関しては、必ずしも自動で重心位置を求めずとも、重心もしくは画像中心と思われる位置を観察者が表示部24を見て視野中心となるよう設定してもよい。
【0045】
次に、観察を開始してからの時間経過に伴ない、光学顕微鏡本体21に生じる顕微鏡鏡体の熱変形に起因した位置ずれの補正処理について説明する。信号処理部231では、CPU23e1が一定の時間間隔で順次更新記憶されている記憶部23bの画像データを重心検出部23dに読出し、観察対象となる試料の重心位置を自動算出させる。そして重心検出部23dは、算出した重心位置と視野の中心位置との画素差を求め、求めた画素差を続く距離換算部23fで移動距離に換算する。
【0046】
図3は、上記画像データにおける観察細胞OCの重心COCの位置と観察視野OFの中心COFの位置との関係を示す図である。距離換算部23fは、図3に示すように重心検出部23dで求められた画素差Lx,Lyを実際の移動距離に換算する。ここで実際の移動距離とは、観察している対物レンズの倍率により決まる実寸法であり、それがスキャニングステージ211の移動量Sx,Syとなる。
【0047】
例えば、使用するテレビカメラ22がアスペクト比4:3、縦横の画素数640×480ドット(正方格子画素)の画像信号を出力するものとし、観察視野の対角線距離が20mmであったとすると、対物レンズの倍率が1倍のときの観察視野OFの横、縦の距離は、それぞれ
(横) 20×4÷5=16mm
(縦) 20×3÷5=12mm
となり、これを1画素間あたりの距離に換算すると、
(横縦共) 16mm÷640=25μm
となる。
【0048】
もし、対物レンズの倍率が10倍の観察で、そのずれ量が画素数Lx=20画素、Ly=10画素であったとすると、
Sx=25×20÷10=50[μm]
Sy=25×10÷10=25[μm]
となり、これが距離換算部23fで換算されてXY駆動部23gに送られる。XY駆動部23gでは、この送られてきた情報に基いて光学顕微鏡本体21のスキャニングステージ211をX,Y方向に移動させ、観察対象の試料である観察細胞OCの中心COCを観察視野OFの中心COFに一致させる。
【0049】
なお、上記位置補正処理において、実際には光学顕微鏡本体21から送られる対物レンズの倍率の情報をCPU23e1が読取り、その情報を重心検出部23dに与えることで移動量を得ることができる。
【0050】
以上の処理により移動制御された後の画像は、観察対象が正確に視野の中心に位置することとなり、D/A変換器23cにてアナログ化された後、表示部24に表示、あるいは画像記録部25に記録される。なお、D/A変換器23cから得た画像信号に代えて、テレビカメラ22で得た画像信号を直接表示部24に表示、あるいは画像記録部25に記録するものとしてもよい。
【0051】
また、上記位置ずれの補正処理を実行する補正処理情報、ここでは時間間隔は、実際の光学顕微鏡本体21の鏡体の熱変形の速度により異なるが、所望の時間間隔を設定可能であるものとする。
【0052】
図4は、CPU23e1のメモリに記憶されている画像取得時間間隔をT1、位置ずれの補正時間間隔をT2(T1>T2)とした場合の、両者の関係を例示した図である。上記補正処理は、画像取得から次の画像取得までの間に行なわなければならないため、図4に示すように、時間T1内で1回あるいは時間間隔T2毎に複数回位置ずれ補正を行なうよう設定すればよい。
【0053】
また、リアルタイムで常に補正処理を行ない観察対象を視野の中心に置きたい場合、テレビカメラ22の1画面の露光時間に同期して、例えばテレビジョン方式がNTSC方式であれば1/30秒間隔で補正処理を行なうことも可能である。
【0054】
一般に、顕微鏡鏡体の熱変形の速度は十分に遅いものであるため、上記のような補正処理に要する処理時間も十分確保することができ、見やすい位置にある所望の観察が可能である。ただし、全体の処理時間は、入力画像の取込み速度により制限される。
【0055】
以上の動作により、初期の設定を行なうのみで、その後は顕微鏡鏡体に熱変形を生じた場合であっても、自動的に長時間にわたって常に観察対象が視野の中心に位置するようにでき、画像を観察、記録することが可能となる。
【0056】
また、画像記録部25はビデオテープレコーダからなるものとしたが、その他にもパーソナルコンピュータを介した記録媒体、例えば光磁気ディスク、ハードディスク等を用いて記録するものとしてもよい。また、テレビカメラ22のサイズ、信号方式には制限はなく、解像度の高いものであれば、位置合わせを行なう精度がより高くなることは言うまでもない。また、テレビカメラを複数用いて、一度に複数の画像を得るようにしてもよい。
【0057】
さらに、上述した補正処理のための情報として、所望の時間間隔で得る熱変形の速度等の情報を用いる他に、顕微鏡鏡体の温度を逐一検出することができる温度センサを鏡体に設け、その温度センサの検出結果を基に、実際の鏡体の熱変形に応じて位置ずれを補正処理するようにしてもよい。
【0058】
(第2の実施の形態)
以下、本発明の第2の実施の形態について図面を参照して説明する。
【0059】
図5は、レーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図である。図5の基本構成は上記第1の実施の形態に示した図1と同様であるため、図1と同一な部分に同一符号を付してその説明を省略する。
【0060】
図5において、31はレーザ顕微鏡本体であり、レーザ光源32から発振されたレーザ光は、必要に応じて光ファイバを介してレーザ顕微鏡本体31に導かれ、対物レンズを通り、そのスポット光が観察光軸と直交する観察画像のXY平面方向に移動可能なスキャニングステージ211上に載置された試料213表面に照射される。
【0061】
2次元走査機構部33は、後述する信号処理部232内の2次元走査駆動制御部23lが発生する走査制御信号により試料213に対してXY走査するものであり、具体的には上記図12で例示したように、2枚のガルバノミラーを用いてX方向とY方向へ走査し、レーザ光をラスタスキャンする。
【0062】
そして、試料213にスポット光を照射した結果得られる試料213からの反射光または蛍光を、レーザ顕微鏡本体31の対物レンズを介して図示しない光路分割部により光路分割する。その分割された一方の光を、2次元走査機構部33を介してピンホール板34を通過させた後、一般に光電子増倍管(PMT)で構成される光検出部35にて輝度に応じた電気信号に光電変換する。
【0063】
ピンホール板34は、所定径のピンホールを開孔したものであり、光検出部35の前面の結像位置に配置される。ピンホール板34を通過した光を光検出部35で検出することにより、試料面上の観察点での合焦により得た情報のみを検出でき、共焦点効果が得られる。光検出部35で変換された電気信号は、信号処理部232において画像処理され、得られた画像信号が表示部24で表示されるとともに、画像記録部25で記録される。
【0064】
信号処理部232では、まず光検出部35で得た電気信号を利得可変部23hにて所望の増幅率により増幅し、次に増幅した電気信号についてオフセット調整部23iで所望分だけオフセット量の増減を行なう。これらの設定量は、CPU23e2がそれぞれD/A変換器23j,23kに所望の値を可変設定することで決められる。そして、オフセット調整部23iから出力された信号がA/D変換器23aに送られてデジタル化され、順次記憶部23bに書込まれる。
【0065】
この記憶部23bでのアドレス指定はCPU23e2により行なわれる。CPU23e2は、2次元走査駆動制御部23lの制御による2次元走査機構部33での走査に同期して、記憶部23bに1画面分の信号を画像データとして記憶させる。
【0066】
次に、本顕微鏡画像観察装置の動作について説明する。まず、2次元走査機構部33によりレーザ光源32からのレーザ光を試料213表面に走査し、得られた反射光または蛍光を順次ピンホール板34を介して光検出部35で検出する。光検出部35では検出した光に対して光電変換を行ない、信号処理部232の利得可変部23h及びオフセット調整部23iでその電気信号の振幅及びオフセット値の調整をした後、A/D変換器23aでデジタル化して記憶部23bに記憶する。
【0067】
この記憶部23bに記憶された1画面分の画像に対して画像処理が実行されるが、その画像処理の内容自体は上記第1の実施の形態と同様であるので説明を省略する。そして、常に観察対象となる試料の重心位置が観察視野の中心位置と一致するよう、XY駆動部23gによりレーザ顕微鏡本体31のスキャニングステージ211を自動的に移動させる。
【0068】
一般的にレーザ顕微鏡の場合、画像取得の方法としてはXYTスキャン、XYZTスキャンといった時間経過を観察する方法があり、上記第1の実施の形態の場合と同様に長時間観察が必要である。したがって、このようなレーザ顕微鏡の画像取込みモードにおいても適切な位置補正を行なうことで、良好な画像の確実な取得が可能となる。
【0069】
(第3の実施の形態)
レーザ顕微鏡で画像を取得するためには、レーザ光源、2次元走査機構部といった主要部分を動かす要素が必須となり、多大な電力を消費する。これに対してテレビカメラで画像を得る場合は、かかる消費電力がはるかに少ないという利点がある。また、特にレーザ顕微鏡で用いられる気体レーザは、一般的に固体レーザに比べて寿命が短い。したがって、顕微鏡画像観察装置において画像の条件を抽出する間は、レーザ光による走査を一時的に停止し、電源を切断しておくことが望ましい。
【0070】
これは、画像の位置ずれに対する補正処理を実行する場合も同様であり、やはりレーザ光による走査にかかる停止作業が必要とされる。そのため、画像の位置ずれの検出に関してはテレビカメラの画像を使い、実際に記憶したい顕微鏡画像としてレーザ光の走査で得た画像を記憶するという使い方を行なえば、必要な電力消費を充分低く抑えることができる。
【0071】
以下、本発明の第3の実施の形態について図面を参照して説明する。本第3の実施の形態では、レーザ光の走査により顕微鏡画像を取得する時間間隔が長い場合に、必要時以外はレーザ光の走査に係る回路の電源を一時的に切断し、その間に複数回テレビカメラで画像を得て、位置ずれの補正処理を行なう。
【0072】
図6は、レーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図である。図6の基本構成は上記第2の実施の形態に示した図5と同様であるため、図5と同一な部分に同一符号を付してその説明を省略する。
【0073】
図6において、2次元走査機構部33の対物レンズ側には光路分割部41が設けられ、レーザ光の走査を行なっていない状態では、この光路分割部41により観察対象となる試料213の光像をテレビカメラ42に導く。テレビカメラ42により撮像された観察対象の画像信号は、信号処理部233内のA/D変換器23mでデジタル化された後に記憶部23nに記憶される。この記憶部23nは、記憶制御部23oの制御に基いて送られくる画像信号を記憶し、記憶部23nに記憶される画像に基いて、重心検出部23dが観察視野中における観察対象となる試料の重心位置を検出する。
【0074】
そして、レーザ光の走査により得られた顕微鏡画像の記憶部23bへの記憶は記憶制御部23pにより、またテレビカメラ42で得られた画像の記憶部23nへの記憶は記憶制御部23oにより、それぞれ制御される。CPU23e3では、光路分割部41を切換えるとともに、これら記憶制御部23p,23oを統括制御して、記憶部23bと記憶部23nのいずれか一方で顕微鏡画像を記憶するよう切換制御する。
【0075】
このような構成とすることにより、試料の観察を行なう場合には、レーザ光源32で発振したレーザ光を2次元走査機構部33で当該試料の表面に走査しながら照射する。そして、光路分割部41を光検出部35側に切換えることで、試料213から得られた反射光あるいは蛍光はピンホール板34を通過し、光検出部35で検出される。
【0076】
光検出部35は、検出した光を順次電気信号に光電変換し、その電気信号は利得可変部23h,オフセット調整部23iを介してA/D変換器23aでデジタル化され、記憶制御部23pの制御により記憶部23bに記憶され、適宜D/A変換器23cを介して表示部24で表示出力される。
【0077】
一方、上述した観察の合間に観察視野の位置ずれの補正処理を行なう場合には、光路分割部41をテレビカメラ42側に切換え、試料の画像を光路分割部41を介してテレビカメラ42で撮像する。テレビカメラ42で得られた画像信号は、A/D変換器23mでデジタル化され、記憶制御部23oの制御により記憶部23nに記憶される。
【0078】
この記憶部23nに記憶された画像に基いて、重心検出部23dは試料の重心位置を算出し、さらにその重心位置と観察視野の中心とのずれ量を座標値で算出し、その結果を距離換算部23fに送出する。距離換算部23fでは、送られてきたずれ量の情報と対物レンズの倍率とから上記第1の実施の形態で説明したようにXY各方向のずれ量の示す各距離を算出し、その算出結果をXY駆動部23gに出力する。XY駆動部23gは、この距離換算部23fからの距離値に応じてレーザ顕微鏡本体31のスキャニングステージ211をX,Y各方向に移動させる。これにより、レーザ顕微鏡本体31の鏡体に熱変形等が生じた場合であっても、観察視野の中心に確実に試料の重心が位置し、試料を観察視野の中央で観察することができるようになる。
【0079】
(第4の実施の形態)
上記第1乃至第3の実施の形態では、いずれも位置ずれの補正処理として観察光軸に直交するXY平面に沿ってステージの移動を行なうものとしたが、観察光軸と平行したZ方向へも位置ずれが生じることがある。この問題は、自動合焦機能を有する顕微鏡であれば、後述するようにZ方向の補正処理をXY方向の補正処理と並列して実行することで解決できる。これにより、特に焦点深度の浅い対物レンズを使用するような場合であっても、確実に試料の高さ方向の変化に対応させ、常に合焦を得ることができる。
【0080】
顕微鏡において観察者が観察する際に、XY方向の位置を決める調整操作を行なうとともに、Z方向の合焦位置を決める。具体的には、ステージのXY操作、Z操作を行ない所望の位置を確定することで、XY観察位置合わせと合焦を行なう。これは、一般的に行なわれている位置合わせである。したがって、XY方向の位置決めにより観察重心位置を決め、Z方向の位置決めにより合焦位置を決めることになる。本第4の実施の形態では、このときのZ方向の合焦位置をZ0とし、この状態で撮像された初期画像のコントラスト値を合焦位置ずれ補正の基準とする。
【0081】
以下、本発明の第4の実施の形態について図面を参照して説明する。
【0082】
図7は、レーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図である。図7の基本構成は上記第3の実施の形態に示した図6と同様であるため、図6と同一な部分に同一符号を付してその説明を省略する。本第4の実施の形態では、観察光軸方向(Z方向)の位置ずれ、すなわち合焦位置ずれに関して、そのずれ量を以下の処理にて補正し、合焦位置で撮像した初期の観察画像に対して合焦位置のずれていない観察画像を得ることを可能とする。
【0083】
図7において、コントラスト算出部23qは、記憶部23nに記憶された観察対象の初期の画像のコントラスト値を、該初期画像の各周辺画素間の差分値を用いて算出する。
【0084】
図8は、試料である観察細胞OCの画像を示す図である。図8において、81,82は、それぞれコントラスト値算出用のX,Yラインを示している。コントラスト算出部23qは、図8に示す画像におけるXY平面内でのXライン81とYライン82の輝度の差分値の絶対値の和をコントラスト値とする。この場合、Xライン81,Yライン82でのコントラスト値とZ位置でのコントラスト値は、以下のようになる。
【0085】
CX=Σ|D(Xn,Yk)−D(Xn+1,Yk)|2 …(1)
CY=Σ|D(Xk,Yn)−D(Xk,Yn+1)|2 …(2)
CZ=CX+CY …(3)
ここで、Xn,Ynは画像中の各画素の位置を示し、D(Xn,Yn)はXn,Yn位置での画像の輝度を示す。また、kは任意の画像位置である。(1),(2)式に示すCX,CYは、X,Yラインでのコントラスト値、(3)式に示すCZは最終的なZ位置でのコントラスト値であり、CXとCYを加算することによりZ位置でのコントラスト値CZを求める。
【0086】
図9は、光軸方向の位置(Z位置)に対するコントラスト値の変化を示す図である。前述したようにコントラスト算出部23qによりZ位置でのコントラスト値を求めた後、光軸方向の位置ずれの補正を行なう。この場合、今回取得した画像に対して、同様にコントラスト算出部23qでコントラスト値(Znの位置でのコントラスト値)を算出し、前回取得した初期画像のコントラスト値(合焦位置Z0でのコントラスト値)と比較する。
【0087】
これら二つのコントラスト値が異なれば合焦位置がずれているため、CPU23e3は以下のようにZ駆動部23rでステージ211を光軸方向で移動させ、前記二つのコントラスト値が一致する光軸位置すなわち合焦位置Z0を探す。すなわち、光軸方向の位置ずれ補正処理の際に上記二つのコントラスト値が異なる場合、今回取得したコントラスト値が合焦位置Z0のときの値と一致するようにステージ211をZ方向で動かす。
【0088】
まずCPU23e3は、標本213と対物レンズの衝突を防ぐため、初めにそれらが離れる方向へZ駆動部23rによりステージ211を移動する。この移動量は、使用している対物レンズの焦点深度量のステップに合わせる。これは、焦点深度内でステージ211を動かしても、合焦範囲内であるため変化を認識できないからである。
【0089】
このとき、ステージ211を2または3ステップ移動してコントラスト値が大きくなるなら、合焦位置のコントラスト値に至るまで、同じ方向で移動を続け合焦点に合わせる。もし、コントラスト値が小さくなるなら、合焦点からずれてゆくので、ステージ211を逆方向へ移動し、合焦位置に到達するようZ方向の位置合わせを行なう。このZ方向の位置ずれ補正処理を行なう時間間隔は、実際の顕微鏡鏡体の熱変形の速度により異なるが、所望の時間間隔を設定可能である。
【0090】
なお、画像取得時間と位置補正時間の関係については、第1の実施の形態の説明で用いた図4と同様であり、例えば、画像取得時間(T1)に対し、位置ずれ補正時間(T2)とした場合(T1>T2)、位置補正は次の画像取得までの間に行なわれなければならないため、T1内にT2の時間間隔で複数回(あるいは1回)位置ずれ補正を行なうよう設定すればよい。また、リアルタイムで常に補正処理を行ない、観察位置を中心に置きたい場合、テレビカメラの1画面の露光時間に同期して例えば1/30s間隔で補正処理を行なうことも可能である。
【0091】
一般に、通常の熱変形の速度は十分に遅いため、処理時間も十分確保でき、所望の観察が可能になる。ただし、全体の処理時間は、入力画像の取り込み速度に制限される。以上により、初期の設定を行なうのみで、その後は自動でZ方向の位置ずれ補正を行ない長時間の画像記録が可能となるため、観察に係る作業効率が向上する。
【0092】
また、Z方向の位置ずれ補正を画像のコントラスト値を基に行なうのでなく、対物レンズとステージの相対距離を基に行なうようにしてもよい。この場合、顕微鏡本体に対物レンズとステージの相対距離を測定するセンサを設け、このセンサで測定される相対距離をCPU23e3で検出する。そしてCPU23e3は、補正処理時に、検出した相対距離と初期の合焦時における相対距離とが一致するよう、Z駆動部23rによりステージ211を光軸方向で移動させる。
【0093】
また、画像記録部25はビデオテープレコーダからなるものとしたが、その他にもパーソナルコンピュータを介した記録媒体、例えば光磁気ディスク、ハードディスク等を用いて記録するものとしてもよい。また、テレビカメラ22のサイズ、信号方式には制限はなく、解像度の高いものであれば、位置合わせを行なう精度がより高くなることは言うまでもない。また、テレビカメラを複数用いて、一度に複数の画像を得るようにしてもよい。
【0094】
一般的にレーザー顕微鏡の場合、XYTスキャン、XYZTスキャンといった方法により時間経過に応じて画像を取得し観察をするため、長時間の観察が必要となる。しかし、以上このようなレーザ顕微鏡の画像取り込みモードによれば、適切な位置補正を行なうことで、長時間による良好な画像の取得が可能となる。これにより、XY方向すなわち平面方向だけでなく、光軸方向の合焦ずれも補正され、長時間において観察位置がずれない画像を取得できる。
【0095】
なお、本発明はその要旨を逸脱しない範囲内で種々変形して実施することが可能であるものとする。
【0096】
(変形例)
上記各実施の形態では示さなかったが、当然ながらレーザ顕微鏡システムでは、透過検出画像に関しても同様の処理を実行することができる。また、複数の画像に対しても同様の位置ずれの補正処理を行なうことが可能である。その場合の構成は上記各実施の形態と同様で、異なる波長の蛍光画像を同時または時分割により記憶部23nに記憶する。そして、複数の蛍光画像に対してそれぞれ位置ずれの補正処理を行ない、全ての画像に対して補正処理を終了した後、表示部24にてマルチ画像を表示させる。
【0097】
さらに、上記第2〜4の実施の形態では、光検出部35を光電子増倍管(PMT)で構成するものとして説明したが、これに限らず、フォトダイオード(PD)、CCD、CMD等の光電変換の効率が良いものであれば他の素子を用いてもよい。また2次元走査機構部33は、ガルバノミラーや、共振ガルバノミラー、ポリゴンミラー、あるいはAODでもよく、要はXYの走査が制御できればよい。また、上述した位置合わせの処理は、ハードウェアとソフトウェアのどちらでも実現可能である。
【0098】
【発明の効果】
本発明のようにすれば、任意に設定された時間間隔後の、画像に係る平面方向の基準位置に対する第1の位置情報のずれ量とずれ方向、及び画像に係る観察光軸方向の基準値に対する第2の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出し、これらずれ量とずれ方向に基いて顕微鏡の対物レンズと観察対象を載置したステージとの相対位置を駆動制御し、対物レンズと観察対象との位置ずれを補正するので、光学顕微鏡あるいは走査型レーザ顕微鏡等において、顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合であっても、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、常に対象画像を観察視野の基準位置に位置するようにして表示させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の第1の実施の形態に係る光学顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図。
【図2】本発明の第1の実施の形態に係る試料である観察細胞OCの観察視野OFにおける位置関係を例示する図。
【図3】本発明の第1の実施の形態に係る画像データにおける観察細胞OCの重心COCと観察視野OFの中心COFを示す図。
【図4】本発明の第1の実施の形態に係る画像所得時間間隔と位置ずれの補正時間間隔の関係を例示した図。
【図5】本発明の第2の実施の形態に係るレーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図。
【図6】本発明の第3の実施の形態に係るレーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図。
【図7】本発明の第4の実施の形態に係るレーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図。
【図8】本発明の第4の実施の形態に係る試料である観察細胞OCの画像を示す図。
【図9】本発明の第4の実施の形態に係る光軸方向の位置に対するコントラスト値の変化を示す図。
【図10】従来例に係る一般的な走査型レーザ顕微鏡の基本構成を示すブロック図。
【図11】従来例に係る2次元走査の原理を説明するための図。
【図12】従来例に係る観察対象となる試料が視野から外れた場合を例示する図。
【符号の説明】
21…光学顕微鏡本体
211…スキャニングステージ
213…試料
22…テレビカメラ
231,232,233…信号処理部
23a…A/D変換器
23b…記憶部
23c…D/A変換器
23d…重心検出部
23e1,23e2,23e3…CPU
23f…距離換算部
23g…XY駆動部
23h…利得可変部
23i…オフセット調整部
23j…D/A変換器
23k…D/A変換器
23l…2次元走査駆動制御部
23m…A/D変換器
23n…記憶部
23o…記憶制御部
23p…記憶制御部
23q…コントラスト算出部
23r…Z駆動部
24…表示部
25…画像記録部
31…レーザ顕微鏡本体
32…レーザ光源
33…2次元走査機構部
34…ピンホール板
35…光検出部
41…光路分割部
42…テレビカメラ
Claims (8)
- 顕微鏡で得た画像を観察するための顕微鏡画像観察装置であり、
前記画像中の観察対象に係る平面方向の第1の位置情報及び観察光軸方向の第2の位置情報の両方を求め、かつ任意に設定された時間間隔後の、前記画像に係る前記平面方向の基準位置に対する前記第1の位置情報のずれ量とずれ方向、及び前記画像に係る前記観察光軸方向の基準値に対する前記第2の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出する算出手段と、
前記顕微鏡の対物レンズと前記観察対象を載置したステージとの相対位置を変化させる駆動手段と、
前記算出手段で得た前記第1の位置情報及び前記第2の位置情報の両方に関する前記ずれ量と前記ずれ方向に基いて前記駆動手段の駆動を制御し、前記対物レンズと前記観察対象との位置ずれを補正する制御手段と、
を具備したことを特徴とする顕微鏡画像観察装置。 - 観察対象に対してスポット光を走査して得られる光信号から画像を構築して観察するための顕微鏡画像観察装置であり、
前記光信号を検出する検出機構とは別に設けられ、前記画像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段で得た前記画像中の前記観察対象に係る平面方向の第1の位置情報及び観察光軸方向の第2の位置情報の両方を求め、かつ任意に設定された時間間隔後の、前記画像に係る前記平面方向の基準位置に対する前記第1の位置情報のずれ量とずれ方向、及び前記画像に係る前記観察光軸方向の基準値に対する前記第2の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出する算出手段と、
前記顕微鏡の対物レンズと前記観察対象を載置したステージとの相対位置を変化させる駆動手段と、
前記算出手段で得た前記第1の位置情報及び前記第2の位置情報の両方に関する前記ずれ量と前記ずれ方向に基いて前記駆動手段の駆動を制御し、前記対物レンズと前記観察対象との位置ずれを補正する制御手段と、
を具備し、
前記制御手段により前記平面方向及び前記観察光軸方向の位置ずれを補正した状態で前記スポット光の走査による画像構築を行うことを特徴とする顕微鏡画像観察装置。 - 前記算出手段は、算出した前記ずれ量及び前記ずれ方向の少なくとも一方を、顕微鏡鏡体の熱変形に係る情報を基に補正することを特徴とする請求項1または2に記載の顕微鏡画像観察装置。
- 前記第1の位置情報は前記観察対象の重心位置であり、前記基準位置は前記画像の中心位置であることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の顕微鏡画像観察装置。
- 前記第2の位置情報と前記基準値は、各々前記画像のコントラスト値であることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の顕微鏡画像観察装置。
- 前記第2の位置情報と前記基準値は、各々前記対物レンズと前記ステージとの相対位置であることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の顕微鏡画像観察装置。
- 観察当初における前記第1の位置情報は操作者によって設定されることを特徴とする請求項1乃至6のいずれかに記載の顕微鏡画像観察装置。
- 前記顕微鏡画像観察装置は、前記観察対象に対してスポット光を走査して得られる光信号から前記画像を構築して観察する走査型レーザ顕微鏡であることを特徴とする請求項1記載の顕微鏡画像観察装置。
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